Diese Arbeit wurde von NIH/NHGRI R00 HG006922 NIH/NHGRI R01 HG008974, j.g. und Huntsman Cancer Institute unterstützt. J.B.C. wurde von NIH Trainingsprogramm in Genetik T32GM007464 unterstützt.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und flexible Methode für sezieren Enhancer-Funktion bei der endogenen genomischen Lokus ohne physisch verändern die DNA-Sequenz. Zwar ähnlich im Konzept zuvor veröffentlichten CRISPR-Störungen-Protokolle mit dCas9-KRAB27, unterscheidet Enhancer-i sich diese Protokolle auf 3 Arten. Erstens nutzt Enhancer-i die SIN3A interagierende Domäne von MAD120 Enhancer Deaktivierung zu erreichen. Enhancer Deaktivierung kann gerettet werden, mit HDAC-Inhibitoren, was darauf hindeutet, dass der primäre Mechanismus der Deaktivierung HDAC angewiesen ist. Im Gegensatz zu CRISPR Störungen mit dCas9-KRABBE führen Enhancer-i nicht zur Ablagerung von H3K9me3. Dies dürfte die Enhancer-i stützt sich auf vorübergehende Einführung des Leitfadens, die RNAs, Transfektion mit den Zellen geerntet an 3 Tagen veröffentlichen. CRISPR Störungen wird eine Zunahme der H3K9me3 um 7 Tage Post Transduktion12beobachtet. Das Enhancer-i-Protokoll sieht schließlich eine Strategie, um mehrere Websites gleichzeitig Ziel und überwachen Sie die Effizienz des Zielens. Mosaik-Seq17dCas9-KRABBE wird verwendet, um mehrere Enhancer gleichzeitig, aber diese Technik stützt sich auf einzelne Zelle RNA Sequenzierung, Ausdruck Veränderungen zu erkennen und viele Gene (z. B. Östrogen-responsive Gene) unentdeckt aufgrund der geringen Empfindlichkeit der einzelligen RNA-FF Enhancer-i bietet eine zuverlässige Methode um Enhancer einzeln und in Kombination für jedes Gen zu untersuchen.
Der wichtigste Schritt der Enhancer-i ist Transfektion, die für die Zell-Linie von Interesse optimiert werden soll. Dieses Protokoll setzt auf Puromycin Behandlung für transfizierte Zellen zu bereichern, aber es ist möglich, dass Co transfecting Guide RNAs mit einem fluoreszierenden Proteins und Sortierung für fluoreszierende Zellen mittels Durchflusszytometrie erweisen eine bessere Methode der Anreicherung für einige Zelle Typen. Es wird empfohlen, Überwachung der Ausdruck der Guide RNAs und SID4x-dCas9-KRABBE durch qPCR zu beheben und Transfektion zu bestätigen. Wenn Richtmengen RNA niedrig sind (Zyklus Schwelle > 30), Benutzer können auch erwägen alternative Anleitung RNA Produktionsstrategien wie in Vitro Transkription28. Es ist auch möglich, dass trotz der hohen gRNA, Guide RNA Ausrichtung des SID4x-dCas9-KRABBE-Proteins ist ineffizient, können notwendig sein, in welchem Fall Auswahl verschiedener RNA-Sequenzen führen. Durch ChIP-Seq Fusionsprotein mit Chromatin von Enhancer-i behandelt Zellen ausführen, kann die Effizienz des Zielens überwacht werden. Wenn high-Signal des SID4x-dCas9-KRABBE in der Region von Interesse ist, und kein Ausdruck Änderungen in seiner vermeintlichen Zielgen werden erkannt, trägt die Region wahrscheinlich nicht zum Ausdruck, dass gen unter den untersuchten Bedingungen bei.
Eine mögliche Einschränkung der Enhancer-i ist, dass Ziel Effekte ansammeln können, wenn zu viele Seiten gleichzeitig gezielt eingesetzt werden. Nichtsdestotrotz haben CRISPR Störungen Strategien für Knockdown weniger Ziel-Effekte als RNAi29, besonders wenn eine polyklonale Zell-Linie mit dem Ausdruck dCas9-KRAB verwendet wird. Während wir off-Target genomische Bindung des SID4X-dCas9-KRABBE gesehen haben, wenn Sie 10 Seiten gleichzeitig auf, haben wir keine Veränderungen der Genexpression durch diese Bindung Ereignisse identifiziert. Da einige Enhancer mehrere Veranstalter bzw. andere Geschmacksverstärker kontaktieren können, ist es möglich, dass viele Gene Ausdruck bei der Ausrichtung der einzelnen Enhancer, ändern können, aber es unklar ist, ob diese Form der Genregulation üblich ist. Um zu bestätigen, dass der Ausdruck Veränderungen werden beobachtet durch Ausrichtung auf eine bestimmte Enhancer und nicht Ziel Effekte, können Benutzer Enhancer-i mit zwei unterschiedliche Sätze von nicht überlappenden Guide RNAs die gleiche Region durchführen. Darüber hinaus kann die genetische Löschung der Region mit Nuklease-kompetente Cas9 weiter seine Auswirkungen auf die Genexpression bestätigen.
Als Enhancer-i Funktionen durch Histon Deacetylation ist es möglich, dass seine Deaktivierung Fähigkeiten auf Geschmacksverstärker beschränken, die spürbare Histon Acetylierung verfügen. Es gibt eine Vielzahl von alternativen repressiven Fusionen, die möglicherweise effektiver bei Ausrichtung auf spezifische Enhancer. DNA-Methyltransferase Fusionen zu dCas9 können zur Genexpression bei distalen Enhancer30gezielt zu reduzieren, aber diese Unterdrückung ist oft nicht flüchtig. Eine andere repressive Fusion nutzt die Freund GATA1 (FOG1) Domäne, wodurch Histon H3 Lysin 27 Trimethylation und unterdrückt Genexpression auf Ebenen ähnlich wie dCas9-KRABBE in einer Vielzahl von Zelle Linien und Promotoren31. Interessanterweise reduziert hinzufügen mehr Kopien von FOG1 zu dCas9 das repressive Potential an Promotoren, was darauf hindeutet, dass eine einzelne Kopie der SID-Domäne möglicherweise mehr Enhancer Deaktivierung als die 4 Kopien derzeit in Enhancer-i verwendet. Es ist möglich, dass einige Loci von dual targeting durch unterschiedliche Kombinationen der oben genannten dCas9 Fusionen profitieren können. Zum Beispiel kann stabile langfristige Unterdrückung durch gleichzeitige Transduktion von dCas9-DNMT3a und dCas9-KRAB32erreicht werden. Die meisten dieser repressiven Fusionen haben nur auf einen einzigen Nenner zu einem Zeitpunkt gezielt, und es bleibt unklar, welche am effektivsten zu manipulieren gleichzeitig mehrere Enhancer ist.
Enhancer-i, während eine geeignete Methode für die Untersuchung von Kombinationen der Enhancer für eine Handvoll Genen, ist noch etwas im Durchsatz begrenzt, wenn der Benutzer wünscht, vermeintliche Enhancer für Hunderte von Genen zu studieren. Zukünftige Anwendungen dieser Technik werden Imaging-basierte Technologien um mehrere Gene in mehrere Proben gleichzeitig zu quantifizieren integrieren. Wichtiger ist, sind diese Technologien kompatibel mit direkte Nachweis der RNA-Moleküle aus lysate, wodurch die Notwendigkeit für zeitaufwändige RNA Isolierung. Diese Anpassungen werden das Verhör von größeren Mengen von Enhancer erleichtern.

Groß angelegte Projekte wie ENCODE1, Fahrplan Epigenomics2und FANTOM-Sequenzierung3 haben festgestellt, dass Millionen von vermeintlichen Enhancer innerhalb des menschlichen Genoms über Hunderte von Zelltypen. Schätzungen gehen davon aus, dass jeder Veranstalter mit durchschnittlich 4,9 Enhancer Associates und jede Enhancer durchschnittlich 2,4 Gene3 Kontakte, darauf hindeutet, dass gen-Expression oft das Ergebnis der Integration von mehreren verteilten regulatorischer Wechselwirkungen ist. Eine verbleibende Herausforderung ist zu definieren, nicht nur wie die einzelnen Enhancer zur Genexpression, beitragen, sondern wie sie kombinieren, um den Ausdruck beeinflussen. Gentechnische Ansätze werden häufig verwendet, um Beziehungen zwischen Enhancer in Modellorganismen Drosophila4 Mäuse5identifizieren. Diese Experimente sind jedoch zeitaufwendig und niedrigen Durchsatz für die Untersuchung von mehreren Enhancer an mehreren Genen.
Ein Ansatz für das Studium Enhancer-Funktion auf einer großen Skala umfasst massiv parallelen Reporter Assays. Diese Tests ermöglichen die gleichzeitige Vorführung von Tausenden von DNA-Sequenzen für ihre Fähigkeit, den Ausdruck von einem Reporter-gen6fahren. Während dieser Tests gezeigt haben, dass DNA-Sequenz allein ausreichen kann, um gen Verordnung Informationen7vermitteln, kommen sie mit den Einschränkungen von außerhalb des Kontexts native Chromatin durchgeführt wird und mit einem heterologen Promotor. Darüber hinaus ist die Größe der DNA-Sequenz in massiv parallelen Reporter Assays analysiert in der Regel weniger als 200 Basenpaaren, die gewünschte umliegenden Sequenz ausschließen können. Wichtig ist, wie Reporter-Assays nur die Aktivität einer Sequenz zu einem Zeitpunkt Messen, nehmen nicht berücksichtigt die komplexen Beziehungen sie, die zwischen Enhancer bestehen können. So massiv parallelen Reporter Assays informativ über die intrinsischen Aktivität einer DNA-Sequenz können zwar sein, sie nicht unbedingt der Funktion dieser DNA-Sequenz im Rahmen des Genoms mitteilen.
Vor kurzem haben entwickelte CRISPR/Cas9 Werkzeuge8 erleichtert das Studium der Genregulation wie sie für die Löschung der Enhancer an die endogenen Locus ermöglichen. Jedoch mehrere Enhancer gleichzeitig löschen, genomische Instabilität führen kann, und es ist zeitaufwendig, zu aufeinander folgenden Enhancer Löschungen in einer einzelnen Zelle Linie zu erzeugen. Darüber hinaus neue genomischen Sequenz entsteht an der Stelle der Löschung nach Reparatur, und diese Sequenz kann regulatorischen Funktion gewinnen. Eine alternative Version des Cas9 wurde entwickelt, speziell für modulierende Genexpression, unter Berufung auf Verschmelzungen von Aktivierung9,10 oder11,12 Domänen der Nuklease-defizienten Form des Cas9 zu unterdrücken (dCas9). Diese Schmelzverfahren Proteine sind ideal für das Studium mehrere Loci gleichzeitig, da sie nicht physisch die DNA-Sequenz verändern, und stattdessen Epigenetik modulieren um eine regulatorische Region zu befragen. Die am weitesten verbreitete repressive Fusion ist KRABBE, die Rekruten den KAP1 Co Repressor Komplex, Förderung der Ablagerung von Repression-assoziierten Histone H3 Lysin 9 Trimethylation (H3K9me3)13. dCas9-KRABBE, auch bekannt als CRISPR Störungen14, wurde für ihren Beitrag zur Gen Ausdruck15,16, Ziel- und Bildschirm einzelne Enhancer verwendet. jedoch wurde es nicht für mehrere Bereiche gleichzeitig gezielt optimiert. Eine Version von multiplex CRISPR-Störungen für Enhancer, Mosaik-Seq17, verwendet einzelne Zelle RNA-Seq als ein Auslesen, aber diese Technologie ist teuer und nur geeignet für die Untersuchung von stark exprimierten Genen aufgrund der geringen Sensitivität der Einzelzelle RNA-Seq.
Wir wollten eine CRISPR Interferenz basierende Methode für kombinatorische Enhancer-Funktion im Rahmen einer transcriptional Antwort auf Östrogen sezieren zu entwickeln. Etwa die Hälfte der Östrogen-responsive Gene enthalten mindestens 2 Enhancer durch Östrogen-Rezeptor Alpha (ER) gebunden, in der Nähe18, was darauf hindeutet, dass mehrere Enhancer können an die Östrogen-Antwort Teilnahme, und das Verständnis die rechtliche Logik erfordern würde Ausrichtung auf gleichzeitig mehrere Enhancer. Wie ausgangsstudien mit CRISPR Störungen bei Promotoren vorgeschlagen, dass nicht alle Veranstalter gleichermaßen auf KRAB-vermittelten Repression19reagieren, begründete wir, dass die Zugabe von einer deutlichen repressiven Domäne dCas9 die Deaktivierung des erleichtern können diverse Enhancer. Wir entschieden uns für die Sin3a Interaktion Domain von Mad1 (SID)20 führt auf die Rekrutierung von Histon Deacetylases21, die Acetyl-Gruppen auf Histone zu entfernen, die transkriptionelle Aktivität zugeordnet sind. Wichtig ist, die SID der Domäne war effektiv bei der Reduzierung der Genexpression bei dCas922 und Geschichten23verschmolzen, und Sin3a hat gezeigt, dass ein potenter repressiven Co-Faktor in einer Vielzahl von Enhancer Sequenz Kontexten24werden. Wir verwendet, SID4x-dCas9-KRABBE (Enhancer-i) um 10 verschiedene Enhancer, an der ER gebunden und ER Bindungsstellen (Stabilisierungen), die notwendig sind für die Östrogen transcriptional Antwort bei 4 Genen18zu identifizieren. Wir gezielt auch die Kombinationen der Enhancer, die Standorte zu identifizieren, die in der Produktion von Östrogen transcriptional Antwort kooperieren. Wir fanden, dass bis zu 50 Seiten möglicherweise gleichzeitig mit Veränderungen der nachweisbaren Genexpression ausgerichtet werden können. Mit ChIP-Seq und RNA-Seq, haben wir bewiesen, dass Enhancer-i eine hochspezifische Technik für mehrere Enhancer gleichzeitig zu studieren.
In diesem Protokoll beschreiben wir die Schritte bei der Durchführung von Enhancer-i, eine flexible Technik, die die funktionelle Studie von mehreren Enhancer gleichzeitig in einer Gewebekultur-Umgebung ermöglicht. Enhancer-i ist hoch korreliert mit genetischen löschen sondern bietet vorübergehende Deaktivierung, das Histon Deacetylases (HDACs) abhängig ist. Durch die Bereitstellung von Guide RNAs über Transiente Transfektion im Gegensatz zu stabilen Integration über virale Vektoren, vermeidet dieses Protokolls Ablagerung und potentielle Verbreitung von H3K9me3. Dieses Protokoll Details Guide RNA-Design und Klonen über Gibson Versammlung, die Transfektion von guide RNAs mit Lipofektion, und die Analyse der resultierenden Genexpression von qPCR ändert. Wir berücksichtigen auch die Methoden zur Bewertung der Spezifität des Zielens Enhancer-i auf der Ebene des Genoms und Transkriptom. Während diese Technik entwickelt wurde, um zu studieren Genregulation durch ER Enhancer in menschlichen Krebszelllinien gebunden, es gilt für die Zerlegung von jedem Säugetier Enhancer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="742">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">ZR 96-well Quick-RNA Kit</td>
			<td style="width:112px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">R1053</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4389986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">AflII restriction enzyme</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0520S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:344px;">Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0531L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2621L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">FuGENE HD</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">DNA Clean &#38; Concentrator Kit</td>
			<td style="width:112px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">D4013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Buffer RLT Plus</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">1053393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">b-estradiol</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Human: Ishikawa cells</td>
			<td style="width:112px;">ECACC</td>
			<td style="width:119px;">99040201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">H3K27ac rabbit polyclonal</td>
			<td style="width:112px;">Active Motif&#160;</td>
			<td style="width:119px;">39133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">H3K9me3 rabbit polyclonal</td>
			<td style="width:112px;">Abcam&#160;</td>
			<td style="width:119px;">ab8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">FLAG mouse monoclonal</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">ER alpha rabbit polyclonal</td>
			<td style="width:112px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">pGL3-U6-PGK-Puro plasmid</td>
			<td style="width:112px;">Addgene&#160;</td>
			<td style="width:119px;">51133</td>
			<td style="width:167px;">Shen et al., 2014</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">gRNA_cloningVector plasmid</td>
			<td style="width:112px;">Addgene&#160;</td>
			<td style="width:119px;">41824</td>
			<td style="width:167px;">Mali et al., 2013</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">AflII U6 puromycin plasmid</td>
			<td style="width:112px;">Addgene&#160;</td>
			<td style="width:119px;">106404</td>
			<td>Carleton et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">SID4X-dCas9-KRAB plasmid</td>
			<td style="width:112px;">Addgene&#160;</td>
			<td style="width:119px;">106399</td>
			<td>Carleton et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:344px;">UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:112px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:344px;">KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, with KAPA mRNA Capture Beads</td>
			<td style="width:112px;">Kapa Biosytems</td>
			<td style="width:119px;">KK8420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:344px;">Pierce Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A32959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Formaldehyde solution</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">252549-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:344px;">Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:344px;">LB Broth</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10855001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Quick-DNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:112px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">D3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Quick-Load Purple 2-Log DNA Ladder</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0050S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of enhancer function using multiplex crispr-based enhancer interference in cell lines

Mehreren Enhancer häufig Regeln eines bestimmten Gens, doch für die meisten Gene, es bleibt unklar, welche Enhancer für die Genexpression notwendig sind und wie diese Enhancer kombinieren, um eine transcriptional Antwort zu produzieren. Da Millionen von Enhancer identifiziert wurden, sind Hochdurchsatz-Werkzeuge notwendig, Enhancer-Funktion auf einer genomweiten Skala bestimmen. Aktuelle Methoden zur Untersuchung von Enhancer-Funktion auch die Abgabe von genetischen Deletionen mit Nuklease-kompetente Cas9, aber es ist schwierig, die kombinatorische Effekte von mehreren Enhancer mit dieser Technik zu studieren, wie mehrere aufeinander folgende klonalen Zelllinien werden muss generiert. Hier präsentieren wir Ihnen Enhancer-i, eine CRISPR Interferenz basierende Methode, die für funktionelle Verhör von mehreren Enhancer gleichzeitig ihre endogenen Loci ermöglicht. Enhancer-i nutzt zwei repressiven Domänen mit Nuklease-defizienten verschmolzen Cas9, SID und KRABBE, Enhancer Deaktivierung über Histon Deacetylation an gezielte Loci zu erreichen. Dieses Protokoll nutzt Transiente Transfektion von Guide RNAs, vorübergehende Inaktivierung von Zielregionen zu ermöglichen und ist besonders effektiv bei der induzierbare transkriptionelle Reaktionen auf Reize in Gewebekultur Einstellungen blockieren. Enhancer-i ist hochspezifisch, sowohl in seiner genomischen targeting und seine Auswirkungen auf die globalen Genexpression. Aus diesem Protokoll erzielten Ergebnisse helfen um zu verstehen, ob ein Enhancer ist zur Genexpression, das Ausmaß des Beitrags und wie der Beitrag von anderen nahe gelegenen Enhancer betroffen ist.

Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des Workflows im Protokoll beschrieben. Um festzustellen, dass die Beiträge von ER-gebundenen Enhancer in der Nähe von Östrogen-regulierten Gens MMP17, hat 3 Bindungsstellen in der Nähe im Sinne von ChIP-Seq (Abbildung 2A) und RNAs leiten wurden für jede Region entwickelt. Design Guide RNAs, ein 600-900 bp Fenster rund um jede ER-Sequenz wurde Bindungsstelle von Interesse ausgewählt und ein Führer-RNA-Design-Programm. Resultierenden Guide Sequenzen RNA mit 0-2 vorausgesagt vom Zielwert, die Seiten des menschlichen Genoms mit BLAT ausgerichtet waren. Vier nicht-überlappende guide RNAs, die durch ChIP-Seq definierten Bereichs überspannt und DNaseI Überempfindlichkeit wurden ausgewählt, für die Ausrichtung (Abb. 2 b). Zusätzliche Sequenz (Tabelle 1) wurde hinzugefügt, um jedem Ende Erleichterung der nachgeschalteten Klonen und die daraus resultierenden bestellte waren 59 Nukleotid-Fragmente. Bei der Ankunft war Guide RNAs verdünnt und gebündelt durch die Website und eine kurze PCR wurden durchgeführt, um Homologie Regionen vor der Gibson-Montage hinzufügen. Abbildung 2 zeigt die erwarteten Guide RNA Produkt nach einer kurzen PCR unter Verwendung der "U6_internal" Zündkapseln (Tabelle 1), die an jedem Ende der 59 Länge 20 Basenpaaren Sequenz hinzufügen guide RNA Fragment, was in einer Länge von ~ 100-Sequenz. Anschluss an Gibson Vollversammlung diese Anleitung RNA-Pools verwandelten sich in Bakterien und Plasmid Minipreps waren am nächsten Tag vorbereitet. Abb. 2D zeigt Ergebnisse aus einem Enhancer Dissektion Experiment, wo mehrere Enhancer in der Nähe MMP17 allein ausgerichtet sind und in Kombination mit Enhancer-i. Seiten gezielt durch Enhancer-i sind mit einem schwarzen Sechseck gekennzeichnet. Guide RNA Plasmide Ausrichtung auf den angegebenen Seiten wurden in einer Östrogen-beraubt Ishikawa Zelllinie stabil mit dem Ausdruck SID4X-dCas9-KRAB transfiziert. Zwei Tage später änderte sich die Medien und Puromycin wurde hinzugefügt, um für transfizierte Zellen anzureichern. Am folgenden Tag wurden die Zellen geerntet, nach einem 8 h 10 nM Estradiol Behandlung. RNA wurde isoliert und eine einstufige qPCR erfolgte. In diesem Beispiel sind Seiten 1 und 2 erforderlich für eine vollständige Östrogene Antwort des MMP17, während Seite 3 nicht unter diesen Bedingungen (Abb. 2D, Fahrspuren Ii-iv) beiträgt. Wenn nur die Seiten 2 oder 3 aktiv sind (vi und Vii), die Östrogen-Reaktion ist ähnlich wie wenn keine Standorte sind aktiv (Viii), was darauf hindeutet, dass diese Seiten nicht selbständig beitragen. Seite 1 kann ein Ausdruck von selbst (V) beitragen, aber die größte Aktivität wird gesehen, wenn die Seiten 1 und 2 aktiv sind (iv).
10-Enhancer in der Nähe von 4 verschiedenen Genen gleichzeitig bearbeiten (Abbildung 3A), führen komplexe Pools von RNAs mit 42 Enhancer-Guides und 16 Veranstalter Guides generiert wurden. Anleitung RNS Oligos wurden vor der ersten Guide RNA Verlängerung PCR (Schritt 3.3) zusammengefasst und daraus resultierende PCR-Produkte wurden gereinigt und in Kombination mit der leeren Puromycin U6 klonen Vektor mit Gibson Assembly. Anschluss an die Vollversammlung Gibson wurden mehrere unabhängige Transformationen durchgeführt und vernickelt. Die Platten wurden in LB geschabt und erlaubt zu wachsen, für 2-4 h vor Maxiprep. Abbildung 3 b zeigt repräsentative Reduktionen in der Genexpression von qPCR wenn diese Anleitung RNA Pools waren in einer Östrogen-beraubt Ishikawa Zelllinie stabil mit dem Ausdruck SID4X-dCas9-KRAB transfiziert und behandelt wie beschrieben (Abb. 2D). Reduzierungen von Enhancer-i sind ähnlich denen, die durch die Ausrichtung des Projektträgers des vermeintlichen Zielgens. Abbildung 3 zeigt die Auswirkungen der Verdünnung des Guide RNAs auf Reduzierung der Östrogen-Antwort mit Enhancer-i. Eine 01:50, die Verdünnung eines Guide RNA-Pools, die Ausrichtung der Enhancer in der Nähe von G0S2 noch deutliche Reduzierung der Genexpression ergibt, was darauf hindeutet, dass Enhancer-i verwendet werden kann bis zu 50 Seiten auf einmal. Jedoch kann die Deaktivierung, verdünnt werden, darauf hinweist, dass Hunderte von Websites können nicht gleichzeitig ausgerichtet werden, es sei denn, empfindlichere Nachweisverfahren beschäftigt sind.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig1.jpg"> Abbildung 1: Protokoll für Multiplex-Enhancer Dissektion mit Enhancer-i. schematische Guide RNAs (rot und blau) sind mit e-knackig und ausgewählten Genom der UCSC Browser gestaltet. Vier Guide RNAs sind gewählt, die die Regionen von Interesse (Transkription Faktor Bindungsstellen definiert durch ChIP-Seq) umspannen. Guide RNA-Oligonukleotide, die von der Region von Interesse (rot und blau) gebündelt haben durchlaufen eine PCR um Homologie Regionen (Orange) vor der Gibson Montage und Transformation hinzuzufügen. Daraus resultierende Plasmid-Pools sind über Lipofektion in Zelllinien stabil mit dem Ausdruck SID4X-dCas9-KRABBE oder in Wildtyp Zellen in Verbindung mit SID4X-dCas9-KRAB Plasmid transfiziert. Guide RNA Plasmid Becken können individuell transfiziert werden, um eine Seite zu einem Zeitpunkt oder in Kombination mit mehreren Standorten gleichzeitig gezielt ansprechen. Transfizierte Zellen sind mit Antibiotika zu bereichern für Zellen mit Guide RNAs behandelt. ~ 72 h Post Transfektion sind die Zellen geerntet. Nukleinsäuren extrahiert werden können, für qPCR, RNA-Seq oder ChIP-Seq <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57883/57883fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig2.jpg"> Abbildung 2. Führen RNA Design und Enhancer Dissektion für MMP17. (A) Genom Browser Screenshot von ER Alpha-gebundenen Enhancer (grau) in der Nähe von zielgerichtet sein MMP17. Diese Zahl wurde von Carleton, Et Al. modifiziert 18. (B) Guide RNA entwirft für die 3 Seiten18verbindlich. Die Bindungsstelle für ER definiert durch ChIP-Seq ist das Ziel und die 4 Guide RNAs Fliese in dieser Region. Die DNaseI Empfindlichkeit Signal, das die Bindungsstelle erstreckt, kann auch zur Zielsequenz für Guide RNA Design definieren. ChIP-Seq und DNaseI HS Daten stammen aus Ishikawa Zellen behandelt mit 10 nM Estradiol für 1 h (C) repräsentative Guide RNA Sequenzen, die montagebereit Gibson, eine kurze PCR Homologie Regionen hinzufügen unterzogen worden sind. (D) Relative Expression von MMP17 über qPCR nach Ausrichtung der einzelnen Regionen mit Enhancer-i und eine 8-h10 nM Estradiol Behandlung gemessen. Ausdruck ist relativ CTCF und Ausdruck Ebene der MMP17 in den Zellen nicht mit Estradiol behandelt. Kontrolle Guide RNAs der Veranstalter des Ziel IL1RN. Alle Fehlerbalken darzustellen SEM, doppelte Sternchen geben p < 0,01 und einzelne Sternchen geben p < 0,05 in ein gepaarter t-Test. Diese Zahl wurde von Carleton, geändert Et Al. 18. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57883/57883fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig3.jpg"> Abbildung 3. Ausrichtung auf mehrere Enhancer in der Nähe von verschiedenen Genen gleichzeitig mit gebündelt Enhancer-i. (A) schematische Darstellung der Bindungsstellen und Promotoren in gepoolten Enhancer-i ausgerichtet werden. (B) die Auswirkungen auf Ausdruck qPCR gemessen, nachdem E2 Behandlung auf Ishikawa Zellen mit Enhancer-i Plasmid Pool (grün), Promoter-i Plasmid Pool (blau) oder Kontrolle gRNAs (weiß)18transfiziert. Eine signifikante Reduktion bei aller Gene wird mit Enhancer-i beobachtet. Diese Zahl wurde modifiziert von Carleton, Et Al. 18. (C) die Effekte auf G0S2 Ausdruck Ebenen nach E2 Behandlung auf Ishikawa Zellen transfiziert mit unterschiedlichen Mengen an Guide RNAs gezielt G0S2. Eine signifikante Reduktion kann man schon mit kleinen Beträgen Guide RNA (01:50 Verdünnung), darauf hindeutet, dass bis zu 50 Seiten kann gleichzeitig ausgerichtet. Alle Fehlerbalken darzustellen SEM, doppelte Sternchen geben p < 0,01 und einzelne Sternchen geben p < 0,05 in ein gepaarter t-Test. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57883/57883fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Name</td>
			<td>Sequenz</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_internal_F</td>
			<td>TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_internal_R</td>
			<td>GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_PCR_F</td>
			<td>CCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_PCR_R</td>
			<td>AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA_qPCR_F</td>
			<td>GCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA_qPCR_R</td>
			<td>AAAAAGCACCGACTCGGTGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>dCas9_qPCR_F</td>
			<td>GTGACCGAGGGAATGAGAAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>dCas9_qPCR_R</td>
			<td>AGCTGCTTCACGGTCACTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAC95_PCR_F</td>
			<td>AGAAGAGAAAGGTGGAGGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAC95_PCR_R</td>
			<td>CGTCACCGCATGTTAGAAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SID4X_PCR_F</td>
			<td>CAATAGAAACTGGGCTTGTCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SID4X_PCR_R</td>
			<td>TCGTGCTTCTTATCCTCTTCC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Primer für RNA Verlängerung und Sequenzierung, qPCR und Erkennung des Fusionsproteins verwendet.

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Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Dieses Protokoll beschreibt die erforderlichen Schritte zum Entwerfen und ausführen gemultiplexten Ausrichtung der Enhancer mit deaktivieren Fusionsproteins SID4X-dCas9-KRABBE, auch bekannt als Enhancer Störungen (Enhancer-i). Dieses Protokoll ermöglicht die Identifizierung von Enhancer, die Genexpression regulieren und erleichtert das Sezieren von Beziehungen zwischen Enhancer Regulierung ein gemeinsames Zielgen.

Dissektion der Enhancer-Funktion mit Multiplex CRISPR-basierte Enhancer Einmischung in Zell-Linien

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

dissection-enhancer-function-using-multiplex-crispr-based-enhancer

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

9.2K Aufrufe.  University of Utah. Dieses Protokoll beschreibt die erforderlichen Schritte zum Entwerfen und ausführen gemultiplexten Ausrichtung der Enhancer mit deaktivieren Fusionsproteins SID4X-dCas9-KRABBE, auch bekannt als Enhancer Störungen (Enhancer-i). Dieses Protokoll ermöglicht die Identifizierung von Enhancer, die Genexpression regulieren und erleichtert das Sezieren von Beziehungen zwischen Enhancer Regulierung ein gemeinsames Zielgen.

Serie: Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.

Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

RNA-Interferenz-basierte Untersuchung der Funktion von Heat Shock Protein 27 während Hornhautepithels Wundheilung

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Forschung

Genetik

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell activation, stress, or stimulation. Single-cell multiplex gene expression enables the simultaneous assessment of tens of genes1,2,3. At the single-cell level, multiplex gene expression determines population heterogeneity4,5. It allows for the distinction of population heterogeneity by determining both the probable mix of diverse precursor stages among mature cells and also the diversity of cell responses to stimuli.
Innate lymphoid cells (ILC) have been recently described as a population of innate effectors of the immune response6,7. In this protocol, cell heterogeneity of the ILC hepatic compartment is investigated during homeostasis.
Currently, the most widely used technique to assess gene expression is RT-qPCR. This method measures gene expression only one gene at a time. Additionally, this method cannot estimate heterogeneity of gene expression, since multiple cells are needed for one test. This leads to the measurement of the average gene expression of the population. When assessing large numbers of genes, RT-qPCR becomes a time-, reagent-, and sample-consuming method. Hence, the trade-offs limit the number of genes or cell populations that can be evaluated, increasing the risk of missing the global picture.
This manuscript describes how single-cell multiplex RT-qPCR can be used to overcome these limitations. This technique has benefited from recent microfluidics technological advances1,2. Reactions occurring in multiplex RT-qPCR chips do not exceed the nanoliter-level. Hence, single-cell gene expression, as well as simultaneous multiple gene expression, can be performed in a reagent-, sample-, and cost-effective manner. It is possible to test cell gene signature heterogeneity at the clonal level between cell subsets within a population at different developmental stages or under different conditions4,5. Working on rare populations with large numbers of conditions at the single-cell level is no longer a restriction.

This protocol describes how to assess the expression of a large array of genes at the clonal level. Single-cell RT-qPCR produces highly reliable results with a strong sensitivity for hundreds of samples and genes.

Einzellige Gene Expression Mit Multiplex-RT-qPCR zum Charakterisieren Heterogene Rare Lymphatische Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) in Maus-T-Zell-Linien

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

Genom-Bearbeitung in Säugetieren Zelllinien mit CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, including eye degeneration, albinism, sleep loss, hyperphagia, and sensory processing. Species of cavefish from around the world display a convergent evolution of morphological and behavioral traits due to shared environmental pressures between different cave systems. Diverse cave species have been studied in the laboratory setting. The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, with sighted and blind forms, has provided unique insights into biological and molecular processes underlying the evolution of complex traits and is well-poised as an emerging model system. While candidate genes regulating the evolution of diverse biological processes have been identified in A. mexicanus, the ability to validate a role for individual genes has been limited. The application of transgenesis and gene-editing technology has the potential to overcome this significant impediment and to investigate the mechanisms underlying the evolution of complex traits. Here, we describe a different methodology for manipulating gene expression in A. mexicanus. Approaches include the use of morpholinos, Tol2 transgenesis, and gene-editing systems, commonly used in zebrafish and other fish models, to manipulate gene function in A. mexicanus. These protocols include detailed descriptions of timed breeding procedures, the collection of fertilized eggs, injections, and the selection of genetically modified animals. These methodological approaches will allow for the investigation of the genetic and neural mechanisms underlying the evolution of diverse traits in A. mexicanus.&#160;

We describe approaches for the manipulation of genes in the evolutionary model system Astyanax mexicanus. Three different techniques are described: Tol2-mediated transgenesis, targeted manipulation of the genome using CRISPR/Cas9, and knockdown of expression using morpholinos. These tools should facilitate the direct investigation of genes underlying the variation between surface- and cave-dwelling forms.

Manipulation der Genfunktion in mexikanischen Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame (ORF) annotation impose two arbitrary criteria: a minimum length of 100 codons and a single ORF per transcript. However, a growing number of studies report expression of proteins from allegedly non-coding regions, challenging the accuracy of current genome annotations. These novel proteins were found encoded either within non-coding RNAs, 5' or 3' untranslated regions (UTRs) of mRNAs, or overlapping a known coding sequence (CDS) in an alternative ORF. OpenProt is the first database that enforces a polycistronic model for eukaryotic genomes, allowing annotation of multiple ORFs per transcript. OpenProt is freely accessible and offers custom downloads of protein sequences across 10 species. Using OpenProt database for proteomic experiments enables novel proteins discovery and highlights the polycistronic nature of eukaryotic genes. The size of OpenProt database (all predicted proteins) is substantial and need be taken in account for the analysis. However, with appropriate false discovery rate (FDR) settings or the use of a restricted OpenProt database, users will gain a more realistic view of the proteomic landscape. Overall, OpenProt is a freely available tool that will foster proteomic discoveries.

OpenProt is a freely accessible database that enforces a polycistronic model of eukaryotic genomes. Here, we present a protocol for the use of OpenProt databases when interrogating mass spectrometry datasets. Using OpenProt database for analysis of proteomic experiments allows for discovery of novel and previously undetectable proteins.

Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analysen mithilfe der OpenProt-Datenbank zu enthüllen neue Proteine übersetzt aus dem nicht-kanonischen Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring fitness phenotypes and improving our understanding of how genotypes are shaped by selection. Extensive recent efforts to develop and apply niche continuous culture devices have revealed the benefits of conducting new forms of cell culture control. This includes defining custom selection pressures and increasing throughput for studies ranging from long-term experimental evolution to genome-wide library selections and synthetic gene circuit characterization. The eVOLVER platform was recently developed to meet this growing demand: a continuous culture platform with a high degree of scalability, flexibility, and automation. eVOLVER provides a single standardizing platform that can be (re)-configured and scaled with minimal effort to perform many different types of high-throughput or multi-dimensional growth selection experiments. Here, a protocol is presented to provide users of the eVOLVER framework a description for configuring the system to conduct a custom, large-scale continuous growth experiment. Specifically, the protocol guides users on how to program the system to multiplex two selection pressures &#8212; temperature and osmolarity &#8212; across many eVOLVER vials in order to quantify fitness landscapes of Saccharomyces cerevisiae mutants at fine resolution. We show how the device can be configured both programmatically, through its open-source web-based software, and physically, by arranging fluidic and hardware layouts. The process of physically setting up the device, programming the culture routine, monitoring and interacting with the experiment in real-time over the internet, sampling vials for subsequent offline analysis, and post experiment data analysis are detailed. This should serve as a starting point for researchers across diverse disciplines to apply eVOLVER in the design of their own complex and high-throughput cell growth experiments to study and manipulate biological systems.

The eVOLVER framework enables high-throughput continuous microbial culture with high resolution and dynamic control over experimental parameters. This protocol demonstrates how to apply the system to conduct a complex fitness experiment, guiding users on programming automated control over many individual cultures, measuring, collecting, and interacting with experimental data in real-time.

Die Entwicklung automatisierter, durchsatzer, kontinuierlicher Zellwachstumsexperimente mit eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian cells, this technology represents a novel means to perform genome-wide genetic screens for functional genomics studies. Libraries of guide RNAs (sgRNA) targeting all open reading frames permit the facile generation of thousands of genetic perturbations in a single pool of cells that can be screened for specific phenotypes to implicate gene function and cellular processes in an unbiased and systematic way. CRISPR-Cas screens provide researchers with a simple, efficient, and inexpensive method to uncover the genetic blueprints for cellular phenotypes. Furthermore, differential analysis of screens performed in various cell lines and from different cancer types can identify genes that are contextually essential in tumor cells, revealing potential targets for specific anticancer therapies. Performing genome-wide screens in human cells can be daunting, as this involves the handling of tens of millions of cells and requires analysis of large sets of data. The details of these screens, such as cell line characterization, CRISPR library considerations, and understanding the limitations and capabilities of CRISPR technology during analysis, are often overlooked. Provided here is a detailed protocol for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 based screens.

CRISPR-Cas9 technology provides an efficient method to precisely edit the mammalian genome in any cell type and represents a novel means to perform genome-wide genetic screens. A detailed protocol discussing the steps required for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 screens is provided here.

Gepoolte CRISPR-basierte genetische Screens in Säugetierzellen

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial patterns of gene expression. Embryoid bodies (EBs) derived from pluripotent stem cells have been a popular model to study the differentiation of the main three germ layers and to define regulatory circuits during cell fate specification. Although it is well-known that tissue-specific enhancers play an important role in these networks by interacting with promoters, assigning them to their relevant target genes still remains challenging. To make this possible, quantitative approaches are needed to study enhancer-promoter contacts and their dynamics during development. Here, we adapted a 4C method to define enhancers and their contacts with cognate promoters in the EB differentiation model. The method uses frequently cutting restriction enzymes, sonication, and a nested-ligation-mediated PCR protocol compatible with commercial DNA library preparation kits. Subsequently, the 4C libraries are subjected to high-throughput sequencing and analyzed bioinformatically, allowing detection and quantification of all sequences that have contacts with a chosen promoter. The resulting sequencing data can also be used to gain information about the dynamics of enhancer-promoter contacts during differentiation. The technique described for the EB differentiation model is easy to implement.

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

We report the application of quantitative chromosome conformation capture followed by high-throughput sequencing in embryoid bodies generated from embryonic stem cells. This technique allows to identify and quantitate the contacts between putative enhancers and promoter regions of a given gene during embryonic stem cell differentiation.

Identifizierung von Enhancer-Promoter-Kontakten in embryoiden Körpern durch quantitative Chromosomenkonformationserfassung (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...