著者は彼らの技術支援のためにアジレントに感謝したいと思います。ケイト・マーカムとラファエル・パロミノは、Aβペプチドの合成及び精製におけるそれらの初期支援のために入金され、博士Hsiau偉リーは、原稿の図1を調製する際に彼の助けのために感謝しています。

Aβ40またはAβ42ペプチドの1分取HPLC精製<ol><li> HPLC精製のための以下の緩衝液を準備します。 <ol><li>超純水1000mlにNH 4 OH（28％溶液）の1.3ミリリットルを添加することにより、緩衝液A（20mMのNH 4 OH）を調製します。 </li><li> HPLCグレードのアセトニトリルを800mLの超純水200mlの溶液に、NH 4 OH（28％溶液）の1.3ミリリットルを添加することにより緩衝液B（20mMのNH 4 OHと80％のアセトニトリル）を準備します。 </li><li>超純水100mlにNH 4 OH（28％溶液）の100μLを添加することにより、試料の溶解緩衝液（0.1％NH 4 OH）を調製します。 </li></ol></li><li> 図1に示すように、セットアップHPLC機器。 <ol><li>緩衝液Aとポリマーチューブを使用して、HPLCポンプのインレットにBをバッファ含まれている溶媒ボトルを取り付けます。ワンピースフィッティングを用いたHPLCポンプにポリマーチューブを取り付けます。のポリマーチュービングていることを確認してください各バッファは、機器の適切な入口弁に取り付けられています。脱気装置とHPLCポンプを取り付けます。 </li><li>カップル300Å8μmの25ミリメートルх300ミリメートル取カラムの入口とHPLCポンプは、ポリマーチューブを使用して（ 図1（b）は 、左端の列、物質一覧を参照してください）。 <ol><li> 1ピース手締めフィッティングで取カラムにポリマーチューブを取り付けます。ポリマーカラムは正しい方法で配向していることを確認してください。 注：分取カラムの固定相は、ポリ（スチレン - ジビニルベンゼン）粒子から構成されています。ポリマーカラムの正しい向きは、単一​​方向矢印とアウターケーシングにマークされています。 </li></ol></li><li>ポリマーチューブを使用して、二波長検出器にカラムの出口を接続し、214 nmおよび280 nmの波長検出器を設定します。 <ol><li>のセットアップ機器メソッドオプションで検出波長パラメータを変更することにより、波長を変化させます内蔵のHPLCソフトウェア。 </li></ol></li><li> 1ピース手締めフィッティングと波長検出器の入口にポリマーチューブを取り付けます。波長検出器の出力バルブにポリマーチューブを取り付けます。 1ピース手締めフィッティングを用いたHPLC検出器の出口弁にポリマーチューブを取り付けます。これは、試料採取チューブです。 注：Aβペプチドに強い発色団の欠如は、214nmがピーク収集のための主要な紫外線（UV）波長として使用することを指示します。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55482/55482fig1.jpg" /> 図1：アミロイドβペプチドの精製に使用したHPLC機器の実験設定。 （A）脱気装置と、214および280nmに設定された可変波長検出器を取り付けた四HPLCポンプ。アミロイドβペプチドの精製のために使用される（B）HPLCカラムから左から右へ、25×300ミリメートル2分取カラム、7.5×300ミリメートル2セミ分取カラムおよび4.6×250ミリメートル2分析カラム; （C）HPLC分析のために使用される20μLステンレススチール注入ループとマニュアルインジェクタ。 （D）分取し、セミ分取精製のために使用される10mLのステンレススチール注入ループとマニュアルインジェクタ。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55482/55482fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="3"><li> （HPLCソフトウェアに組み込まれたセットアップ装置メソッドオプションで）溶剤時刻表のパラメータを変更することにより、精製方法を入力して、表1に示すように、精製方法を実行するためのHPLCソフトウェアをプログラムします。 HPLCソフトの「上」ボタンをクリックすることにより、HPLCポンプをオンにします。 注：ポンプは、バッファAの開始比を供給を開始し、分取を通じてBをバッファリングしますarativeカラムおよびHPLC機器。 <ol><li> 30分が完全に平衡化するためのシステムのままにしておきます。 </li></ol></li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 時間/分 </td><td> バッファーAの％ </td><td> 緩衝液B Bの％ </td><td> 流量D / mLの分-1 </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 80 </td><td> 20 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 45 </td><td> 75.5 </td><td> 24.5 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 45.01 </td><td> 80 </td><td> 20 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 52.01 </td><td> 80 </td><td> 20 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 52.02 </td><td> 73 </td><td> 27 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 85 </td><td> 73 </td><td> 27 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 92 </td><td> 5 </td><td> 95 C </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> &lt;強い&gt;表1：25×300ミリメートルのポリマーカラムを用いてAβ42とAβ40ペプチドの精製のための時刻表。緩衝液A - 20 mMのNH 4 OHとH 2 O; 20mMのNH 4 OHでBが80％のMeCN / 20％H 2 O; cが前のサンプルの次の注射にカラムを洗浄するために15分間走りました。 dは HPLCの計装に6 ml /分の流速を実行するために、圧力限度は200バールに低減する必要があります。 <ol start="4"><li> Aβペプチド試料の精製 注：粗ペプチドは、自動固相ペプチド合成によって得られました。 10 <ol><li>サンプル溶解バッファー4mLの粗Aβペプチドの3ミリグラムを溶解します。室温で30〜60秒間および溶解を助けるために、40キロヘルツの周波数でサンプルを超音波処理。 </li><li> 16ゲージを取り付けた5mLのプラスチック注射器を用いて、HPLCカラム上にサンプル全体を注入ステンレス製の針。サブステップ1.3に概説されているような精製方法を実行します。 注：システムは、10mLのステンレススチール注入ループ（ 図1D）を装着したマニュアルインジェクタの使用を介して行われるべき試料注入を可能にします。希望のAβペプチドは、シャープな解像ピーク（ 図2C）として72と74分の間に溶出します。 </li><li> 50 mLコニカル遠心管に試料を採取します。収集した溶離液を直接注入質量分析を通じてAβピークの身元を確認してください。 11ストア-20℃で最大12時間のための溶離液。 注：12時間よりも長い期間のためのソリューションのストレージが原因で、ペプチドの酸化のための潜在的にはお勧めできません。 </li><li>液体窒素凍結乾燥中のAβペプチドの収集アリコート/アリコートを凍結フラッシュによって精製されたペプチドを分離します。凍結乾燥して-60℃の温度での試料とPRESを凍結乾燥を行います24時間の期間のための20ミリトールのを確認してください。 </li><li> Aβペプチドの純度を決定するために、下記のように分析用HPLCプロトコルを実行します。 6ヶ月までの期間、-20℃で、それらの凍結乾燥形態で保管ペプチド。 </li></ol></li></ol>精製されたAβタンパク質の2分析HPLC分析<ol><li>サブセクション1.1に概説されるようにHPLCバッファを準備します。上記のプロトコルの。 </li><li>セットアップ手順1.2.1あたり4.6×250ミリメートル分析カラム（ 図1B、右端の列）とに取り付けられた20μLのステンレススチール注入ループ（ 図1C）とマニュアルインジェクタと、図1に示したと同様に分析用HPLC楽器。 </li><li>ステップ1.3と同様の手順に従って、 表2に示すような分析方法を実行するためのHPLCソフトウェアをプログラムします。 </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 時間/分</td><td> バッファーAの％ </td><td> 緩衝液B Bの％ </td><td> レート/ mLの分流量-1 </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 95 </td><td> 5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30 </td><td> 50 </td><td> 50 </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> 表2：AβペプチドのHPLC純度分析のための時刻表。緩衝液A - 20 mMのNH 4 OHとH 2 O; 20mMのNH 4 OHでBが80％のMeCN / 20％H 2 O。 <ol start="4"><li> Aβペプチドの純度分析 <ol><li>サンプル緩衝液中のペプチドの溶解により精製ペプチドを1mg / mLの溶液を調製します。 注：バッファのレシピは、サブセクション1.1に記載されています。タンパク質濃度は、280nm（280nmの ）でのタンパク質の吸収を測定することによって決定されます。 12メートル<html>濃度を決定するために使用されるOLAR吸光係数（ε）は、ε= 1,490 DM 3モル-1 cm -1 です 。 13 </li><li> HPLCカラムには1mg / mLの（222μM）溶液20μLを注入し、ステップ2.3で設定した分析法を実行します。 注：分析のために使用されていない残りの溶液を液体窒素中で急速冷凍し、Aβペプチドを回収するために凍結乾燥することができます。凍結乾燥の詳細は、サブセクション1.4.4に記載されています。 Aβペプチドは、16及び18分（ 図2D）との間の分析カラムから溶出します。 Aβペプチドの純度を決定するためのHPLC機器に付随する組み込みの統合解析ソフトウェアを使用してください。純度は、スペクトルの個々のピークの各々を積分し、ペプチドピーク率面積を計算することによって決定されます。一般的に、&gt; 95％の精製が確認されるべきです。 </li></ol></li></ol><img alt="&lt;/ htmlの">「図2」SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 55482 / 55482fig2.jpg&quot; /&gt; 図2：Aβ42の代表的HPLCトレース。 （A）従来のC 4シリカ精製条件：緩衝液A：H 2 O 0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）で、緩衝液B：0.1％TFAとMeCNの（アセトニトリル）、勾配：20〜27％緩衝液B 40分、続いてアイソクラティック27％の緩衝液Bにより、 （B）調製精製25×300 mm 2のポリマーカラム、条件を用いて：緩衝液A：H 2 O 20でmMのNH 4 OH、バッファーB：20mMのNH 4 OH、勾配80％のMeCN / 20％H 2 Oを：アイソクラチック27％緩衝液Bに続いて70分間にわたって20〜27％緩衝液B; 25×300 mm 2のポリマーカラムを用いて分取精製を最適化（C）は 、条件は、サブセクションプロトコル記述テキストの1.3に位置し、表1に記載されています。 （D）分析用HPLCは、4.6×250ミリメートル2ポリマーカラムは、condを使用して、itions：緩衝液A：H 2 O 20 mMのNH 4 OH、緩衝液Bで30分間にわたって20mMのNH 4 OH、グラジエント5〜50％緩衝液Bで80％のMeCN / 20％H 2 O。部品A、BおよびCについてはAβ42に対応するピークは、アスタリスクでマークされています。パートD.質量分析に示すように、Cは、&gt; 95％の純度を明らかに部分的にマークされたAβ42のピークの回収は、Aβ42のピークの同一性を決定するために使用しました。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55482/55482fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Mass Spectrom. 13 (23), 2348-2351 (1999).</li><li>Layne, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+turbidimetric+methods+for+measuring+proteins.">Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins.</a> Met. Enzymology. 3, 447-455 (1957).</li><li>Ioannou, J. C., Donald, A. M., Tromp, R. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+&#946;-protein+(A&#946;)+assembly:+A&#946;40+and+A&#946;42+oligomerize+through+distinct+pathways.">Amyloid &#946;-protein (A&#946;) assembly: A&#946;40 and A&#946;42 oligomerize through distinct pathways.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (1), 330-335 (2003).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

AβペプチドのHPLC精製は、精製に用いられる固定相とペプチドを溶出するために選択された移動相の両方の選択に大きく依存します。集約のためのペプチドおよび高傾向の低い等電点は、疎水性タンパク質の分離のための伝統的なクロマトグラフィー条件（C4または酸性モバイル溶離液と相まってC8固定相）をレンダリング挑戦、Aβペプチドは長時間の幅広いとして溶出すると、非解決ピーク（ 図2A）。 この問題は、PLRP-S固定相を回避するために、高いpHにおいて化学的に安定では、Aβペプチド（ 図2Bおよび2C）の精製のために有効であることが見出されました。高pH移動相の使用は、凝集の程度を最小化し、最適化されたとき、シャープ、十分に分解されたピークを生じました。最適化されたプロトコルでは、バッファBの割合が急速であったswitc52分の時点で、結果として27％と20％からHED、明確に定義されたAβのピーク（ 図2C）を生じました。この最適化されたプロトコルは、バッファB濃度の初期20 24.5％の増加の間にカラムから溶出された疎水性不純物のすべてに依存しています。不純物がAβペプチドと同様の疎水性である検出された場合、次にHPLCプロトコルのさらなる最適化を保証することができます。最適化された方法は、合成されたAβの個々のバッチの中で非常に再現し、最適化された手順（ 図3）を変更することなくペプチドの両方の40と42の変異体を精製することができました。両方のペプチドについて、分析HPLCにより決定される純度は95％以上であることが見出されました。 Aβペプチドの凝集性向を変更する微量不純物の報告を考えると、直交生物物理学的特徴付けを確認するために使用することが賢明です精製されたペプチドは、オリゴマー化を受けることが可能です。使用して、以前に我々はPICUPを実行することを選択したプロトコルを報告しました。 14は 、精製されたタンパク質の15 PICUP分析は、Aβ40ペプチドおよびAβ42ペプチドに関連した七量分布を通じてモノマーのためのヘキサマー人口分布を通じて特性モノマーを示しています。 10これらの結果は、集計することが可能であるAβタンパク質にPLRP-S固定相と高pHモバイル溶離液の結果を用いて、Aβペプチドの精製を確認します。 報告された精製手順は、単一のクロマトグラフィーランでのAβペプチドの3ミリグラムまで精製することができるように設計されています。この手順のために、6 ml /分でのHPLC機器の流量を設定することが重要です。 HPLCポンプの低い流量を使用する場合、HPLCの実行時間は、これに対応するために拡張されるべきです。 CONVERSELY、より高い流量の使用は、HPLCの実行時間の短縮を保証することができます。ただし、実行時間の短縮は、他のピークとのAβピークの共溶出が生じるため、収集したAβペプチドの純度を低下させることができます。さらに、精製のために使用されるクロマトグラフィーカラムのHPLC計測およびサイズが大きく、単一の実行で精製することができる材料の量に影響を与えることができます。ピークは、Aβペプチドの予想される溶離液時に生成されない、大きなピークは溶媒先端に相当する溶離液時に生成される場合、あまりにも多くの材料は、最初にカラムにロードしました。各実行のためのHPLCカラムに注入された材料の量を減らすことは、この問題を回避します。 Aβペプチドは、精製されていると、非常に溶液をできるだけ迅速に凍結乾燥することをお勧めします。溶液中のペプチドの長期保管は、Aβの酸化につながるため、不純物の形成することができます。 PUAβペプチドのリティは常に分析HPLCにより決定されるべきです。微量の不純物が劇的ペプチドの凝集傾向を変えることができます。分析的HPLCトレースは、不純物の存在を示した場合、サンプルは、HPLC精製プロトコルに再施されるべきであり、その純度は、分析用HPLCにより再測定しました。 Aβ42とAβ40ペプチドの精製のために、この調整された手順は、科学界のために有益であるとユーザーがオリゴマー形成のAβが可能な高純度を得ることができるようになることが期待されています。なお、この手順では、単離および精製することが困難である他のアミロイド形成ペプチドに適合させることができることが予想されます。

アルツハイマー病は、全世界で3,500万人を超える人々に影響を与える神経変性疾患です。疾患の発症と進展に強く関与する1は 、非常に凝集しやすい、疎水性ペプチドのアミロイドベータ（Aβ）です。 2Aβしかし、アミロイドベータ42（Aβ42）は、タンパク質の最も有毒な形態の42アミノ酸の変異体であると考えられている、長さが36〜43個のアミノ酸の範囲です。 3これは容易に拡散し、特に神経毒性実体であると考えられているオリゴマー種を形成するAβ42の能力に大部分で起因します。 図4は、Aβペプチドの我々の理解を促進するためには、日常的に高純度の材料を得ることが不可欠です。微量の不純物の存在は、劇的に、ペプチドの凝集性向特性を変化させることが示されています。 5 Traditionally、例えば、Aβのような疎水性ペプチドの高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分離は、C 4またはC 8シリカベース固定相及び酸性移動相の組み合わせの使用を介して行われてきました。 6しかし、そのような条件は、ペプチドの精製に挑戦を提示することができます。 Aβペプチド（pIが約5.5）の低い等電点7は 、酸性条件下でいることを意味する（ 図2A）ペプチド凝集が増加し、結果としてしばしば単離することが困難である広い、非分解HPLCピークが生成されます。さらに、このようなブロードなピークは、多くの場合、ペプチドの凝集特性に影響を与え、そして一般的に劇的に産生されるペプチドの量に影響を与える可能性精製のその後のラウンドを必要とし得る不純物を含有します。 ポリ（スチレン/ジビニルベンゼン）固定相、PLRP-Sは、purifの代替手段を表し、瑛疎水性ペプチド。固定相は、異なるタンパク質とメッセンジャーリボ核酸（mRNA）の多数の精製に使用されています。 8,9 PLRP-S固定相は逆相分離のための付加的なアルキルリガンドを必要とせず、そしてより重要なペプチドの脱凝集をもたらす高いpHにおいて化学的に安定です。 7ここでは、我々は、高純度のアミロイドベータ42（Aβ42）とアミロイドベータ40（Aβ40）のペプチドをもたらす仕立てHPLC精製プロトコルを報告しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1207">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:207px;">Agilent 1260 Infinity II quarternary pump</td>
			<td style="width:85px;">Agilent</td>
			<td style="width:179px;">G7111B</td>
			<td style="width:739px;">http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:207px;">Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detector</td>
			<td style="width:85px;">Agilent</td>
			<td style="width:179px;">G7114A</td>
			<td style="width:739px;">http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:207px;">Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loop</td>
			<td style="width:85px;">Agilent</td>
			<td style="width:179px;">0101-1232</td>
			<td style="width:739px;">http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:207px;">Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 &#181;L stainless steel sample loop</td>
			<td style="width:85px;">Agilent</td>
			<td style="width:179px;">G1328C</td>
			<td style="width:739px;">http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:207px;">Ring Stand Mounting Bracket</td>
			<td style="width:85px;">Agilent</td>
			<td style="width:179px;">1400-3166</td>
			<td style="width:739px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:207px;">PEEK Tubing Blue (1/32&#34; outer diameter &#1093; 0.010&#34; internal diameter)</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:179px;">03-050-399</td>
			<td style="width:739px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:207px;">Agilent PLRP-S 300&#197; 8&#181;m 25 &#1093; 300 mm column (Preparative)</td>
			<td style="width:85px;">Agilent</td>
			<td style="width:179px;">PL1212-6801</td>
			<td style="width:739px;">http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:207px;">Agilent PLRP-S 300&#197; 8&#181;m 7.5 &#1093; 300 mm (Semi-Preparative)</td>
			<td style="width:85px;">Agilent</td>
			<td style="width:179px;">PL1112-6801</td>
			<td style="width:739px;">http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:207px;">Agilent PLRP-S 300&#197; 5 &#181;m 4.6 x 250 mm (Analytical)</td>
			<td style="width:85px;">Agilent</td>
			<td style="width:179px;">PL1512-5501</td>
			<td style="width:739px;">http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">A&#946;42 or A&#946;40 peptide</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:739px;">Synthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:207px;">Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution)</td>
			<td style="width:85px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:179px;">A669-500</td>
			<td style="width:739px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:207px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:85px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:179px;">A998-4</td>
			<td style="width:739px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:207px;">HPLC grade water</td>
			<td style="width:85px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:179px;">W5-4</td>
			<td style="width:739px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:207px;">Falcon 50 ml conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:85px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:179px;">14-954-49A</td>
			<td style="width:739px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:207px;">Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 ea</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:179px;">Z227250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:207px;">Normject 5cc sterile syringe</td>
			<td style="width:85px;">Fisher Scientific</td>
			<td>1481729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:207px;">16 Gauge SS Needle</td>
			<td style="width:85px;">Rheodyne</td>
			<td style="width:179px;">3725-086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tailored hplc purification protocol that yields high-purity amyloid beta 42 and amyloid beta 40 peptides, capable of oligomer formation

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high purity material. Here we present a tailored HPLC purification protocol to produce high-purity amyloid beta 42 (A&#946;42) and amyloid beta 40 (A&#946;40) peptides. We have found that the combination of commercially available hydrophobic poly(styrene/divinylbenzene) stationary phase, polymer laboratory reverse phase - styrenedivinylbenzene (PLRP-S) under high pH conditions, enables the attainment of high purity (&gt;95%) A&#946;42 in a single chromatographic run. The purification is highly reproducible and can be amended to both semi-preparative and analytical conditions depending upon the amount of material wished to be purified. The protocol can also be applied to the A&#946;40 peptide with identical success and without the need to alter the method.

72および74分（ 図2C）との間の保持時間におけるAβペプチドに鋭い解決ピークの形成PLRP-S固定相と高pHの移動相の結果の組み合わせを使用してAβ42ペプチドの精製。ピークの身元の確認は、収集した溶離液を直接注入質量分析を介して行われます。溶離剤は、最大12時間、溶液中で-20℃で保存することができます。ストレージのより長い期間は、タンパク質の酸化をもたらし得ます。精製されたペプチドを単離するために、溶離液は、液体窒素と凍結乾燥で急速凍結しています。精製されたペプチドの分析HPLCは&gt; 95％（ 図2D）の純度を明らかにする。同じ手順は、この方法を変更することなくAβ40ペプチド（ 図3A）を精製するために使用することができます。分析用HPLCは、Aβ40の純度は95％を超える（ 図3B）であることを示しています。 </P&gt; <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55482/55482fig3.jpg" /> 図3：Aβ40の代表的HPLCトレース。 （A）25×300ミリメートル2ポリマーカラムを用いて分取精製を最適化され、条件は、プロトコルの説明テキストのサブセクション1.3にあり、表1に記載されています。 Aβ40に対応するピークはアスタリスクが表示されます。 （B）分析用HPLC 4.6×250 mm 2のポリマーカラム、条件を用いて：緩衝液A：H 2 O 20 mMのNH 4 OH、緩衝液Bで20 mMのNH 4 OH、勾配80％のMeCN / 20％H 2 Oを30分かけて5〜50％の緩衝液B。 B.質量分析は、Aβ40のピークの同一性を決定するために使用された部分に示すように、部分Aの顕著なAβ40ピークの回収は、&gt; 95％の純度を明らかにする。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55482/55482fig3large.jpg" target="_blank">彼女をクリックしてください</a>eは、この図の拡大版を表示します。 先に図14、 図15に記載し、ロバストオリゴマー形成を観察することができたように精製されたペプチドは、オリゴマー混合物を形成することができることを確認するために、我々は、未修飾タンパク質（PICUP）の光誘起架橋を行います。 10

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A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

ここで我々は、オリゴマー形成が可能な高純度のアミロイドベータ42（Aβ42）とアミロイドベータ40（Aβ40）のペプチドを、もたらす仕立てHPLC精製プロトコルを報告しています。アミロイドベータは、アルツハイマー病に関与する高度に凝集しやすい、疎水性ペプチドです。ペプチドのアミロイド形成性の性質は、その精製の挑戦になります。

オリゴマー形成可能な高純度のアミロイドベータ42とアミロイドベータ40ペプチドを、利回りテーラードHPLC精製プロトコル

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.8K ビュー.  University of California, Santa Cruz. ここで我々は、オリゴマー形成が可能な高純度のアミロイドベータ42（Aβ42）とアミロイドベータ40（Aβ40）のペプチドを、もたらす仕立てHPLC精製プロトコルを報告しています。アミロイドベータは、アルツハイマー病に関与する高度に凝集しやすい、疎水性ペプチドです。ペプチドのアミロイド形成性の性質は、その精製の挑戦になります。 

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Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

This protocol describes the production of a therapeutic antibody in a mammalian expression system. The methods described include preparation of vector DNA, stable transfection and serum-free adaptation of a human embryonic kidney 293 cell line, set up of large scale cultures and purification using affinity chromatography.

治療用抗体の実験室規模の産生および精製

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

生化学

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

S100A12の発現、精製および抗菌活性

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s disease afflicting primarily the central nervous system, and systemic amyloidosis where serum amyloid A, transthyretin and IgG light chains deposit as amyloid in liver, carpal tunnel, spleen, kidney, heart, and other peripheral tissues. Amyloid has been known and studied for more than a century, often using amyloid specific dyes such as Congo red and Thioflavin T (ThT) or Thioflavin (ThS). In this paper, we present heptamer-formyl thiophene acetic acid (hFTAA) as an example of recently developed complements to these dyes called luminescent conjugated oligothiophenes (LCOs). hFTAA is easy to use and is compatible with co-staining in immunofluorescence or with other cellular markers. Extensive research has proven that hFTAA detects a wider range of disease associated protein aggregates than conventional amyloid dyes. In addition, hFTAA can also be applied for optical assignment of distinct aggregated morphotypes to allow studies of amyloid fibril polymorphism. While the imaging methodology applied is optional, we here demonstrate hyperspectral imaging (HIS), laser scanning confocal microscopy and fluorescence lifetime imaging (FLIM). These examples show some of the imaging techniques where LCOs can be used as tools to gain more detailed knowledge of the formation and structural properties of amyloids. An important limitation to the technique is, as for all conventional optical microscopy techniques, the requirement for microscopic size of aggregates to allow detection. Furthermore, the aggregate should comprise a repetitive &#946;-sheet structure to allow for hFTAA binding. Excessive fixation and/or epitope exposure that modify the aggregate structure or conformation can render poor hFTAA binding and hence pose limitations to accurate imaging.

Amyloid deposition is a hallmark of different diseases and afflicts many different organs. This paper describes the application of luminescent conjugated oligothiophene fluorescence staining in combination with fluorescence microscopy techniques. This staining method represents a powerful tool for detection and exploration of protein aggregates in both clinical and scientific setups.

アミロイド組織イメージング ステンド グラス ハイパー スペクトルで発光共役オリゴチオフェンと共焦点顕微鏡と蛍光寿命イメージング

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

高効率巻き戻しと受容体リガンド結合領域の浄化法

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. The ability to readily detect the formation of these fibers under various experimental conditions is essential for understanding their potential function. Many methods have been used to detect the fibers, but not without some drawbacks. For example, electron microscopy (EM), or staining with Congo Red or Thioflavin T often requires purification of the fibers. On the other hand, semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis (SDD-AGE) allows detection of the SDS-resistant amyloid-like fibers in the cell extracts without purification. In addition, it allows the comparison of the size difference of the fibers. More importantly, it can be used to identify specific proteins within the fibers by Western blotting. It is less time consuming and more easily accessible to a wider number of labs. SDD-AGE results often show variable degree of heterogeneity. It raises the question whether part of the heterogeneity results from the dissociation of the protein complex during the electrophoresis in the presence of SDS. For this reason, we have employed a second dimension of SDD-AGE to determine if the size heterogeneity seen in SDD-AGE is truly a result of fiber heterogeneity in vivo and not a result of either degradation or dissociation of some of the proteins during electrophoresis. This method allows fast, qualitative confirmation that the amyloid or amyloid-like fibers are not partially dissociating during the SDD-AGE process.

Here we use two-dimensional semi-denaturing agarose gel electrophoresis to confirm the presence of amyloid-like fibers of heterogeneous size and exclude the possibility that the size heterogeneity is due to dissociation of the amyloid fibers during the gel running process.

アミロイドやアミロイドのような繊維のサイズの不均一性を確認するため 2 次元半変化洗剤 Agarose のゲル電気泳動の使用

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

哺乳類の Mrna の翻訳開始複合体形成の Toeprinting 分析

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer is widely accepted as the leading neurotoxin in the progress of Alzheimer&#39;s disease (AD) and is considered to be the crucial event in the pathogenesis of AD. Therefore, A&#946; oligomer inhibitors might prevent neurodegeneration and have the potential to be developed as disease-modifying treatments of AD. However, different formation protocols of A&#946; oligomer might lead to oligomers with different characteristics. Moreover, there are not many methods to effectively screen A&#946;1-42 oligomer inhibitors. An A11 antibody can react with a subset of toxic A&#946;1-42 oligomer with anti-parallel &#946;-sheet structures. In this protocol, we describe how to prepare an A11-positive A&#946;1-42 oligomer-rich sample from a synthetic A&#946;1-42 peptide in vitro and to evaluate relative amounts of A11-positive A&#946;1-42 oligomer in samples by a dot blotting analysis using A11 and A&#946;1-42-specific 6E10 antibodies. Using this protocol, inhibitors of A11-positive A&#946;1-42 oligomer can also be screened from semi-quantitative experimental results.

This protocol describes how to prepare A&#946; oligomers from a synthetic peptide in vitro and to evaluate relative amounts of A&#946; oligomer by a dot blotting analysis.

A11 肯定的なアミロイド β オリゴマーの合成と評価を使用してドットのしみが付く分析

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

精製と TRPV1 の分光学的解析のための再構成

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity

Apoptotic bodies (ApoBDs), microvesicles and exosomes are the key members of the extracellular vesicle family, with ApoBDs being one of the largest type. It has been proposed that ApoBDs can aid cell clearance as well as intercellular communication through trafficking biomolecules. Conventional approaches used for the identification and isolation of ApoBDs are often limited by the lack of accurate quantification and low sample purity. Here, we describe a workflow to confirm the induction of apoptosis, validate ApoBD formation, and isolate ApoBDs to high purity. We will also outline and compare fluorescence-activated cell sorting (FACS) and differential centrifugation based approaches to isolate ApoBDs. Furthermore, the purity of isolated ApoBDs will be confirmed using a previously establish flow cytometry-based staining and analytical method. Taken together, using the described approach, THP-1 monocyte apoptosis and apoptotic cell disassembly was induced and validated, and ApoBD generated from THP-1 monocytes were isolated to a purity of 97-99%.

A workflow using flow cytometry or differential centrifugation is developed to detect, quantify and isolate apoptotic bodies from an apoptotic sample to high purity.

高純度にアポトーシス小体の検出と分離

Apoptotic bodies (ApoBDs), microvesicles and exosomes are the key members of the extracellular vesicle family, with ApoBDs being one of the largest type. ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and structure by spectrometry and scanning electron microscopy (SEM). A&#946;, which forms neurotoxic amyloid aggregates in Alzheimer&#39;s disease (AD), has been shown to interact with fibrinogen. This A&#946;-fibrinogen interaction makes the fibrin clot structurally abnormal and resistant to fibrinolysis. A&#946;-induced abnormalities in fibrin clotting may also contribute to cerebrovascular aspects of the AD pathology such as microinfarcts, inflammation, as well as, cerebral amyloid angiopathy (CAA). Given the potentially critical role of neurovascular deficits in AD pathology, developing compounds which can inhibit or lessen the A&#946;-fibrinogen interaction has promising therapeutic value. In vitro methods by which fibrin clot formation can be easily and systematically assessed are potentially useful tools for developing therapeutic compounds. Presented here is an optimized protocol for in vitro generation of the fibrin clot, as well as analysis of the effect of A&#946; and A&#946;-fibrinogen interaction inhibitors. The clot turbidity assay is rapid, highly reproducible and can be used to test multiple conditions simultaneously, allowing for the screening of large numbers of A&#946;-fibrinogen inhibitors. Hit compounds from this screening can be further evaluated for their ability to ameliorate A&#946;-induced structural abnormalities of the fibrin clot architecture using SEM. The effectiveness of these optimized protocols is demonstrated here using TDI-2760, a recently identified A&#946;-fibrinogen interaction inhibitor.

Presented here are two methods that can be used individually or in combination to analyze the effect of beta-amyloid on fibrin clot structure. Included is a protocol for creating an in vitro fibrin clot, followed by clot turbidity and scanning electron microscopy methods.

Β アミロイド誘起分光と電子顕微鏡によるフィブリン血栓構造異常の解析

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...