Wir sind verpflichtet, den Patienten für ihre Teilnahme an der Gewebe-Sammlung für diese Experimente. Ein DoD OCRP Ovarian Krebs Oscar (W81XWH-15-0253) und ein pilot Award von Colleens Dream Foundation, Anirban K. Mitra unterstützt diese Forschung.

Das Protokoll folgt den Richtlinien des institutionellen Regulatory Board der Indiana Universität.
1. Zelle-Vorbereitung
<ol><li>
Isolation und Kultur der menschlichen primäre Mesothelzellen
	<ol>
<li>Isolieren menschliche primäre Mesothelzellen (HPMCs) von menschlichen Omentum beschriebenen17,18 und wachsen sie in komplette Wachstumsmedium [Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fötalen Rinderserum, 1 % Penicillin-Streptomycin, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 % Vitamine] bei 37 ° C und 5 % CO2. Hinweis: Die HPMCs werden in der Regel zu 100 % Zusammenfluss (Abbildung 1A) angebaut.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Wachstumsbedingungen von Eierstockkrebs Zellen
	<ol>
<li>Wachsen Sie HeyA8 Eierstockkrebs Zellen in komplette Nährmedium bei 37 ° C und 5 % CO2. Hinweis: Verwenden HeyA8 Zellen gewachsen auf ca. 80 % Zusammenfluss (Abbildung 1 b).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. die Zellkultur
<ol><li>
Proximalen Kultur Einrichtung
	<ol>
<li>Verwendung Transwell Einsätze für 6-Well-Platten mit einem 10 μm Dicke Gewebe-Kultur-behandelten Polycarbonat-Membran mit 0,4 μm Poren (108 Poren/cm2) und ein Wachstumsbereich 4,67 cm2 . Bei Bedarf optimieren Sie für verschiedene einfügen Größen durch Skalieren die Anzahl der Zellen, die nach dem Wachstum Fläche ausgesät. Warmen komplette Wachstumsmedium, Trypsin und Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf 37 ° C vor dem Gebrauch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Einsätze
	<ol>
<li>Um die HeyA8 Zellen auf der unteren Fläche der Membran des Einsatzes zu säen, entfernen Sie die Einlage aus der Verpackung mit steriler Pinzette und legen Sie es umgekehrt in der Kulturschale steril 15 cm.</li>
		<li>Verwenden Sie eine 15-cm-Schüssel, da es die Tiefe hat, um Platz für die invertierte einfügen oder ersetzen es mit jedem geeigneten sterilen Behälter. Je nach dem Experiment legen Sie die erforderliche Anzahl von Einsätzen in 15 cm Schüssel.</li>
		<li>Beschriften Sie die drei Steuerelemente und drei experimentellen Bedingungen entsprechend mit einer Markierung auf der Kante der Einsätze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Krebszellen
	<ol>
<li>Trypsinize die HeyA8 Zellen gewachsen an 80 % Einmündung in eine 25 cm2 Kolben (~ 2 x 106 Zellen), fügen Sie 1 mL Trypsin (0,25 %) für 40-60 s und neutralisieren die Trypsin mit 6 mL komplette Wachstumsmedium.</li>
		<li>Die Zellen bei 500 X g bei Raumtemperatur (RT) für 3 min zentrifugieren, überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 5 mL komplette Wachstumsmedium. Zählen Sie die lebenden Zellen der Trypan blauen Farbstoff Ausschluss-Methode.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aussaat der Krebszellen
	<ol>
<li>100.000 Zellen/mL von lebenden HeyA8 Zellen in komplette Wachstumsmedium auszusetzen. Sorgfältig 80.000 HeyA8 Samenzellen in 800 μl des vollständigen Wachstumsmedium auf der Unterseite des Einsatzes (was jetzt, konfrontiert ist, da es invertiert) ausgesetzt.</li>
		<li>Samen der Zellen, um eine DOM-artige Form zu bilden, so die Zellen auf dem Einsatz (Abbildung 1 bleiben). Ab der Mitte der Membran und nach außen in konzentrischen Kreisen zu bewegen Sie, während Sie langsam pipettieren. Mehr als 3 mm von der Kante, um zu verhindern, dass irgendwelche verschütten des Mediums geht nicht. Hinweis: Die Anzahl der Zellen ausgesät hängt von der Wachstumsrate der Zellen und die Dauer des Experiments. Die Anzahl der HeyA8 Zellen für diese proximalen Kultur ausgesät wurden optimiert und die Zellen werden 80 – 90 % Zusammenfluss am Ende des dritten Tages.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Krebs-Zellhaftung
	<ol>
<li>Bedecken Sie die Schüssel 15 cm, und ziehen Sie vorsichtig die Schale mit den Einsätzen in den CO-2 -Inkubator. Es ist wichtig nicht zu stören den Tropfen des Mediums und Zellen auf den Einsatz bei diesem Schritt. Lassen Sie die Zellen bei 37 ° C für 4 h damit der Krebszellen auf den Einsatz aufstecken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Mesothelzellen
	<ol>
<li>Nach ca. 4 h trypsinize der HPMCs bei 100 % Zusammenfluss in einem 75 cm2 Kolben (~ 4 x 106 Zellen) mit 2 mL Trypsin (0,25 %) für 1 – 2 min. angebaut und neutralisieren die Trypsin mit 12 mL komplette Wachstumsmedium.</li>
		<li>Die Zellen bei 500 X g bei RT 3 min zentrifugieren, Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL komplette Wachstumsmedium und zählen die lebenden Zellen der Trypan blauen Farbstoff Ausschluss-Methode.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aussaat der Mesothelzellen
	<ol>
<li>300.000 Zellen/mL live HPMCs in komplette Wachstumsmedium auszusetzen. Jede Vertiefung einer 6-Well-Platte 2,5 mL frische komplette Wachstumsmedien hinzufügen. Sorgfältig die 15 cm Teller, enthält die Einsätze, um die biologische Sicherheit Haube zu bringen. Mit sterilen Pinzette, flip die Einlage und legen Sie sie in den Brunnen des 6-Well-Platte, damit sie aufrecht, mit den HeyA8 Zellen an der unteren Fläche, eingetaucht in das komplette Wachstumsmedium (Abbildung 1) befestigt ist.</li>
		<li>Samen 450.000 HPMCs suspendiert in 1,5 mL Wachstumsmedium im Inneren der Einsätze mit den HeyA8 Zellen an der Oberfläche mit Blick auf die Unterseite des Brunnens (Abbildung 1) oder auf Einsätze ohne irgendwelche HeyA8 Zellen für die HPMC-Steuerelemente. 1,5 mL Wachstumsmedium ohne Zellen auf die HeyA8-Steuerelemente hinzufügen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Wächst der proximalen Kultur
	<ol>
<li>Die proximale Kultur im CO2 Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 72 h wachsen zu lassen. Bei Bedarf kann das Medium wie folgt wieder aufgefüllt werden.<ol>
<li>Entfernen Sie für die Innenseite des Einsatzes 750 µL und 750 µL frische komplette Wachstumsmedium.</li>
			<li>Entfernen Sie für die Außenseite des Einsatzes (6-Well-Platte) 1 mL zu und fügen Sie 1 mL frische komplette Wachstumsmedium. 1 mL wurde für die Bequemlichkeit der Ändern des Mediums in einem Schritt gewählt. Falls gewünscht, kann 1,25 mL entfernt und stattdessen ersetzt werden.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sammeln die Zellen
	<ol>
<li>Sammeln Sie die Zellen nach 72 h der proximalen Kultur. Besondere Vorsicht ist bei diesem Schritt zu Cross-Kontamination der HeyA8 Zellen und HPMCs. Trypsinize zu verhindern, dass die Zellen, Zentrifugieren sie und lösen Sie die Tablette anstelle von Lyse der Zellen auf der Membran um eine Kreuzkontamination zu verhindern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trypsinizing der Zellen
	<ol>
<li>Spülen Sie beide Seiten des Einsatzes mit 1 X PBS.</li>
		<li>Übertragen Sie die Einsätze zu einem neuen Brunnen und fügen Sie Trypsin. Das Innere des Einsatzes 0,5 mL Trypsin hinzu und die 6-Well-Platte, die Krebszellen an der unteren Fläche des Einsatzes befestigt trypsinize fügen Sie 2 mL Trypsin hinzu. Inkubieren Sie die Platte für 2 min bei 37 ° c</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Neutralisierung der trypsin
	<ol>
<li>Fügen Sie 1 mL der vollständigen Wachstumsmedium an der Innenseite des Einsatzes zu neutralisieren die Trypsin, pipette rauf und runter, und dann nehmen die Zellen und übertragen Sie sie auf einem beschrifteten sammelröhrchen. Fügen Sie eine zusätzliche 2 mL des vollständigen Wachstumsmedium für eine vollständige Neutralisation. Darauf sollte geachtet werden, nicht auf die Membran durchdringen beim pipettieren um eine Cross-Kontamination der Zellen zu verhindern.</li>
		<li>Um die Zellen auf der Unterseite des Einsatzes zu sammeln, pipette 2 mL Trypsin, das in Schritt 12.2 auf der unteren Fläche 2 – 3 X hinzugefügt wurde, so dass die Zellen in den unteren Teil der 6-Well-Platte fallen. Neutralisieren Sie die Trypsin auf der Unterseite der Platte mit 6 mL Wachstumsmedium zu, und übertragen Sie den Inhalt der Platte auf einen beschrifteten sammelröhrchen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sammeln und Lyse der Zellen
	<ol>
<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 X g für 3 min und Aspirieren Sie die Medien. Aufschwemmen und lyse der Zelle Pellets mit 0,7 mL Phenol und Guanidin-Thiocyanat-basierten Lyse-Reagenz für die RNA-Extraktion. Isolieren Sie die RNA mit jedem geeigneten Kit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion
Hinweis: Die folgenden Schritte beschreiben eine quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) um gen Ausdrücke Veränderungen infolge der proximalen Kultur zu studieren.
<ol><li>QPCR cDNA aus den RNA-Proben vorbereiten. Passenden Reverse Transkriptase mit einem entsprechenden Puffer und zufällige Primer verwenden, um der reversen Transkription von allen mRNA sicherzustellen (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Die Änderungen in der mRNA Ausdruck Fibronektin (FN1) und E-Cadherin (CDH1) zu bewerten und Wachstumsfaktor Beta 1 (TGFβ1) von qPCR mit Glyceraldehyde-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) als interne Kontrolle zu verwandeln. Es ist möglich, standardisierte handelsübliche Gen Ausdruck Assays zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien) oder Grundierungen zu gestalten.</li>
	<li>Vergleichen Sie die HeyA8 Zellen gewachsen im proximalen Kultur mit HPMCs mit der HeyA8-Steuerung und die HPMCs im proximalen Kultur mit den Steuerelementen HPMC angebaut.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li><li>Cupedo, T., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+interactions+in+lymph+node+development.">Cellular interactions in lymph node development.</a> The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).</li><li>Suvas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Substance+P+Neuropeptide+in+Inflammation,+Wound+Healing,+and+Tissue+Homeostasis.">Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis.</a> The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).</li><li>Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+Mechanisms+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Tissue+Repair.">Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair.</a> Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).</li><li>Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+autocrine+and+paracrine+myocardial+signals:+an+emerging+therapeutic+strategy+in+heart+failure.">Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).</li><li>Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+regulation+of+angiogenesis+by+different+cell+types+in+the+aorta+ring+model.">Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).</li><li>Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+the+cancer+stem+cells+-+what+challenges+do+they+pose.">Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).</li><li>Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+stem+cell+niche:+how+essential+is+the+niche+in+regulating+stemness+of+tumor+cells.">The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).</li><li>Elenbaas, B., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+signaling+between+epithelial+tumor+cells+and+fibroblasts+in+carcinoma+formation.">Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation.</a> Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).</li><li>Wilson, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+ligands+exhibit+functional+differences+in+models+of+paracrine+and+autocrine+signaling.">EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling.</a> Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).</li><li>Kopan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling.">Notch signaling.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).</li><li>Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juxtacrine+activation+of+epidermal+growth+factor+(EGF)+receptor+by+membrane-anchored+heparin-binding+EGF-like+growth+factor+protects+epithelial+cells+from+anoikis+while+maintaining+an+epithelial+phenotype.">Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).</li><li>Swartz, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+complexity:+emerging+roles+in+cancer+therapy.">Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy.</a> Cancer Research. 72 (10), 2473-2480 (2012).</li><li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+reprogram+normal+fibroblasts+into+cancer-associated+fibroblasts+in+ovarian+cancer.">MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer.</a> Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).</li><li>Nieman, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocytes+promote+ovarian+cancer+metastasis+and+provide+energy+for+rapid+tumor+growth.">Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).</li><li>Salimian Rizi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+mediates+metabolic+coupling+of+omentum-derived+adipose+stroma+to+ovarian+and+endometrial+cancer+cells.">Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells.</a> Cancer Research. 75 (2), 456-471 (2015).</li><li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-induced+downregulation+of+miR-193b+drives+ovarian+cancer+metastasis.">Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis.</a> Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).</li><li>Tomar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETS1+induction+by+the+microenvironment+promotes+ovarian+cancer+metastasis+through+focal+adhesion+kinase.">ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase.</a> Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).</li><li>Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis Available from: <a target="_blank" href="https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination">https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination</a> (2016)</li><li>Iwanicki, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium.">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).</li><li>Kenny, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesothelial+cells+promote+early+ovarian+cancer+metastasis+through+fibronectin+secretion.">Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).</li><li>Boelens, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+transfer+from+stromal+to+breast+cancer+cells+regulates+therapy+resistance+pathways.">Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways.</a> Cell. 159 (3), 499-513 (2014).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer.">The biology and function of exosomes in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li><li>Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+mediators+and+communicators+between+cancer+cells+and+the+tumor+microenvironment.">MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment.</a> Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Den Mechanismus der Parakrine und Juxtacrine Signale zwischen Zellen zu verstehen ist wichtig für die Entwicklung einer besseren Kenntnis des normalen Gewebes Homöostase und Krankheit Bedingungen7,8. Die meisten Parakrine signalisieren, dass durch das Sammeln von Studien sind konditioniert Medium aus einer Zelle Art und benutzen, um die anderen Zelltyp zu behandeln. Diese Methode hat einen Vorteil in seiner Einfachheit. Jedoch ist es nicht genau lokalisierten Konzentrationen der sezernierten Faktoren in der zellulären Mikroumgebung oder die Kinetik der Produktion und die Erschöpfung der beteiligten Faktoren zusammenfassen. Während erstere in gewisser Weise behoben werden kann, ist nicht genau durch die Konzentration der konditionierten Mediums, es sehr schwierig, die Kinetik neu zu erstellen. Die Verwendung von Transwell Einsätze Zellen im Einsatz und in der Tiefe des Brunnens wachsen kann, in gewisser Weise die Auswirkungen der Kinetik von Produktion und Erschöpfung zurückzuerobern. Aber die Zellen sind getrennt durch den Abstand zwischen der Einlage und die Unterseite des Brunnens und daher können nicht die lokalisierten Konzentrationen der Parakrine Faktoren neu. Wir berichteten die Entwicklung einer einfachen proximalen Kultur Methode zur gegenseitigen Parakrine Signaltechnik, studieren die lokalisierten hohen Konzentrationen der sezernierten Faktoren sowie die Dynamik der Produktion und die Erschöpfung der Faktoren beibehalten.
In einem Proof of Principle-Studie haben wir die Wirksamkeit der proximalen Kultur-Methode bei der Reproduktion die berichteten Effekte von Interaktionen zwischen Eierstockkrebs Zellen und HPMCs gezeigt. Darüber hinaus zeigten wir auch entgegengesetzte Effekte der gegenseitigen Parakrine Interaktionen auf die Expression von der epitheliale Marker E-Cadherin in HeyA8 Zellen und HPMCs. Während unser Experiment beteiligt, Kultivierung der Zellen über einen Zeitraum von 3 Tagen, es kann angepasst werden, um kürzere oder längere Zeit zeigt durch eine Anpassung der ursprünglichen Anzahl der Zellen ausgesät. Dies ermöglicht Forschern sowohl kurzfristige als auch langfristige Auswirkungen von Parakrine Signalisierung oder Zeitverlauf Studien durchzuführen. Diese einfache Methode kann möglicherweise Forschung auf Parakrine Signalisierung zwischen zwei adhärente Zelltypen, einschließlich Immunologie, Angiogenese, Zellentwicklung und Wundheilung, neben Studium auf den Tumor Mikroumgebung angewendet werden.
Die entscheidenden Schritte in dieser Methode werden die Zellen auf der unteren Fläche der Membran Aussaat und Ernte der Zellen von beiden Oberflächen am Endpunkt. Wir erreichten eine Aussaat auf der unteren Fläche von ersten spiegeln das Einfügen und dann säen die Zellen als ein großer Tropfen Medium. Mehr adhärente Zellen der beiden studierte sollten auf der unteren Fläche ausgesät werden. Pflege muss ergriffen werden, um nicht zu stören den Einsatz während der Inkubation um dieses Blob des Mediums von Störung zu vermeiden. Silikon-Gel kann auf den Rändern des Einsatzes, der Zerschlagung zu vermeiden und der Blase Flüssigkeit verschüttet angewendet werden. Am Ende des Experiments proximalen Kultur sind die Zellen auf beiden Seiten der Membran sequenziell statt trypsiniert lysiert direkt, weil sie auf die Membran Risiken Kreuz-Kontamination von Lysaten durch die Poren Lyse. Durch trypsinizing sie in ihre einzelnen Kompartimente und darauf achten, dass das Medium und Trypsin Volumen nie die festgelegte Menge des Protokolls überschreitet, ist Kreuzkontamination vermieden. Jeder Zelltyp wird in einem separaten Rohr, zentrifugiert, gesammelt und ist dann die Zelle Pellet lysiert.
Obwohl diese Technik die wirksame Untersuchung der Parakrine Wechselwirkungen ermöglicht offene direkte Interaktionen zu vermeiden, auszuschließen nicht wir Interaktionen durch tunneling Nanotubules (TNTs). Einige von diesen TNTs kann schmal genug, um die 0,4 µm-Poren durchdringen und lange genug, um die 10 µm Dicke der Membran erstrecken. Während unsere Versuche, ihre Präsenz in den Poren durch konfokale Mikroskopie zu überzeugen waren nicht schlüssig (Daten nicht gezeigt), könnte potenziell Elektronenmikroskopie eingesetzt werden, um ihre Anwesenheit zu bestätigen. Daher schließt diese Methode nicht aus den potenziellen Zell-Zell-Kommunikation durch TNTs wenn die Kandidaten-Zellen in der Lage sind, sie zu bilden und durch sie interagieren. In ähnlicher Weise auszuschließen nicht erhöhte Autokrine Signalisierung durch die mögliche Sperrung der Poren durch Zellen auf beiden Seiten der Membran Kreuz-Verbreitung zu verhindern.
Wachsenden Zellen entweder oberflächlich eine Membran mit 0,4 µm-Poren ermöglicht auch den möglichen Austausch von exosomen. Exosomen wurden traditionell als Müllbeutel von Zellen, sondern neueste Forschung hat gezeigt, dass diese Vesikel mit ihrer Ladung der Proteine, Micro-RNAs, und sogar mRNAs und DNA als wichtige Vermittler von Parakrine Mobilfunk22 dienen , 23 , 24. daher der proximalen Kultur-Methode effektiv einsetzbar, Mobilfunk durch exosomen zu studieren. Darüber hinaus ist diese Methode auf die Behandlung mit spezifischen Inhibitoren der Signalisierung oder neutralisierende Antikörper gegen die sekretierten Liganden oder entsprechenden Rezeptor zugänglich. Zusammenfassend lässt sich sagen berichteten wir über die Entwicklung der eine einfache und vielseitige proximalen Kultur-Methode, die genau Parakrine Signalisierung und verhindert direkte Interaktionen zwischen den Zellen repliziert werden kann. Die Einfachheit dieser Methode ermöglicht die breite Anwendung in den unterschiedlichsten Bereichen wie Krebsbiologie, Entwicklung und Immunologie.

Die Rolle der produktive gegenseitige Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und der Tumor Mikroumgebung in Tumorprogression gut etabliert und ist ein wichtiger Schwerpunkt der Forschung auf Krebs Biologie1geworden. Ähnliche Fälle der bidirektionalen Signalisierung sind von entscheidender Bedeutung bei der Wundheilung, Immunreaktionen, Angiogenese, Stammzell-Nischen, und während der Entwicklung2,3,4,5,6 , 7 , 8. ein gemeinsames Thema in all diesen biologischen Prozessen ist, dass Zellen reagieren auf verschiedene Weise extrazelluläre Signale aus ihrer Mikroumgebung die Zelle Schicksal, Gewebe-Physiologie und Fortschreiten der Krankheit zu bestimmen. Daher hat der Fokus zunehmend wandte sich an ein besseres Verständnis der Mechanismen, die in solchen Zell-Zell-Kommunikation. Ein Großteil solcher Wechselwirkungen beinhalten Parakrine oder Juxtacrine Signale zwischen Zellen. Parakrine Signalisierung beinhaltet die Sekretion von bestimmten Signalisierung Faktoren durch eine Zelle, die durch entsprechende Rezeptoren auf eine andere Zelle in der Nähe,9,10, eine Reaktion in ihm auslöst, während Juxtacrine wahrgenommen werden Signalisierung erfordert direkten Kontakt zwischen zellulären Komponenten der beiden Zellen beteiligt11,12.
Diese Signalisierung ist eine entscheidende Komponente in Gewebe Homöostase sowie in der Tumor-Mikroumgebung. Die Krebszellen profitieren von Parakrine und Juxtacrine Faktoren von Zellen in der Tumor-Stroma, einschließlich Krebs-assoziierten Fibroblasten (CAFs), Immunzellen und Adipozyten13,14,15,16. Die Parakrine Signale von Wachstumsfaktoren, Zytokine, Chemokine, etc., vermittelt werden können, während der Juxtacrine signalisieren nebeneinander angeordneten Liganden und Rezeptoren wie Notch Signalisierung oder Wechselwirkungen zwischen Integrine und deren jeweilige beinhaltet extrazelluläre matrixproteine. Wir haben die Bedeutung der gegenseitigen Wechselwirkungen zwischen Eierstockkrebs Zellen und CAFs im Tumor Progression und Metastasierung14gezeigt. In ähnlicher Weise regulieren die Wechselwirkungen von metastasierenden Eierstockkrebs Zellen mit den auf der Website von Metastasen Mesothelzellen wichtige Mikro-RNAs und Transkriptionsfaktoren in den Krebszellen die metastatische Besiedlung17, zu fördern 18.
Die meisten Studien über Parakrine Signalisierung beinhalten die Verwendung eines konditionierten Mediums gesammelt von einem Zelltyp, die zweite Zelle Art mit zu behandeln. Während dieser Ansatz weit verbreitet wurde, ist es nicht effektiv lokalisierten hohe Konzentrationen des Faktors abgesondert in der Mikroumgebung von der Empfängerzelle repliziert. Es auch nicht reproduzieren die Kinetik der den kontinuierlichen Fluss des Faktors abgesondert von einer Zelle produziert und erhielt von der benachbarten Zelle. Parakrine Signalisierung über kurze Distanzen effektiv ist wie die sezernierten Faktoren in den erforderlichen Konzentrationen nur in der Nähe der Quellzelle sind und neigen zu diffundieren und verdünnen zunehmender Entfernung. Diese lokalisierten hohe Konzentration des Faktors sekretierten unbedingt eine Antwort in der Empfängerzelle ausgelöst. Darüber hinaus ist die Antwort in den empfängerzellen auch die Balance zwischen neu sezernierten Faktoren und ihre ständige Erschöpfung durch Abbau, Bindung und Internalisierung empfängerzellen und Verbreitung von der Quellzelle abhängig. Konditionierten Medium kann konzentrierter entfallen die höheren lokalisierten Konzentrationen in der Mikroumgebung vorhanden sein, aber, die nicht genau reproduzieren kann die genaue Konzentrationen. Darüber hinaus kann nicht es die natürliche Kinetik der Produktion und die Erschöpfung der beteiligten Faktor imitieren. Um genauer Parakrine Signalisierung zu replizieren und trennen Sie ihn von Juxtacrine signalisieren Mechanismen, haben wir eine neuartige proximalen Kultur-Methode entwickelt, die bringt die beiden Zelltypen entweder oberflächlich eine poröse Membran wachsen. Die Poren sind klein genug, um zu verhindern, dass Juxtacrine Interaktionen und noch ermöglichen den Austausch von sezernierten Faktoren bei lokalisierten hohen Konzentrationen. Auf diese Weise behält dieses System die Kinetik der Produktion und die Erschöpfung der Parakrine Faktoren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 mm Transwell permeable support with 0.4 &#181;m Pore Polycarbonate Membrane Insert</td>
			<td>Corning (Costar)</td>
			<td>3412</td>
			<td>&#8226; 10 &#181;m thick translucent polycarbonate membrane 
			&#8226; Treated for optimal cell attachment 
			&#8226; Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case 
			&#8226; Membrane must be stained for cell visibility 
			&#8226; Sterilized by gamma radiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning (Falcon)</td>
			<td>353046</td>
			<td>Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm culture dish</td>
			<td>Corning (Falcon)</td>
			<td>353025</td>
			<td>Sterile, TC-treated Cell Culture Dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning (Cellgro)</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Nonessential amino acids</td>
			<td>Corning (Cellgro)</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamins</td>
			<td>Corning (Cellgro)</td>
			<td>25-020-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any make is fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any make is fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety level II cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any make is fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FN1 TaqMan Gene Expression Assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs01549976_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs00998133_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDH1 TaqMan Gene Expression Assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs01023895_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH TaqMan Gene Expression Assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Hs99999905_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy mini RNA isolation Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>43-688-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeyA8 ovarian cancer cells</td>
			<td>Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946; Neutralizing Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1835-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a proximal culture method to study paracrine signaling between cells

Interzelluläre Wechselwirkungen spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen, einschließlich der Tumorprogression, Immunreaktionen, Angiogenese und Entwicklung. Parakrine oder Juxtacrine signalisieren vermittelt diese Wechselwirkungen. Die Verwendung eines konditionierten Mediums und Coculture Studien sind die am häufigsten verwendeten Methoden zur Unterscheidung zwischen diesen beiden Arten von Interaktionen. Jedoch die Wirkung der lokalisierten hohe Konzentrationen von sezernierten Faktoren in der Mikroumgebung während die Parakrine Interaktionen ist nicht exakt von konditionierten Medium zusammengefaßt und so zu ungenauen Ergebnissen führen kann. Um dieses Problem zu überwinden, haben wir eine proximale Kultur-Methode, um Parakrine Signalisierung studieren entwickelt. Die zwei Zelltypen werden entweder oberflächlich eine 10 µm dicken Polycarbonat-Membran mit 0,4 µm-Poren angebaut. Die Poren ermöglichen den Austausch von sezernierten Faktoren und zur gleichen Zeit hemmen Juxtacrine signalisieren. Die Zellen können gesammelt und am Endpunkt zu bestimmen, welche Auswirkungen die Parakrine Signalisierung lysiert. Darüber hinaus ermöglicht es für lokalisierte Konzentration Steigung von sezernierten Faktoren, ist diese Methode offen für Experimente mit längere Kultur sowie der Einsatz von Inhibitoren. Während wir diese Methode anwenden, um die Wechselwirkungen zwischen Eierstockkrebs Zellen und die Mesothelzellen stoßen sie auf der Website von Metastasen zu studieren, kann es zwei adhärente Zelltypen für Forscher, Parakrine Signalisierung in verschiedenen Bereichen zu studieren angepasst, einschließlich Tumor Mikroumgebung, Immunologie und Entwicklung.

Metastasierenden Eierstockkrebs Zellen stoßen Mesothelzellen am Ort der Metastasen in die Bauchhöhle19. Produktive Parakrine und Juxtacrine Interaktionen mit Mesothelzellen Hilfe bei der Induktion von adaptive Reaktionen in den Eierstock-Krebs-Zellen, die ermöglichen erfolgreiche Metastasierung17,18,20,21 . Um die Wirksamkeit der proximalen Kultur-Methode zu testen, haben wir die Parakrine Interaktionen zwischen HeyA8 Eierstockkrebs Zellen und HPMCs getestet. Es wurde zuvor berichtet, dass eine Coculture von HeyA8 Zellen mit HPMCs führt zu erhöhten Ausdruck der Fibronektin in der HPMCs21. Diese Induktion von Fibronektin Ausdruck wird durch eine vermehrte Ausschüttung von TGFβ durch die HeyA8 Zellen21vermittelt. Daher haben wir die Wirkung einer proximalen Kultur der HeyA8 Zellen und HPMCs auf die mRNA-Niveaus von Fibronektin und TGFβ in diesen beiden Zellen getestet. Erwartungsgemäß ergab proximalen Kultur mit HeyA8 Zellen in einem erhöhten Ausdruck der Fibronektin in der HPMCs im Vergleich zu Kontrollen, die auf Einsätzen ohne HeyA8 Zellen an der unteren Fläche (Abbildung 2A) ausgesät wurden. In ähnlicher Weise die proximalen Kultur des HPMCs mit HeyA8 Zellen führte zu erhöhten Ausdruck der TGFβ in der ehemaligen (Abb. 2 b). Der Ausdruck der Fibronektin und TGFβ auch deutlich erhöht in HeyA8 Zellen nach proximal Kultur mit HPMCs im Vergleich zu Kontrollen, wo HPMCs nicht in der oberen Fläche der Einsätze (Abbildung 2 und 2D) ausgesät wurden.
Um die Wirkung der klassischen konditionierten mittlerer Ansatz zu vergleichen, haben wir ein Experiment, die Behandlung von HeyA8 Zellen mit einem HPMC konditioniertes Medium durchgeführt. Gab es einen Rückgang der Fibronektin Ausdruck und eine signifikante Veränderung im TGFβ in HeyA8 Zellen mit dem HPMC konditioniertes Medium behandelt. (Abbildung 3A und 3 b). Wir haben auch das Potenzial der sekretierten TGFβ mit einem neutralisierenden Antikörper in der proximalen Kultur zu blockieren. Behandlung mit dem TGFβ neutralisierende Antikörper führte zu einem deutlichen Rückgang in der Induktion von TGFβ HeyA8 Zellen im proximalen Kultur mit HPMCs (Abbildung 3). Jedoch stieg der TGFβ neutralisierende Antikörper TGFβ Ausdruck in der Kontrollzellen HeyA8, wahrscheinlich als eine kompensatorische Reaktion (Abbildung 3).
Darüber hinaus haben wir auch den Effekt der proximalen Kultur auf den Ausdruck der epitheliale Marker E-Cadherin getestet. Während proximalen Kultur mit HeyA8 Zellen den E-Cadherin-Ausdruck in der HPMCs (Abb. 2E) leicht gestiegen sind, verzeichneten ein deutlichen Rückgang der E-Cadherin HeyA8 Zellen, die in der Nähe des HPMCs im Vergleich zu Kontrollen (Abb. 2F) gezüchtet. Zusammen genommen, diese Ergebnisse belegen die Wirksamkeit des Kultursystems der proximalen studieren die Parakrine Signalisierung zwischen Eierstockkrebs Zellen und die normalen Zellen am Ort der Metastasierung, die Gen-Expression in beiden Zelltypen während beeinflussen die Prozess der metastatischen Kolonisation.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58144/58144fig1.jpg"> Abbildung 1: Montage des proximalen Kultursystem. (A) dieses Panel zeigt menschliche primäre Mesothelzellen (HPMCs). (B) dieses Panel zeigt HeyA8 Eierstockkrebs Zellen. Skalieren von Balken = 200 µm (A-B). (C) HeyA8 Zellen auf der Unterseite von einem Transwell gesät wurden mit 0,4 µm-Poren einsetzen. Sobald die Zellen angefügt wurden, wurde der Einsatz in einem Brunnen von einer 6-Well-Platte mit Wachstumsmedium gesetzt. Mesothelzellen wurden dann in den Einsatz ausgesät, so dass sie an der Oberseite befestigt und wurden von den HeyA8 Zellen durch die Membran getrennt. Die 0,4 µm-Poren in der Membran ermöglichte den Austausch von abgesondert Faktoren aber keinen direkten Kontakt zwischen den Zellen gehemmt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58144/58144fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58144/58144fig2.jpg"> Abb. 2: Auswirkung der proximalen Kultur auf mRNA Ausdruck. Die ersten beiden Platten zeigen die qPCR Fibronektin (A) und (B) TGFβ1 Ausdruck im menschlichen primäre Mesothelzellen (HPMCs) nach proximal zu HeyA8 Zellen, im Vergleich zur Kontrolle HPMCs kultiviert. Die nächsten beiden Fenster zeigen die qPCR Fibronektin (C) und (D) TGFβ1 Ausdruck in den HeyA8 Zellen kultiviert proximal, HPMCs, im Vergleich zur Kontrolle Heya8 Zellen. Die letzten beiden Panels zeigen die qPCR für die E-Cadherin-Expression in (E) HPMCs proximal kultiviert, HeyA8 und HeyA8 (F) Zellen kultiviert proximal zu HPMCs. N = 3, * p < 0,01. Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung der drei Wiederholungen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58144/58144fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58144/58144fig3.jpg"> Abbildung 3: Wirkung von menschlichen primäre mesothelial Zelle (HPMC)-mittlere Behandlung auf die mRNA Expression von HeyA8 Zellen bedingt. Die oberen beiden Platten zeigen qPCR Fibronektin (A) und (B) TGFβ1 Ausdruck in den HeyA8 Zellen. (C) dieses letzten Panel zeigt die Auswirkungen der Hemmung der sekretierten TGFβ1 mit einem neutralisierenden Antikörper (TGFβ1 Ab) auf der HeyA8 TGFβ1 Ausdruck nach einem proximalen Kultur mit HPMCs. N = 3, * p < 0,01. p < 0,05. Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung der drei Wiederholungen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58144/58144fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells at JoVE.com

A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

Parakrine und Juxtacrine zelluläre Interaktionen spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen, einschließlich der Tumorprogression, Immunreaktionen, Angiogenese und Entwicklung. Hier ist eine proximale Kultur-Methode zur Untersuchung Parakrine Signalisierung wo sind die lokalisierten Konzentrationen der sezernierten Faktoren beibehalten und zelluläre Direktkontakt zu verhindern.

Eine proximale Kultur-Methode zu studieren, Parakrine Signale zwischen Zellen

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and ...

a-proximal-culture-method-to-study-paracrine-signaling-between-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.4K Aufrufe.  Indiana University School of Medicine. Parakrine und Juxtacrine zelluläre Interaktionen spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen, einschließlich der Tumorprogression, Immunreaktionen, Angiogenese und Entwicklung. Hier ist eine proximale Kultur-Methode zur Untersuchung Parakrine Signalisierung wo sind die lokalisierten Konzentrationen der sezernierten Faktoren beibehalten und zelluläre Direktkontakt zu verhindern.

Serie: A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Forschung

Biologie

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hallo-C: eine Methode, um die dreidimensionale Architektur des Genoms Study.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Ein System zur Kultivierung Iris Pigmentepithelzellen nach Lens Regeneration in Newt Study

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

Ein PCR-basierte Genotypisierung Methode, zwischen Wildtyp-und Ziersorten Unterscheiden von Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

Visualization of Vascular Ca 2 + Signaling Ausgelöst durch Parakrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

Ein High-Content-Imaging Workflow Grb2 Signaling-Komplexe durch Expression Cloning Studie

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Verfahren zur embryonalen Maus Herz

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the brain, liver, retina, cochlea and vasculature. In experimental settings, intercellular Ca2+-waves can be elicited by applying a mechanical stimulus to a single cell. This leads to the release of the intracellular signaling molecules IP3 and Ca2+ that initiate the propagation of the Ca2+-wave concentrically from the mechanically stimulated cell to the neighboring cells. The main molecular pathways that control intercellular Ca2+-wave propagation are provided by gap junction channels through the direct transfer of IP3 and by hemichannels through the release of ATP. Identification and characterization of the properties and regulation of different connexin and pannexin isoforms as gap junction channels and hemichannels are allowed by the quantification of the spread of the intercellular Ca2+-wave, siRNA, and the use of inhibitors of gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-wave in monolayers of primary corneal endothelial cells loaded with Fluo4-AM in response to a controlled and localized mechanical stimulus provoked by an acute, short-lasting deformation of the cell as a result of touching the cell membrane with a micromanipulator-controlled glass micropipette with a tip diameter of less than 1 &mu;m. We also describe the isolation of primary bovine corneal endothelial cells and its use as model system to assess Cx43-hemichannel activity as the driven force for intercellular Ca2+-waves through the release of ATP. Finally, we discuss the use, advantages, limitations and alternatives of this method in the context of gap junction channel and hemichannel research.

Intercellular Ca2+-waves are driven by gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-waves in cell monolayers in response to a local single-cell mechanical stimulus and its application to investigate the properties and regulation of gap junction channels and hemichannels.

Mechanische Stimulation induzierte Calcium Wellenausbreitung in Zellmonoschichten: Das Beispiel Bovine Endothelzellen

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...