HAC リタ アレン財団 (http://www.ritaallenfoundation.org) のミルトン E. カッセル学者でもあった。この作業によって賄われていた補助金拍する国立研究所の一般的な医療科学 R01 GM081686、R01 AR070245、国立の研究所一般医療科学 R01 GM0866465、イーライ ・ エディス広い再生医療センター ・幹細胞研究 (からローズの丘と Hal Gaba 賞)、WEL および HAC にジョンソン総合がんセンターからアイリス カントール女性の健康センター/カリフォルニア大学ロサンゼルス校 CTSI NIH グラント UL1TR000124、白血病リンパ腫協会の影響賞を受賞します。この出版物で報告された研究は、賞を受賞番号 P50CA092131 の下で健康の国民の協会の国立癌研究所によって支えられました。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。HAC は、Eli およびエディス広い再生医療センター ・幹細胞研究、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の分子生物学研究所と UCLA バイオインフォマティクス部門間プログラムのメンバーです。

記載されているすべての実験は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校で動物ケア委員会によって承認されました。
1. 冷凍マウス皮膚のスライドを生成します。
<ol><li>機関のポリシーに従ってマウスを安楽死させます。 注: 防護服の制度のポリシーに従ってください。動物を含むすべてのプロトコルは、機関動物ケア委員会によって承認される必要があります。</li>
	<li>動物の毛トリマーとマウスの髪を削除します。</li>
	<li>はさみを使用して皮膚の切開を行います。鉗子を使用すると、マウスから皮膚を持ち上げます。皮膚セクションを切り取るはさみを使用しています。</li>
	<li>凍結試薬をコンパウンドで、cryomold を埋める (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>皮膚針鼻セクションを使用して塗りつぶされた cryomolds に鉗子を配置します。組織スライスは真皮、皮下・筋 (図 2) に表皮から皮膚の断面図を生成することは、肌を合わせます。 注意: 可能であれば、マウント実験と同じスライド上に切断し、一緒に処理できるので、同じ cryomold で一緒にマウスを制御します。泡を作成しないように注意してください。</li>
	<li>氷バケットにドライアイスのブロックの平らな面に cryomold を配置し、凍結させます。スキンの向きを観察し続けます。必要に応じて調整します。 注: は、ドライアイスを取り扱う際に低温手袋を着用します。</li>
	<li>ストレージの-80 ° C のフリーザーに cryomolds を転送します。サンプルは、冷凍庫で約 3ヶ月酵素活性の重要な損失なしで維持できます。凍結切片の乾燥をさせてください。</li>
	<li>-20 ° c、7-10 μ m の最高の皮膚形態21の厚いセクションを作成するスライス組織クライオスタットを用いた。</li>
</ol>2. 染色スライドの準備
<ol><li>テストするスライドのセットを確立します。NAD は源泉徴収されるコントロール スライドを含めるし、別のコントロールをスライド基板、乳酸、源泉徴収されます。以前調査した凍結するティッシュのブロックからの肯定的な制御スライドが含まれます。</li>
	<li>簡単にスライドを固定 5 分 4% ホルマリンで皮膚セクションを含む 4% ホルマリンをスライド、またはピペット 1 mL、4% ホルマリン入り容器にスライドを浸すことによって複数のスライドを処理するとき。 注: 固定、皮膚がスライドから次の手順と保存皮膚の形態の中にむいていないを確認します。 注意: ホルマリンは発がん性物質と危険だもの手袋を着用する、それはあなたの肌に触れるし、化学の発煙のフードでこの手順を実行させてはいけない。</li>
	<li>少なくとも 1 mL リン酸洗浄スライドによって緩衝される塩、pH 7.4、スライドごとピペッティングまたは浸漬で。</li>
</ol>3. 染色液の準備
<ol><li>乳酸脱水素酵素活性染色用渦一緒に試薬 (50 mM Tris pH 7.4 では、750 μ M NADP、80 μ M フェナジン methosulfate (PMS)、600 μ M nitrotetrazolium ブルーの塩化物および 30 mM 乳酸) 染色の量に応じて適切なサイズのチューブで必要なソリューションです。 注: 1 mL は完全に 1 つのスライドをカバーするのに十分です。</li>
	<li>NAD を除くすべての試薬がある、2 番目のソリューションを準備します。すべての試薬は乳酸以外存在第 3 ソリューションを準備します。</li>
</ol>4. 染色液でスライドを孵化させなさい。
<ol><li>優しくピペット染色液またはその全体のセクションをカバー スライド上に制御ソリューション (1 mL は、1 つのスライド十分です)。複数のスライドを一緒に処理されている場合は、同時に染色液にすべてのスライドをディップ (コンテナーが完全にティッシュ セクションをカバーする十分なソリューションを確認してください)。</li>
	<li>暗闇の中で 37 ° C で加湿環境でスライドを孵化させなさい。染色液は、スライド上にある場合、は、蒸発を防ぐために加湿環境にスライドを配置します。</li>
</ol>5. モニター スライド
<ol><li>目視による青クリアから染色液の変換を監視します。サンプルが青の所望のレベルに達したら、染色液を除去することによって反作用を停止します。 注: 皮膚、10 分は十分です。時にオルガンと酵素の活性が異なります。</li>
	<li>ピペッティングでリン酸緩衝生理食塩水でスライドをリンス (1 mL はスライドごとに十分な) または浸漬します。 注: 互いに比較されるサンプルは、時間の同じ量の染色液で維持する必要があります。</li>
</ol>6. 対比染色とマウント
<ol><li>スライド、スライドが青の適切なレベルに達したときに対比染色をピペットで移しなさい。 注: 赤または緑の核を有効に Counterstains は沈殿ホルマザン結晶によって作成された青と良好なコントラストを提供します。</li>
	<li>水または水溶液中22をマウントをマウントします。メディアをマウントのひとつ 〜 3 滴 (40-50 μ L) でカバー スリップのサイズによっては十分です。</li>
</ol>7. スライドの画像し、定量化
<ol><li>画像は、光学顕微鏡下でスライドします。10 X、20 X、40 倍の倍率でのすべての否定的なコントロールとコントロールのサンプル実験の写真を取る。</li>
	<li>画像解析ソフトウェアでさまざまな地域の青い汚れの強度を決定します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Boonacker, E., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+cytochemical+techniques+for+metabolic+mapping+in+living+cells,+with+special+reference+to+proteolysis.">Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).</li><li>Seidler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tetrazolium-formazan+system:+Design+and+histochemistry.">The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry.</a> Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+imaging+of+patients+with+prostate+cancer+using+hyperpolarized+[1-(1)(3)C]pyruvate.">Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate.</a> Sci Transl Med. 5, 198ra108 (2013).</li><li>Flores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactate+dehydrogenase+activity+drives+hair+follicle+stem+cell+activation.">Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation.</a> Nat Cell Biol. , (2017).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. 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A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors.</a> J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).</li></ol>

著者は開示する競合する興味を持ってないです。

ここで説明する方法は、乳酸脱水素酵素や他の代謝酵素生成 NADH または NADPH 依存性の異なる種類の細胞、組織内または時間の経過とともに組織のさまざまな部分の活動を監視する使用できます。乳酸脱水素酵素は幹細胞と腫瘍の生物学を理解するための重要な酵素を個々 の細胞における乳酸脱水素酵素の活動を監視する機能はこの酵素の機能に重要な洞察を提供する可能性が高い。
他の方法論と比較してこのプロトコルの重要な利点の 1 つはタンパク質豊富なだけではなく、モニター酵素活性能力はより決定的なについてだけではなく、乳酸脱水素酵素の酵素が結果することができます。現在、実際には機能しているが。ここで説明している方法は、選択した蛋白質、例えば、細胞の系統マーカーのレベルは、乳酸脱水素酵素活性として同じ組織サンプルで決定されますので、免疫組織化学と結合できます。乳酸脱水素酵素の活動を監視するため、MRI を用いたアプローチと比較して提供されるプロトコルがそれがより高い空間解像度を提供し、高い酵素活性を持つ、組織内の特定のセルを決定するのに役立つことができます利点.蛍光基板に基づくマッピング代謝へのアプローチと比較しては、蛍光1によって説明されたプロトコルと信号の検出は制限はありません。ミラーと共著、塩7への変換を監視することによって同様の時間依存性と 5 つの異なる酵素の基板依存性の分析を実行しました。反応は、酵素反応の化学量論的原則に従うこと発見されました。ミラーとの共著者識別ミトコンドリア酵素非ミトコンドリア ミトコンドリア染色7との共局在酵素から。5-Cyano-2,3-di-(p-tolyl)tetrazolium 塩化 (CTC) は、共焦点顕微鏡を用いた共局在解析7続いて検出試薬としても使用。
記載されているメソッドは、同様な欠点です。MRI ベースのアプローチは、生きている有機体で使用できますが、記述されているアプローチは、凍結や新鮮な組織を必要があります。凍結するティッシュの数ヶ月、時間をかけて、酵素の活性が低下するので場合でも適している冷凍します。さらに、基板が過剰にあるので、アプローチは「活動電位」基板あると仮定すると情報を提供します。基板のレベルを制限している場合、このアッセイの活動分布は生理学的に発生するアクティビティの量から逸脱可能性があります。さらに、同じ酵素の活動を実行する同じ酵素の異なるアイソ フォームが存在する場合に、ここで紹介した方法がそれらを区別することができるは。例えば、紹介した方法は、LDHB 対発現の活動と区別できません。遺伝子を使用することこの問題に対処する 1 つ方法は、単一の酵素のアイソ フォームが遺伝子活性化するマウスを設計されています。
PMS の実験を行ったが、NADH とテトラゾリウム間電子伝達を仲介する光化学安定な電子キャリア染料、23。一方、PMS がグルコース 6-リン酸脱水素酵素活性を阻害する、PMS 役に立たない5を発見したいくつかの科学者を報告している、酵素の局在化の価値があるし、我々 のプロトコルに含めることに PMS がわかったポリビニル アルコールを使用してグルコース 6-リン酸脱水素酵素1の拡散を制限するいくつかの他の著者が報告しています。実験では、有用であるポリビニル アルコールを見つけられませんでした、それを排除しました。
いくつかの手順は、染色の成功のために重要です。1 つの重要な問題は、組織のサンプルを cyromolds に正しく配置することです。皮膚のセクションは、フラット、スライス カット、肌全体にレイアウトするか。さらに、複数のセクションを準備する場合は、それは理想的な同じスライド上一緒にスライスできますので同じ cryomold 内に埋め込まれている場合。これはクリオスタットでカットはスライドの厚さによる変動を排除するのに役立ちます。また、組織がまだ酵素活性を保持することを確認することが重要です。
反応を終了する最もよい時期は経験的に決定する必要があります。潜伏期間中にスライドを密接に監視し、青い汚れの強度に基づいてスライド マウントを対比染色を追加して適切な時間を決定する必要は。サンプルがあまりにも軽く染色、それは活動の場所を特定することが可能なります。サンプルが overstained される場合は、活動で高値、もともと特定の領域を確認するために困難に塩の沈殿物が広がることができます。
このプロトコルは代謝の役割についての質問の広い範囲で科学者のために貴重になります期待しています。代謝活性と細胞系統マーカーや増殖マーカー、遺伝的モデルで、酵素活性の細胞内の局在化を評価する別の酵素の貢献を評価する共同染色用途の監視病気の組織や開発中の酵素活性は。

酵素が高または低活性を持つ、組織内の場所を理解する理解の開発および生理学のため不可欠です。謄本又はタンパク質レベルは、酵素活性の代理として使われます。このような研究は有益であることができます中、に、酵素の活動、翻訳後修飾、タンパク質複合体や酵素の細胞内局在性の存在などを決定するための重要なことができる情報は提供しません。酵素活性は直接計測するときにしばしばもはや組織内の高または低の活動と混合物または細胞の空間的分布内で個々 のセルについての情報が含まれて均質化タンパク質溶解液で監視されます。
ここで組織サンプル中の酵素活性の分布をマッピングするための詳しいプロトコルいたします。方法論は、テトラゾリウム塩を凍結するティッシュ1酸化酵素、還元酵素、脱水素酵素の活性のローカライズに使用できることを示す以前の研究に基づいています。これらのメソッドは、テトラゾリウム塩2,3に陽子が転送されるときに水不溶性ホルマザンが形成されます。グルコース-6-リン酸脱水素酵素は、NADPH と、陽子を生成し、テトラゾリウム アクティビティが検出されました。グルコース-6-リン酸脱水素酵素は、欧州ヒラメ肝4肺5の 2 型肺胞細胞と5腎臓のネフロンに監視されています。テトラゾリウム塩は、凍結するティッシュ6の細胞の活動を監視する使用されています。同様のアプローチは、隣接するスライド7で同じ組織の複数の脱水素酵素の活動を監視する最近使用されました。
乳酸脱水素酵素活性 (図 1) の空間分布を監視するテトラゾリウム塩を利用する方法をご紹介します。乳酸脱水素酵素、乳酸を解糖系と逆の反応で生成されたピルビン酸に変換できます。乳酸脱水素酵素活性はその結果ピルビン酸の乳酸とその分泌対トリカルボン酸入学の決定が重要であります。血液中の乳酸濃度は、それことを知らせた病気やけがが損傷した細胞、酵素がリリースされているので癌8,9,10, を含む病気の範囲の診断に使われます。
4 つの乳酸脱水素酵素の遺伝子がある: 発現、LDHB、LDHC、LDHD11。発現と LDHB は、早期発現遺伝子12の重複から生じていると考えられています。LDH は 4 量体として活躍、発現と LDHB は、homotetramers と heterotetramers の相互を形成できます。発現は、乳酸、高い親和性を持っていると優先的に乳酸をピルビン酸13に変換する LDHB が報告される間、ピルビン酸、高い親和性を有するとされています。発現プロモーターには、HIF1α、cMYC FOXM1 のトランスクリプション要因11結合部位が含まれています。さらに、ように多く他解糖系酵素14,15LDH が翻訳後修飾によって変更できます。線維芽細胞増殖因子受容体 1 は Y10、4 量体形成を促進する、または NADH 基板結合16を促進する Y83 発現に対することができます。発現にアセチル化17することができます。これらの理由から LDH タンパク質レベルだけでなく、同様の酵素の活性を監視する必要の LDH 活性を完全に理解します。
ここでは提示方式に加え乳酸脱水素酵素の活動を監視する他のアプローチは使用されました。乳酸脱水素酵素活性は、均質化蛋白ライセートの吸収スペクトルの測定監視できます。NADH の生成、乳酸、ピルビン酸に変換されます測定可能 340 吸光度に基づいて nm, ピルビン酸は乳酸18に変換されます NADH の消失を監視できます。乳酸脱水素酵素活性は、磁気共鳴画像 (MRI) に監視されています。13C ピルビン酸を投与することができの比としてピルビン酸から乳酸の変換を監視できる [1-13] 乳酸/[1-13C] ピルビン酸。比率を上昇 [1-13C] 乳酸/[1-13] ピルビン酸は、癌組織19で観察されています。MRI ベースのアプローチは、通常の乳酸脱水素酵素活性と疾患組織に関する情報を提供できますが、方法論は特定の細胞の活動レベルを決定するために必要な解像度を持っていません。ここで提供されている方法論は、組織の地域とも単一細胞における乳酸脱水素酵素活動の情報を提供できます。
その場で活性測定法を使用して、乳酸脱水素酵素の活性が高い20マウス皮膚の毛包幹細胞のことがわかった。また培養胚性幹細胞の乳酸脱水素酵素の活動を監視し、活動は幹細胞に送り装置の層よりも高いメソッドを使いました。最後に、新鮮なマウス大動脈における乳酸脱水素酵素の活動を監視し、平滑筋細胞内染色を観察しました。我々 はここで冷凍マウス皮膚における乳酸脱水素酵素の活動を監視するための詳しいプロトコルについて説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="814">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:312px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;">For collecting skin from euthanized mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">NC9511236</td>
			<td style="width:217px;">For freezing mouse skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">NC9638938</td>
			<td style="width:217px;">For mounting cryomolds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">07-210-106</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Dry Ice</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Polysine Adhesion Slide</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">12-545-78</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">4% formalin</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">23-245-684</td>
			<td style="width:217px;">Dilluted in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">phosphate buffered saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">vortex</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tris base</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">23-245-684</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NAD</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">N7004</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phenazine methosulfate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P9625</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">Nitrotetrazolium blue chloride</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">N6876</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Lithium L-lactate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">L2250</td>
			<td style="width:217px;">Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">37&#176;C incubator (or tissue culture incubator)</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Braziliant! Counter stain</td>
			<td style="width:164px;">Anatech</td>
			<td style="width:121px;">861</td>
			<td style="width:217px;">Counter stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:164px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:121px;">H-5000&#160;</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Cover slips for slides</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">12-544D</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Light microscope</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping metabolism: monitoring lactate dehydrogenase activity directly in tissue

空間と時間における酵素活性のマッピングは、正常組織と病気での細胞行動の分子基盤を理解することにとって重要です。その場で代謝活性アッセイは、組織内の代謝活動の空間分布に関する情報を提供できます。ここで組織サンプルに直接酵素乳酸脱水素酵素の活動を監視するための詳しいプロトコルいたします。乳酸脱水素酵素は消費グルコースが好気性または嫌気性解糖系によるエネルギーに変換するかどうかの決定が重要です。液乳酸および NAD は、凍結するティッシュ セクションを提供しています。高乳酸脱水素酵素活性と細胞はニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NAD) NADH と検出することができるプロトンの減少に基づいて提供される同時変換中、提供乳酸をピルビン酸に変換されます。nitrotetrazolium 青青い沈殿物として可視化した塩。マウス皮膚における乳酸脱水素酵素の活動を監視するための詳しいプロトコルについて述べる。このプロトコルを適用すると、乳酸脱水素酵素活性が皮膚内で静止の毛包幹細胞で高いことがわかった。マウス胚性線維芽細胞より培養胚性幹細胞の高い染色プロトコルを培養マウス胚性幹細胞に適用することを明らかにしました。新鮮単離マウス大動脈の解析では、大動脈に垂直平滑筋細胞における染色を明らかにしました。提供手法を使用して、新鮮なまたは冷凍の組織で陽子を生成する酵素の活性を空間的にマッピングすることができます。

我々 は以前マウス皮膚20の活性測定法の場での結果を報告しました。図 3のように、上記の手順で説明したときの毛包の基部に毛包幹細胞の乳酸脱水素酵素活性の高いレベルが続いていたを見ました。これらの調査結果は、毛包幹細胞を皮膚の並べ替えと並べ替えられた細胞の活性測定法と幹細胞コンパートメント高乳酸脱水素酵素活性を確認する蛍光性によって作動セルによって確証されました。
毛包幹細胞が高乳酸脱水素酵素活性を持つという我々 の調査結果に基づいて、我々 は培養胚性幹細胞の研究を拡張しました。マウス萌芽期の繊維芽細胞はフィーダー層としては、単独で、または胚性幹細胞の存在下で解析しました。媒体の吸気、培養細胞を分析して細胞が簡単に固定し乳酸脱水素酵素染色液を上記のように培養します。胚性線維芽細胞 (図 4) マウスと比較して胚性幹細胞における高乳酸脱水素酵素活性を見ました。
新鮮単離組織染色プロトコルも適用しました。マウス大動脈は解剖され、スライス オープン。血管が開かれ、固定化、内部大動脈の内腔にアクセスでした。サンプル新鮮な組織に適用されたトリトン X 染色液 10 分乳酸脱水素酵素染色液の乳酸脱水素酵素とその後の 10 分の 0.5% を含むハンクの平衡塩溶液で培養。インキュベーション後、画像を集め、平滑筋細胞 (図 5) の染色を示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57760/57760fig1.jpg"> 図 1: 化学活性乳酸脱水素酵素とその検出します。乳酸脱水素酵素はピルビン酸 + NADH + H+乳酸 + NAD を変換します。生成されるプロトン ニトロブルーテトラゾリウムを青色の沈殿物を形作る塩に減ります。<a href="/files/ftp_upload/57760/57760fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57760/57760fig2.jpg"> 図 2: Cryomolds のマウス皮膚を定位のスケマティック。各断面は、表皮、真皮、皮下、筋肉から全身の皮膚の断面を含まれることマウス皮膚が cryomolds 内でする必要があります。<a href="/files/ftp_upload/57760/57760fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57760/57760fig3.jpg"> 図 3: 乳酸脱水素酵素染色マウス皮膚の毛包幹細胞で高活性を明らかにします。マウス皮膚は cryomolds で凍結され、培養乳酸脱水素酵素とは、乳酸を含む染色液。乳酸脱水素酵素活性は、毛包幹細胞で顕著だった。(A, B)マウス皮膚の乳酸脱水素酵素活性測定法の 2 つの画像。(C, D)源泉徴収基板乳酸染色コントロールの 2 つの画像。スケールバー = 50 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57760/57760fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57760/57760fig4.jpg"> 図 4: 培養マウス胚性幹細胞における高乳酸デヒドロゲナーゼ活性します。照射マウス胚性線維芽細胞の送り装置の層上に成長した培養マウス胚性幹細胞は、乳酸脱水素酵素活性の解析しました。繊維芽細胞と比較して幹細胞の高い活性を示した。マウス胚性線維芽細胞は、染色と照射なしの同じようなレベルを示した。画像は、20 × 対物で撮影されました。スケールバー = 50 μ m. (B、D、E、) マウス胚性線維芽細胞と幹細胞。(C)マウス胚性線維芽細胞だけで。(A ~ C)染色液の孵化の 7 分後に撮影されました。(D-F)染色液の孵化の 20 分後に撮影されました。<a href="/files/ftp_upload/57760/57760fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57760/57760fig5.jpg"> 図 5: マウス大動脈を取り巻く平滑筋細胞における高乳酸脱水素酵素活性します。大動脈は、安楽死させたマウスから分離しました。船は 2% パラホルムアルデヒドで 2 分間修正され、1 x リン酸緩衝生理食塩水の 3 × 10 分を洗浄しました。0.5% トリトン X とリン酸緩衝生理食塩水で洗浄の 3 x 5 分ハンクの平衡塩溶液を添加して血管。サンプル 37 ° C で 10 分間培養し, および 3 x 5 分 x 1 リン酸緩衝生理食塩水での洗浄、乳酸脱水素酵素染色液が追加されました。サンプル 2% パラホルムアルデヒドで 1 時間固定し、リン酸緩衝生理食塩水 x 1 と 3 x 5 分を洗浄およびイメージします。(A) 乳酸脱水素酵素液乳酸。(ネガティブ コントロールとして乳酸なし乳酸脱水素酵素 B) ソリューションです。各セクションの左下の拡大画像があるし、右側に高倍率で指定された領域を示します。(A, B)乳酸を含む完全な乳酸脱水素酵素溶液は、染色に使われました。B はネガティブ コントロールとしての汚損のため使用されたイメージ (C, D) A. 乳酸脱水素酵素ソリューション乳酸なしで示された領域の拡大画像です。D は C で示された領域の拡大画像です。A と C は 20 X の目的で撮影された (スケールバー = 50 μ m) と B と D は、40 X 目的で撮影された (スケール バー = 20 μ m)。<a href="/files/ftp_upload/57760/57760fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

マッピング代謝: 監視組織で直接乳酸脱水素酵素活性

Nicotinatmide アデニン酸 (NAD(P)H) + H + 組織サンプルで直接生成酵素の酵素活性の分布をマッピングするためのプロトコルについて述べます。

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

mapping-metabolism-monitoring-lactate-dehydrogenase-activity-directly

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.3K ビュー.  UCLA. Nicotinatmide アデニン酸 (NAD(P)H) + H + 組織サンプルで直接生成酵素の酵素活性の分布をマッピングするためのプロトコルについて述べます。

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A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of "mock sorted" cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.

This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.

安定同位体のトレースを使用した複雑な細胞のコミュニティのソートされた亜集団で代謝を測定する方法

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

生化学

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of reactive oxygen species, and more. These fluctuations can lead to a widespread protein unfolding, aggregation, and cell death. Therefore, cells have evolved a dynamic and stress-specific network of molecular chaperones, which maintain a "healthy" proteome during stress conditions. ATP-independent chaperones constitute one major class of molecular chaperones, which serve as first-line defense molecules, protecting against protein aggregation in a stress-dependent manner. One feature these chaperones have in common is their ability to utilize structural plasticity for their stress-specific activation, recognition, and release of the misfolded client. 
In this paper, we focus on the functional and structural analysis of one such intrinsically disordered chaperone, the bacterial redox-regulated Hsp33, which protects proteins against aggregation during oxidative stress. Here, we present a toolbox of diverse techniques for studying redox-regulated chaperone activity, as well as for mapping conformational changes of the chaperone, underlying its activity. Specifically, we describe a workflow which includes the preparation of fully reduced and fully oxidized proteins, followed by an analysis of the chaperone anti-aggregation activity in vitro using light-scattering, focusing on the degree of the anti-aggregation activity and its kinetics. To overcome frequent outliers accumulated during aggregation assays, we describe the usage of Kfits, a novel graphical tool which allows easy processing of kinetic measurements. This tool can be easily applied to other types of kinetic measurements for removing outliers and fitting kinetic parameters. To correlate the function with the protein structure, we describe the setup and workflow of a structural mass spectrometry technique, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, that allows the mapping of conformational changes on the chaperone and substrate during different stages of Hsp33 activity. The same methodology can be applied to other protein-protein and protein-ligand interactions.

One of the most challenging stress conditions that organisms encounter during their lifetime involves the accumulation of oxidants. During oxidative stress, cells heavily rely on molecular chaperones. Here, we present methods used to investigate the redox-regulated anti-aggregation activity, as well as to monitor structural changes governing the chaperone function using HDX-MS.

Hsp33 の酸化還元規制シャペロン活性を定義および水素重水素交換質量分析法による Hsp33 の構造変化をマッピング

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine whether there is an imbalance in age-related energy metabolism between mitochondrial oxidative phosphorylation and aerobic glycolysis. Here, we show the utilization of commercial colorimetric assay kits for lactate and pyruvate in the model organism C. elegans. Recently, the sensitivity and accuracy of the colorimetric/fluorimetric assay kits have been improved greatly by the research and development conducted by reagent manufacturers. The improved reagents have enabled the use of small-scale assays with a 96-well plate in C. elegans. In general, a fluorimetric assay is superior in sensitivity to a colorimetric assay; however, the colorimetric approach is more suitable for the use in common laboratories. Another important issue in these assays for quantitative determination is protein precipitation of homogenized C. elegans samples. In our protein precipitation method, common precipitants (e.g., trichloroacetic acid, perchloric acid and metaphosphoric acid) are used for sample preparation. A protein-free assay sample is prepared by directly adding cold precipitant (final concentration of 5%) during homogenization.

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe a modified small-scale extraction and colorimetric assays of lactate and pyruvate in the nematode C. elegans. When utilizing commercial assay kits, the technical development of their sensitivity and accuracy is important. Protein precipitation in extraction is the most critical step for the quantitative determination of intracellular metabolites.

小規模な比色試金の細胞内乳酸と線虫の線虫のピルビン酸

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

TRNA イソペンテニル トランスフェラーゼ活性を検出する体外の試金

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is synthesized in response to multiple cellular and environmental factors. Melanin protects skin cells from ultraviolet damage, but also has biophysical and biochemical functions. Excessive production or accumulation of melanin in melanocytes can cause dermatological problems, such as freckles, dark spots, melasma, and moles. Therefore, the control of melanogenesis with hypopigmentation agents is important in individuals with clinical or cosmetic needs. Melanin is primarily synthesized in the melanosomes of melanocytes in a complex biochemical process called melanogenesis, which is influenced by extrinsic and intrinsic factors, such as hormones, inflammation, age, and ultraviolet light exposure. We describe three methods to determine the hypopigmentation activity of chemicals or natural substances in melanocytes: measurement of the 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) staining and quantifying cellular melanin with image analysis.
In melanogenesis, tyrosinase catalyzes the rate-limiting step that converts L-tyrosine into 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and then into dopaquinone. Therefore, the inhibition of tyrosinase is a primary hypopigmentation mechanism. In cultured melanocytes, tyrosinase activity can be quantified by adding L-DOPA as a substrate and measuring dopaquinone production by spectrophotometry. Melanogenesis can also be measured by quantifying the melanin content. The melanin-containing cellular fraction is extracted with NaOH and melanin is quantified spectrophotometrically. Finally, the melanin content can be quantified by image analysis following Fontana-Masson staining of melanin. Although the results of these in vitro assays may not always be reproduced in human skin, these methods are widely used in melanogenesis research, especially as the initial step to identify potential hypopigmentation activity. These methods can also be used to assess melanocyte activity, growth, and differentiation. Consistent results with the three different methods ensure the validity of the effects.

We describe three experimental methods for evaluating the hypopigmentation activity of chemicals in vitro: quantification of 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) measurement of melanin by cellular melanin staining and image analysis.

培養色素脱失活動の定量化

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the progression of cancer, diabetes, neurodegeneration, and aging to name a few. For instance, changes in mitochondrial activity, the cell&#39;s metabolic powerhouse, have been characterized in many such diseases. Generally, the oxygen consumption rates of mitochondria were considered a reliable readout of mitochondrial activity and measurements in some of these studies were based on isolated mitochondria or cells. However, such conditions may not represent the complexity of a whole tissue. Recently, we have developed a novel method that enables the dynamic measurement of oxygen consumption rates from whole isolated fly heads. By utilizing this method, we have recorded lower oxygen consumption rates of the whole head segment in young versus aged flies. Secondly, we have discovered that lysine deacetylase inhibitors rapidly alter the oxygen consumption in the whole head. Our novel technique may therefore aid in uncovering new properties of various drugs, which may impact metabolic rates. Furthermore, our method may give a better understanding of metabolic behavior in an experimental setup that more closely resembles physiological states.

Measuring alterations in metabolic rates is central to understanding the progression of various diseases and aging. Here, we present a novel technique to measure whole head oxygen consumption that more closely resembles the physiological state and may aid in revealing novel drugs that modify mitochondrial activity.

測定と酸素消費量全体の解釈飛ぶ頭セグメント

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in liver cancer, the modification by SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) has been given the most attention. Isolation of endogenous SUMOylated proteins in vivo is challenging due to the presence of active SUMO-specific proteases. Initial studies of SUMOylation in vivo were based on the molecular detection of specific SUMOylated proteins (e.g., by western blot). However, in many cases, antibodies, generally made with non-modified recombinant protein, did not immunoprecipitate SUMOylated forms of the protein of interest.&#160;Nickel chromatography has been the other approach to study SUMOylation by capturing histidine-tagged versions of SUMO molecules. This approach is mainly used in cells stably expressing or transiently transfected with His-SUMO molecules. To overcome these limitations, SUMO-binding entities (SUBEs) were developed to isolate endogenous SUMOylated proteins. Herein, we describe all the steps required for the enrichment, isolation, and identification of SUMOylated substrates from human hepatoma cells and hepatic tissues from a liver cancer mouse model by using SUBEs. Firstly, we describe methods involved in the preparation and lysis of the human hepatoma cells and liver tumor tissue samples. Then, a thorough explanation of the preparation of SUBEs and controls is detailed along with the protocol for the protein pull-down assays. Finally, some examples are provided regarding the options available for the identification and characterization of the SUMOylated proteome, namely the use of western-blot analysis for the detection of a specific SUMOylated substrate from liver tumors or the use of proteomics by mass spectrometry for high-throughput characterization of the SUMOylated proteome and interactome in hepatoma cells.

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Here, we present a protocol to enrich, isolate, identify, and characterize proteins modified by SUMO in vivo both from human hepatoma cells and liver tumors obtained from mouse models of hepatocellular carcinoma by using SUMO-binding entities (SUBEs).

肝癌における相撲プロテオームの濃縮、単離、同定、特性評価のためのツールとしての相撲結合エンティティ(SES)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is going to move beyond the laboratory and become a widespread and standard just in time manufacturing technology, we must understand the performance limits of these systems. Toward this question, we developed a robust protocol to quantify 40 compounds involved in glycolysis, the pentose phosphate pathway, the tricarboxylic acid cycle, energy metabolism and cofactor regeneration in CFPS reactions. The method uses internal standards tagged with 13C-aniline, while compounds in the sample are derivatized with 12C-aniline. The internal standards and sample were mixed and analyzed by reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry (LC/MS). The co-elution of compounds eliminated ion suppression, allowing the accurate quantification of metabolite concentrations over 2-3 orders of magnitude where the average correlation coefficient was 0.988. Five of the forty compounds were untagged with aniline, however, they were still detected in the CFPS sample and quantified with a standard curve method. The chromatographic run takes approximately 10 min to complete. Taken together, we developed a fast, robust method to separate and accurately quantify 40 compounds involved in CFPS in a single LC/MS run. The method is a comprehensive and accurate approach to characterize cell-free metabolism, so that ultimately, we can understand and improve the yield, productivity and energy efficiency of cell-free systems.

Here, we present a robust protocol to quantify 40 compounds involved in central carbon and energy metabolism in cell-free protein synthesis reactions. The cell-free synthesis mixture is derivatized with aniline for effective separation using reversed-phase liquid chromatography and then quantified by mass spectrometry using isotopically labelled internal standards.

逆相液体クロマトグラフィー-質量分析法による無細胞タンパク質合成代謝の絶対定量

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective denaturation of proteins from RNA, 3) ribonuclease inactivation, and 4) removal of contamination from DNA, proteins, and carbohydrates. However, it is very laborious to maintain the integrity of RNA when there are high levels of RNase in the tissue. Spontaneous autolysis makes it very difficult to extract RNA from pancreatic tissue without damaging it. Thus, a practical RNA extraction method is needed to maintain the integrity of pancreatic tissues during the extraction process. An experimental and comparative study of existing protocols was carried out by obtaining 20-30 mg of rat pancreatic tissues in less than 2 minutes and extracting the RNA. The results were assessed by electrophoresis. The experiments were carried out three times for generalization of the results. Immersing pancreatic tissue in RNA stabilization reagent at -80 &#176;C for 24 h yielded high integrity RNA, when the RNA extraction reagent was used as the reagent. The results obtained were comparable to the results obtained from commercial kits with spin column bindings.

The purity and integrity of the isolated RNA is a vital step in RNA dependent assays. Here, we present a practical, rapid, and inexpensive method to extract RNA from a small quantity of undamaged pancreatic tissue.

ラット膵臓組織の迅速かつ費用対効果の高いRNA抽出

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains of &#945;1,4-linked glucose residues with branches introduced through the addition of &#945;1,6-linkages. Understanding how the synthesis and degradation of glycogen are regulated and how glycogen attains its characteristic branched structure requires the study of the enzymes of glycogen storage. However, the methods most commonly used to study these enzyme activities typically employ reagents or techniques that are not available to all investigators. Here, we discuss a battery of procedures that are technically simple, cost-effective, and yet still capable of providing valuable insight into the control of glycogen storage. The techniques require access to a spectrophotometer, operating in the range of 330 to 800 nm, and are described assuming that the users will employ disposable, plastic cuvettes. However, the procedures are readily scalable and can be modified for use in a microplate reader, allowing highly parallel analysis.

Techniques to measure the activity of key enzymes of glycogen metabolism are presented, using a simple spectrophotometer operating in the visible range.

真核生物グリコーゲン代謝研究のための吸光光度法

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...