この作品は、NIH/NHGRI R00 HG006922 と j. g. に NIH/NHGRI R01 HG008974 とハンツマン癌研究所によって支持されました。J.B.C. は、NIH の遺伝学 T32GM007464 トレーニング プログラムによって支えられました。

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このプロトコルでは、物理的に dna 塩基配列を変えることがなく内因性の genomic 位置でエンハンサー機能を解剖するための簡単で柔軟なメソッドについて説明します。間 dCas9 KRAB27を使用して以前に発行された CRISPR 干渉プロトコルに概念で類似した、3 つの主要な方法でこれらのプロトコルが異なりますエンハンサー i。まず、エンハンサー i は、エンハンサーの非アクティブ化を達成するために MAD120の SIN3A の相互作用ドメインを利用しています。エンハンサーの非アクティブ化は、非アクティブ化の主要なメカニズムが HDAC 依存であることを示唆している HDAC の抑制剤を使用して救出することができます。DCas9 KRAB に CRISPR 干渉とは異なり、エンハンサー i は H3K9me3 の沈着に導かない。これは、エンハンサー i ガイド Rna、3 日間で収穫されて細胞をトランスフェクションの記事の一時的な導入に依存しているという事実のために可能性が高いです。CRISPR 干渉で 7 日間ポスト伝達12H3K9me3 の増加が観察されます。最後に、エンハンサー i プロトコルは、複数のサイトを同時にターゲットし、ターゲットの効率を監視するための戦略を提供します。モザイク seq17、dCas9 KRAB が複数エンハンサーを同時にターゲットに使用しますが、この手法で表現の変更を識別するために単一細胞 RNA シーケンスで利用され (エストロゲン応答遺伝子) など多くの遺伝子が低いのため探知されていなく行く単一細胞 RNA シーケンス エンハンサー-i の感度は、エンハンサーを個別に任意の遺伝子を組み合わせて研究を信頼性の高い方法を提供します。
エンハンサー i の最も重要なステップは、トランスフェクション興味の細胞ラインのために最適化する必要があります。ピューロマイシン transfected セルを豊かにするためにこのプロトコル依存しますが、可能な蛍光蛋白質及びフローサイトメトリーを使用して蛍光セルの並べ替えと共同 transfecting ガイド Rna は、いくつかの細胞への良い濃縮法証明するかもしれないタイプ。トラブルシューティングを行うし、トランスフェクションを確認する qPCR によるガイド Rna の発現レベルと SID4x-dCas9-KRAB の監視をお勧めします。ガイド RNA レベルが低いかどうか (サイクルしきい値 > 30)、ユーザーまた RNA の生産戦略の in vitro転写28など代替ガイドを検討する場合があります。高 gRNA レベルにもかかわらずガイド SID4x-dCas9-KRAB 蛋白質の RNA をターゲットすることは効率的ではありません、RNA シーケンスをガイドの場合異なる選択をする必要があります可能です。エンハンサー i 扱われる細胞クロマチンと融合タンパク質のチップ seq を実行すると、ターゲットの効率を監視できます。SID4x-dCas9-KRAB 関心の領域での高信号があり、その推定ターゲット遺伝子の表現の変更が検出されない場合、可能性が高い地域は検討した条件の下でその遺伝子の発現に影響しません。
エンハンサー-i の 1 つの潜在的な制限は、あまりにも多くのサイトが同時に対象とした場合、オフターゲット効果が蓄積する可能性です。それにもかかわらず、ノックダウンの CRISPR 干渉戦略少数がある RNAi29よりターゲット効果を特に dCas9 KRAB を表現するポリクローナル セルラインを使用時。我々 は同時に 10 のサイトをターゲットにする場合 SID4X-dCas9-KRAB の標的をゲノム結合を見ていますが、ないそれらのバインド イベントの結果として遺伝子発現変動を同定しました。いくつかエンハンサーは複数のプロモーターおよび/または他のエンハンサーに連絡、遺伝子発現制御のこの形態は共通かは明らかではないが、多くの遺伝子が単一のエンハンサーのターゲット式に変更されることが可能です。式変化観察特定エンハンサーをターゲットことを確認していないターゲットに効果、ユーザーは非重複ガイド Rna ターゲットに同じ地域の 2 つの明瞭なセットとエンハンサー i を実行できます。また、ヌクレアーゼ有能な Cas9 を使用して、領域の遺伝子の欠失はさらに遺伝子発現に及ぼす影響を確認できます。
ヒストン脱アセチル化を介してエンハンサー i 機能としてその無効化能力のヒストンのアセチル化のレベルがかなり増強に制限が可能です。さまざまな可能性があります特定のエンハンサーをターゲットでより効果的な代替の抑圧的な融合があります。遠位エンハンサー30、ターゲット遺伝子の発現を抑える dCas9 への DNA メチルトランスフェラーゼ融合を使用できますが、この抑圧が一時的でよくないです。別の抑圧的な融合は、ヒストン H3 のリジン 27 トリメチルにつながる、さまざまな細胞ラインとプロモーター31dCas9 ボブと同様のレベルでの遺伝子発現を抑制する友人の GATA1 (噴霧試験 ※ 1) ドメインを使用します。興味深いことに、SID のドメインの単一のコピーがエンハンサー i で現在使用されている 4 つのコピーよりもより多くのエンハンサー非アクティブ化を提供することが示唆しているプロモーターで抑圧的な可能性を低減噴霧試験 ※ 1 のより多くのコピーを dCas9 に追加します。いくつかの遺伝子座上 dCas9 融合のさまざまな組み合わせによるデュアル ターゲットから寄与するかもしれないことが可能です。たとえば、安定した長期的な抑圧は dCas9 DNMT3a と dCas9 KRAB32の同時伝達によって達成できます。これらの抑圧的な融合のほとんどだけ、一度に単一の軌跡に対象となってにいるし、不明のままは、同時に複数のエンハンサーを操作するに最も効果的であります。
エンハンサー-i、一握りの遺伝子の増強物の組み合わせを研究するための適切な方法ながらまだ多少スループット ユーザーが何百もの遺伝子の推定エンハンサーを勉強したい場合限られます。この技術の将来のアプリケーションは、複数のサンプルに複数の遺伝子を同時に定量化するイメージング技術を組み込む予定します。重要なは、これらの技術は時間のかかる RNA の隔離の必要性を排除、ライセートから RNA 分子の直接検出と互換性が。これらの適応はエンハンサーの大きいセットの尋問を容易にするため。

大規模なエンコード1、ロードマップ早稲田2、ファントムなどプロジェクトのシーケンス3セルタイプの数百にわたる数百万の人間のゲノムの内で推定エンハンサーを識別しました。各プロモーターに関連付けます 4.9 エンハンサーの平均、各エンハンサーと交信 2.4 遺伝子3の平均遺伝子発現は頻繁複数分散規制相互作用の統合の結果であることを示唆するいると推定されます。重要な残りの課題だけでなく個々 のエンハンサーは、遺伝子発現に貢献を定義することですが表現に影響を与える結合方法しますが、。遺伝子解析、マウス5ショウジョウバエ4からのモデル生物のエンハンサーの間の関係を識別するために使用されます。しかし、これらの実験は時間がかかり、複数の遺伝子に複数のエンハンサーの研究の低スループットです。
大規模なエンハンサー機能を勉強するための 1 つのアプローチには、並列のレポーターの試金が含まれます。これらの試金 DNA シーケンス6レポーター遺伝子の発現をドライブする能力についての何千もの同時のスクリーニングを可能にします。これらのアッセイは、DNA シーケンスでは、遺伝子制御情報7を伝えるために十分なだけすることができます示されている、彼らはネイティブ クロマチンのコンテキストの外部で実行中の注意事項と異種プロモーター付属します。さらに、超並列レポーターの試金の分析対象の DNA シーケンスのサイズは通常関連する周囲のシーケンスを除外する可能性があります未満 200 ヒトです。重要なは、レポーターの試金はのみ、一度に 1 つのシーケンスの活性を測定ととることはありません考慮エンハンサーの間に存在することができます複雑な関係。したがって、並列レポーターの試金が DNA シーケンスの本質的な活動についての参考情報であるが、彼らはありません必ずしもお知らせゲノムのコンテキストでその DNA シーケンスの関数の。
最近内因性遺伝子座でエンハンサーの削除ができるよう、開発した CRISPR/Cas9 ツール8が遺伝子発現制御の研究を促進しました。ゲノム不安定性につながる可能性があります複数のエンハンサーを同時に削除するし、それは単一セルラインで連続エンハンサー削除を生成する時間がかかる。さらに、修復、削除のサイトで新しいゲノム配列が作成され、このシーケンスは、調節機能を得ることができます。9,10を活性化または抑制 Cas9 のヌクレアーゼ欠損形態に11,12ドメインの融合に依存する遺伝子発現を調節することのために特別開発した Cas9 の代替バージョン(dCas9)。これらの融合蛋白質は、彼らは物理的に DNA シーケンスを変更し、代わりに規制地域を調査するためにエピジェネティクスを調節すると同時に複数の遺伝子座の勉強に最適です。最も広く使われている抑圧的な融合は、抑圧のヒストン H3 のリジン 9 のトリメチル (H3K9me3)13の堆積を促進 KAP1 コリプレッサー複合体を募集する KRAB です。dCas9-KRAB、として知られているまた CRISPR 干渉14、遺伝子発現15,16; への貢献ターゲットと画面の個々 の増強に使用されていますただし、同時に複数の地域をターゲットにしない最適化されています。エンハンサー、モザイク seq17、多重 CRISPR 干渉の影響の 1 つのバージョンは、読み出しとして単一細胞 RNA シーケンスを使用しますが、この技術は高価で、単一細胞の感度が低いため高発現遺伝子の研究にのみ適してRNA シーケンス
我々 はエストロゲンに転写応答のコンテキスト内で組合せエンハンサー機能解剖 CRISPR 干渉に基づく手法を開発しようとしました。エストロゲン応答遺伝子の約半分が含まれて 2 つ以上エンハンサー縛られてエストロゲン受容体 α (ER)18、近くに複数のエンハンサーのエストロゲン応答に参加して規制のロジックが必要になりますを理解可能性があることを示唆しています。同時に複数のエンハンサーを対象とします。プロモーターに CRISPR 干渉を用いた初期の研究は、すべてのプロモーターは KRAB 仲介抑圧19に均等に敏感ことを示唆と私たちは dCas9 への抑圧的なドメインの追加が非活性化を促進するかもしれないと判断多様なエンハンサー。我々 は選んだ Sin3a の相互作用ドメインの Mad1 (SID)20それヒストン脱アセチル化酵素21の採用につながると転写活性に関連付けられているヒストンのアセチルのグループを削除します。重要なは、SID のドメイン dCas922と23の物語に融合遺伝子の発現を減らすことで有効であったし、Sin3a 様々 なエンハンサー シーケンス コンテキスト24で強力な抑圧的な共同の要因であることが示されています。我々 は ER によってバインドされている 10 の異なるエンハンサーを対象とする SID4x-dCas9-KRAB (エンハンサー-i) を使用し、4 遺伝子18エストロゲン転写反応に必要な小胞体結合部位 (ERB) を識別します。またエストロゲン転写応答の生産に協力するサイトを識別するエンハンサーの組み合わせを取り上げた。その 50 サイトまですることができます潜在的の対象になる同時に検出可能な遺伝子発現変動がわかった。チップ seq と RNA シーケンスを使用して、エンハンサー i が複数エンハンサーを同時に研究のための特異性の高い技術であることを示しました。
このプロトコルではエンハンサー-i、ティッシュ文化の設定で同時に複数のエンハンサー機能研究をできる柔軟な技術を実行するための手順をについて説明します。エンハンサー i 遺伝子欠失との相関が大きいが、ヒストン脱アセチル化酵素 (Hdac) に依存している一時的な不活性化を提供します。ガイドを提供する Rna ウイルスベクターによる安定した統合ではなく一過性トランスフェクションを介して堆積と H3K9me3 の潜在的な広がりこのプロトコルを回避できます。このプロトコルの詳細ガイド RNA デザインとクローニングのトランスフェクション ギブソン アセンブリを介してガイド リポフェクションを使用して Rna と qPCR による結果の遺伝子発現の解析を変更します。我々 はゲノムとトランスクリプトームのレベルを対象にしたエンハンサー i の特異性を評価する方法があります。この手法を研究開発した小胞体遺伝子はひと癌細胞株におけるエンハンサーをバインド、すべての哺乳類のエンハンサーの解剖にも適用可能です。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="742">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">ZR 96-well Quick-RNA Kit</td>
			<td style="width:112px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">R1053</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4389986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">AflII restriction enzyme</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0520S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:344px;">Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0531L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2621L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">FuGENE HD</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">DNA Clean &#38; Concentrator Kit</td>
			<td style="width:112px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">D4013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Buffer RLT Plus</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">1053393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">b-estradiol</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Human: Ishikawa cells</td>
			<td style="width:112px;">ECACC</td>
			<td style="width:119px;">99040201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">H3K27ac rabbit polyclonal</td>
			<td style="width:112px;">Active Motif&#160;</td>
			<td style="width:119px;">39133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">H3K9me3 rabbit polyclonal</td>
			<td style="width:112px;">Abcam&#160;</td>
			<td style="width:119px;">ab8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">FLAG mouse monoclonal</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">ER alpha rabbit polyclonal</td>
			<td style="width:112px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">pGL3-U6-PGK-Puro plasmid</td>
			<td style="width:112px;">Addgene&#160;</td>
			<td style="width:119px;">51133</td>
			<td style="width:167px;">Shen et al., 2014</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">gRNA_cloningVector plasmid</td>
			<td style="width:112px;">Addgene&#160;</td>
			<td style="width:119px;">41824</td>
			<td style="width:167px;">Mali et al., 2013</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">AflII U6 puromycin plasmid</td>
			<td style="width:112px;">Addgene&#160;</td>
			<td style="width:119px;">106404</td>
			<td>Carleton et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">SID4X-dCas9-KRAB plasmid</td>
			<td style="width:112px;">Addgene&#160;</td>
			<td style="width:119px;">106399</td>
			<td>Carleton et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:344px;">UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:112px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:344px;">KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, with KAPA mRNA Capture Beads</td>
			<td style="width:112px;">Kapa Biosytems</td>
			<td style="width:119px;">KK8420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:344px;">Pierce Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A32959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Formaldehyde solution</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">252549-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:344px;">Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:344px;">LB Broth</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10855001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Quick-DNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:112px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">D3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Quick-Load Purple 2-Log DNA Ladder</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0050S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of enhancer function using multiplex crispr-based enhancer interference in cell lines

複数エンハンサーはしばしばある特定の遺伝子を調節する、まだほとんどの遺伝子は不明のまま、エンハンサーは、遺伝子の発現に必要などのようにこれらの増強物結合転写応答を生成します。エンハンサーの何百万人を特定したとゲノム規模でエンハンサー機能を決定する高スループット ツールが必要です。エンハンサー機能を研究するための現在の方法は、ヌクレアーゼ熟練した Cas9 を使用して遺伝的削除ですが複数の連続したクローンの細胞が必要としてこのテクニックを使用して複数のエンハンサーの組合せの効果を検討することは困難生成されます。エンハンサー-i、その内因性遺伝子座で同時に複数のエンハンサー機能の尋問は、CRISPR 干渉ベースの方法を紹介します。エンハンサー i ターゲット遺伝子ヒストンの脱アセチル化を介してエンハンサーを非アクティブ化を達成するために Cas9、SID および KRAB、ヌクレアーゼ欠損に溶ける 2 つの抑圧的なドメインの使用になります。このプロトコルは利用ガイド対象地域の一時的な不活性化を有効にする Rna のトランスフェクションと組織文化の設定で刺激誘導型転写応答をブロックで特に効果的です。エンハンサー i は、ゲノムをターゲットとグローバル遺伝子発現への影響の両方非常に固有です。このプロトコルから得られた結果は、エンハンサーが遺伝子発現の出資の大きさと他の近くのエンハンサーでの貢献の影響に貢献しているかどうかを理解を助けます。

プロトコルで説明したワークフローの模式図を図 1に示します。エストロゲン調節遺伝子MMP17、チップ seq (図 2 a) で定義されている近隣 3 の結合部位を持っている近い ER バインド エンハンサーの貢献ガイド Rna を決定するため、地域ごとに設計されました。ガイド Rna シーケンスの各小胞体を周囲の 600-900 bp ウィンドウを設計するには、興味の結合部位は選択されガイド RNA デザイン プログラムに入れています。ガイド、その結果 RNA 配列 0-2 BLAT を使用して人間のゲノムに一直線に並んだサイト ターゲットを予測します。4 非重複ガイド Rna チップ seq によって定義される領域を指すと DNaseI の過敏症 (図 2 b) をターゲットに選ばれました。追加シーケンス (表 1) は、下流のクローン作成と結果 59 ヌクレオチド断片が命じられた容易に各端に追加されました。到着後、ガイド Rna は希釈され、サイト、および短い PCR によってプールだった実行ギブソン アセンブリ前に相同領域を追加できます。図 2 59 basepair の両端にシーケンスの 20 ヒトを追加"U6_internal"プライマー (表 1) を使用して短い PCR 後予想されるガイド RNA 製品ガイド RNA 断片、〜 100 basepair シーケンスの結果を示しています。ギブソン アセンブリこれらガイド RNA プールが細菌に変身した、プラスミド minipreps は、次の一日を用意しました。図 2 Dエンハンサー-i を使用して組み合わせ、エンハンサー解剖実験により, MMP17の近くに複数のエンハンサーを単独で対象との結果を示しています。エンハンサー i の対象となるサイトは、黒い六角形で示されます。示されているサイトをターゲット ガイド RNA プラスミド安定に発現する SID4X-dCas9-KRAB エストロゲンを奪われた石川細胞ラインに導入させた。2 日後はメディアが変更され、ピューロマイシン transfected セルの豊かを追加しました。次の日セルを 8 h 10 nM エストラジ オール投与収穫されました。RNA が分離され、ワンステップ qPCR を行った。この例ではサイト 1 と 2、 MMP17の完全なエストロゲン応答に必要なサイト 3 は (図 2 D、車線 ii 〜 iv) これらの条件の下で含まれません。2 または 3 サイトのみがアクティブなとき (vi と vii) エストロゲン応答は、サイトがないようアクティブ (viii)、これらのサイトが独立して貢献できないことを示唆しています。(V)、それ自体でいくつかの表現を貢献できるサイト 1、サイト 1 と 2 がアクティブなとき最大の活動が見られる (iv)。
同時に 4 つの異なる遺伝子の近く 10 エンハンサーを操作する (図 3 a) の複雑なプール ガイド Rna 42 エンハンサー ガイドと 16 のプロモーターのガイドを含む生成されました。ガイド RNA oligos 初期ガイド RNA 拡張子 PCR (ステップ 3.3) の前にプールと結果として得られる PCR の製品は精製されギブソンのアセンブリを使用して空ピューロマイシン U6 クローニング ベクトルと組み合わせます。次のギブソン アセンブリ複数の独立した変換は実行されメッキします。プレートは LB に盗用され、maxiprep の前に 2-4 時間を育つことができます。図 3Bは qPCR によるに遺伝子発現のこれらガイド RNA プールは安定に発現する SID4X-dCas9-KRAB エストロゲンを奪われた石川細胞ラインに導入され (図 2 D) 上記のように扱われるとき代表的な削減を示します。エンハンサー i からの削減は、推定標的遺伝子のプロモーターをターゲットによって得られるものに似ています。図 3は、エンハンサー i を用いたエストロゲン応答低減に関する Rna ガイドの希釈の効果を示しています。1:50 G0S2まだ近くエンハンサーをターゲット ガイド RNA プールの希釈生成遺伝子発現、エンハンサー i を 50 までを対象とする使用ことができることを示唆しているの大幅な削減は一度にサイトします。しかし、こと何百ものサイトの対象にはできません同時により敏感な検出方法を採用しない限りを示す、非アクティブ化、薄くことが。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig1.jpg"> 図 1。プロトコル エンハンサー i. を使用して多重エンハンサー解剖図ガイド Rna (赤と青) は、e カリカリと UCSC のゲノムのブラウザーを使用して選択したを使用して設計されています。4 ガイド Rna にまたがる地域 (転写因子結合部位チップ seq で定義された) 選択されます。(赤と青) 関心領域にプールされてガイド RNA オリゴヌクレオチドは、ギブソン アセンブリおよび変換する前の相同領域 (オレンジ) を追加する PCR を受けます。SID4X-dCas9-KRAB を安定に発現する細胞株や SID4X-dCas9-KRAB プラスミドと共に野生型細胞に、結果プラスミド プールはリポフェクション経由で導入しました。ガイド RNA プラスミド プールは、一度に、または同時に複数のサイトを対象とする組み合わせで、1 つのサイトを対象とする個別にトランスフェクションすることができます。Transfected セルは、ガイド Rna を含むセルを豊かに抗生物質で治療されます。~ 72 h ポスト トランスフェクションでセルを収穫しています。QPCR、RNA シーケンスまたはチップ シーケンスの核酸を抽出できる<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57883/57883fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig2.jpg"> 図 2。RNA のデザインとエンハンサーの郭清MMP17のためのガイドです。(A)ゲノム ブラウザーのスクリーン ショット近く対象とする ER α バインド エンハンサー (グレー) MMP17.この図は、カールトン、らから変更されています。18. (B)ガイド RNA の結合サイト183 デザインします。チップ seq によって定義されている小胞体の結合部位は、ターゲット、および 4 ガイド Rna タイルをこの地域全体です。ガイド RNA デザインのターゲット シーケンスを定義する結合部位にまたがる、DNaseI 感度信号を使用もできます。チップ seq と DNaseI HS データの両方は、1 h. (C)代表的なガイド rna の相同領域を追加する短い PCR を受けたギブソン アセンブリの準備が 10 nM エストラジ オール石川細胞から得られました。(D) MMP17の相対的な表現は qPCR エンハンサー i と 8 h10 nM エストラジ オール処理で特定の地域のターゲット設定、次を介して測定。式は、エストラジ オールと扱われない細胞におけるMMP17のCTCFと表現のレベルに対して相対的です。Rna をターゲットのプロモーター制御ガイドIL1RN.すべての誤差範囲を表す SEM、二重アスタリスクを示すp < 0.01 と単一アスタリスクを示すp < t 検定で 0.05。この図は、カールトンから変更されているら。18.<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57883/57883fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig3.jpg"> 図 3。エンハンサー i. をプールと同時に異なる遺伝子の近くの複数のエンハンサーをターゲット(A)結合部位とプールされたエンハンサー i における対象とするプロモーターの模式図。(B)式エンハンサー i プラスミド プール (緑)、プロモーター i プラスミド プール (青) または制御 gRNAs (ホワイト)18をトランスフェクトした石川セル E2 処理後の qPCR による測定に及ぼす影響。エンハンサー i すべての遺伝子に重要な減少が観察されます。この図は、カールトンから変更されたら。18. (C)石川細胞 E2 治療後G0S2発現量に及ぼす影響をトランスフェクトしたガイドG0S2のターゲット Rna の量が異なる。ガイド RNA の少量でも大幅な削減を見ることができる (1:50 希釈)、まで示唆 50 サイトが同時に対象とします。すべての誤差範囲を表す SEM、二重アスタリスクを示すp < 0.01 と単一アスタリスクを示すp < t 検定で 0.05。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57883/57883fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>名</td>
			<td>シーケンス</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_internal_F</td>
			<td>TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_internal_R</td>
			<td>GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_PCR_F</td>
			<td>CCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_PCR_R</td>
			<td>AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA_qPCR_F</td>
			<td>GCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA_qPCR_R</td>
			<td>AAAAAGCACCGACTCGGTGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>dCas9_qPCR_F</td>
			<td>GTGACCGAGGGAATGAGAAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>dCas9_qPCR_R</td>
			<td>AGCTGCTTCACGGTCACTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAC95_PCR_F</td>
			<td>AGAAGAGAAAGGTGGAGGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAC95_PCR_R</td>
			<td>CGTCACCGCATGTTAGAAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SID4X_PCR_F</td>
			<td>CAATAGAAACTGGGCTTGTCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SID4X_PCR_R</td>
			<td>TCGTGCTTCTTATCCTCTTCC</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1。ガイド RNA 拡張機能とシーケンス、qPCR、融合タンパク質の検出に使用されるプライマー。

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Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

このプロトコルでは、デザインを多重化融合タンパク質として知られているエンハンサー干渉 (エンハンサー-i) SID4X-dCas9-KRAB にエンハンサーのターゲットを実行するために必要な手順について説明します。このプロトコルにより、遺伝子発現調節エンハンサーの同定と共通のターゲット遺伝子を調節するエンハンサー関係の解剖が容易になります。

細胞を用いた多重 CRISPR ベース エンハンサー干渉エンハンサー機能の解剖

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

dissection-enhancer-function-using-multiplex-crispr-based-enhancer

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

9.2K ビュー.  University of Utah. このプロトコルでは、デザインを多重化融合タンパク質として知られているエンハンサー干渉 (エンハンサー-i) SID4X-dCas9-KRAB にエンハンサーのターゲットを実行するために必要な手順について説明します。このプロトコルにより、遺伝子発現調節エンハンサーの同定と共通のターゲット遺伝子を調節するエンハンサー関係の解剖が容易になります。

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RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.

Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

角膜上皮創傷治癒中の熱ショックタンパク質27の機能のRNA干渉ベースの調査

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

遺伝学

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell activation, stress, or stimulation. Single-cell multiplex gene expression enables the simultaneous assessment of tens of genes1,2,3. At the single-cell level, multiplex gene expression determines population heterogeneity4,5. It allows for the distinction of population heterogeneity by determining both the probable mix of diverse precursor stages among mature cells and also the diversity of cell responses to stimuli.
Innate lymphoid cells (ILC) have been recently described as a population of innate effectors of the immune response6,7. In this protocol, cell heterogeneity of the ILC hepatic compartment is investigated during homeostasis.
Currently, the most widely used technique to assess gene expression is RT-qPCR. This method measures gene expression only one gene at a time. Additionally, this method cannot estimate heterogeneity of gene expression, since multiple cells are needed for one test. This leads to the measurement of the average gene expression of the population. When assessing large numbers of genes, RT-qPCR becomes a time-, reagent-, and sample-consuming method. Hence, the trade-offs limit the number of genes or cell populations that can be evaluated, increasing the risk of missing the global picture.
This manuscript describes how single-cell multiplex RT-qPCR can be used to overcome these limitations. This technique has benefited from recent microfluidics technological advances1,2. Reactions occurring in multiplex RT-qPCR chips do not exceed the nanoliter-level. Hence, single-cell gene expression, as well as simultaneous multiple gene expression, can be performed in a reagent-, sample-, and cost-effective manner. It is possible to test cell gene signature heterogeneity at the clonal level between cell subsets within a population at different developmental stages or under different conditions4,5. Working on rare populations with large numbers of conditions at the single-cell level is no longer a restriction.

This protocol describes how to assess the expression of a large array of genes at the clonal level. Single-cell RT-qPCR produces highly reliable results with a strong sensitivity for hundreds of samples and genes.

レアリンパ集団の不均一性を特徴づけるためにマルチプレックスRT-qPCRのを使用した単一細胞の遺伝子発現

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

マウスT細胞株におけるクロマチン免疫沈降（ChIP）

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

CRISPR Cas を用いた哺乳類細胞におけるゲノム編集

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, including eye degeneration, albinism, sleep loss, hyperphagia, and sensory processing. Species of cavefish from around the world display a convergent evolution of morphological and behavioral traits due to shared environmental pressures between different cave systems. Diverse cave species have been studied in the laboratory setting. The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, with sighted and blind forms, has provided unique insights into biological and molecular processes underlying the evolution of complex traits and is well-poised as an emerging model system. While candidate genes regulating the evolution of diverse biological processes have been identified in A. mexicanus, the ability to validate a role for individual genes has been limited. The application of transgenesis and gene-editing technology has the potential to overcome this significant impediment and to investigate the mechanisms underlying the evolution of complex traits. Here, we describe a different methodology for manipulating gene expression in A. mexicanus. Approaches include the use of morpholinos, Tol2 transgenesis, and gene-editing systems, commonly used in zebrafish and other fish models, to manipulate gene function in A. mexicanus. These protocols include detailed descriptions of timed breeding procedures, the collection of fertilized eggs, injections, and the selection of genetically modified animals. These methodological approaches will allow for the investigation of the genetic and neural mechanisms underlying the evolution of diverse traits in A. mexicanus.&#160;

We describe approaches for the manipulation of genes in the evolutionary model system Astyanax mexicanus. Three different techniques are described: Tol2-mediated transgenesis, targeted manipulation of the genome using CRISPR/Cas9, and knockdown of expression using morpholinos. These tools should facilitate the direct investigation of genes underlying the variation between surface- and cave-dwelling forms.

メキシコの血脈遺伝子機能の操作

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame (ORF) annotation impose two arbitrary criteria: a minimum length of 100 codons and a single ORF per transcript. However, a growing number of studies report expression of proteins from allegedly non-coding regions, challenging the accuracy of current genome annotations. These novel proteins were found encoded either within non-coding RNAs, 5' or 3' untranslated regions (UTRs) of mRNAs, or overlapping a known coding sequence (CDS) in an alternative ORF. OpenProt is the first database that enforces a polycistronic model for eukaryotic genomes, allowing annotation of multiple ORFs per transcript. OpenProt is freely accessible and offers custom downloads of protein sequences across 10 species. Using OpenProt database for proteomic experiments enables novel proteins discovery and highlights the polycistronic nature of eukaryotic genes. The size of OpenProt database (all predicted proteins) is substantial and need be taken in account for the analysis. However, with appropriate false discovery rate (FDR) settings or the use of a restricted OpenProt database, users will gain a more realistic view of the proteomic landscape. Overall, OpenProt is a freely available tool that will foster proteomic discoveries.

OpenProt is a freely accessible database that enforces a polycistronic model of eukaryotic genomes. Here, we present a protocol for the use of OpenProt databases when interrogating mass spectrometry datasets. Using OpenProt database for analysis of proteomic experiments allows for discovery of novel and previously undetectable proteins.

非正規の開いたリーディング ・ フレームから翻訳された蛋白質を発表する OpenProt データベースを利用した質量分析を用いたプロテオミクス解析

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring fitness phenotypes and improving our understanding of how genotypes are shaped by selection. Extensive recent efforts to develop and apply niche continuous culture devices have revealed the benefits of conducting new forms of cell culture control. This includes defining custom selection pressures and increasing throughput for studies ranging from long-term experimental evolution to genome-wide library selections and synthetic gene circuit characterization. The eVOLVER platform was recently developed to meet this growing demand: a continuous culture platform with a high degree of scalability, flexibility, and automation. eVOLVER provides a single standardizing platform that can be (re)-configured and scaled with minimal effort to perform many different types of high-throughput or multi-dimensional growth selection experiments. Here, a protocol is presented to provide users of the eVOLVER framework a description for configuring the system to conduct a custom, large-scale continuous growth experiment. Specifically, the protocol guides users on how to program the system to multiplex two selection pressures &#8212; temperature and osmolarity &#8212; across many eVOLVER vials in order to quantify fitness landscapes of Saccharomyces cerevisiae mutants at fine resolution. We show how the device can be configured both programmatically, through its open-source web-based software, and physically, by arranging fluidic and hardware layouts. The process of physically setting up the device, programming the culture routine, monitoring and interacting with the experiment in real-time over the internet, sampling vials for subsequent offline analysis, and post experiment data analysis are detailed. This should serve as a starting point for researchers across diverse disciplines to apply eVOLVER in the design of their own complex and high-throughput cell growth experiments to study and manipulate biological systems.

The eVOLVER framework enables high-throughput continuous microbial culture with high resolution and dynamic control over experimental parameters. This protocol demonstrates how to apply the system to conduct a complex fitness experiment, guiding users on programming automated control over many individual cultures, measuring, collecting, and interacting with experimental data in real-time.

EVOLVER を用いた自動、高スループット、連続細胞増殖実験の設計

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian cells, this technology represents a novel means to perform genome-wide genetic screens for functional genomics studies. Libraries of guide RNAs (sgRNA) targeting all open reading frames permit the facile generation of thousands of genetic perturbations in a single pool of cells that can be screened for specific phenotypes to implicate gene function and cellular processes in an unbiased and systematic way. CRISPR-Cas screens provide researchers with a simple, efficient, and inexpensive method to uncover the genetic blueprints for cellular phenotypes. Furthermore, differential analysis of screens performed in various cell lines and from different cancer types can identify genes that are contextually essential in tumor cells, revealing potential targets for specific anticancer therapies. Performing genome-wide screens in human cells can be daunting, as this involves the handling of tens of millions of cells and requires analysis of large sets of data. The details of these screens, such as cell line characterization, CRISPR library considerations, and understanding the limitations and capabilities of CRISPR technology during analysis, are often overlooked. Provided here is a detailed protocol for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 based screens.

CRISPR-Cas9 technology provides an efficient method to precisely edit the mammalian genome in any cell type and represents a novel means to perform genome-wide genetic screens. A detailed protocol discussing the steps required for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 screens is provided here.

哺乳類細胞におけるCRISPRベースの遺伝子スクリーンのプール

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial patterns of gene expression. Embryoid bodies (EBs) derived from pluripotent stem cells have been a popular model to study the differentiation of the main three germ layers and to define regulatory circuits during cell fate specification. Although it is well-known that tissue-specific enhancers play an important role in these networks by interacting with promoters, assigning them to their relevant target genes still remains challenging. To make this possible, quantitative approaches are needed to study enhancer-promoter contacts and their dynamics during development. Here, we adapted a 4C method to define enhancers and their contacts with cognate promoters in the EB differentiation model. The method uses frequently cutting restriction enzymes, sonication, and a nested-ligation-mediated PCR protocol compatible with commercial DNA library preparation kits. Subsequently, the 4C libraries are subjected to high-throughput sequencing and analyzed bioinformatically, allowing detection and quantification of all sequences that have contacts with a chosen promoter. The resulting sequencing data can also be used to gain information about the dynamics of enhancer-promoter contacts during differentiation. The technique described for the EB differentiation model is easy to implement.

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

We report the application of quantitative chromosome conformation capture followed by high-throughput sequencing in embryoid bodies generated from embryonic stem cells. This technique allows to identify and quantitate the contacts between putative enhancers and promoter regions of a given gene during embryonic stem cell differentiation.

定量染色体立体構造捕捉による胚体におけるエンハンサー・プロモーター接触の同定(4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

細胞を用いた多重 CRISPR ベース エンハンサー干渉エンハンサー機能の解剖

細胞を用いた多重 CRISPR ベースエンハンサー干渉エンハンサー機能の解剖