本研究は、ペリン C. ボルカン (デブ 1457690) に全米科学財団からの助成金によって支えられました。

次のプロトコルは、デューク大学研究倫理委員会の倫理規範と一致。
1. 組織ショウジョウバエ蛹の発育の準備及び
<ol><li>まず、どのように多くのハエが郭清の必要があります。RT-PCR および RNAseq は、前、8 h APF、40 h APF、および大人の段階で必要である個人から 100-200 触角ディスクと触角を収集します。免疫組織の個々 の 10-20 を解剖します。</li>
	<li>郭清パッドおよび鉗子、70% のワイプを使用してを含むすべての材料をきれい江藤。切り裂かれた材料は RNA の抽出に使用する RNase 中和剤できれい、ヌクレアーゼ フリーのいずれかを使用してすべてのソリューションまたはピロ炭酸ジエチルエステル (DEPC) 処理水。 注: このプロトコルは、ガラスではなく、解離の解離のシリコン パッドを使用します。シリコン パッドは超微細鉗子にやさしい、高速かつ高品質の解離を促進します。</li>
	<li>0 h APF/前ステージで蛹を収集します。<ol>
<li>最も正確なステージングを確認するには、30 分を 1 時間間隔で幼虫を監視します。 注: やや混雑したボトルで放浪 3 齢幼虫は数時間以内は蛹可能性が高い。</li>
		<li>幼虫は不動なり非常に軽い (ほぼ白) 色蛹ケースに囲まれている、一度、小 2 で湿ったろ紙を敷いたシャーレに転送します。</li>
		<li>1-2 時間、時折監視、識別、および前蛹の転送を続けます。 注: または、すべて蛹のボトルをオフにし、幼虫は、2 h の開発を許可します。すべての蛹は、APF 範囲 2 h が 0 - 2 h になります後に収集されました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ステップ 3.1 0 h APF ステージ前の触角を解剖するすぐに移動します。イラガ前蛹が熟成する場合は、皿にそれらを収集、カバー皿とパラフィン膜の乾燥を抑制するエッジの周りを配置し、25 ° C にペトリ皿を配置 注: 蛹は、羽化に今老化することができます。</li>
	<li>蛹は 2 h の範囲で収集の蛹がないことを確保するために 2 h 希望年齢未満の前蛹を年齢超過。</li>
	<li>組織が非常に小さく、壊れやすい、超微細鉗子 (デュモン 55) を使用します。</li>
</ol>2. 組織他のショウジョウバエの種から蛹の発達の準備及び
<ol><li>他ショウジョウバエ種の蛹の発育日数を調べるには、最適な温度でサンプルを配置、前蛹を観察するときの日付を記録、新鮮なバイアルに並べ替えたり、イラガ前蛹から成人期までの日数数を記録します。</li>
	<li>非キイロショウジョウバエ種とキイロショウジョウバエの蛹の発育のための時間の割合を記録します。キイロショウジョウバエのステージング非キイロショウジョウバエ種を年齢に時間の数を取得するために使用時間の数によって発達の時間の割合を乗算します。</li>
</ol>3.ショージョーバエ ・蛹の触角の郭清
注: すべてのエージング時間と解剖のプロトコルの説明がキイロショウジョウバエ。他のすべての種のため、種特異的な発達時期に基づく高齢化プロトコルの変更は、前述のよう、必要になります。
<ol><li>蛹の触角解剖の 50 100 0 - 2 h やヘラを使用して 6 ~ 8 h 古い蛹を収集し、郭清パッドの上に置きます。</li>
	<li>RNA 分離ソリューションの 150 μ L のピペット、RNase フリー 1.5 mL および microfuge 200 μ L ピペットを使用してチューブし、チューブを氷の場所に。</li>
	<li>1 × PBS (リン酸緩衝生理食塩水、ヌクレアーゼ フリー) の 150-200 μ L 中の蛹を解剖します。郭清パッドに PBS (液滴あたり 150-200 μ L) の複数の滴を配置します。</li>
	<li>郭清パッド PBS 滴 × 1 のいずれかで切り裂かれる 0 - 2 h または歳 6-8 h 蛹 (1 ドロップ 1 つ蛹) を配置します。体を安定させるために片方の手で鉗子を使用します。</li>
	<li>0 - 2 h 蛹、イラガ前蛹の最も前方部分 (口フック) する一方、ホールドで鉗子を用いた高齢者し、脳と前蛹の場合に添付成虫ディスクを公開するそれを引き出します。</li>
	<li>8 h APF 蛹の最初を慎重にはがし本体を囲む膜の袋内のヘッドを公開、蛹の最も前の四半期から蛹ケース。 注: ボディ、この段階でように見えます変性幼虫。</li>
	<li>ネック ジョイントの頭を削除します。 注: これにより、触角のディスクが、失われないだろうことをこの段階では主に脳の視葉に接続しています。</li>
	<li>脳と成虫ディスク組織を鉗子または 20 μ L ピペットを使用して PBS 液滴 x 別 1 に転送します。</li>
	<li>視葉で脳に接続された目触角のディスクを識別します。鉗子を使用して、脳と蛹のケースから目触角を外します。鉗子または 20 μ L ピペットを使用して PBS 液滴 x 新しい 1 に転送します。 注: 前の目触角ディスク、フラット組織です。ただし、8 h 蛹目ディスクは回転カッピング触角ディスク中央の脳の前方に座っています。</li>
	<li>鉗子を使用すると、目と触角のディスク間の接続のサイトでティッシュをカットします。20 μ L ピペットを使用して、優しく RNA 分離液試薬に切り裂かれたティッシュを転送します。できるだけ小さく量をピペットで転送される液体の量を最小限に抑えます。</li>
	<li>この操作を繰り返して、すべての蛹を解剖しました。</li>
</ol>4.ショージョーバエ ・半ば-蛹とアダルト アンテナの郭清
注: 40 h APF、変容の大部分が完了し、大人の構造、明らかになっているが、まだ白と目立たない。この発達の時点でアダルト アンテナその最終的な形をとっているけれどもまだ透明には、嗅覚受容体の少数を除いて、大半が式を開始していません。
<ol><li>蛹の触角の解剖の手順 1 で説明したように 50-100 の前蛹を収集し、25 ° C で 40 h の年齢</li>
	<li>ピペット 150 μ L の RNA 分離ソリューションに RNase フリー 1.5 mL 遠心チューブ 200 μ L ピペットを使用して、チューブを氷の場所します。</li>
	<li>郭清パッド PBS 滴 x 1 の 1 つに切り裂かれる蛹を配置します。体を安定させるために片方の手で鉗子を使用します。鉗子を使用すると、もう一方の手で、体を取り巻く膜袋内のヘッドを公開、蛹の最も前の四半期から蛹のケースを慎重にはがし。</li>
	<li>鉗子のセットが付いているボディを押し、鉗子の別のセットを持つ共同首で頭をリッピング蛹の体の残りの部分から頭を切って鉗子を使用して、慎重に。優しく鉗子を使用して PBS 液滴 x 別 1 に頭を転送します。上下のピペット ヘッド開発ショウジョウバエの頭部を囲む明確な膜を取得する (脳、等) の内容をきれいにします。 注: 40-50 h で APF、アンテナ膜の前方のセクションに接続しています。ピペッティングで頭の内容が消去されるとき、彼らは郭清の明白になります。</li>
	<li>鉗子を使用して、膜から蛹のアンテナを外します。3 からアンテナの 2ndセグメントを切断rd 3rdのセグメントだけが嗅覚受容ニューロンの家として区域の共同でスライスに鉗子を使用します。</li>
	<li>20 μ L ピペットを使用して、優しく RNA 分離液試薬に切り裂かれたティッシュを転送します。できるだけ小さく量をピペットで転送される液体の量を最小限に抑えます。この操作を繰り返して、すべての蛹を解剖しました。</li>
	<li>大人の触角解剖の約 50 大人を収集し、一週間後羽化の年齢します。 注: 嗅覚受容体遺伝子の発現と他の遺伝子はピーク羽化後一週間です。大人生体関連遺伝子検出のしきい値を超えて上昇する低豊富の成績証明書を確保するため一週間熟成します。</li>
	<li>RNA の抽出、CO2パッドの上まだ生きている間ハエを解剖します。RNase 阻害剤と CO2パッドを扱います。共焦点レーザー顕微鏡の解剖 1 × PBS または PBS + 0.2% で解剖パッドに乗って飛ぶトリトン。</li>
	<li>郭清範囲の下で CO2駅パッド上で寝る大人はまず、置きます。CO2駅パッドは、体を安定させるために片方の手で鉗子を使用して 2 番目から 3 番目の触角セグメントを優しくプル/ピンチにもう一方の手で鉗子を使用します。</li>
	<li>液体に直接アンテナを配置する鉗子を使用して RNA 分離ソリューションにアンテナを移します。この操作を繰り返して、すべての大人を解剖しました。 注: は、アンテナが RNA の分離ソリューションに沈んでいることを確認します。アンテナは、チューブの側面に残ることがあります。これは、rna の増加低下を RNA の品質と量を減らすことが生じます。</li>
	<li>直接 RNA の抽出に進むか、長期保存のための-80 ° c チューブを配置します。</li>
</ol>5 切り裂かれたティッシュから RNA の隔離
<ol><li>-80 ° C の記憶域からすべてのサンプルを削除し、氷の上にそれらを解凍します。</li>
	<li>簡単にスピン (5-6 s, ~ 6,000 x g) 各サンプル チューブの下部に資料の収集をします。</li>
	<li>10 のオートクレーブ養生プラスチック杵と電気モーターを使用して各サンプルを挽く氷上 s。</li>
	<li>5.2 と 5.3 の 4 の手順を繰り返します。</li>
	<li>市販のキットを使用して、次の最適な収率の製造元のプロトコル、RNA の抽出を実行します。</li>
	<li>市販試薬、遺伝子興味のそして次の製造元のプロトコルに対して特異的プライマーを用いた qRT PCR を実行します。<ol>
<li>次の条件を使用してすべての PCR 反応を行う: 95 ° C 10 分の変性に続いて 40 サイクル 95 ° C の 15 s、55 ° C、30 s、および 30 ° C、60 s。 注:ディップとdprの遺伝子のプライマーは、表 1に記載されて、嗅覚受容体遺伝子のプライマーは、Hueston CEらに表示されます。8。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 蛹触角ディスクと免疫組織化学のアンテナの固定
注: は、10-20 個人、組織、時間の同じ量の修正の確認からバッチで組織を修正します。サンプルは、組織の完全性を最大化する定着剤にそれらを転送する前に PBT (洗剤で PBS) で滞在時間の量を最小限に抑えます。
<ol><li>収集切り裂かれた触角ディスクまたは 0.2% の 200 μ L を含む 200 μ L の PCR チューブに蛹のアンテナ PBT 氷の上、組織の整合性を維持し、200 μ L の PCR の壁に付着してからサンプルを避けるためには不完全な固定につながる管します。 注: 蛹触角と触角ディスクかなり半透明を参照してくださいすることは困難にすることができます。組織の損失を防ぐためにすべての洗浄のステップの郭清範囲を使用することをお勧めします。また、96-well テラサキ プレート固定用に使用されると最適組織に管理する染色があります。</li>
	<li>4% の約 200 μ L で蛹から解剖の触角と触角のサンプルを修正 PFA (パラホルムアルデヒド) 室温で 30 分間。これおよびそれに続く手順は正しくソリューションのサンプルを混ぜて nutator にサンプル チューブを維持します。6.7 のステップに進みます。</li>
	<li>アダルト アンテナ頭全体をまず解剖 4% の約 200 μ L でそれを修正、PFA (パラホルムアルデヒド) 室温で 1 時間。</li>
	<li>0.2% の 200 μ L で 3 x を洗って 10 分 PBT です。孵化の間に、nutator のサンプルを保ちます。</li>
	<li>固定ヘッドからの第 2 触角セグメントの細かい解剖の解剖顕微鏡へ戻る。頭を安定させる、2 番目から 3 番目の触角セグメントを優しくプル/ピンチに鉗子を使用してください。</li>
	<li>4% の約 200 μ L に切り裂かれた第 3 触角セグメントを移す PFA (パラホルムアルデヒド) し、室温で 30 分間それらを修正します。</li>
	<li>0.2% の 200 μ L で 3 x を洗って 10 分 PBT です。孵化の間に、nutator のサンプルを保ちます。</li>
	<li>4 ° C で試料を保存か全体マウント免疫組織化学的に直接進みます。 注: 抗体が使用されていると、染色の効率が変わります。このメソッドは、以下の豊富なタンパク質タグの適切なまたは弱い抗体をする必要があります。しかし、時に、それは (アイデンティティまたは固定液の量や固定の時間) プロトコルの最適化を必要があります。</li>
</ol>

<ol>
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この議定書は遺伝子と転写プログラム開発ショウジョウバエ嗅覚組織だけでなく、これらのプログラムの比較分析ショウジョウバエで動作を識別するのに興味を持って実験室のための有用なリソース種。それは、将来の研究のためのプライマーとしてさまざまな発達段階からシステム レベルの転写プロファイルが必要な場合に便利です。ここで説明されているプロトコルはステージし、分化される前のパターンから嗅覚システムの開発の 4 つの主要段階からサンプルを取得するショウジョウバエの嗅覚組織の開発を分離する方法を示します分子および免疫組織学的研究.ショウジョウバエの解剖触角ディスクとさまざまな蛹段階でアンテナは定量的 RT-PCR による RNA シーケンスによるシステム レベルまたは個々 の遺伝子レベルでの嗅覚系開発時の遺伝子発現プロファイルを識別する使用できます。サンプルは、体内の組織特異的遺伝子発現のパターンを識別する免疫組織および上皮内交配のため使用できます。このプロトコルの追加の利点は、解離の標準的な方法を使用して、FAC 並べ替えなど、セル型固有の分子分析精製細胞人口 (または単一の細胞) を取得するにはさらにすることができます解剖サンプル定量RT-PCR または RNAseq。
にもかかわらず、プロトコルは、触角のディスクと (0 h/イラガ前蛹、8 h、40 h APF) で蛹からアンテナおよび大人の段階の解離を示しては、他の蛹の時期に合わせることができます。それはまたこれらの解剖を学習は時間と練習を言及する価値が。専門家は、時速 50 サンプルを分析することができるはず。超過しないことが重要です蛹。したがって、解剖を開始する前に時間は、希望年齢よりも蛹がないことを確認します。各ステージの練習の期間は実験を開始する前に必要なので解剖については、時間がかかることができます。解剖は、形態学的変化のための 9-12 h APF から難しくなります。それは年齢によって蛹のソートも可能 (暗い色のそれ以上の年齢の身体の色) で前蛹を収集するとき。時効を防ぐために年齢順に解離最初前蛹の並べ替えが可能です。
上記で説明したプロトコルは、他のショウジョウバエの種に適用できます。他の種の蛹の解離のタイミング基づくことができますショージョーバエ ・ 25 ° C で特定の種の蛹の発育の比率およびアンテナ/触角ディスク形態の比較観測の両方解剖中で、可能な限り同じにする形態の考慮事項に優先します。ショウジョウバエ、蛹期は約 4 日間かかります。D. sechellia D. エレクター蛹発達ステージングはキイロショウジョウバエ;に似てただし、クロショウジョウバエ蛹の発育は長く11,12x 1.3 です。他の種の解剖のため準備がステージングは形態学的類似性が最も高い優先度を中蛹期間の両方のタイミングとステージ固有アンテナ/触角ディスク形態の比較観測に基づく必要があります。まず、興味のある種の温度処理最適を識別します。多くの種は 25 ° C でも成長が、UC サンディエゴショウジョウバエ種のストック センターから保守条件についての詳細を取得できます。
プロトコルの最も重要な手順は、正しいステージングと十分な数の異なる種からの興味の組織の適切な郭清です。これらがあると、一度プロトコルはそのような分析の組織コレクションの効率的な方法を提供します、ショウジョウバエ種のいずれかで蛹の段階で実質的にあらゆる発展途上の成虫ディスク ティッシュに合わせることができます。
このプロトコルの制限の 1 つはセルの種類に固有のサンプルを行いません。細胞の機能と形態のより詳細な理解には、定量的 RT-PCR 法や免疫組織化学など標準的な分子手順に加えて、システム レベルでの転写プロファイリングの種類に固有のセルが必要です。セルの種類に固有のプロファイルが難しくなってきました特に非キイロショウジョウバエ種のセル型固有レポーター遺伝子組み換えの欠如を与えられました。携帯電話のプロファイルの現在の進歩、遺伝子組み換えや CRISPR Cas9 媒介非キイロショウジョウバエ種でゲノムの編集、ラベルや転写13をプロファイルする興味の単一セルを並べ替えられるようになりました。

発達神経生物学、システム神経科学、神経生理学、行動学、行動の進化1,2,3、ショウジョウバエの嗅覚システムは広く使用されているシステム 4。ショウジョウバエ嗅覚組織の水力発電と熱感覚ニューロン1,5,6に加えて揮発性化学手掛かりを検出嗅覚受容神経細胞 (ORNs) 家します。この原稿の全体的な目標は、ステージおよびショウジョウバエ種の蛹と大人の嗅覚組織の開発を分析する方法を示すことです。この技術のための理論的根拠は体内組織ラベリング技術にさらに RNAseq、定量的 RT-PCR など、周辺の嗅覚システムの分子・発達的分析に蛹の段階からサンプルを生成するには.この手法は、特定型のセルのすべての遺伝子導入試薬を持っていない非キイロショウジョウバエ ショウジョウバエの種から開発大人嗅覚システムの転写プロファイルのダイナミクスを識別する特に役立ちますラベリングと分析。本稿では、触角のディスクと蛹と大人のショウジョウバエ種からアンテナを分析する方法を示します。まず、ショウジョウバエの蛹殻形成過程 (APF、白い蛹や前蛹) 発達のステージングと種特異的な高齢化のための 0 h を識別する方法を示します。次に、触角ディスクと 3 番目の触角セグメントを分析する方法を示す具体的には、目のディスクと RNAseq または RT-Pcr に必要な組織の純度の第 2 触角セグメントからそれらを分離する方法。キイロショウジョウバエ約このプロトコルで記述されている段階対応済みパターンの触角 (前蛹)、前駆体、触角からの選択ディスク (8 h APF) ORNs (40 h APF) の分化の開始とアダルト アンテナ。メソッドを使用して分離された大人アンテナからと生体内での免疫組織化学の最後に、我々 は、定量的 RT-PCR 法の例を与えます。このメソッドは、RNA ・ DNA 分析、ショウジョウバエ種から末梢の嗅覚組織の開発に免疫組織化学のサンプルを生成する使用できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1180px;" width="1180">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">10X Phosphate-buffered Saline</td>
			<td style="width:236px;">Gibco</td>
			<td style="width:241px;">70011-044</td>
			<td style="width:432px;">Dilute to 1X in RNase free water</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CO2 tank</td>
			<td>Air Gas</td>
			<td>CD R200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Two sharp forceps (Dumont #55)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-026</td>
			<td>RNA isolation solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small bucket with ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P20 and P200 micropipettes and tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.7 mL Microfuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchase nuclease free for best results</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 mL PCR tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde powder</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10% Triton X-100</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T1105</td>
			<td>Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2&#34; petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">55mm filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td>Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25 C incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">deionized H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Purchase nuclease free or treat with DEPC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroWell Mini Trays with lids</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>438733</td>
			<td>Lids can be used to make silicone dissection pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-GFP antibody</td>
			<td>MBL international corpor</td>
			<td>PM005</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti RAT CD2</td>
			<td>AbD seroTec</td>
			<td>MCA154RHDL</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ADL195 (anti lamin, mouse)</td>
			<td>Dev studies hydoma ban</td>
			<td>ADL195-s</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor&#174; 488 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy3 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-166-003</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered</td>
			<td>CALBIOCHEM</td>
			<td>648463</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lab Rotator</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td>Rotator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease Free Water</td>
			<td>Growcells.com</td>
			<td>NUPW-0125</td>
			<td>Water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light-Duty Tissue Wipers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82003-822</td>
			<td>For cleaning dissection supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superscript II</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td>Reverse Transcriptase&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAshredder (50)</td>
			<td>RNA extraction</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>79654</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oligo(dT)12-18 Primer</td>
			<td>RT</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>18418012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)</td>
			<td>RNA extraction</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74204</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)</td>
			<td>qPCR</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04913850001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER&#160;</td>
			<td>qPCR</td>
			<td>Roche</td>
			<td>06402712001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIGHTCYCLER 480 - MULTIWELL PLATE 96</td>
			<td>qPCR</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04729692001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix</td>
			<td>qPCR</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0541S</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing developing peripheral olfactory tissue for molecular and immunohistochemical analysis in drosophila

ショウジョウバエの嗅覚は発達神経生物学、システム神経科学、神経生理学、行動、行動の進化で広く使われているシステムです。ショウジョウバエ嗅覚組織の水力発電と熱感覚ニューロンに加え揮発性化学手掛かりを検出嗅覚受容神経細胞 (ORNs) 家します。このプロトコルでは大人のショウジョウバエ種の嗅覚の末梢組織の開発の解剖について述べる。最初にステージングして、半ば蛹と大人からアンテナの解剖によって続いて蛹初期から続く、触角の解剖によってショウジョウバエ幼虫の年齢方法について述べる。我々 も準備を qRT PCR、RNAseq、または免疫組織化学の RNA の抽出など、分子生物学の手法で活用できるメソッドに示します。これらのメソッドは、種特異的な蛹の発育度の決定、および適切な高齢化の各段階の計算後、他のショウジョウバエの種に適用もできます。

切り裂かれた発展途上の嗅覚組織遺伝子発現を評価する RT-PCR による RNA 抽出の使用ことができますまたはその表現パターンとの遺伝子の細胞内の局在を決定する免疫プロトコルによって取ることができます。関心します。このセクションのいずれかのプロトコルからの代表的な結果を提案する.図 1は、代表定量的 RT-PCR 野生型アダルト アンテナの細胞表面受容体と嗅覚受容体遺伝子の転写を示します。図 2は、6-8 h と Rn EGFP トランスジェニックに 12 h APF の触角染色ハエを使用して抗 GFP (1: 1000) と反ラミン抗体 (1: 100) (図 2Aおよび2 b)。Rn EGFP 蛹初期触角ディスク内の特定領域にラベルを付けます。40 h APF 蛹触角抗 GFP 抗体染色Or67d GAL4 UA CD8GFP遺伝子組換えハエと大人触角アンチ elav (1: 100) 抗体の汚損 ORNs (図 2) も表示します。他の例は文献7,8,9,10でもあります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57716/57716fig1v2.jpg"> 図 1.異なる遺伝子の野生型アダルト触角の RNA のサンプルから定量的 RT-PCR 法。これらのパネルは、(A) の定量的 RT-PCR の結果を表示、ディップ α ディップ eta、dpr5、dpr8、kug、beatIIIb (プライマーのペアは表 1を参照、) と (B) 嗅覚とイオン型受容体 (または/Ir)大人からの遺伝子触角の RNA のサンプル。誤差範囲は、(SEM) の平均の標準誤差を表示します。または/Ir遺伝子は低豊富まだ qRT PCR で検出できる Rna であります。3 通の各遺伝子の発現を調べた。Ct 値は、各遺伝子の作成した標準曲線に基づく各遺伝子の希釈係数を計算する使用されました。希釈倍率は、平均8の前に、の前述の測定すべての遺伝子発現に各遺伝子の正規化されたし。<a href="/files/ftp_upload/57716/57716fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57716/57716fig2.jpg"> 図 2.嗅覚のティッシュの開発に異なった抗体を用いた免疫組織化学。これらのパネルを示す抗 GFP (緑) と (赤) の反ラミン (A) 6 h APF 蛹触角ディスクおよび(Bで抗体染色) 12 h APF 蛹触角ディスク。(C) このパネルは、 Or67d GAL4 UA CD8GFP遺伝子組み換えからアンテナに染まったウサギ抗 GFP (グリーン) 抗体 40 h APF を示しています。(D) このパネルは、アダルト アンテナどのラベルOr47b CD2正 ORNs (マゼンタ) 抗 CD2 抗体で染色を示しています。<a href="/files/ftp_upload/57716/57716fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>前方のプライマー</td>
			<td>逆プライマー</td>
			<td>長さ</td>
		</tr>
<tr>
<td>CGGAGAGGAGGTTATGAGCA</td>
			<td>GGAAGTGCACAACTAGCGTT</td>
			<td>143</td>
		</tr>
<tr>
<td>CGCGAATCGTTGTGTCAGTA</td>
			<td>TGTCGATAGCGTGAACCTGA</td>
			<td>129</td>
		</tr>
<tr>
<td>AGGAGTGGACGTTGAGTTACA</td>
			<td>CAATCATGTCCTCGTGACCG</td>
			<td>146</td>
		</tr>
<tr>
<td>TAGAGTCCGAGCAGCAGATG</td>
			<td>GTCAGAATTCGAGTTGTCCGC</td>
			<td>104</td>
		</tr>
<tr>
<td>GGCGCTAAGTAGCAGGACG</td>
			<td>GGCCAAGTCTGTTTGTGAGG</td>
			<td>215</td>
		</tr>
<tr>
<td>TAAGACCCTAGCGCCCTCTT</td>
			<td>AGGGAGATGCGCTTTGAGAC</td>
			<td>129</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1。QRT PCR で使用される PCR プライマーの一覧です。

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Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

ここでは、ステージし、解剖ショウジョウバエ種から嗅覚の組織を開発するためのプロトコルを提案する.解剖組織は、免疫組織化学または上皮内などの生体内解析だけでなく、定量的 RT-PCR (逆転写ポリメラーゼ連鎖反応) や RNA 配列 (RNAseq) などの分子生物学的解析の後で使用できます。交配。

周辺嗅覚組織の開発を準備する分子とショウジョウバエの免疫組織化学的解析

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

preparing-developing-peripheral-olfactory-tissue-for-molecular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

5.7K ビュー.  Duke University. ここでは、ステージし、解剖ショウジョウバエ種から嗅覚の組織を開発するためのプロトコルを提案する.解剖組織は、免疫組織化学または上皮内などの生体内解析だけでなく、定量的 RT-PCR (逆転写ポリメラーゼ連鎖反応) や RNA 配列 (RNAseq) などの分子生物学的解析の後で使用できます。交配。

ビデオ: Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions. 
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

代謝分析のためのミトコンドリア富化画分の調製で<em&gt;ショウジョウバエ</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

発生生物学

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy. The sub-diffraction limit resolution capabilities of super-resolution light microscopes allow improving the accuracy of the correlated data. Briefly, 110 nanometer thick cryo-sections are transferred to a silicon wafer and, after immunofluorescence staining, are imaged by super-resolution light microscopy. Subsequently, the sections are preserved in methylcellulose and platinum shadowed prior to imaging in a scanning electron microscope (SEM). The images from these two microscopy modalities are easily merged using tissue landmarks with open source software. Here we describe the adapted method for the larval zebrafish retina. However, this method is also applicable to other types of tissues and organisms. We demonstrate that the complementary information obtained by this correlation is able to resolve the expression of mitochondrial proteins in relation with the membranes and cristae of mitochondria as well as to other compartments of the cell.

This protocol describes the necessary steps to obtain subcellular protein localization results on zebrafish retina by correlating super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy images.

ゼブラフィッシュの網膜におけるタンパク質局在を解決する相関超解像および電子顕微鏡観察

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. Recent studies have extended the role of cellular senescence to various physiological processes, including development, wound healing, immune surveillance, and age-related tissue dysfunction. Although cell cycle arrest is a critical hallmark of cellular senescence, an increased intracellular reactive oxygen species (ROS) production has also been demonstrated to play an important role in the induction of cellular senescence. In addition, recent studies revealed that senescent cells exhibit potent paracrine activities on neighboring cells and tissues through a senescence-associated secretory phenotype (SASP). The sharp increase in interest regarding therapeutic strategies against cellular senescence emphasizes the need for a precise understanding of senescence mechanisms, including intracellular ROS and the SASP. Here, we describe protocols for quantitatively assessing intracellular ROS levels during H-Ras-induced cellular senescence using ROS-sensitive fluorescent dye and flow cytometry. In addition, we introduce sensitive techniques for the analysis of the induction of mRNA expression and secretion of SASP factors. These protocols can be applied to various cellular senescence models.

Intracellular ROS has been shown to play an important role in the induction of cellular senescence. Here, we describe a sensitive assay for quantifying ROS levels during cellular senescence. We also provide protocols for assessing the senescence-associated secretory phenotype, which reportedly contributes to various age-related dysfunctions.

癌遺伝子が誘導する老化の中に活性酸素種および分泌老化関連の表現型正常ひと線維芽細胞の定量測定

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of cells or tissues in model organisms. These systems contain two components as separate transgenic lines. A driver line expresses a transcriptional activator under the control of tissue-specific promoters/enhancers, and a reporter/effector line harbors a target gene placed downstream to the binding site of the transcription activator. Animals harboring both components induce tissue-specific transactivation of a target gene expression. Precise spatiotemporal expression of the gene in targeted tissues is critical for unbiased interpretation of cell/gene activity. Therefore, developing a method for generating exclusive cell/tissue-specific driver lines is essential. Here we present a method to generate highly tissue-specific targeted expression system by employing a &#34;Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated&#34; (CRISPR/Cas)-based genome editing technique. In this method, the endonuclease Cas9 is targeted by two chimeric guide RNAs (gRNA) to specific sites in the first coding exon of a gene in the Drosophila genome to create double-strand breaks (DSB). Subsequently, using an exogenous donor plasmid containing the transactivator sequence, the cell-autonomous repair machinery enables homology-directed repair (HDR) of the DSB, resulting in precise deletion and replacement of the exon with the transactivator sequence. The knocked-in transactivator is expressed exclusively in cells where the cis-regulatory elements of the replaced gene are functional. The detailed step-by-step protocol presented here for generating a binary transcriptional driver expressed in Drosophila fgf/branchless-producing epithelial/neuronal cells can be adopted for any gene- or tissue-specific expression.

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Here, we present a method for generating tissue-specific binary transcription systems in Drosophila by replacing the first coding exon of genes with transcription drivers. The CRISPR/Cas9-based method places a transactivator sequence under the endogenous regulation of a replaced gene, and consequently facilitates transctivator expression exclusively in gene-specific spatiotemporal patterns.

ショウジョウバエのゲノム編集による組織固有のバイナリ転写システムを生成するための効率的な戦略

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a variety of human retinal degenerative diseases and pinpoint new treatment approaches. The nuclear architecture of mouse retina is organized in two different patterns: conventional and inverted. Conventional pattern is universal where heterochromatin is localized to the periphery of the nucleus, while active euchromatin resides in the nuclear interior. In contrast, inverted nuclear pattern is unique to the adult rod photoreceptor cell nuclei where heterochromatin localizes to the nuclear center, and euchromatin resides in the nuclear periphery. DNA methylation is predominantly observed in chromocenters. DNA methylation is a dynamic covalent modification on the cytosine residues (5-methylcytosine, 5mC) of CpG dinucleotides that are enriched in the promoter regions of many genes. Three DNA methyltransferases (DNMT1, DNMT3A and DNMT3B) participate in methylation of DNA during development. Detecting 5mC with immunohistochemical techniques is very challenging, contributing to variability in results, as all DNA bases including 5mC modified bases are hidden within the double-stranded DNA helix. However, detailed delineation of 5mC distribution during development is very informative. Here, we describe a reproducible technique for robust immunohistochemical detection of 5mC and another epigenetic DNA marker 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), which colocalizes with the &#34;open&#34;, transcriptionally active chromatin in developing and postmitotic mouse retina.

The objective of this report is to describe the protocol for robust immunohistochemical detection of epigenetic markers, 5-methylcytosine (5mC) and 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in developing and postmitotic mouse retina.

5-メチルシトシンと開発の 5-ヒドロキシメチルシトシンの免疫組織化学的検出と後マウス網膜

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

培養ショウジョウバエ卵室のタイムラプスムービーを用いた局所細胞および組織スケールにおけるアトミオシンダイナミクスの解析

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

解凍、養殖、ショウジョウバエ細胞をトウキョウ

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...