Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в обсуждении UCMSC, таких как лучший источник USMSC для клеточной терапии. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет последовательной изоляции и энергичного распространения UCMSC от досрочных и срок младенцев. Последствия этого метода распространяются на терапию неразрешимых заболеваний.
Хотя этот метод может дать представление о обсуждении UCMSC, он также может быть применен к другим источникам MSC, таким как жировая ткань, синовий, кожа, зубная пульпа, и так далее. Как правило, человек, новый для этого метода будет бороться, потому что Есть так много изменений в шагах пуповинной вскрытия и мезенхимальной изоляции стволовых клеток. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку эти шаги трудно узнать, потому что есть несколько моментов, подверженных упускать из виду.
Чтобы начать рассечение пуповины, сначала приготовьте металлический лоток, стерилизованные ножницы и типсы, десять миллилитров трубок, 25 миллилитров пипеток и две 60-миллиметровые ткани культуры посуды. Разогреть PBS очищенных ферментных смесей, 500 миллилитров снижение средней и культурной среды сыворотки, до комнатной температуры. Удалите ранее изолированный пуповину из 50-миллилитровой трубки в альфа-MEM и поместите ее в пластиковый лоток.
Взвесить пуповину, а затем использовать стерилизованные ножницы, чтобы вскрыть пять граммов пуповины. Чтобы стерилизовать пуповину, используйте десять миллилитров пипетки, чтобы залить его десятью миллилитров 70-процентного этанола. Затем мыть шнур дважды, добавив десять миллилитров PBS с десятью миллилитров пипетки.
Поместите промытый пуповину в стерилизованную 60-миллиметровую ткань культуры блюдо и добавить десять миллилитров снижение среднего сыворотки и 0,5 миллилитров очищенных ферментных смесей. Используйте стерилизованные ножницы и типсы, чтобы разрезать шнур на две-три миллиметра штук. Поместите блюдо в пятипроцентный инкубатор двуокиси углерода и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут.
Затем разрежьте частично переваренные кусочки на более мелкие кусочки и инкубировать их при 37 градусах по Цельсию в пятипроцентный инкубатор двуокиси углерода до тех пор, пока гомогенат не станет вязким. Наконец, убедитесь, что гомогенат легко течет через 25 миллилитров пипетки. Сначала подготовь четыре, 50 миллилитров пластиковых трубок в 500 миллилитров бутылку культуры среды.
Используйте 25 миллилитров пипетки, чтобы разделить гомогенат пуповины на две, 50 миллилитров пластиковые трубки с примерно 7,5 миллилитров в каждой трубке. Затем добавьте 20 миллилитров среды культуры в каждую трубку и хорошо перемешайте. Соберите каждый гомогенат с 25 миллилитровой пипеткой и процедите через 100-метровый клеточный ситечко, помещенное поверх новой трубки сбора 50 миллилитров.
Центрифуга две трубки с фильтраты на 1000г в течение пяти минут при комнатной температуре. После завершения центрифугации, тщательно аспирировать супернатант и отказаться от него. Добавьте пять миллилитров среды культуры к каждой трубке и повторно приостановит клеточные гранулы.
Перенесите подвеску клетки в новую 60-миллиметровую пластину и культуру при 37 градусах Цельсия в пятипроцентный инкубатор двуокиси углерода. Для культуры UCMSC, тепло PBS, трипсин EDTA, и культуры среды, к комнатной температуре. Когда клетки прикреплены к пластине, удалить средний, и мыть дважды с пятью миллилитров PBS для удаления мусора и красных кровяных телец.
Добавьте культурную среду и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в пятипроцентный инкубатор двуокиси углерода. Замените среду два раза в неделю, и культуры клеток, пока они не достигнут 90 до 100 процентов слияния. Затем промыть клетки дважды с пятью миллилитров PBS, добавить 0,5 миллилитров трипсина EDTA, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение пяти-десяти минут.
Когда клетки становятся округлыми и отделенными, добавить девять миллилитров культуры среды, и хорошо перемешать, чтобы инактивировать трипсин. Добавьте подвеску клетки в новую 100-миллиметровую пластину. Выращиваем клетки при 37 градусах Цельсия в пятипроцентной инкубаторе углекислого газа, пока не достигнут 90-100-процентного слияния.
Повторите трипсинизацию и разделив на две новые пластины, до десятого прохода. В качестве критерия их характеристики использовалось выражение поверхностного маркера UCMSC. При инкубации с соответствующими антителами и проанализированы поток цитометрии, они были найдены положительными для маркеров подписи MSC, но отрицательный для моноцитов макрофаг, отрицательный для гематапоэтических стволовых клеток и эфителиальных клеток, отрицательный для В-клеток, отрицательный для пан лейкоцитов, и отрицательный для основных гистосовместимости сложных маркеров.
Для оценки трилинейной дифференциации способности USCMSC от недоношенных и срок младенцев, клетки были индуцированы, чтобы дифференцироваться в адипоциты, остеоциты и хондроциты. UCMSC успешно дифференцированы во все три типа мезодермальных клеток, подтверждающих их способность дифференциации. При попытке этой процедуры, важно помнить, что Есть четыре важных шага.
Резка шнура на два-три сантиметра штук, разрезание на более мелкие кусочки, убедившись, что гомогенат течет легко через 25 миллилитров пипетки, и фильтрации гомогената через 100 микрометровый ситечко клетки.
