この方法は、細胞治療のためのUSMSCの最良の供給源など、UCMSCの審議における主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、早年期および期産児からのUCMSCの一貫した分離および活発な増殖を可能にすることです。この技術の意味は、難治性疾患の治療にまで及ぶ。
この方法はUCMSCの審議に関する洞察を提供することができますが、脂肪組織、滑膜、皮膚、歯髄などの他のMSC源にも適用できます。一般的に、この方法の新しい個々の方法は、臍解剖および間葉系幹細胞分離のステップに非常に多くのバリエーションがあるので苦労します。この方法の視覚的なデモンストレーションは、見落とされがちな点がいくつかあるため、これらの手順を理解することが困難であるため、非常に重要です。
臍帯の解剖を開始するには、まず金属トレイ、滅菌ハサミ、鉗子、10ミリリットルピペット、25ミリリットルピペット、および2つの60ミリメートル組織培養皿を準備します。温めるPBS精製酵素ブレンド、500ミリリットルの減らされた血清培地及び培養培地を、室温にする。アルファMEMの50ミリリットルチューブから以前に分離された臍帯を取り出し、プラスチックトレイに入れる。
臍帯の重さを量り、殺菌したはさみを使って5グラムのコードを解剖する。臍帯を殺菌するには、10ミリリットルのピペットを使用して、その上に70%エタノールの10ミリリットルを注ぎます。その後、10ミリリットルのピペットでPBSの10ミリリットルを加えることによってコードを2回洗います。
洗浄した臍帯を滅菌した60ミリメートルの組織培養皿に入れ、10ミリリットルの減らされた血清培地と0.5ミリリットルの精製酵素ブレンドを加えます。滅菌したはさみと鉗子を使用して、コードを2〜3ミリメートルに切ります。皿を5%の二酸化炭素インキュベーターに入れ、37°Cで30分間インキュベートします。
その後、部分的に消化した部分を小さく切り、ホモジネートが粘性になるまで5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度でインキュベートします。最後に、ホモジネートが25ミリリットルのピペットを通って容易に流れることを確認してください。まず、500ミリリットルの培養培地のボトルに4本、50ミリリットルのプラスチックチューブを調製する。
25ミリリットルのピペットを使用して、臍帯ホモジュネートを各チューブに約7.5ミリリットルの2つの50ミリリットルのプラスチックチューブに分割します。その後、各チューブに20ミリリットルの培養培地を加え、よく混ぜます。25ミリリットルのピペットで各ホモジュネートを収集し、新しい50ミリリットルのコレクションチューブの上に置かれた100マイクロメートルの細胞ストレーナーを通してフィルター。
遠心分離機1000gで濾過物を付けたチューブを2本、室温で5分間行います。遠心分離が終了した後、上清を慎重に吸引し、廃棄する。各チューブに5ミリリットルの培養培地を加え、細胞ペレットを再懸濁する。
細胞懸濁液を新しい60ミリメートルプレートに移し、5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で培養します。UCMSCを培養するために、PBS、トリプシンEDTA、および培養培地を室温まで温める。細胞がプレートに取り付けられている場合は、培地を取り除き、5ミリリットルのPBSで2回洗浄して、破片や赤血球を除去します。
培養培地を加え、5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度でインキュベートします。培地を週に2回交換し、90~100%の合流に達するまで細胞を培養します。その後、PBSの5ミリリットルで細胞を2回洗浄し、0.5ミリリットルのトリプシンEDTAを加え、摂氏37度で5〜10分間インキュベートします。
細胞が丸くなり、剥離したら、9ミリリットルの培養培地を加え、よく混ぜてトリプシンを不活性化する。新しい100ミリメートルのプレートに細胞懸濁液を追加します。彼らは90〜100パーセントの合流に達するまで、5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で細胞を成長させます。
トリプシン化を繰り返し、10番目の通過まで2つの新しいプレートに分割します。UCMSCの表面マーカー発現は、その特性評価の基準として用いられた。適切な抗体をインキュベートし、フローサイトメトリーで分析したところ、MSCのシグネチャーマーカーに陽性が見つかりましたが、単球マクロファージには陰性、血液系幹細胞およびエキシセル細胞に対して陰性、B細胞に対して陰性、汎性白血球、および主要な組織適合性複合体マーカーに対して陰性であった。
早産および期産児からのUSCMSCの三分化能力を評価するために、細胞は、有分細胞、骨細胞、および軟骨細胞に分化するように誘導された。UCMSCは、その分化能力を確認する3種類の中胚葉全てに正常に分化した。この手順を試みる際には、4 つの重要な手順があることを覚えておくことが重要です。
コードを2〜3センチメートルに切断し、より小さな部分に切断し、ホモジネートが25ミリリットルのピペットを通って容易に流れ、100マイクロメートルの細胞ストレーナーを通してホモゲネートを濾過します。
