これらの実験の組織コレクションに参加するため患者さんにお世話になっております。国防総省 OCRP 卵巣癌アカデミー賞 (W81XWH-15-0253) および Anirban k. ミトラにコリーンの夢財団からパイロット賞は、この研究をサポートしました。

プロトコルは、インディアナ大学の制度的規制委員会のガイドラインに従います。
1. セル準備
<ol><li>
ひと中皮細胞の分離と培養
	<ol>
<li>分離ひと中皮細胞 (HPMCs)17,18を前述とのそれらを育てる人間の大網から完了成長培地 [ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 10% 牛胎児血清 1% を含むペニシリン-ストレプトマイシン, 1% 非本質的なアミノ酸、および 1% ビタミン] 37 ° C および 5% の CO2。 注: HPMCs は、通常 100% 合流点 (図 1 a) を栽培しています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
卵巣癌の細胞の成長条件
	<ol>
<li>37 ° C、5% CO2で完全培地に HeyA8 卵巣癌細胞を成長します。 注: 使用 HeyA8 セル成長する約 80% 合流 (図 1 b)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 細胞培養
<ol><li>
近位文化セットアップ
	<ol>
<li>使用 Transwell 0.4 μ m 孔 (108毛穴/cm2) と 4.67 cm2成長分野 10 μ m 厚い組織文化扱われるポリカーボネート膜 6 ウェル プレートを挿入します。必要な場合は、成長の表面積によると播種された細胞の数を拡大することで異なる挿入サイズの最適化します。温かみのある完全な成長媒体、トリプシン、およびリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 使用前に 37 ° c。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
挿入の準備
	<ol>
<li>挿入の膜の下の表面の HeyA8 細胞をシードするには、滅菌ピンセットを使用してパッケージからドライブベイ カバーを取り外し、滅菌 15 cm 培養皿で反転配置。</li>
		<li>反転挿入に対応する適切な滅菌コンテナーとそれの代わりに深さがあり、15 cm 皿を使用します。実験によって 15 cm 皿に挿入の必要な数を配置します。</li>
		<li>3 つのコントロールと 3 つの実験条件をそれに応じてラベル挿入の端にマーカーで。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
がん細胞を準備
	<ol>
<li>25 cm2フラスコ (10 の6セル × 2 ~) 80% 合流で育った HeyA8 細胞を trypsinize 40-60 s のトリプシン (0.25%) の 1 つの mL を追加し、6 ml の完全培のトリプシンを中和します。</li>
		<li>室温 (RT) 3 分間で 500 x gで細胞を遠心分離機、上澄みを廃棄し、5 ml の完全培細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー色素排除法を使用して生きているセルをカウントします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
癌細胞の播種
	<ol>
<li>100,000 セル/mL の完全培地に生きている HeyA8 のセルを中断します。慎重に種 80,000 HeyA8 細胞懸 (これは今直面している、それが反転するので) 挿入の下に完全な成長媒体の 800 μ L。</li>
		<li>ドームのような形を形成するので、セルの挿入 (図 1) のままに細胞を播きます。膜の中心から開始し、ゆっくりとピペッティングしながら同心円の外側に移動します。あらゆる媒体の流出を防ぐためにエッジから 3 mm 以上を行くことを避けてください。 注: セルの成長率と実験の期間に播種された細胞の数によって異なります。この近位文化のシード HeyA8 細胞数を最適化した、セルは、3 日目の終わりに 80-90% の合流になります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
癌細胞の接着
	<ol>
<li>カバー 15 cm 皿、CO2インキュベーターへの挿入を含む料理を慎重に移動します。培地およびこの手順で挿入のセルのドロップを破壊することが重要です。挿入にアタッチする癌細胞を許可する 4 h の 37 ° C で細胞を残します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
中皮細胞の準備
	<ol>
<li>約 4 時間後 100 %2 ml のトリプシン (0.25%) に 1-2 分の 75 cm2フラスコ (10 の6セル × 4 〜) で合流で成長して HPMCs を trypsinize、12 ml の完全培のトリプシンを中和します。</li>
		<li>500 x gで RT 3 分で細胞を遠心分離機、10 mL の完全培に細胞ペレットを再懸濁します、トリパン ブルー色素排除法を使用して生きているセルをカウントします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
中皮細胞を播種
	<ol>
<li>完全培地にライブ HPMCs の 300,000 細胞/ml を中断します。6 ウェル プレートの各ウェルに新鮮な完全な成長媒体の 2.5 mL を追加します。うちバイオ セーフティ フードへの挿入を含む 15 cm の料理をもたらす慎重に。滅菌鉗子を使用して、挿入を反転し、6 ウェル プレートのウェルに配置、完全な成長媒体 (図 1) に浸漬下面に接続されている HeyA8 細胞直立。</li>
		<li>シード 450,000 HPMCs または HPMC コントロールの HeyA8 セルなし挿入 (図 1) 井戸の底の面に接続 HeyA8 細胞とインサートの内側の成長培地の 1.5 mL で中断します。細胞成長培地の 1.5 mL を HeyA8 コントロールに追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
近位の文化を育てる
	<ol>
<li>72 h の 37 ° C で 5% CO2 CO2インキュベーターで育つ近位文化をしましょう。必要な場合、媒体をとおり補充することができます。<ol>
<li>カバーの内側、750 μ L を削除し、完全な新鮮な成長媒体の 750 μ L を追加します。</li>
			<li>挿入 (6 ウェル プレート) の外、1 mL を削除し、新鮮な完全な成長培地 1 mL を追加します。1 mL は、1 つのステップの中での利便性のために選ばれました。に応じて、1.25 mL を削除、代わりに交換することができます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
セルの収集
	<ol>
<li>近位文化の 72 時間後セルを収集します。セル HPMCs。 Trypsinize と HeyA8 細胞のクロスコンタミネーションを防ぐためにこの段階で特別な注意を取る、それらを遠心し、交差汚染を防ぐために膜に細胞を溶解ではなくペレットを溶解します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞をトリプシン
	<ol>
<li>1x PBS で挿入の両側をすすいでください。</li>
		<li>新しい井戸に挿入を転送し、トリプシンを追加します。カバーの内側に 0.5 mL のトリプシンと挿入の下面に接続されているがん細胞を trypsinize に 6 ウェル プレートに 2 mL のトリプシンを追加します。37 ° C で 2 分間プレートを孵化させなさい</li>
	</ol>
</li>
	<li>
トリプシンを中和
	<ol>
<li>トリプシンを中和、ピペットの上下、および、細胞を取るし、ラベル コレクションの管にそれらを転送にカバーの内側に完全な成長培地 1 mL を追加します。中和を完全に完全な成長媒体の追加 2 mL を追加します。細胞のクロスコンタミネーションを防ぐためにピペッティングしながら細胞膜に穴を開けるように注意が必要があります。</li>
		<li>セルを挿入の下に収集、底面に 12.2 手順で追加した 2-3 x セル 6 ウェル プレートの底に落ちるように 2 mL のトリプシンをピペットします。6 ml の成長媒体のプレートの底にトリプシンを中和し、プレートの内容をラベル コレクション チューブに転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
収集し、細胞を溶解
	<ol>
<li>500 x g 3 分で細胞を遠心し、メディアを吸引します。再懸濁します、RNA 抽出用の溶解試薬のフェノールとグアニジン-チオシアン酸塩-ベースの 0.7 ml 細胞ペレットを溶解させます。任意の適切なキットを使用して RNA を分離します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3 量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応
注: 次の手順は、近位の文化の結果として遺伝子の表現の変更を検討する、リアルタイムの量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) をについて説明します。
<ol><li>QPCR の RNA のサンプルからの cDNA を準備します。対応するバッファーとランダム プライマーすべて mRNA の逆のトランスクリプションを確保するため任意の適切な逆転写酵素を使用 (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>フィブロネクチン (FN1) と E-カドヘリン (CDH1) の mRNA 発現量の変化を評価し、内部統制としてグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH) と qPCR による成長因子 β 1 (TGFβ1) を変換します。標準化された市販遺伝子式の試金 (材料の表を参照) を使用するかプライマーを設計することが可能です。</li>
	<li>HeyA8 コントロールと HPMCs と HPMC コントロールと近位文化で育つ HPMCs 近位の文化で育った HeyA8 細胞を比較します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li><li>Cupedo, T., Mebius, R. 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Tumor Metastasis Available from: <a target="_blank" href="https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination">https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination</a> (2016)</li><li>Iwanicki, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium.">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).</li><li>Kenny, H. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+mediators+and+communicators+between+cancer+cells+and+the+tumor+microenvironment.">MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment.</a> Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

パラクリンの juxtacrine 細胞間シグナル伝達機構を理解することは、正常組織の恒常性と病気の条件7,8のよりよい知識を開発するため不可欠です。ほとんどパラクリン シグナルにより収集実施エアコンから 1 つのセルの種類とその他の細胞のタイプの治療に使用中。このメソッドでは、その本来のシンプルさの利点があります。しかし、それはない正確に再現細胞の微小環境における分泌因子のローカライズされた濃度または生産の動態と関与する因子の枯渇。前者はある程度対処することができます、しかし正確に、馴化培地を集中してだ動態を再現する非常に困難。セル挿入と井戸の底を育てること transwell 挿入の使用はある程度の生産と消耗速度論的効果を取り戻すことができます。ただし、セルの挿入と、井戸の底の間の距離によって区切られ、したがって、パラクリン因子のローカライズされた濃度を再作成できません。分泌因子のローカライズされた高濃度だけでなく、生産率と要因の枯渇のダイナミクスを保った相互パラクリン シグナル伝達、勉強する近位文化法の開発を報告しました。
原理の実証研究では、卵巣癌細胞と HPMCs の相互作用は報告された効果の再現に近位培養法の有効性を示した。さらに、上皮性マーカー HeyA8 細胞で E-カドヘリンと HPMCs の式で相互パラクリン作用の反対の効果についてもしました。我々 の実験は、3 日間の期間にわたって、細胞を培養を行って、短いに合わせることができるまたは細胞数の初期値を調整することによって長い時間ポイント シードします。これにより、パラクリン シグナル短期と長期の効果や経時的研究を実施する研究者。この簡単な方法は、パラクリン シグナル伝達、免疫学、血管新生、セルの開発、創傷治癒、腫瘍微小環境の研究に加えてなど 2 つの付着性のセル型の間の研究に潜在的適用できます。
この方法の重要な手順は、膜の下の表面の細胞を播種、エンドポイントで両方の表面から細胞を採取します。最初反転挿入中の大規模なドロップとして、細胞を播種して低い表面のシードを達成しました。研究の 2 つのより付着性のセルは、底面にシードする必要があります。ケアは、中断からの媒体のこの blob を避けるために抱卵中の挿入を邪魔しないようにする必要があります。シリコーンゲルは、こぼれる液体の泡の破裂を避けるために挿入のエッジに適用できます。近位培養実験の終わりには、細胞膜の両側が順番にトリプシンの代わりに、直接分離孔を通って lysates の膜リスクの交差汚染にそれらを溶解するため。それらを彼らの個々 のコンパートメントにトリプシンと世話を媒体とトリプシンのボリュームはプロトコルの規定量を超えることはありません、すべての交差汚染を回避できます。遠心分離、別の管で各セル型が収集され、細胞ペレットを分離するか。
この手法は、明白な直接的な相互作用を避けながらパラクリン作用の効果的な学習を使用できますが、ナノチューブ (TNTs) をトンネルを通して相互作用を排除できません。これら TNTs のいくつかは、0.4 μ m の細孔を通過するには十分に狭いと膜の 10 μ m の厚さをスパンする十分な長さをすることができます。共焦点顕微鏡による毛穴の彼らの存在を確認する我々 の試みでしたが決定的な (データは表示されません)、電子顕微鏡が自分の存在を確認する潜在的採用されている可能性があります。したがって、このメソッドは TNTs を通じて潜在的な細胞間コミュニケーションを除外しない候補細胞がそれらを形成し、それらを介して相互作用することができる場合。同様に、相互拡散防止増加増殖細胞膜の両側によって毛穴の潜在的なブロックの結果としてシグナルを排除することはできません。
エクソソームの潜在的な交換ができます 0.4 μ m の孔を持つ膜のいずれかの表面の細胞を成長しています。エクソソーム伝統的細胞、ゴミ袋として考えられていたが、最近の研究は、パラクリン セルラー通信22の重要なメディエーターとしての DNA とも Mrna マイクロ Rna は、タンパク質、積荷でこれらの小胞を使用することを示しています,23,24. エクソソームを介して携帯電話通信を勉強する近位文化メソッドを効果的に使用できますしたがって。さらに、このメソッドは分泌リガンドまたは対応する受容体シグナリングまたは中和抗体の特異的阻害剤による治療を受けやすい。要約すると、我々 は傍分泌細胞の直接相互作用を防止しながら信号を正確に複製することができますシンプルで汎用の近位文化メソッドの開発を報告しました。この方法のシンプルさは、がん生物学、開発、免疫学などの分野で広く応用できます。

がん細胞と腫瘍の進行がん微小環境との間の生産的な相互作用の役割は、定着させてきた、がん生物学1の研究の主要な焦点となっています。双方向信号のような場合、重要な創傷治癒、免疫反応、血管新生、幹細胞ニッチ中および開発2,3,4,5,6,7,8. これらのすべての生物学的プロセスに共通するテーマは、細胞が様々 な細胞の運命、組織生理学、病気の進行を決定するの細胞外のキューにその微小環境からの方法で応答します。したがって、このような細胞間コミュニケーションに関与するメカニズムの理解に向けてますますなっています。このような相互作用の大部分は、パラクリンや juxtacrine 細胞間シグナル伝達を伴います。Juxtacrine に対し9,10、それの応答をトリガー、近くの別のセルの対応する受容体によって感知される 1 つのセルによって特定のシグナル伝達因子の分泌を含むパラ分泌シグナル信号 2 つのセル関係11,12細胞成分の直接の接触が必要です。
このような信号だけでなく、腫瘍微小環境における組織の恒常性の重要なコンポーネントです。がん細胞の恩恵癌関連付けられている線維芽細胞 (CAFs)、免疫細胞、脂肪細胞13,14,,1516など、腫瘍・間質の細胞からパラクリン juxtacrine 要因。パラクリン シグナル並置配位子と Notch シグナル、またはインテグリンと、それぞれの相互作用と同様に受容体を含む juxtacrine シグナリング、成長因子、サイトカイン、ケモカインなどによって媒介されることができます。細胞外マトリックス蛋白質。我々 は、腫瘍の進展と転移14で卵巣癌のセルと CAFs との相互作用の重要性を実証しました。キーのマイクロ Rna と癌細胞転移増殖17,を促進する転写因子同様に、転移性卵巣癌細胞転移を覆う中皮細胞の相互作用を調節します。18。
パラクリン シグナル伝達に関するほとんどの研究と 2 番目のセルのタイプの治療に 1 つのセル型から収集した馴化培地の使用を含みます。このアプローチは広く使用されて、それは効果的に受容細胞の微小環境における分泌因子のローカライズされた高濃度を複製してないです。また、1 つのセルによって生成されて分泌因子の連続的な流れの動態を再現するは失敗し、隣接セルによって受信されました。パラクリン シグナル分泌因子、ソース セルの近くでのみ必要な濃度で拡散し、を希釈する距離が長くなる傾向があると短い距離で効果的です。このローカライズされた高濃度分泌因子の受容細胞の応答をトリガーに不可欠です。また、受信者の細胞応答も新しく分泌因子と劣化、バインド、および受信者のセル、ソース セルから拡散の国際化を通じて継続的な枯渇のバランスに依存しているです。馴化培地は、微小環境に存在高いローカライズされた濃度のアカウントに集中することができますが、ことは、正確な濃度を正確に複製することはできません。さらに、生産の自然動態と関与する因子の枯渇を模倣することはできません。正確にパラ分泌シグナルをレプリケートし、juxtacrine シグナリング メカニズムから分離、我々 は多孔質膜のいずれかのサーフェスの 2 つのセルのタイプを育てることを含む近位培養法を考案しました。毛穴が小さく、juxtacrine やり取りを防ぐためし、まだローカライズされた高濃度に分泌因子の交換を許可します。その方法では、このシステムは、生産の動力学とパラクライン因子の枯渇を保持します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 mm Transwell permeable support with 0.4 &#181;m Pore Polycarbonate Membrane Insert</td>
			<td>Corning (Costar)</td>
			<td>3412</td>
			<td>&#8226; 10 &#181;m thick translucent polycarbonate membrane 
			&#8226; Treated for optimal cell attachment 
			&#8226; Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case 
			&#8226; Membrane must be stained for cell visibility 
			&#8226; Sterilized by gamma radiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning (Falcon)</td>
			<td>353046</td>
			<td>Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm culture dish</td>
			<td>Corning (Falcon)</td>
			<td>353025</td>
			<td>Sterile, TC-treated Cell Culture Dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning (Cellgro)</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Nonessential amino acids</td>
			<td>Corning (Cellgro)</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamins</td>
			<td>Corning (Cellgro)</td>
			<td>25-020-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any make is fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any make is fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety level II cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any make is fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FN1 TaqMan Gene Expression Assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs01549976_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs00998133_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDH1 TaqMan Gene Expression Assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs01023895_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH TaqMan Gene Expression Assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs99999905_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy mini RNA isolation Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>43-688-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeyA8 ovarian cancer cells</td>
			<td>Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946; Neutralizing Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1835-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a proximal culture method to study paracrine signaling between cells

細胞間相互作用は、腫瘍の進行、免疫反応、血管新生、開発など多くの生物学的プロセスに重要な役割を果たします。パラクリンや juxtacrine シグナリングは、このような相互作用を仲介します。馴化培地と培養研究の使用は相互作用のこれらの 2 つのタイプを区別する最も一般的な方法です。ただし、パラクリン作用中に、微小環境における分泌因子のローカライズされた高濃度の効果は馴化培地によって正確にそうはいないと、したがって、不正確な結論につながる可能性があります。この問題を克服するために我々 は、パラクリン シグナルを研究する近位部の培養法を考案しました。2 つのセル型は、0.4 μ m 孔を持つ 10 μ m 厚ポリカーボネート膜のいずれかのサーフェスに栽培しています。毛穴は分泌因子の交換を許可して、同時に juxtacrine シグナリングを禁じる。細胞を収集、パラクリン シグナル伝達の効果を決定するエンドポイントで分離できます。分泌因子の局在の濃度勾配をできるだけでなく、この方法は長時間文化だけでなく、阻害剤の使用を含む実験を受けやすい。このメソッドを使用して、卵巣癌細胞と中皮細胞の転移のサイトで出会う彼ら間の相互作用を研究する、パラクリン シグナル、様々 な分野の研究に研究の 2 つ付着性のセル型に合わせることができます。開発、免疫学、腫瘍微小環境を含みます。

転移性卵巣癌細胞19腹腔内転移の部位に中皮細胞が発生します。成功した転移17,18,20,21 を有効にすると卵巣癌のセルの適応応答の誘導に中皮細胞の助けを借りて生産パラクリンと juxtacrine 相互作用.近位培養法の有効性をテストするため HeyA8 卵巣癌細胞と HPMCs のパラクリンの相互作用をテストしました。以前、HPMCs と HeyA8 細胞の培養結果 HPMCs21におけるフィブロネクチンの発現を増強する報告されています。このフィブロネクチン発現誘導は、HeyA8 セル21TGFβ の増加分泌によって媒介されます。したがって、両方のこれらの細胞のフィブロネクチンと TGFβ の mRNA のレベルに及ぼす近位培養 HeyA8 細胞と HPMCs をテストしました。予想通り、HeyA8 細胞の近位の文化は挿入 (図 2 a) 下面に接続されている HeyA8 細胞播種のコントロールに比べて HPMCs におけるフィブロネクチンの発現の増加で起因しました。同様に、前者 (図 2 b) で TGFβ の発現の増加で起因した細胞 HeyA8 と HPMCs の近位文化。フィブロネクチンと TGFβ の両方の式は、コントロールと比較する HPMCs と近位文化 HPMCs が挿入 (図 2および2 D) の上面に播種したない HeyA8 細胞でも大幅増加しました。
古典的なエアコン中のアプローチの効果を比較するには、HPMC エアコン媒体と HeyA8 セルを扱う実験を行った。ファイブロネクチン発現の減少、HPMC 調整培 HeyA8 細胞 TGFβ に大きな変化があった。(図 3 aと3 b)。また、近位の文化における中和抗体を分泌 TGFβ をブロックする可能性をテストしました。TGFβ 中和抗体による治療は、HPMCs (図 3) と近位培養 HeyA8 細胞 TGFβ の誘導で大幅な減少で起因しました。ただし、TGFβ の中和抗体微増コントロール HeyA8 細胞における TGFβ の発現 (図 3) の代償反応としておそらく。
さらに、また上皮性マーカー E-カドヘリンの発現レベルに及ぼす近位文化をテストしました。HeyA8 細胞の近位文化 HPMCs (図 2 e) の E-カドヘリンの発現が微増、E-カドヘリンの著しい減少コントロール (図 2 f) と比較すると HPMCs の近くで育った HeyA8 細胞で観察されました。一緒に取られて、これらの結果は卵巣癌細胞と転移中に両方の細胞の種類の遺伝子発現に影響を与えるサイトで正常細胞間シグナリング パラクリンの勉強に近位文化システムの有効性を示す、転移の植民地化のプロセス。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58144/58144fig1.jpg"> 図 1: 近位文化システムのアセンブリです。(A) パネルを示しています人間のプライマリ中皮の細胞 (HPMCs)。(B) このパネルは、HeyA8 卵巣癌のセルを示しています。スケール バー 200 μ m (A ・ B) を =。(C) HeyA8、transwell の低い表面の細胞を播種は 0.4 μ m の気孔を挿入します。セルが接続されると、挿入は成長媒体を含んでいる 6 ウェル プレートのウェルに配置されました。中皮細胞は、上面に接続されているし、が HeyA8 細胞から膜で隔てられて、挿入で播種しました。0.4 μ m 孔膜の交換を許可要因を分泌はセル間の直接接触.<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58144/58144fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58144/58144fig2.jpg"> 図 2: mRNA の発現におよぼす近位栽培します。フィブロネクチン (A) と (B) TGFβ1 発現ひと中皮細胞 (HPMCs) の qPCR 培養近位 HeyA8 セル、コントロール HPMCs に比較する最初の 2 つのパネルを。次の 2 つのパネルを qPCR フィブロネクチン (C) と (D) TGFβ1 式 HeyA8 細胞での HPMCs に近位培養、細胞制御 Heya8 と比較しています。最後の 2 つのパネル (E) HPMCs HeyA8 細胞と培養近位に HPMCs N (F) HeyA8 細胞に培養近位での E-カドヘリン発現の qPCR の表示 = 3、* p < 0.01。誤差範囲は、3 つの繰り返しの標準偏差を表します。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58144/58144fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58144/58144fig3.jpg"> 図 3: 人間原発中皮細胞 (HPMC) の効果-HeyA8 細胞の mRNA 発現に対する中治療を完備します。トップの 2 つのパネルは、HeyA8 細胞のフィブロネクチン (A) と (B) TGFβ1 式の qPCR を表示します。(C) この最後のパネルは、 N HPMCs と近位文化に HeyA8 TGFβ1 式中和抗体 (TGFβ1 Ab) で分泌された TGFβ1 を抑制する効果、3 を = * p < 0.01。p < 0.05。誤差範囲は、3 つの繰り返しの標準偏差を表します。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58144/58144fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

傍分泌と juxtacrine 細胞間相互作用は、腫瘍の進行、免疫反応、血管新生、開発など多くの生物学的プロセスに重要な役割を果たします。ここでは、近位文化メソッドを細胞の直接接触を防止しながら分泌因子のローカライズされた濃度を維持する、パラクリン シグナル伝達研究に使用します。

パラ分泌細胞間シグナル研究に近位の培養法

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and ...

a-proximal-culture-method-to-study-paracrine-signaling-between-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.4K ビュー.  Indiana University School of Medicine. 傍分泌と juxtacrine 細胞間相互作用は、腫瘍の進行、免疫反応、血管新生、開発など多くの生物学的プロセスに重要な役割を果たします。ここでは、近位文化メソッドを細胞の直接接触を防止しながら分泌因子のローカライズされた濃度を維持する、パラクリン シグナル伝達研究に使用します。

ビデオ: A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

トカゲの運動の速度と方向の視覚感度のテスト

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

生物学

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

初期のニワトリ胚をex vivo（新文化）の文化のための方法

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

グローバルS. cerevisiaeの細胞小器官の形態を研究するためにハイスループット法

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

ハイC：ゲノムの三次元構造を研究する方法。

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

イモリのレンズ再生を研究するために培養虹彩色素上皮細胞のためのシステム

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

の野生型と観賞用品種を区別するPCRベースのジェノタイピング法チガヤ</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

血管のCaの可視化 2 +パラクリン派生ROSをきっかけにシグナリング

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

発現クローニングによりGrb2のシグナル伝達複合体を研究するために高コンテンツイメージングワークフロー

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

小説<em&gt;エクスビボ</emマウス胎児ハート&gt;文化法

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the brain, liver, retina, cochlea and vasculature. In experimental settings, intercellular Ca2+-waves can be elicited by applying a mechanical stimulus to a single cell. This leads to the release of the intracellular signaling molecules IP3 and Ca2+ that initiate the propagation of the Ca2+-wave concentrically from the mechanically stimulated cell to the neighboring cells. The main molecular pathways that control intercellular Ca2+-wave propagation are provided by gap junction channels through the direct transfer of IP3 and by hemichannels through the release of ATP. Identification and characterization of the properties and regulation of different connexin and pannexin isoforms as gap junction channels and hemichannels are allowed by the quantification of the spread of the intercellular Ca2+-wave, siRNA, and the use of inhibitors of gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-wave in monolayers of primary corneal endothelial cells loaded with Fluo4-AM in response to a controlled and localized mechanical stimulus provoked by an acute, short-lasting deformation of the cell as a result of touching the cell membrane with a micromanipulator-controlled glass micropipette with a tip diameter of less than 1 &mu;m. We also describe the isolation of primary bovine corneal endothelial cells and its use as model system to assess Cx43-hemichannel activity as the driven force for intercellular Ca2+-waves through the release of ATP. Finally, we discuss the use, advantages, limitations and alternatives of this method in the context of gap junction channel and hemichannel research.

Intercellular Ca2+-waves are driven by gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-waves in cell monolayers in response to a local single-cell mechanical stimulus and its application to investigate the properties and regulation of gap junction channels and hemichannels.

細胞単層に機械的刺激によって誘発されるカルシウム波の伝播：ウシ角膜内皮細胞の例

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...