コア RRK (U105115237) の資金の医学研究議会イギリスに感謝いたします。

1. セルと材料の準備
<ol><li>説明23として SM 寒天プレート機構の解析などの細菌と組み合わせてまたは HL5 など栄養培地での細胞を栽培してください。 注: 細菌マクロピノサイトーシスに欠陥のあるノックアウト変異体を成長マクロピノサイトーシスの率を高める可能性があります二次突然変異の蓄積を防ぐことができます。最適な結果を得るのための株式から細胞をめっき後 4 下通路の数を保持します。突然変異体の分離後できるだけ早く凍結する在庫として保存します。</li>
	<li>SM 寒天プレート上のセルを養う、SM 培地で合流する健食を成長します。SM 寒天上に細菌の 200-300 μ L を追加し、。(別の細菌のプレートから転送) 時細胞の生殖不能のループを取るし、プレートの 1 つの端に 。今週の 22 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>テトラ-メチル-ローダミン イソチオ シアン酸 (TRITC-) デキストランを 50 mg/mL の水に溶解、1 ml に 0.22 μ m のフィルターを使用してフィルター処理および-20 ° C で保存因数は無期限に保存することができます。 注: 155 kDa、一括で安く買うことができるより小さい dextrans の測定と同様に効果的に細胞性粘菌24マクロピノサイトーシスこのメソッドで使用される典型的なサイズです。Alexa-647、カスケード ブルーなどの異なる非水魔 dextrans は異なった fluorophores が必要な場合の選択肢であります。</li>
</ol>2. (省略可能) を定量的に定性的な測定を変換します。
<ol><li>
細胞懸濁液を用いた流体吸収分析を実行します。
	<ol>
<li>3 分間 300 x g で axenically 成長細胞のペレット、上澄みを廃棄し、1 x 107セル/mL に培養液で再懸濁します。TRITC デキストランを 0.5 mg/mL に追加し、180 rpm、22 ° c. で振る</li>
		<li>サンプル 0、30、60、90、120 分の洗浄で冷たい KK2 0.7 mL に一度冷えた KK2バッファー23ベンチトップ遠心分離機の 1.5 mL で同じバッファーに 1 mL に再懸濁し、氷の上を格納 0.8 mL を希釈します。 注:相当の結果をすぐに、または収集されたすべてのサンプルの洗浄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞によって内面液量を決定します。
	<ol>
<li>574 の 544 nm、発光波長の励起波長を用いた蛍光を測定する蛍光を設定 10 nm スリットの nm。TRITC デキストランの希釈系列を設定し、指定された蛍光を測定するために使用デキストランのボリューム。検量線を作成します。</li>
		<li>セクション 2.1 0.9 mL 細胞懸濁液を使用してのセルによって蛍光を測定します。校正曲線24を使用してセルごと内面液量を計算します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.5 mL の氷冷株式会社2に別々 にそれぞれの時点から細胞の残りの部分を薄くしなさい。5 mL ポリスチレン流れ cytometry チューブに 70 μ m セル ストレーナー フィルターします。流れの cytometer を設定時間の各ポイントから細胞は互いからはっきりとその蛍光を記録 (セクション 3.4 と 3.5 を参照)。</li>
	<li>上記の設定を使用して流れの cytometer でキャリブレーション ビーズの蛍光を測定し、それを記録します。 注: これは流れの cytometer のすべての将来の蛍光測定の参照: ビーズを実行再度を使用する前に、と同じ蛍光があるので設定を調整します。これは非常に狭い定義されたピークを与えます。蛍光ピーク周辺ゲートを入れて、この容易になります。</li>
	<li>3 回繰り返すし、2.2 と 2.3 互いのセクションで得られた細胞蛍光データをプロットします。ベスト フィットのラインをプロットし、cytometry 流れから質的データを定量的な単位に変換する式を使用します。</li>
</ol>3. 測定流体吸収
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig1.jpg"> 図 1: マクロピノサイトーシスの高スループット測定の概略図。(A) SM 板の成長細胞性粘菌は健食菌 (黄色) でシードします。細胞を採取供給のフロント (オレンジ)、細胞は既に開発を回避する (緑)、25 mL の KK2バッファーに。分離するに渦は 300 x gで 3 分遠心分離によってペレットしてたびに上清を廃棄 KK2バッファーの 50 mL で 3 回洗ってください。1 x 105セル/ml HL5 成長媒体に再懸濁します、フラットボトム 96 ウェル プレートのサンプルあたりの 3 つの井戸に 50 μ L を追加します。(B)希釈 TRITC デキストラン HL5 培地に 1 mg/mL に 50 mg/mL の原液から 22 ° C 24 時間インキュベートします。(0 分吸収制御井戸を除く)、各サンプルを 50 μ l 添加し、デキストランを 0 分取り込みコントロールに追加した後, 1 h, 22 ° C で。(C)はすぐにメディアをデカント、余分なメディアを取り外して洗浄する井戸を埋める冷たい KK2バッファーのお風呂で水没する組織にプレートをパットします。バッファーを捨て、再び乾燥パットします。5 mM アジ化ナトリウム KK2セルをデタッチする MC に溶解の 100 μ L を追加します。フローサイト メーターの内面化された蛍光測定のために取る。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58434/58434fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<ol><li>
ティッシュ文化 96 ウェル平底プレート (図 1 a) を設定します。試金; 前に 24 h HL5 媒体 (含まれている 100 μ g/mL ジヒドロストレプトマイシン、100 μ g/mL アンピシリン 50 μ G/ml カナマイシンの) にそれらを転送する細菌の成長のセルを使用これはマクロピノサイトーシス細菌24上に成長した細胞に見られる低レベルから誘導することができます。また、培養、細胞密度の異なるから希釈されて誤差を減らすために、試金する前に 24 時間インキュベートから直接細胞を希釈します。<ol>
<li>KK2 50 mL 遠心管中の 25 mL に餌のフロントから細胞を採取します。ボルテックスと 3 分.の 300 x gでペレットによる細胞を分離します。上澄みを廃棄、ペレットを再懸濁します、KK の2細菌を除去するたびに上清を廃棄 50 mL で 3 分間 300 x gで 3 回洗浄しなさい。</li>
		<li>(、血球または他のセルのカウント システムを使用) セル密度を決定して HL5 含む抗生物質を 1 x 10 の5セル/mL に希釈します。条件ごとに 3 つの井戸を使用して各ウェルに 50 μ L をピペットします。24 時間 0 分吸収のコントロールを設定するための 22 ° C で孵化させなさい。 注: 代替メディア、例えばSIH、VL6 を代わりに使用することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ロードセルとは TRITC デキストラン (図 1 b)。
	<ol>
<li>1 mg/ml 使用される媒体にデキストランを希釈 (これに増加 2.5-5 mg/mL 吸収量が非常に少ないとセルを評価するとき)。(0.5 mg/mL TRITC デキストランの最終的な集中を与える) 各ウェルに 50 μ L を追加し、これにより、デキストランの重要な蓄積が、デキストランの放出はまだ始まっていない 22 ° C 1 時間にプレートを戻ります。 注:リピータ ピペット誤差の低減より急速に行われるこの手順をことができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
(図 1) フローサイトメトリー用セルを準備します。
	<ol>
<li>すぐに洗濯する前に、0 分取り込みコントロールに 50 μ L デキストランを含むメディアを追加します。</li>
		<li>媒体を捨て、ティッシュで水気します。冷たい KK2プレートを水没によって洗浄し、デカントします。 注:付着欠陥を有するいくつかの系統がこの手順で、例えばタリンの両方の同族体のノックアウト剥離 (タラ-/talB -)25。不完全を添付、必要な場合は、メディアを吸引細胞を操作するときは、注意を使用します。</li>
		<li>冷たい 5 mM アジ化ナトリウム KK2MC (KK2 + 2 mM MgSO4と 100 μ M CaCl2) に溶解の 100 μ L を追加します。 注意: アジ化ナトリウムは非常に有毒です。粉体を操作するときは、防塵マスク、保護メガネを使用します。常に手袋、白衣を着用します。熱を避け、酸と混ぜないでください。 注: 細胞は急速にデタッチ、開口放出が防止24.顕微鏡は、これを確認する使用できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
フローサイトメトリーによる測定流体吸収
	<ol>
<li>相対値を絶対的なものに変換する場合は、(セクション 2 を参照してください) の流れの cytometer 設定を標準化するビーズを使用します。また、使用セル搭載マシンがブロックされていないことを確認 (図 2 a) のセルを隔離する前方散乱、側方散乱が適切に設定されていることを確認する 2 のセクションとデキストラン (図 2 b) とパラメーターを調整(図 2) の内面の蛍光を測定します。</li>
		<li>高速サンプリング システムを接続し、プレートを追加します。セットアップ プロトコル (TRITC デキストランは、エキサイトし、582 nm チャネルまたは類似を測定に黄緑色のレーザーを使用) の蛍光を測定するための細胞懸濁液および実行の最大 65 μ L。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
流れの cytometry の結果を分析します。
	<ol>
<li>前方散乱、側方散乱 (図 2 a) を使用してセルのゲート。統計情報オプションを使用してセルの中央の蛍光を計算します。1 つのサンプルを使用してこれらのパラメーターを設定し、すべてのサンプルに適用します。 注: 前方散乱/サイド散乱プロファイルは、サンプル異なる変異体または阻害剤を使用する場合によって異なります。</li>
		<li>条件ごとに 3 つの井戸の意味を決定し、0 分摂取コントロールを減算します。どちらかはセクション 2 で決定方程式を使用して数量値を変換またはコントロールに正規化すること。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 流体吸収時間コースを実行します。
<ol><li>セクション 3 の時点およびひずみ/条件ごとに 3 つの井戸のようにセルを設定します。</li>
	<li>順次、さまざまな坑井にデキストラン ラベル付きメディアを追加します。典型的な経過を測定流体吸収 0、30、60、90、120 と 180 分追加 120 分時点の井戸へそれを追加することによって、後 60 分、180 分時間ポイント井戸デキストラン含有培地等(図 3 a)。</li>
	<li>0 分でデキストラン含有の 50 μ L を追加中、すぐに捨て、セクション 3.3 のようにプレートを洗います。セクション 3.5 で説明されているように分析します。</li>
</ol>5. 用量応答曲線
<ol><li>各ひずみと条件の 3 つの井戸を 3 で説明したようにセルを設定します。</li>
	<li>化合物の二重目的の最大最終濃度1 mg/mL デキストランを含有する培地に関心の化合物を希釈します。車両の割合が第 1 として同じデキストランと媒体を含んでいる第 2 管を準備します。ミックスする渦。</li>
	<li>200 μ L デキストランのサンプル (図 4 a) あたりの媒体を含んでいる興味の化合物の希釈系列を作成します。ミックスする渦。1 h は、各サンプルに媒体の 50 μ L を追加します。</li>
	<li>洗って、セクション 3.3 以降で前述の分析します。</li>
</ol>6. 貧食能および膜の取り込み
<ol><li>膜の吸収を測定するには、セクション 3 で説明したセルを準備します。培最終濃度 10 μ M、20 μ M FM 1-43 の 50 μ L を追加します。読み込み後洗浄し、3.3 節のようにフローサイトメトリー用セルを準備します。585 nm チャネルまたは同様に、エキサイトに青色レーザーを使用して測定します。 注: 膜輸送は液相よりもより高速な 10 分は 1 h26よりも使用するより適切な時点です。膜に組み込まれる場合にのみ蛍光を発する代替染料を代わりに使用することができます。</li>
	<li>
貪食能を測定する蛍光標識ビーズや細菌のいずれかを使用します。前方に細胞性粘菌から分離し、側散布24、蛍光酵母を使用ことはできません。セクション 3 で説明するようにセルを設定し、説明27として分析します。<ol>
<li>測定するには、ビーズの貪食能黄緑ビーズ洗浄と同様にフローサイトメトリーの準備の前に 1 時間 5 x 107ビーズ/mL (1.75 と 2 μ m) または 1 × 108ビーズ/mL (1、1.5 μ m) の最終的な集中にセクション 3.2 で説明するようにラベルを追加します。セクション 3.3。525 nm チャネルまたは同様に、エキサイトに青色レーザーを使用して測定します。 注: 高濃度は、細胞の剥離をもたらすでしょう。</li>
		<li>細菌の貪食能を測定するには、前述のセクション 3.2 に 1 x 10 の8細菌/mL の 1 h のために洗濯やセクション 3.3 のようにフローサイトメトリー用の準備の前に、テキサス赤ラベル大腸菌バクテリアを追加します。610 nm チャネルまたは同様に、エキサイトに黄緑色のレーザーを使用して測定します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Dictyostelium+RasGEF+is+required+for+normal+endocytosis,+cell+motility+and+multicellular+development.">A novel Dictyostelium RasGEF is required for normal endocytosis, cell motility and multicellular development.</a> Current Biology. 10, 1427-1437 (2000).</li><li>Thomason, P. A., King, J. S., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mroh1,+a+lysosomal+regulator+localized+by+WASH-generated+actin.">Mroh1, a lysosomal regulator localized by WASH-generated actin.</a> Journal of Cell Science. 130 (10), 1785-1795 (2017).</li><li>van Duijn, B., Vogelzang, S. A., Ypey, D. L., van der Molen, L. G., van Haastert, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+chemotaxis+in+Dictyostelium+discoideum+cells+with+a+depolarized+plasma+membrane+potential.">Normal chemotaxis in Dictyostelium discoideum cells with a depolarized plasma membrane potential.</a> Journal of Cell Science. 95, 177-183 (1990).</li><li>Novak, K. D., Peterson, M. D., Reedy, M. C., Titus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+myosin+I+double+mutants+exhibit+conditional+defects+in+pinocytosis.">Dictyostelium myosin I double mutants exhibit conditional defects in pinocytosis.</a> Journal of Cell Biology. 131, 1205-1221 (1995).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+uses+macropinocytosis+and+apoptotic+mimicry+to+enter+host+cells.">Vaccinia virus uses macropinocytosis and apoptotic mimicry to enter host cells.</a> Science. 320 (5875), 531-535 (2008).</li><li>Paschke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+genetic+engineering+of+both+wild+type+and+axenic+strains+of+Dictyostelium+discoideum.">Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum.</a> PLoS One. 13 (5), e0196809 (2018).</li><li>Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+duplications+in+the+genomes+of+laboratory+stocks+of+Dictyostelium+discoideum.">Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum.</a> Genome Biology. 9 (4), R75 (2008).</li><li>Fey, P., Dodson, R. J., Basu, S., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+stop+shop+for+everything+Dictyostelium:+dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center+in+2012.">One stop shop for everything Dictyostelium: dictyBase and the Dicty Stock Center in 2012.</a> Methods in Molecular Biology. 983, 59-92 (2013).</li></ol>

著者はある利益相反を開示します。

流体の摂取量を評価するために他の方法は低スループットである一方マクロピノサイトーシス、膜吸収の高スループット測定をできるように、このメソッドで重要な手順は、その場で細胞と細胞をデタッチするアジ化ナトリウムの使用を洗浄または貪食細胞性粘菌。細胞が表面に付着し、媒体ではない、彼ら左周り中が最初に投げ時に取り付け、その浸漬バッファーを変更でき再びオフにスローされます。細胞の ATP の枯渇と30の膜を脱分極、アジ化ナトリウムを使用して、セルをデタッチし、も24セル実行可能性に影響を与えずに開口放出を防ぎます。
特定の株または条件が流体の摂取量を変更する理由理由を確立する非常に迅速に、流体吸収の非常に正確な測定を与えるフローサイトメトリーを使用して細胞性粘菌によってマクロピノサイトーシスを測定するそれ以上の調査を使用して顕微鏡は必要な24です。それも注意しなければならないこと以前に発行された結果、いくつかのケースで違いを示している流体吸収で突然変異系統のいずれか (この場合は) のように表面上に成長または懸濁液 (標準プロトコル) のように31の揺れ。このメソッドを使用して、まれに、明らかな流体吸収不良を逃している可能性があります。また、貪食能を測定するとき、粒子の低濃度が使用できます。菌株と条件24の貪食の関連の違いを測定することも可能だが、この手法で決定することができます食の最大レートは本当の最大値をはるかに下回るです。食の最大レートを決定するには、吸収は、代替プロトコル27によって懸濁液を振動で測定しなければなりません。この訂正されるべきのそれに応じて流れの cytometer を設定するとき、ビーズを貪食した細胞は側方散乱を増加しています。
フローサイトメトリーを使用して哺乳類セル32の流体の摂取量を測定できます、流体のより高い割合で他のエンドサイトーシス経路による吸収を相ただし細胞性粘菌に見られるよりも、心配です。また、セルは通常 37 ° c、さらに内面のデキストランのエンドサイトーシスの進行を許可するトリプシンを使用して戸建します。冷たいアジでは、この手法をさらに最適化を行う哺乳類セルには適用されません、サーフェス (ウィリアムズ、未発表観測) からデタッチするマクロファージは発生しません。
マクロピノサイトーシスの高スループット測定画面のすぐにそして安く細胞性粘菌に及ぼす阻害剤、遺伝子の突然変異や遺伝子の打撃に使用する可能性があります。変異体は、彼らの直接の親のみを常に比較必要があります。読者には、細胞性粘菌のひずみの事前設定がなければ、DdB や NC4 など非無菌系統は無菌のものよりも「野生型」より、し、、無菌系統33として効果的に操作することができます。そうでなければ、ax2 横型の系統は、無菌系統が最も少ないゲノム重複34Ax4 の多くの菌株タリン A ノックアウトする必要があります回避可能であれば23。最も以前に発行された系統は、35Dicty ストック センターから注文できます。
このテクニックには、さまざまな条件、阻害剤、細胞性粘菌によってマクロピノサイトーシスの突然変異の効果に以前可能だったより大きい調査の可能性ができます。

大規模な非特異的流体吸収マクロピノサイトーシスはいくつか生物学的コンテキスト1に重要な細胞によって免疫抗原サンプリングを含む2、病原体参入ホスト細胞3、癌細胞増殖4とプリオン病5の広がり。哺乳類、細胞性粘菌アクチン6、7、π (3,4,5) P38,9,10 (脂質の正確な性質が異なる 2 つの11の間) が、活性化Macropinocytic パッチの方法について多くの疑問が残っているが Ras12,13, と活性 Rac14,15がマクロピノサイトーシス、効率的な流体吸収のために重要組織化され、最終的には内面、形作られます。マクロピノサイトーシスとどのように彼らが様々 な生物学的文脈で重要のそれに続く決定の重要な多くのタンパク質を発見マクロピノサイトーシスのより包括的な理解を与える、悪意のあるの開発条件の範囲のための治療を対象とします。
細胞性粘菌は、マクロピノサイトーシスを研究するための理想的なモデル システムです。標準的な実験室の緊張の構成マクロピノサイトーシスの高レベルは、その流体吸収はマクロピノサイトーシス6により 90% を意味します。これはマクロピノサイトーシス マクロピノサイトーシスによる流体吸収の割合ははるかに低い哺乳類細胞とは異なり、流体の吸収を決定するだけで測定することができます。マクロピノサイトーシスはとてもよく定義されて、このシステムで簡単に可視化12を同様に提供を調査するための明確な利点は他のシステム上、macropinosome の保存されているコンポーネントをコア複数の規制信号があります。16,17。
18デキストラン陽性膜小胞で占められているセルの領域を決定する顕微鏡に続いて短期間のデキストランをパルス後固定セル マクロピノサイトーシスを測定する哺乳類細胞で使用される標準的な方法が含まれます。この手法はしかし macropinosomes だけ内面化ボリュームを意味セルの単一の平面を考慮し、細胞性粘菌19で報告されている細胞に入ると縮小の可能性を考慮しません不明です。Macropinosomes 与えられた時間内在化している数を数える、代替手法が同じマイナス20。細胞性粘菌を使用すると、これらの問題が回避できます。しかし、細胞性粘菌液吸収を測定するための既存の技術が比較的細胞およびデキストラン21の労働集約的な大規模な使用量です。細胞蛍光デキストランと、蛍光を使用して内面化された蛍光性の定量のための様々 な時点で削除のサンプル高密度で揺さぶられます。このまま低スループットが、解像度の22、人口レベルではなく、1 つのセルを得るためにフローサイトメトリーによる細胞はこのように調製を分析できます。
ここでは、ラベルとして蛍光デキストランを用いた内面流体を測定する標準的な方法は、高速サンプリング (HTS) 添付ファイルを使用して、フローサイトメトリーで分析したサンプル 96-well 版のフォーマットに適応です。細胞は、あらかじめ決められた時間、浸漬冷たいバッファーで洗浄、5 mM のアジ化ナトリウムがまた分泌を停止するを使用して戸建のため非水魔蛍光デキストランを供給されています。各ウェル内のセルは、フローサイトメトリーで分析しています。このメソッドより少ないリソースを使用して労力を軽減し、ながら系統/条件の多数の流体の摂取量の同時比較ができ、上記の方法の限界を克服するために設計されました。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>LSR_II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-dextran (155 kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1287</td>
			<td>Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL5 medium</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>HLGCFG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydrostreptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>Formdium</td>
			<td>AMP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103694M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate hydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25169.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.02382.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phopshate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.04877.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-potassium hydrogen phosphate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.05104.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorimeter</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>LS 50 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>T35356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>15702-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>09719-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17687-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 &#181;m</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>09847-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red E. coli bioparticles</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>E2863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow-set fluorospheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6607007</td>
			<td>Calibration Beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>SMACFG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Elkay Laboratory Products</td>
			<td>E25-PS22-50S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom polystyrene tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352058</td>
			<td>Use a tube that will fit onto your flow cytometer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeating pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M4-SK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL repeating pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY294002</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>70920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry

大規模な非特異的流体吸収マクロピノサイトーシスは特定の癌細胞、抗原サンプリング、ホスト細胞浸潤、神経変性疾患の広がりの増殖にとって重要です。アメーバ細胞性粘菌キイロタマホコリカビの一般的に使用される実験室の緊張は、マクロピノサイトーシスが 90% の以上の培養液で栽培された流体吸収が非常に高いレートを持っています。また、マクロピノサイトーシスを勉強するためのエクセレント モデル システムは現在、哺乳類マクロピノサイトーシスの既知のコア コンポーネントの多く、また。ここでは、ラベルとして蛍光デキストランを用いた内面流体を測定する標準的な方法は、高速サンプリング (HTS) 添付ファイルを使用して、フローサイトメトリーで分析したサンプル 96-well 版のフォーマットに適応です。
細胞は、あらかじめ決められた時間、浸漬冷たいバッファーで洗浄、5 mM のアジ化ナトリウムがまた分泌を停止するを使用して戸建のため非水魔蛍光デキストランを供給されています。各ウェル内のセルは、フローサイトメトリーで分析しています。メソッドは、膜吸収および蛍光ビーズや細菌の貪食能を測定に適応できます。
このメソッドは、高スループット、労働およびリソース効率的に細胞性粘菌によって流体吸収の測定を許可するように設計されました。複数の菌株 (例えば遺伝子のノックアウト変異) と条件の同時比較が可能に (例えば細胞のさまざまなメディアで、阻害剤の濃度の異なる扱われます) 並行し時間コースを簡素化します。

手法が実行されているし、セル、デキストランと読み込まれ、分析 (図 1) の準備ができて、一度流れの cytometer がブロックされていないことを確認し、図 2 aに示すように細胞のように前方散乱/サイド散乱プロファイルを調整します。マシンがブロックされている場合は、 2 b を図のようになるよりになります、続行する前にブロックする必要があります。パラメーター コントロールを表示する無菌細胞より長い時点で高い内面デキストラン蛍光と短いもので低い内面化された蛍光性があることを確認 (図 2)。
突然変異体間の相違点を探して、3 つの表現型の 1 つをすることがそうです。変異体は、通常の流体の摂取量を持つことが、部分的な欠陥があってもまたは流体吸収が完全に廃止されます。この場合標準研究室ひずみ ax2 横型、変異 〜 50% と減少流体吸収 (ax2 横型rasG-14)、流体吸収 (Ax3 gefB-28) を廃止、図 2 D通常の流体の摂取量と歪みを示しています。平均中央値の流体の摂取量 (セクション 3.5) を取得し、それを使用して (図 3 b) のように内面流体の体積を計算または、データ コントロールを比較 (図 4 bのようにと4 C)。
その後、デキストランを exocytosed するのに開始、60-90 分間内面化された蛍光を増やす必要があります流体吸収時間のコースを図 3 aのようにを実行するとき、高原に達する (図 3 b)。したがってマクロピノサイトーシス異なる変異体/条件を比較することにより、達成されるべき良好な信号と信号がエキソサイトーシスにより失われないとき、標準時ポイントとして 60 分を使用します。開口放出が妨げられる深刻な突然変異体は、高原29に到達する時間がかかります。
ほとんどの場合より高い添加剤でほとんど何も下に行くとき治療細胞と細胞性粘菌( 4 a を図のようにを設定)、マクロピノサイトーシスに対する有効な阻害剤 1 h で内面化デキストラン(図 4 b)。いくつかの阻害剤は 100% 有効にできない場合があります、ただし、例えばノコダゾールのみによって抑制する流体の摂取量の 50% までマクロピノサイトーシス鋭く追加される (図 4)。阻害剤が効果がない場合、セルは、コントロールとしてデキストランのような量を内面化し、蛍光の減少は見ていません。この手法は、阻害剤治療を最適化する時間を短縮でき異なる阻害剤および非常に迅速に、マクロピノサイトーシスによって流体の吸収に及ぼす影響は上映阻害剤濃度の広い範囲をことができます。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig2.jpg"> 図 2: 流れの cytometer と代表データの設定。(A)セルを簡単に区別できるように、前方散乱 (FSC) と細胞の面散布 (SSC) プロファイルを設定する必要があります。Ax2 横型セルがどのように見えるべきかの例です。(B)この例のように、流れの cytometer がブロックされている場合、セルは、非常に低い側散布を持ってください。レーザーが正しく、蛍光物質を刺激しないと、マシンは続行する前にブロックできませんする必要があります。マシンがブロックされたときに取得されたすべてのデータを破棄する必要があります。(C)蛍光設定してください 0 分取り込みサンプルが増加するときに細胞が培養されている低蛍光性蛍光メジウムで長く 2018年24ウィリアムズ & ケイから取られるこの例で示すように。(D)通常マクロピノサイトーシス (ax2 横型、緑)、1 h の TRITC デキストランで培養されている細胞の例マクロピノサイトーシス (ax2 横型rasG -、HM172614, オレンジ) を削減、廃止マクロピノサイトーシス (Ax3 gefB-HM177628, 青)。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58434/58434fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig3.jpg"> 図 3: 96 ウェル プレートで流体吸収時間コースを実行します。(A)デキストランはする必要があります、順番に同じ終了時刻のサンプルの各セットに追加します。井戸を洗浄し、デタッチして、フローサイトメトリーによる内面の蛍光を測定します。例、デキストランを追加する時は以下のとおりです。(B) ax2 横型セルの流体吸収時間コースは、96 ウェル プレートで実行されます。誤差範囲 2018年24ウィリアムズ & ケイから撮影、3 つの独立実験の標準エラーが表示します。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58434/58434fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig4.jpg"> 図 4: 流体吸収線量の応答曲線。(A)の関心は、この場合、PI3K 阻害剤 LY294002、HL5 に二重目的の最終的な最大濃度で 1 mg/mL TRITC デキストランを含む化合物を追加。HL5 成長培地 + 条件あたり 200 μ L 中の希釈系列を生成する様々 な割合で単独で車を含む 1 mg/mL デキストランと混ぜます。1 h は通常井戸洗浄および内面化された蛍光を測定する前に追加します。(B) ax2 横型セルの流体吸収線量の応答曲線はAから LY294002 含有培地で培養。ウィリアムズ & ケイ 2018年24から適応。流体の摂取量は、未処理のコントロールに正規化されます。誤差範囲は、3 つの独立実験の標準誤差を表示します。(C) ax2 横型セルの流体吸収線量の応答曲線は、ノコダゾールと孵化させます。ウィリアムズ & ケイ 2018年24から適応。流体の摂取量は、未処理のコントロールに正規化されます。誤差範囲は、3 つの独立実験の標準誤差を表示します。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58434/58434fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

マクロピノサイトーシス、大規模な非固有の流体吸収、免疫、感染症、がん、神経変性疾患を含む臨床生物学の多くの分野で重要です。ここでは、既存の手法はマクロピノサイトーシス モデル生物キイロタマホコリカビ使用マクロピノサイトーシスの計測フローサイトメトリー高スループット、単一セルの解像度を許可するように適応されています。

フローサイトメトリーによる細胞性粘菌キイロタマホコリカビマクロピノサイトーシスの高スループット測定

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

high-throughput-measurement-dictyostelium-discoideum-macropinocytosis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

7.7K ビュー.  MRC-Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK. マクロピノサイトーシス、大規模な非固有の流体吸収、免疫、感染症、がん、神経変性疾患を含む臨床生物学の多くの分野で重要です。ここでは、既存の手法はマクロピノサイトーシス モデル生物キイロタマホコリカビ使用マクロピノサイトーシスの計測フローサイトメトリー高スループット、単一セルの解像度を許可するように適応されていま?...

ビデオ: High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP - FCM：フローサイトメトリーにより検出免疫沈降

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

生物学

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

フローサイトメトリーによる細胞膜へのGLUT4転の定量的測定

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1. Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since they do not react with colorimetric reagents2,3. Enzymatic hydrolysis (EH) is an emerging method for accurately characterizing organic P forms in environmental samples4,5. This method is only trumped in accuracy by Phosphorus-31 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (31P-NMR) -a method that is expensive and requires specialized technical training6. We have adapted an enzymatic hydrolysis method capable of measuring three classes of phosphorus (monoester P, diester P and inorganic P) to a microplate reader system7. This method provides researchers with a fast, accurate, affordable and user-friendly means to measure P species in soils, sediments, manures and, if concentrated, aquatic samples. This is the only high-throughput method for measuring the forms and enzyme-lability of organic P that can be performed in a standard laboratory. The resulting data provides insight to scientists studying system nutrient content and eutrophication potential.

This protocol describes a high-throughput method of enzymatic hydrolysis that utilizes a microplate reader to measure and classify soil phosphorus as P monoesters, P diesters and inorganic P. Up to 96 samples can be measured at one time in a standard laboratory.

環境試料中の有機Pのハイスループット測定と分類

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

イメージングG -タンパク質共役受容体（GPCR）を介するシグナル伝達事象その制御走キイロタマホコリカビ</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

単離されたミトコンドリアのフローサイトメトリーによる外膜タンパク質の免疫検出

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular development program, during which single cells chemotax towards aggregation centers1-4. This process is dependent on the release of cyclic adenosine monophosphate (cAMP)5. cAMP is produced in waves through the concerted action of adenylate cyclase and phosphodiesterases, and binds to G protein-coupled cAMP receptors6,7. A widely used assay to analyze the mechanisms involved in the developmental cycle of the lower eukaryote Dictyostelium discoideum is based on the observation of cell aggregation in submerged conditions8,9. This protocol describes the analysis of the role of coronin A in the developmental cycle by starvation in tissue-culture plates submerged in balanced salt solution (BSS)10. Coronin A is a member of the widely conserved protein family of coronins that have been implicated in a wide variety of activities11,12. Dictyostelium cells lacking coronin A are unable to form multicellular aggregates, and this defect can be rescued by supplying pulses of cAMP, suggesting that coronin A acts upstream of the cAMP cascade10. The techniques described in these studies provide robust tools to investigate functions of proteins during the initial stages of the developmental cycle of Dictyostelium discoideum upstream of the cAMP cascade. Therefore, utilizing this aggregation assay may allow the further study of coronin A function and advance our understanding of coronin biology.

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

初期の飢餓応答でCoronin Aの機能を調査<em&gt;細胞性粘菌</em&gt;凝集アッセイによって

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

キイロタマホコリカビ急性の機械的刺激に対する応答の評価

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...