I.K.H.P. に国立保健医学研究評議会 (GNT1125033 ・ GNT1140187) とオーストラリアの研究評議会 (DP170103790) からの助成金によって支えられた仕事

1. アポトーシスの誘導
<ol><li>5 分間 300 x g でセルのサンプルを遠心し、任意の既存の細胞の残骸を削除する上澄みを廃棄します。 注: 付着性のセルを使用して、事前に細胞を播くし、アポトーシス誘導前にリン酸緩衝液 (PBS) × 1 で洗います。</li>
	<li>セルの数を決定し、細胞を収集します。 注: 測定後分離に応じてお勧めします少なくとも 1 x 10 の開始セル番号7セル。</li>
	<li>1 x 106セル/mL の最終的な集中の完全なメディア (50 μ G/ml ストレプトマイシンの混合物、50 IU/mL ペニシリン (巻/巻) 10% 牛胎児血清を含むそれぞれの媒体) に再懸濁します。</li>
	<li>分注 ~ 6 ウェル プレートのウェルあたり 10 の6セル × 2。</li>
	<li>アポトーシスを誘導して、板蓋を取り外して 150 mJ/cm2の紫外線照射器を使用して細胞を照射します。これは、約 30-60 秒を取る必要があります。 注: 照射前に '非導入' セル コントロール ~0.5 x 106セルが保存されることを確認します。 注: 抗 Fas または血清飢餓6など他の方法を介してアポトーシスを誘導もことができます。</li>
	<li>37 ° c、5% CO2セル行に応じて、2-8 時間孵化させなさい。</li>
	<li>ベンチ トップ光学顕微鏡を使用して、ブレブ、apoptopodia と ApoBD 層などのアポトーシスの形態の存在を確認する細胞を可視化します。 注: 40 倍の倍率は、十分です</li>
	<li>P1000 ピペットを使用して、ピペットし、アポトーシスのサンプルを収集します。</li>
	<li>1x PBS で洗浄して最大収量を確保するため残りのサンプルと組み合わせます。</li>
	<li>収集 ~1/10th '全体アポトーシス サンプル' (WAS) を制御します。</li>
	<li>「未処理」サンプルを収集します。</li>
	<li>6 分間 3,000 x g で WAS と非導入の両方のサンプルを遠心します。</li>
	<li>1 mL の 1x PBS に再懸濁します、氷の脇します。</li>
	<li>ApoBD 分離、ステップ 2 または残りのアポトーシス サンプル 3 のいずれかに進みます。</li>
</ol>2 FACS による ApoBD 分離
<ol><li>6 分間 3,000 x g で全体のサンプルを遠心します。</li>
	<li>ペレットを中断させることがなく上澄みの大半を削除します。</li>
	<li>A5-FITC の 75 μ L と 1 x 10 の7セルあたり 2 μ L に PRO 3 の 1 の x A5 結合バッファーの 1 つの mL を含む染色液で再懸濁します。</li>
	<li>10 分間室温で暗闇の中でサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>1 x A5 結合バッファーの 1-2 の mL を追加し、余分な汚れを削除する 6 分間 3,000 x g でサンプルを遠心分離します。 注: 混合細胞または組織サンプルは、1 x A5 結合バッファーで細胞型-特異的マーカーの組み合わせを使用して、ステップを汚す抗体を実行し、6 3,000 × g で遠心分離前に氷上 20 分 (または製造元のプロトコルに従って) 孵化させなさい分。</li>
	<li>3 mL の FACS バッファーでサンプル ペレットを再懸濁します (1 × PBS、1 x A5 結合バッファー 10 %fsc、2 ミリメートルの EDTA) 1 x 10 の7セルあたり。</li>
	<li>丸底、ポリプロピレン (フローサイトメトリー) 管に 70 μ m セル ストレーナー フィルターし、暗闇の中、氷の上のサンプルを保ちます。</li>
	<li>FACS マシンをオンにし、100 μ m ノズルを使用して標準的なセットを実行、ドロップ遅延実行、安定したストリームを確保します。</li>
	<li>サンプルをロードし、集録速度を 〜 1000 イベント/秒に設定します。</li>
	<li>FSC、SSC、APC (に-プロ-3)、FITC (A5) 電圧を調整し、集団を明確に分離することができますように FACS プロット内のイベントの位置します。</li>
	<li>20,000 イベントを記録します。</li>
	<li>パート 4 のようにゲート戦略を設定します。</li>
	<li>並べ替えレイアウト目的の並べ替えの人口として最後の ApoBD ゲートを追加します。</li>
	<li>サンプルを集録を開始し、〜 250 μ L FACS バッファーを含む新しいチューブに 5,000-10,000 の ApoBDs を集めることによってテストの並べ替えを実行します。</li>
	<li>バック フラッシュ システムを実行し、並べ替えられた ApoBDs をロードします。</li>
	<li>取得し、テストの一種 ApoBDs を記録します。</li>
	<li>ApoBD 純度が FSC (y 軸) vs A5 を比較することにより 〜 99% をあることを確認 (x 軸イベント)。 注: が A5 染色再レーザー漂白のためのサンプルを分析する際にわずかに減らすことができます。</li>
	<li>高純度を達成すると、一度元のサンプルをロードし、ApoBDs の希望の番号を取得するまでの並べ替えを続行します。 注: 必要に応じて、デュアル並べ替え実行できます ApoCells と ApoBDs を同時に分離します。 注意: ソートは長い期間にわたって、お勧め 4 ° C でコレクションの管をインキュベート</li>
	<li>並べ替えが完了したら、ApoCells、非導入と WAS アポトーシスを検証し、並べ替え後の純度を確認後並べ替え並べ替え後 ApoBDs の小さな部分を収集します。 注: テストの並べ替え、並べ替え後の純度が大きく違いはありませんが、これはストリームの設定と安定性に基づいています。</li>
</ol>3 差動遠心分離による ApoBD 分離
<ol><li>10 分間 300 x g で残りのアポトーシスのサンプルを遠心します。</li>
	<li>細胞ペレットを中断することを避けるために 〜 500 μ L を残して上清を収集し、新しい 15 mL の円錐管に追加します。</li>
	<li>残り 500 μ L を削除し、2 mL の 1x PBS (これは 'ApoCell 濃縮率' を表しますで細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>3,000 gで 20 分間収集した上清を遠心します。</li>
	<li>ペレットを確認し、(小さな細胞の小胞エクソソーム機構の解明研究などを含む上清) 上清を慎重に取り外します。</li>
	<li>1 mL の 1x PBS (これは 'ApoBD 濃縮' 分数を表します) でペレットを再懸濁します</li>
	<li>各実行可能な ApoCell 濃縮 WAS 新しい丸底、ポリスチレン (フローサイトメトリー) チューブの ApoBD 濃縮試料 100 μ L を収集します。</li>
	<li>2 x A5 結合バッファー、1: 100、A5 FITC や縮尺に PRO 3 を含む汚れの 100 μ L を追加します。</li>
	<li>暗闇の中で 10 分間室温でインキュベートします。</li>
	<li>成功したアポトーシス誘導と ApoBD 濃縮率の純度検証上記ゲートの戦略を使用して、フローサイトメトリーによるサンプルを分析します。</li>
</ol>4. フローサイトメトリー戦略をゲート
<ol><li>プロットに-プロ-3 (y 軸) に対して FSC (x 軸) すべての他の非グリセリン イベント (に-プロ-3低/中級) から壊死細胞 (に-プロ-3高) を分離します。</li>
	<li>グリセリン以外のすべてのイベントを選択し、A5 から SSC をプロットします。ゲート 1 (P1)、SSC中級/高A5低/中間細胞の人口と人口 2 (P2)、他のすべてのイベントを含む 2 つの集団。</li>
	<li>P2 に-プロ-3 A5 に対してプロットし、すべて細胞の残骸を除外する A5中級/高イベントを選択します。</li>
	<li>A5 のすべての肯定的なイベントを選択し、A5 に対して FSC をプロットします。ApoCells (FSC中級/高) から ApoBDs (FSC低) を分離します。 注: ApoBDs FACS に基づくアプローチによる ApoBD 分離のため、ゲートお勧めします最後のステップを ApoBDs に-プロ-3 A5 に比較してすべてのイベントを選択して。これにより、最終的な並べ替えゲートが FSC/SSC パラメーターではなく蛍光を使用すること。</li>
	<li>生細胞分析の P1 を選択し、ゲートの 2 つの方法のいずれかを実行します。一般生菌分析 A5 に対して FSC をプロットし、従って残りの細胞の残骸の取り外し、FSC中級/高のすべてのセルを選択します。また、詳細な分析を実行可能なセルから分離できる A5-に-プロ-3 に対して FSC をプロットすることによって初期の ApoCells。FSC中級/高実行可能なセルを選択する-プロ-3低にプロ 3中間FSC中級/高A5-初期の ApoCells。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+clearance:+basic+biology+and+therapeutic+potential.">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).</li><li>Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+the+Dying:+Mechanisms+and+Functions.">Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions.</a> Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).</li><li>Tixeira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+morphologic+features+and+products+of+cell+disassembly+during+apoptosis.">Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis.</a> Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).</li><li>Sebbagh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-3-mediated+cleavage+of+ROCK+I+induces+MLC+phosphorylation+and+apoptotic+membrane+blebbing.">Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing.</a> Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).</li><li>Coleman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+blebbing+during+apoptosis+results+from+caspase-mediated+activation+of+ROCK+I.">Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I.</a> Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).</li><li>Atkin-Smith, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+generating+extracellular+vesicles+during+apoptosis+via+a+beads-on-a-string+membrane+structure.">A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure.</a> Nature Communications. 6, 7439 (2015).</li><li>Poon, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+link+between+an+antibiotic,+pannexin+channels+and+apoptosis.">Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis.</a> Nature. 507, 329-334 (2014).</li><li>Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+microtubules+in+apoptotic+chromatin+dynamics+and+cellular+fragmentation.">A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation.</a> Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).</li><li>Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+inhibits+the+Sonic+Hedgehog+signaling+pathway+and+triggers+apoptosis+in+medulloblastoma+cells.">Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells.</a> Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).</li><li>Sagulenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AIM2+and+NLRP3+inflammasomes+activate+both+apoptotic+and+pyroptotic+death+pathways+via+ASC.">AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC.</a> Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).</li><li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+RNA+profiles+in+subpopulations+of+extracellular+vesicles:+apoptotic+bodies,+microvesicles+and+exosomes.">Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Turiak, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+thymocyte-derived+microvesicles+and+apoptotic+bodies+in+BALB/c+mice.">Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice.</a> Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).</li><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V.">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).</li><li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+progression+of+cell+death+and+the+disassembly+of+dying+cells+by+flow+cytometry.">Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry.</a> Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).</li><li>Berda-Haddad, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+inflammation+of+endothelial+cell-derived+apoptotic+bodies+is+mediated+by+interleukin-1alpha.">Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).</li><li>Lleo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+proteomics:+identification+of+unique+protein+profiles+of+apoptotic+bodies+from+biliary+epithelial+cells.">Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells.</a> Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).</li><li>Atkin-Smith, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cell+type-specific+apoptotic+bodies+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting.</a> Scientific Reports. 7, 39846 (2017).</li><li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+contents+and+cell+origins+of+apoptotic+bodies+by+flow+cytometry.">Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry.</a> Scientific Reports. 7, 14444 (2017).</li></ol>

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1950 年代の初期、説明文からアポトーシスのフィールドは著しく、進んでいる、著名な研究領域になります。広範な努力および広範な関心にもかかわらず特定の ApoBDs の形成におけるアポトーシスの特定の側面がよく研究されていない適切な方法論の不足のため。特にアポトーシスの進行と同時に従来のフローサイトメトリー A5/PI 解析、ApoBD 分離の不純物を使用して ApoBD 形成を追跡の制限が含まれます。これらの方法論の欠点に対処する方法を最近開発しました。
我々 の新しい流れ cytometry ベース解析的アプローチでは、ApoBDs を検出する従来の分析方法を使用して多くの場合無視され、20を定量化することができます。さらに、この変更したがってアポトーシス進行20の良い描写をレンダリング、流れ cytometry 法、染色に-プロ-3、明らかに追加の A5 を使って-初期アポトーシスの段階です。従来、ApoBD 検出が重く頼った共焦点顕微鏡と組織などのイメージ ベースの手法が私たちフローサイトメトリー法 ApoBD 形成を量的にスループットの高いアプローチを提供します。一見複雑な手順は比較的簡単、市販試薬と基本的な流れの cytometer のみ必要です。論理の検出と ApoBDs の正確な定量化、さらにアポトーシス細胞の微小環境の知識を指示細胞のクリアランスと免疫学的反応。実際には、細胞小器官に固有の汚れに記載フローサイトメトリー法を結合することによって、我々 は最近 ApoBDs24細胞内容の不均質分布を報告しています。ApoBDs は異なるサブセットに分類でき、各 ApoBD のサブセットは、さまざまな機能を示すことがありますが示唆されました。
隔離技法には、最近開発された ApoBD 細胞小胞の分野の進歩にも貢献します。従来、ApoBD の分離に使用される差動遠心分離方法は下流機能アッセイに影響を与える可能性がありますより小さい細胞のかなりの量を含めることができます。ただし、純度 97% に ApoBDs を分離するの変更された差動遠心分離アプローチを使用できます。差動遠心分離で高純度を実現できるが、このような方法に複雑なサンプルから ApoBDs を分離することが適さない場合があります。対照的に、FACS 法は 99% 純度に ApoBDs を豊かにすることができ、粒子サイズ、粒度と粒子の密度だけに頼るのではなく、PtdSer の露出を含む ApoBDs のユニークな生物学的特性に基づいています。この方法では、同時に識別し、細胞型-特異的マーカー24を使用して別の細胞起源の ApoBDs を分離する可能性もあります。正確な ApoBD の単離とその後下流解析 ApoBDs 必要なの量に応じて 1-8 h を取ることができる長い FACS プロシージャ、にもかかわらず分子特性の直接帰属と ApoBDs の機能的役割を許可するでしょう。このような手法のため、ApoBD 分離アプローチに結合されているフローサイトメトリーなどの手法で (ここで説明した)、両方のアポトーシスの誘導と ApoBD 濃縮試料の純度検証が重要です。さらに、適切な FACS を設定は、低純度で不安定なストリームまたは不適切に実行されるドロップ遅延可能性があります、FACS に基づいたアプローチによる ApoBD 分離に不可欠です。
総称して、我々 は、アポトーシス誘導、ApoBD 検出および高純度 ApoBDs の分離を定量化するための最先端の方法論を概説しました。我々 のアプローチは、アポトーシス細胞分解プロセスを研究し、病気の設定で、このプロセスの役割を明らかに新しいツールを提供可能性があります。

アポトーシス、プログラム細胞死のよく研究フォームは、生理的恒常性を維持し、人体1内で潜在的有害な細胞を除去する必要があります。アポトーシスの誘導後、アポトーシス細胞 (ApoCells) は一連の形態学的変化を受けるし、ApoBDs と呼ばれる小さな膜小胞に分解できます。全体的にみて、このプロセスはアポトーシス細胞分解として知られている、形態2,3に基づいて 3 段階に分けることができます。ステップ 1 (膜ブレブ) は、鉱物4,5として知られている細胞の表面に風船のような構造の形成によって特徴付けられます。ステップ 2 (アポトーシス突起形成) には、apoptopodia、apoptopodia ビーズと微小管結合スパイク6,7,8などの長い膜突起部の形成が含まれています。最後に、ステップ 3 (ApoBD 編成) にはアポトーシス突起および/または ApoBDs6,9を生成する ApoCells の断片化が含まれています。前の調査結果は、アポトーシス細胞のクリアランスを支援し、細胞間のコミュニケーションを仲介することで ApoBDs の役割を示唆しています。たとえば、ApoBDs に、ApoCell の断片化が小さい '' 作品を一口食2,10,11を囲むことによって簡単に削除することができますを生成可能性があります提案します。さらに、ApoBDs は、DNA、RNA および蛋白質は、細胞間コミュニケーション12,13,14を容易にする周囲の細胞に取り引きされる可能性がありますなどの生体分子のシリーズを抱く可能性があります。これらのプロセスを調べる機能的、アポトーシス誘導および ApoBD の形成の検証 (i)、ApoBDs の分離 (ii) と (iii) ApoBD 純度の確認を含む 3 つの重要なパラメーターを確認する重要です。
以前は、アポトーシスと ApoBDs15,16,17,18の勉強をフローサイトメトリーと電子顕微鏡を含むメソッドの数が使用されています。しかし、ApoBD の検出と定量、しばしば困難または見落とさ。例えば、最も日常的に使用される流れのフローサイトメトリーによるアポトーシス アッセイ アネキシン V を採用 (A5、外部結合タンパク質 'を食べる-私' 信号ホスファチジルセリン (PtdSer)) 核酸染色 propidium ヨウ化 (PI)19。しかし、この普遍的な染色の組み合わせを使用して、解析では、のみ 3 種類のサンプルで (実行可能なセル、ApoCells と壊死細胞) 細胞のサブセットがあること想定しています。さらに、cytometry 流れの試金の apoptosis のため多くの研究者によって「ゴールド スタンダード」として考慮される、しかし、以降のデータ解析はしばしば FSC/SSC中間高イベントの選択最初のゲーティング ステップを通じて ApoBDs を除外します。したがって、A5 とする PRO 3 を使用して新規流れ cytometry 試金を最近開発した、7、20チャンネルは別の核酸染色カスパーゼ 3/7 活性化パネキシン 1 (PANX1) によって選択的に取ることができます。カスパーゼ 3 による PANX1 活性化はアポトーシスの早い段階での PtdSer 露出を前に、ようにプロ 3 は特異的アポトーシスとネクローシス細胞を汚れ。このアプローチ戦略をゲートの小説と組み合わせてさらに、データ分析中に取得しているすべてのイベントが含まれています、6 セル/パーティクルのサブセットの識別結果としてを含む: (i) 実行可能なセル (FSC/SSC中級/高、A5低にプロ 3低)、(ii) A5-初期の ApoCells (FSC/SSC中級/高A5低、中間にプロ 3)、(iii) A5+ ApoCells (FSC/SSC中級/高、A5高にプロ 3 の中間)、(iv) 壊死細胞または後期 ApoCells (FSC/SSC中級/高A5高にプロ 3高)、(v) ApoBDs (FSC/SSC低、A5中間に-プロ-3低中間/)、および (vi) 破片 (FSC/SSC低A5低、低にプロ 3)20。我々 のアプローチでは、すべてのセル/パーティクルのサブセットと、もっと重要なは、細胞および破片20からの ApoBDs の分離分析の重要性を強調しています。したがって、このアプローチは、アポトーシスおよび ApoBD の形成の誘導を同時に検証する効率的な方法を示します。
伝統的に、ApoBDs は、さまざまな細胞や密度に基づく他の細胞小胞から ApoBDs を分離できるという差動遠心分離アプローチを通じて分離されています。しかし、このようなの遠心分離法はしばしば低 ApoBD 純度、定量ステップ サンプル純度および/または細胞型特異 ApoBDs17,21,22を分離することができないことを確認するための不足によって制限されます。そこで、最近 2 つのアプローチ、FACS に基づいた新しい差動遠心分離に基づくアプローチをアポトーシスとサンプルの純度のための23の誘導を検証する私たち以前に確立された流れフローサイトメトリー法と結合することができますを開発しました。FACS 手法による ApoBD 分離を最大 99% 純度 ApoBDs を豊かにすることができます、さまざまな混合細胞集団、組織サンプルと体液23から ApoBDs を分離する細胞型特異抗体と組み合わせて利用できます。さらに、我々 の改訂された差動遠心分離アプローチを示しますに ApoBDs を分離するための効率的な方法 > 90% 純度23。
本稿で我々 はアポトーシス誘導を検証し検出し、定量化の ApoBD 形成私たちの実験の詳細について説明します。FACS ベースおよび差動遠心分離ベースのメソッドを使用して ApoBD 分離ワークフローはまた詳述し、比較しました。代表的なデータ記述の方法論では、将来の ApoBD 研究の効果的な最先端のツールをデモンストレーションします。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1309px;" width="1309">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202)</td>
			<td style="width:149px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:513px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:149px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Penicillin-streptomycin mixture</td>
			<td style="width:149px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">FSC</td>
			<td style="width:149px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x PBS</td>
			<td style="width:149px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Annexin V FITC</td>
			<td style="width:149px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TO-PRO-3 iodide</td>
			<td style="width:149px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">T3605</td>
			<td>TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x Annexin V binding buffer</td>
			<td style="width:149px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">556454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">1001710526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Centrifuge tube (15 mL)</td>
			<td style="width:149px;">Cellstar</td>
			<td style="width:119px;">188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td style="width:149px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Tissue culture incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td style="width:149px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:149px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection</td>
			<td style="width:149px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection</td>
			<td style="width:149px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">FACS Diva 6.1.1 software</td>
			<td style="width:149px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:528px;">FlowJo 8.8.6 software</td>
			<td style="width:149px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;UV Stratalinker 1800</td>
			<td style="width:149px;">Stratagene</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and isolation of apoptotic bodies to high purity

アポトーシス小体 (ApoBDs) 機構の解明、エクソソーム細胞小胞族最大の型の一つである ApoBDs の主要メンバーであります。ApoBDs が細胞除去として人身売買生体分子を介して細胞間のコミュニケーションを助けることができることが提案されています。使用の識別と ApoBDs の分離従来多くの場合、正確な定量化と低いサンプル純度の欠如によって制限されます。ここでは、アポトーシスの誘導の確認、ApoBD 形成を検証および ApoBDs を高純度に分離するワークフローについて述べる。またアウトライン、蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えと ApoBDs を分離に基づく差動遠心分離アプローチを比較します。使用して孤立した ApoBDs の純度を確認、さらに、以前の流れ cytometry による染色と分析法を確立します。まとめると、記述されているアプローチを使用して THP 1 単球のアポトーシスとアポトーシス細胞の分解は誘発され、検証と THP 1 球から生成された ApoBD は 97-99% の純度に分離されました。

ここで説明する手順を使用して、THP 1 単球のアポトーシスが誘導されたと ApoBDs が検出および FACS ベースまたは差動遠心分離アプローチ (図 1) のどちらか経由で分離されました。まず、紫外線照射によるアポトーシス誘導し、細胞アポトーシスの形態、ブレブ、アポトーシス膜突出部形成 ApoBDs6の生成などを展示したとき 2-3 時間後採取しました。プロ 3 と A5 ベースのフロー フローサイトメトリー法は、生菌、壊死細胞、初期 ApoCells、ApoCells、ApoBDs および残骸 (図 2) を分離することによって ApoBD の形成と単球のアポトーシスの誘導を確認する使用されました。フローサイトメトリー解析一緒に取られて、紫外線治療が ~ 20% の結果を示される ApoCells (図 3)。
THP 1 球 ApoBDs 当時の 2 つのアプローチを介して WAS から分離されました。まず、サンプルは高純度のみ 1 つの遠心分離のステップが汚れる前に全体のアポトーシス サンプルをペレット必要 FACS に基づくのために準備された、FACS。このメソッドは、高いサンプル純度が (たとえば、qPCR 分析) 必要な大幅場合、ApoBDs の特定の数が、必要な場合または複雑なサンプルから型固有 ApoBDs ときセルの取得機能の試金の適切なです。この方法論を使用して、ApoBDs ~ 99% 純度 (図 4) に隔離されました。
次に、THP 1 球 ApoBDs も分離された 2 段階、差動遠心分離アプローチを介して。最初のステップには、実行可能なセル、ApoCells と壊死細胞の分離が含まれています。2 番目のステップはより大きい ApoBDs の機構の解明など小さな細胞小胞からの分離、エクソソームは、g. フローサイトメトリー x 3,000 でペレットことができないがアポトーシス誘導と ApoBD サンプル純度確認を行ったと~ 97% を含む ApoBD 濃縮サンプルを示した ApoBDs (図 4)。これは ApoBD を比較的高純度に分離するための迅速かつ効果的な手法を提案する、単一の細胞型を含む試料から ApoBDs を浄化する場合に適しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58317/58317fig1.jpg"> 図 1.どちらか FACS ベースまたは差動遠心分離アプローチによる ApoBD 分離の模式図.<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58317/58317fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58317/58317fig2.jpg"> 図 2.フローサイトメトリー戦略をゲーティングします。6 セル/パーティクルのサブセット (実行可能なセル、A5 を含む-初期 ApoCells、A5+ ApoCells、壊死細胞、ApoBDs および残骸) が識別され、FACS に基づく分離の ApoBD を選択するために使用します。(a) 膜スキンド細胞は非スキンド イベントから分離されます。(b) A5低中級SSC低高細胞は A5低高イベントから分離されます。(b.i) にプロ 3中間A5 から深さ方向分析に POR 3低実行可能なセルを分けることができますの-初期の ApoCells。(アブロ) または、単に ApoBD の純度を計算するとき、実行可能なセルを FSC低イベントから分けることができます。(c) A5低破片が除外されます。(d) FSC中級/高ApoCells は、FSC低ApoBDs から分離されます。(e) すべて A5-PRO 3中級/高ApoBDs ソートされています。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58317/58317fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58317/58317fig3.jpg"> 図 3.THP 1 単球のアポトーシスの検証します。実行可能なセル、A5 のレベルを決定する未処理または UV 照射の THP 1 球の流れフローサイトメトリー解析を行った-初期 ApoCells、A5+ ApoCells と壊死細胞。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58317/58317fig4.jpg"> 図 4.THP 1 の精製モノサイト ApoBDs.分離 THP 1 単球由来 ApoBDs いずれか FACS ベースまたは差動遠心分離のベースのアプローチでは、経由で実行可能な細胞、ApoCells と壊死細胞から ApoBDs の濃縮を示すに流れフローサイトメトリー解析を行った。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58317/58317fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity

検出、定量化およびアポトーシス サンプルから高純度にアポトーシス小体を分離する流れの cytometry または差動遠心分離を使用してワークフローを開発しました。

高純度にアポトーシス小体の検出と分離

Apoptotic bodies (ApoBDs), microvesicles and exosomes are the key members of the extracellular vesicle family, with ApoBDs being one of the largest type. ...

detection-and-isolation-of-apoptotic-bodies-to-high-purity

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.5K ビュー.  La Trobe University. 検出、定量化およびアポトーシス サンプルから高純度にアポトーシス小体を分離する流れの cytometry または差動遠心分離を使用してワークフローを開発しました。

ビデオ: Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most interestingly, sRNAs are also found outside of cells and are stably present in all biological fluids. As such, extracellular sRNAs represent a novel class of disease biomarkers and are likely involved in cell signaling and intercellular communication networks. To assess their potential as biomarkers, sRNAs can be quantified in plasma, urine, and other fluids. Nevertheless, to fully understand the impact of extracellular sRNAs as endocrine signals, it is important to determine which carriers are transporting and protecting them in biological fluids (e.g., plasma), which cells and tissues contribute to extracellular sRNA pools, and cells and tissues capable of accepting and utilizing extracellular sRNA. To accomplish these goals, it is critical to isolate highly pure populations of extracellular carriers for sRNA profiling and quantification. We have previously demonstrated that lipoproteins, particularly high-density lipoproteins (HDL), transport functional microRNAs (miRNA) between cells and HDL-miRNAs are significantly altered in disease. Here, we detail a new protocol that utilizes tandem HDL isolation with density-gradient ultracentrifugation (DGUC) and fast-protein-liquid chromatography (FPLC) to obtain highly pure HDL for downstream profiling and quantification of all sRNAs, including miRNAs, using both high-throughput sequencing and real-time PCR approaches. This protocol will be a valuable resource for the investigation of sRNAs on HDL.

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

非コード小型RNA定量化のための高密度リポタンパク質の単離

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

生化学

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high purity material. Here we present a tailored HPLC purification protocol to produce high-purity amyloid beta 42 (A&#946;42) and amyloid beta 40 (A&#946;40) peptides. We have found that the combination of commercially available hydrophobic poly(styrene/divinylbenzene) stationary phase, polymer laboratory reverse phase - styrenedivinylbenzene (PLRP-S) under high pH conditions, enables the attainment of high purity (&gt;95%) A&#946;42 in a single chromatographic run. The purification is highly reproducible and can be amended to both semi-preparative and analytical conditions depending upon the amount of material wished to be purified. The protocol can also be applied to the A&#946;40 peptide with identical success and without the need to alter the method.

Herein we report a tailored HPLC purification protocol that yields high-purity amyloid beta 42 (A&#946;42) and amyloid beta 40 (A&#946;40) peptides, capable of oligomer formation. Amyloid beta is a highly aggregation prone, hydrophobic peptide implicated in Alzheimer&#39;s disease. The amyloidogenic nature of the peptide makes its purification a challenge.

オリゴマー形成可能な高純度のアミロイドベータ42とアミロイドベータ40ペプチドを、利回りテーラードHPLC精製プロトコル

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, consequently, cardiovascular disease. Although PCSK9 proteolysis is required for its full hypercholesterolemic effect, the evaluation of its proteolytic function is challenging: PCSK9 is only known to cleave itself, undergoes only a single turnover, and after proteolysis, retains its substrate in its active site as an auto-inhibitor. The methods presented here describe an assay which overcomes these challenges. The assay focuses on intermolecular proteolysis in a cell-based context and links successful cleavage to the secreted luciferase activity, which can be easily read out in the conditioned medium. Via sequential steps of mutagenesis, transient transfection, and a luciferase readout, the assay can probe PCSK9 proteolysis under conditions of either genetic or molecular perturbation in a high-throughput manner. This system is well suited for both the biochemical evaluation of clinically discovered missense single-nucleotide polymorphisms (SNPs), as well as for the screening of small-molecule inhibitors of PCSK9 proteolysis.

This protocol presents a method to evaluate the proteolytic activity of an intrinsically low-activity, single turnover protease in a cellular context. Specifically, this method is applied to evaluate the proteolytic activity of PCSK9, a key driver of lipid metabolism whose proteolytic activity is required for its ultimate hypercholesterolemic function.

シングル売り上げ高プロテアーゼ PCSK9 のタンパク質分解を評価する高スループット ルシフェラーゼ アッセイ

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling cascades during homeostasis and disease, and as such represent prime therapeutic targets. Despite their relevance, these interaction networks remain significantly underrepresented in current databases; therefore, most extracellular proteins have no documented binding partner. This discrepancy is primarily due to the challenges associated with the study of the extracellular proteins, including expression of functional proteins, and the weak, low affinity, protein interactions often established between cell surface receptors. The purpose of this method is to describe the printing of a library of extracellular proteins in a microarray format for screening of protein-protein interactions. To enable detection of weak interactions, a method based on multimerization of the query protein under study is described. Coupled to this microbead-based multimerization approach for increased multivalency, the protein microarray allows robust detection of transient protein-protein interactions in high throughput. This method offers a rapid and low sample consuming-approach for identification of new interactions applicable to any extracellular protein. Protein microarray printing and screening protocol are described. This technology will be useful for investigators seeking a robust method for discovery of protein interactions in the extracellular space.

Here, we present a protocol to screen extracellular protein microarrays for identification of novel receptor-ligand interactions in high throughput. We also describe a method to enhance detection of transient protein-protein interactions by using protein-microbead complexes.

低親和性受容体-リガンド相互作用のハイスループット検出の細胞外タンパク質マイクロ アレイ技術

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR and sensitivity-enhanced DNP experiments. The sample processing procedure of plant biomass is also detailed. This method allows the measurement of a series of 1D and 2D 13C-13C/15N correlations spectra, which enables high-resolution structural elucidation of complex biomaterials in their native state, with minimal perturbation. The isotope-labeling can be examined by quantifying the intensity in 1D spectra and the polarization transfer efficiency in 2D correlation spectra. The success of dynamic nuclear polarization (DNP) sample preparation can be evaluated by the sensitivity enhancement factor. Further experiments examining the structural aspects of the polysaccharides and proteins will lead to a model of the three-dimensional architecture. These methods can be modified and adapted to investigate a wide range of carbohydrate-rich materials, including the natural cell walls of plants, fungi, algae and bacteria, as well as synthesized or designed carbohydrate polymers and their complex with other molecules.

A protocol for preparing 13C,15N-labeled fungal and plant samples for multidimensional solid-state NMR spectroscopy and dynamic nuclear polarization (DNP) investigations is presented.

真菌の準備、動的核偏極固体 NMR を用いた構造解明のための植物素材

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form loose callus on Murashige and Skoog (MS) basal media with the plant hormones 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D, 1.0 mg L-1) and kinetin (KT, 0.1 mg L-1). Callus formed after 3 or 4 rounds of subculturing, each lasting 28 days. Loose callus (about 3 g) was then inoculated into B5 liquid media containing the same plant hormones and was cultured in a shaking incubator (120 rpm) in the dark at 25 &#177; 1 &#176;C. After 3&#8722;4 subcultures, a cell suspension derived from tea leaf was established at a subculture ratio ranging between 1:1 and 1:2 (suspension mother liquid: fresh medium). Using this platform, six insecticides (5 &#181;g mL-1 each thiamethoxam, imidacloprid, acetamiprid, imidaclothiz, dimethoate, and omethoate) were added into the tea leaf-derived cell suspension culture. The metabolism of the insecticides was tracked using liquid chromatography and gas chromatography. To validate the usefulness of the tea cell suspension culture, the metabolites of thiamethoxan and dimethoate present in treated cell cultures and intact plants were compared using mass spectrometry. In treated tea cell cultures, seven metabolites of thiamethoxan and two metabolites of dimethoate were found, while in treated intact plants, only two metabolites of thiamethoxam and one of dimethoate were found. The use of a cell suspension simplified the metabolic analysis compared to the use of intact tea plants, especially for a difficult matrix such as tea.

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

This work presents a protocol for establishing a cell suspension culture derived from tea (Camellia sinensis L.) leaves that can be used to study the metabolism of external compounds that can be taken up by the whole plant, such as insecticides.

茶由来の新たに確立された細胞懸濁液培養における6種の全身殺虫剤の代謝に関する研究(カメリアシネンシスL.葉

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the homeostasis of adult tissues. Interestingly, oxidative stress can alter these processes, thus contributing to the pathophysiology of diseases such as metastatic cancer. Therefore, understanding the mechanism(s) of how cells attach and spread on the ECM during perturbations in redox status can provide insight into normal and disease states. Described below is a step-wise protocol that utilizes an immunofluorescence-based assay to specifically quantify cell adhesion and spreading of immortalized fibroblast cells on fibronectin (FN) in vitro. Briefly, anchorage-dependent cells are held in suspension and exposed to the ATM kinase inhibitor Ku55933 to induce oxidative stress. Cells are then plated on FN-coated surface and allowed to attach for predetermined periods of time. Cells that remain attached are fixed and labeled with fluorescence-based antibody markers of adhesion (e.g., paxillin) and spreading (e.g., F-actin). Data acquisition and analysis are performed using commonly available laboratory equipment, including an epifluorescence microscope and freely available Fiji software. This procedure is highly versatile and can be modified for a variety of cell lines, ECM proteins, or inhibitors in order to examine a broad range of biological questions.

This method is useful for quantifying the early dynamics of cellular adhesion and spreading of anchorage-dependent cells onto the fibronectin. Furthermore, this assay can be used to investigate the effects of altered redox homeostasis on cell spreading and/or cell adhesion-related intracellular signaling pathways.

酸化ストレス中のフィブロネクチン上皮細胞の細胞接着と広がりのダイナミクスを調べる

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they contain various parental cell-derived biomolecules such as DNA, mRNA, miRNA, proteins, and lipids, their enrichment and isolation are critical steps for their exploitation as potential biomarkers for clinical applications. However, conventional isolation methods (e.g., ultracentrifugation) cause significant loss and damage to microvesicles and exosomes. These methods also require multiple repetitive steps &#160;of ultracentrifugation, loading, and wasting of reagents. This article describes a detailed method to fabricate an origami-paper-based device (Exo-PAD) designed for the effective enrichment and isolation of microvesicles and exosomes in a simple manner. The unique design of the Exo-PAD, consisting of accordion-like multifolded layers with convergent sample areas, is integrated with the ion concentration polarization technique, thereby enabling fivefold enrichment of the microvesicles and exosomes on specific layers. In addition, the enriched microvesicles and exosomes are isolated by simply unfolding the Exo-PAD.

Presented is a protocol to fabricate a paper-based device for the effective enrichment and isolation of microvesicles and exosomes.

マイクロベシクルとエキソソームのペーパーベースの事前濃縮と分離

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without labeling other than deuterium. In particular, neutron backscattering spectroscopy records the scattering signals at multiple scattering angles simultaneously and is well suited to study the dynamics of biological systems on the ps-ns timescale. By employing D2O-and possibly deuterated buffer components-the method allows monitoring of both center-of-mass diffusion and backbone and side-chain motions (internal dynamics) of proteins in liquid state.
Additionally, hydration water dynamics can be studied by employing powders of perdeuterated proteins hydrated with H2O. This paper presents the workflow employed on the instrument IN16B at the Institut Laue-Langevin (ILL) to investigate protein and hydration water dynamics. The preparation of solution samples and hydrated protein powder samples using vapor exchange is explained. The data analysis procedure for both protein and hydration water dynamics is described for different types of datasets (quasielastic spectra or fixed-window scans) that can be obtained on a neutron backscattering spectrometer.
The method is illustrated with two studies involving amyloid proteins. The aggregation of lysozyme into &#181;m sized spherical aggregates-denoted particulates-is shown to occur in a one-step process on the space and time range probed on IN16B, while the internal dynamics remains unchanged. Further, the dynamics of hydration water of tau was studied on hydrated powders of perdeuterated protein. It is shown that translational motions of water are activated upon the formation of amyloid fibers. Finally, critical steps in the protocol are discussed as to how neutron scattering is positioned regarding the study of dynamics with respect to other experimental biophysical methods.

Neutron backscattering spectroscopy offers a nondestructive and label-free access to the ps-ns dynamics of proteins and their hydration water. The workflow is presented with two studies on amyloid proteins: on the time-resolved dynamics of lysozyme during aggregation and on the hydration water dynamics of tau upon fiber formation.

タンパク質と水和水のピコ秒ナノ秒ダイナミクスを研究するための高分解能中性子分光法

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the physiological and pathological state of a cell. However, there is no standard method for sEV isolation, which prevents downstream biomarker identification and drug intervention studies. In this article, we provide a detailed protocol for the isolation and purification of 50-200 nm sEV by a flow cell sorter. For this, a 50 &#181;m nozzle and 80 psi sheath fluid pressure were selected to obtain a good sorting rate and stable side stream. Standard sized polystyrene microspheres were used to locate populations of 100, 200, and 300 nm particles. With additional optimization of the voltage, gain, and forward scatter (FSC) triggering threshold, the sEV signal could be separated from the background noise. These optimizations provide a panel of critical sort settings that enables one to obtain a representative population of sEV using FSC vs. side scatter (SSC) only. The flow cytometry-based isolation method not only allows for high-throughput analysis but also allows for synchronous classification or proteome analysis of sEV based on the biomarker expression, opening numerous downstream research applications.

This protocol provides a rapid and size-specific isolation method for small extracellular vesicles by optimizing the size of the air spray nozzle, sheath fluid pressure, sample flow pressure, voltage, gain, and triggering threshold parameters.

低分子細胞外小胞のハイスループット単離および精製のためのフローサイトメトリーソーティングパラメータの最適化(英語)

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...