Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Multiple Sclerosis Society (RG4591A1/2) e il National Institutes of Health (R03NS06740402). Gli autori ringraziano il Dr. Ivan Hernandez e membri del suo laboratorio per fornire consulenza, attrezzature e lo spazio laboratorio.

I topi utilizzati in questo studio sono stati curati per secondo le indicazioni del numero di protocollo di SUNY Downstate Medical Center divisione del laboratorio animale risorse (DLAR) 15-10492.
Nota: Oligodendrocytes primario sono stati isolati da neonatale (P5-P7 selvaggio-tipo C57Bl/6N) topi. In questa fase, immaturi OLs costituiscono più dell'80% della materia bianca del roditore garantire alto rendimento cellulare. Tutti i buffer e composizioni di reagente sono disponibili alla fine della Tabella materiali.
1. preparazione vetrini coprioggetti
Nota: Poli-D-lisina (PDL) / vetrini coprioggetti laminin rivestito devono essere preparati prima dell'isolamento di OL.
<ol><li>Posto n. 1 tedesco vetrini coprioggetto in vetro in una provetta conica da 50 mL e aggiungere 35 mL di 70% EtOH per pulirli.</li>
	<li>Tappare la provetta, metterlo in un mixer nutante e incubare a temperatura ambiente per almeno 30 min mentre delicatamente a dondolo. Le lamelle possono essere incubate durante la notte.</li>
	<li>Scartare il 70% EtOH.</li>
	<li>Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte con acqua deionizzata, rimuovere l'acqua ogni volta con aspirazione a vuoto.</li>
	<li>Aggiungere 30-35 mL di PDL 50 µ g/mL a lamelle nel tubo da 50 mL, abbastanza per coprire i coprioggetti.</li>
	<li>Posizionare il tubo da 50 mL contenente lamelle su un mixer nutante e incubare a temperatura ambiente per almeno 30 min mentre a dondolo delicatamente.</li>
	<li>Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte con acqua deionizzata, rimuovendo l'acqua ogni volta con aspirazione a vuoto.</li>
	<li>Trasferire i coprioggetti in 60 mm di Petri contenente acqua deionizzata.</li>
	<li>Utilizzare una punta di pipetta P200 per disporre i vetrini coprioggetti come uno strato che copre l'intera superficie del piatto Petri.</li>
	<li>Con attenzione, rimuovere l'acqua dai piatti con aspirazione a vuoto.</li>
	<li>Rimuovere l'eccesso di acqua intorno a lamelle e lasciarli asciugare durante la notte con il coperchio aperto e sotto UV luce nella cappa. Nota: PDL rivestito vetrini coprioggetti memorizzabili a 4 ° C in Petri sterili fino a tre mesi.</li>
	<li>Inserire i vetrini coprioggetti in piastre da 24 pozzetti, uno per bene, utilizzando una pinzetta.</li>
	<li>Spostare i coprioggetti al centro il Bene assicurandosi che i bordi non tocchino la parete del pozzo.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di 10 µ g/mL laminin, diluito in B27NBMA (Vedi la Tabella materiali) iniziando al centro di ogni vetrino coprioggetto e lo spostamento in modo circolare verso i bordi per coprire tutta l'area. Nota: Poiché la laminina è coinvolto nella manutenzione di OL e promuove la differenziazione in OLs matura, è un importante fattore di sopravvivenza della OL per in vitro cultura41,42,43,44.</li>
	<li>Incubare la piastra in un incubatore a 37 ° C 5% CO2 per almeno 1 h o fino a quando la OLs sono pronti per la placcatura.</li>
</ol>2. Mouse Brain Cortex dissociazione
<ol><li>Sacrificare postnatali cuccioli di topo C57Bl/6N vecchi di 5-7 giorni per decapitazione veloce con forbici precedentemente pulite in etanolo al 70%. Nota: cortecce cerebrali da 5-6 cuccioli di topi neonatali sono stati utilizzati per ogni preparazione. In media, un cervello di topo produce 1-1.5 x 106 OLs.</li>
	<li>Tagliare la pelle del cuoio capelluto lungo la linea mediana con piccole forbici per dissezione e ritrarre per esporre il cranio.</li>
	<li>Tagliare il cranio con cura lungo la linea mediana a partire dall'apertura nella parte posteriore del cranio verso l'area frontale, sollevando con le forbici per evitare di danneggiare il cervello. Quindi, utilizzando l'apertura nella parte posteriore del cranio tagliare verso ogni zoccolo dell'occhio lungo la base del cranio.</li>
	<li>Utilizzare una pinzetta per delicatamente prendere in giro le cortecce dal mesencefalo e trasferirli su un piatto di coltura del tessuto 60 mm contenente 7 mL di B27NBMA. Ripetere i passaggi da 2.2 attraverso 2.4 per ogni cervello, pool le cortecce dissecate.</li>
	<li>Le cortecce di trasferimento a un nuovo piatto di coltura del tessuto 60 mm contenente 5 mL di tampone di dissociazione (B27NBMA, 20-30 U/mL papaina e 2.500 U dnasi io).</li>
	<li>Tagliare a dadini le cortecce in pezzetti di circa 1 mm3 utilizzando una lama per bisturi #15 e incubare per 20 minuti in un 37 ° C, 5% CO2 incubator.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di siero della crescita bovina (BGS) per fermare la reazione enzimatica.</li>
	<li>Trasferire le cortecce insieme con il supporto di dissociazione di un tubo conico di 15 mL utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL.</li>
	<li>Delicatamente comincia a dissociare il tessuto cerebrale pipettando lentamente su e giù 6 - 8 volte utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, facendo attenzione a ridurre al minimo le bolle.</li>
	<li>Consentire i pezzi di tessuto di stabilirsi per 2-3 min e trasferire il surnatante in una nuova provetta.</li>
	<li>Aggiungere 3 mL di B27NBMA contenente 10% BGS/2500 U dnasi I per il tessuto a pellet.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta sierologica di 5ml per dissociare delicatamente il tessuto cerebrale durante il pipettaggio su e giù 6 - 8 volte. Fare attenzione a ridurre al minimo le bolle.</li>
	<li>Consentire i pezzi di tessuto a stabilirsi per 2-3 min.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in una nuova provetta. Aggiungere 3 mL di B27NBMA contenente 10% BGS/dnasi I per il tessuto a pellet.</li>
	<li>Delicatamente dissociare il tessuto cerebrale utilizzando una punta di pipetta P1000, mentre pipettaggio il mix dei media e del tessuto del cervello su e giù. Ripetere passaggi 2.13 e 2.14 fino a quando non rimangono grossi pezzi di tessuto o fino a quando B27NBMA contenente 10% BGS/dnasi I è esausto, si verifichi per primo. Fare attenzione a ridurre al minimo le bolle.</li>
	<li>Sospensione di cellule di piscina con surnatanti precedenti.</li>
	<li>Colino di cella posto 70 µm in un tubo da 50 mL. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, passare la sospensione cellulare in pool delicatamente sopra il filtro di cella di 70 µm.</li>
	<li>Lavare il filtro cella aggiungendo 1 mL di B27NBMA contenente 10% BGS/dnasi I.</li>
	<li>Gettare il filtro cella. Portare il volume a 30 mL con B27NBMA contenente 10% BGS/dnasi I.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare a due provette coniche da 15 mL. Centrifugare la sospensione cellulare per 10 min a 200 x g.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante senza lasciare le cellule esposte all'aria. Il surnatante sarà nuvoloso a causa di detriti cellulari. Aggiungere 3 mL di B27NBMA contenente 10% BGS al pellet.</li>
	<li>Attentamente e dissociare il pellet cellulare utilizzando una pipetta da P1000. Portare il volume a 15 mL con B27NBMA contenente 10% BGS.</li>
	<li>Passare la sospensione cellulare sopra un fresco filtro di cella 40 µm.</li>
	<li>Lavare il filtro cella aggiungendo 1mL di B27NBMA contenente 10% BGS. Gettare il filtro cella.</li>
	<li>Portare il volume a 30 mL con B27NBMA contenente 10% BGS.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare per provette coniche da 2 x 15 mL. Centrifugare la sospensione cellulare per 10 min a 200 x g.</li>
	<li>Rimuovere la maggior parte del surnatante senza lasciare le cellule esposte all'aria. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di ghiaccio freddo magnetico cella ordinamento buffer (MCS).</li>
</ol>3. determinazione del conteggio delle cellule e vitalità
<ol><li>Diluire 100 µ l di sospensione cellulare con 400 µ l di soluzione di blu di Trypan in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per ottenere una diluizione di 1:5 in 0,4% (p/v).</li>
	<li>Centrare una copertura vetrata sopra un emocitometro camera e riempire le due camere con 10 µ l della diluizione delle cellule usando una pipetta P10 ed evitando di troppo-pieno. La soluzione passerà sotto il vetro di copertura per azione capillare.</li>
	<li>Posizionare l'emocitometro sul tavolino del microscopio e regolare la messa a fuoco utilizzando ingrandimento 40x. Nota: I conteggi delle cellule vengono registrati utilizzando un contatore portatile in ognuna delle cinque piazze (quattro angoli e un centro). Solo le cellule non vitali assorbono il colorante e appaiono blue, mentre dal vivo e le cellule sane appaiono rotondi e rifrangente e non assorbono la tintura di colore blu, permettendo per la determinazione del numero di cellule vitali e totale per millilitro.</li>
</ol>4. isolamento di O4+ oligodendrociti
<ol><li>Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 10 min.</li>
	<li>Attentamente e scartare il surnatante tramite aspirazione a vuoto, evitando l'esposizione delle cellule all'aria.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 90 µ l di tampone MCS per 1 x 107 cellule totale seguita dall'aggiunta di 10 µ l di anti-O4 perline per 1 x 107 cellule.</li>
	<li>Mescolare la sospensione cellulare e le perle scorrendo delicatamente la provetta conica 15 mL con il dito 4 - 5 volte.</li>
	<li>Incubare il mix per 15 min a 4 ° C, sfogliando la provetta conica 15 mL con il dito 4-5 timesevery 5 min.</li>
	<li>Lavare il mix delicatamente aggiungere 2 mL di tampone MCS per 1 x 107 cellule al tubo. Centrifugare il mix a 200 x g per 10 min.</li>
	<li>Scartare il surnatante mediante accuratamente aspirazione a vuoto, evitando l'esposizione delle cellule all'aria. Risospendere il pellet cellulare in 500 µ l di tampone MCS per ogni 1 x 107 cellule.</li>
	<li>Posizionare un separatore magnetico su un separatore magnetico. Associare una colonna di selezione per il separatore magnetico e posizionare un colino di cella di 40 µm in cima alla colonna. Posizionare due 15 mL o una provetta conica da 50 mL sotto la colonna di separazione per raccogliere il flusso attraverso.</li>
	<li>Pre-risciacquo la colonna filtro e separazione della cella da 40 µm con 3 mL di tampone MCS e lasciare che il buffer attraversano la colonna senza lasciarlo asciugare.</li>
	<li>Aggiungere il mix di sospensione cellulare e perline al filtro delle cellule e nella colonna di selezione.</li>
	<li>Lavare il filtro di cella 40 µm con 1 mL di tampone MCS.</li>
	<li>Eliminare il filtro cella e lasciare che il mix di cellule, perline e buffer attraversano la colonna senza lasciarlo asciugare.</li>
	<li>Lavare la colonna di separazione 3 volte con 3 mL di tampone MCS e 1 volta con media di proliferazione di OL.</li>
	<li>Rimuovere la colonna di separazione dal separatore magnetico, in modo di metterlo in una provetta conica da 15 mL e immediatamente aggiungere 5 mL di terreno di proliferazione di OL.</li>
	<li>Posizionare uno stantuffo in cima alla colonna e saldamente push per scovare le cellule con etichettate nella provetta conica 15 mL.</li>
	<li>Rimuovere 100 µ l di sospensione cellulare per determinare il conteggio delle cellule e attuabilità utilizzando Trypan Blue ed emocitometro come indicato nella sezione 3. Nota: La vitalità cellulare oltre l'80% è considerata accettabile per procedere con la cultura di OLs, ma redditività superiore al 90% è ottimale.</li>
</ol>5. placcatura di isolato O4+ oligodendrociti
<ol><li>Diluire la sospensione di eritrociti al desiderio placcatura densità (5 x 105 cellule per vetrino coprioggetti) utilizzando OL proliferazione media. Nota: OL densità di semina è molto importante, quindi la densità di cella appropriata devono essere confermate usando un microscopio di coltura del tessuto prima di procedere. Semina di densità inferiore a 10.000 cellule/vetrini coprioggetti può portare a scarsa sopravvivenza. Placcatura di densità a 10.000 a 25.000, OL differenziazione morfologica è lento45. Abbiamo piastra OLs ad una densità di semina di almeno 50.000 cellule/coprivetrini per garantire la sopravvivenza delle cellule.</li>
	<li>Spostare le piastre 24 pozzetti contenenti lamelle rivestite con laminin da incubatore per la cappa di coltura del tessuto.</li>
	<li>Rimuovere laminin da ciascun vetrino coprioggetto e sostituirlo con 100 µ l della sospensione OL.</li>
	<li>Incubare OLs nell'incubatore 37 °C/5% CO2 per un massimo di 45 min per promuovere l'adesione OL a lamelle.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, rimuovere le piastre a 24 pozzetti dall'incubatrice. Inondare ogni bene della piastra 24 pozzetti con 500 µ l di media di proliferazione di OL.</li>
	<li>Rimettere la OLs nell'incubatore 37 °C/5% CO2 per altre 24 h.</li>
	<li>24 h dopo il placcaggio di OLs, rimuovere i supporti di proliferazione e sostituire con media di differenziazione di OL per indurre la differenziazione.</li>
	<li>Rimettere la OLs nell'incubatrice e non rimuovere fino a quando le cellule sono pronte per il fissaggio. Nota: Variazioni di pH sono dannosi per OLs e diminuiscono la vitalità cellulare, pertanto dovrebbe essere evitati inutili rimozione di OLs culture dall'incubatrice.</li>
</ol>6. immunofluorescenza
<ol><li>Per la rilevazione della cellula marcatori di superficie (NG2, O1 e O4) rimuovere il supporto dai pozzi.</li>
	<li>Aggiungere 250 µ l di surnatanti di ibridoma mouse contenente anticorpi primari contro O1 (non diluito)13 e O4 (non diluito)13 e coniglio policlonale contro NG2 (1: 150 diluito in B27NBMA). Nota: Se gli anticorpi anti-O1 e anti-O4 commercialmente disponibili devono essere utilizzati, si consiglia di utilizzare diluizioni suggeriti dal produttore.</li>
	<li>Incubare le cellule con l'anticorpo primario per 45 min massimo in incubatore a 37 °C/5% CO2 .</li>
	<li>Lavare due volte con 0.05% Tween-20/1 X PBS. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% (4% PFA) per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare tre volte per 5 minuti ciascuno con 0.05% Tween-20/1 X PBS.</li>
	<li>Diluire anti-topo di capra Alexa 488-coniugato IgM o anticorpo secondario (1: 400) di anti-coniglio IgG in B27NBMA.</li>
	<li>Rimuovere il 0.05% Tween-20/1 X PBS da lamelle. Incubare le cellule con anticorpo secondario per 1 h a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Lavare tre volte per 5 minuti ciascuno con 0.05% Tween-20/1 X PBS.</li>
	<li>Per la doppia colorazione per l'individuazione di indicatori interni (GFAP), rimuovere il 0.05% Tween-20/1 X PBS e blocco/permeabilize cellule con un tampone di blocco/permeabilizzazione per 15 min a temperatura ambiente. In caso contrario, procedere al passaggio 6.17.</li>
	<li>Rimuovere il tampone di blocco/permeabilizzazione e aggiungere 250 µ l pollo anti-GFAP (1: 100) diluito in un tampone di blocco/permeabilizzazione.</li>
	<li>Incubare le cellule con anti-GFAP per 1 h a temperatura ambiente. Lavare tre volte per 5 minuti ciascuno con 0.05% Tween-20/1 X PBS.</li>
	<li>Diluire l'anticorpo secondario da Alexa 594-coniugati anti-pollo IgG (1: 400) in B27NBMA.</li>
	<li>Rimuovere il 0.05% Tween-20/1 X PBS da lamelle. Incubare le cellule con anticorpo secondario per 1 h a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Lavare tre volte per 5 minuti ciascuno con 0.05% Tween-20/1 X PBS.</li>
	<li>Colorante di contrasto con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e montare le cellule con montaggio supporti contenenti DAPI antifade.</li>
	<li>Lasciate che i coprioggetti curare una notte al buio a temperatura ambiente.</li>
	<li>L'immagine di cellule marcate con un microscopio a epifluorescenza. Nota: Nel presente protocollo, le cellule erano imaged a 40 ingrandimenti utilizzando un tempo di esposizione uniforme.</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcuna informazioni integrative.

In questa comunicazione, presentiamo un metodo per l'isolamento efficiente delle culture del oligodendrocyte altamente purificata del mouse immaturo. Rispetto ai protocolli precedentemente pubblicati39,40, questo metodo ha reso una purezza più elevata con un livello molto più basso degli astrociti GFAP-positive e una percentuale molto bassa di altre cellule non caratterizzato. È importante sottolineare che questi sono immaturi OLs già commit alla stirpe oligodendroglial. Così, queste cellule non sarebbe utile per lo studio delle prime fasi di differenziazione.
Una delle modifiche dal protocollo Dincman40 era la rimozione del fattore di crescita di base del fibroblasto (bFGF) dal nostro supporto di proliferazione. È stato segnalato che in vitro, bFGF che agisce come un forte fattore mitogenico non solo inibisce OPCs da differenziazione, ma diminuisce anche il numero di processi46,47. Inoltre, bFGF aumenta del oligodendrocyte dedifferentiation e proliferazione in cellule secondarie del lignaggio oligodendroglial 48. Di conseguenza, è plausibile che il ridotto numero di O4+ cellule e aumento del numero di A2B5+ e NG2+ cellule osservate in Dincman Studio40 possono essere dovuto l'effetto di bFGF nella cultura.
Nonostante l'uso O4 associazione come metodo per isolare le cellule, solo il 59% delle cellule sono O4+ a 1DIV. Questi risultati sono qualitativamente simili a quelli di Dincman e colleghe40 che ha trovato che utilizza l'associazione O4 per isolamento, poco meno del 50% delle cellule erano O4+ a 1DIV. È stato dimostrato che PDGF ritarda lo sviluppo post-mitotico da transitoriamente ripristino O4+GalC– progenitori a A2B5+O4– pre-progenitor-come le cellule che successivamente si differenziano anche nella continua presenza di PDGF 49. Pertanto, è probabile che durante il processo di proliferazione nel primo giorno in vitro alcuni OLs immaturo può verificarsi un'inversione da O4+NG2+ a O4–NG2+, mentre rimanendo impegnati il casato di oligodendrociti. Questa ipotesi è sostenuta dal ritrovamento di Dincman40 che subito dopo l'isolamento circa l'80% delle cellule erano O4+.
A 3DIV, questo protocollo produce una purezza OL piuttosto più alta di quello descritto da altri39,40 , anche se non abbiamo fatto un confronto testa a testa con i loro metodi. Rispetto al protocollo di Dincman et al. 40, il più basso numero di cellule GFAP-positive nelle nostre culture potrebbe essere a causa della mancanza di FGF sui media di proliferazione. Il protocollo Emery e Dugas39 si basa sul passaggio sequenza delle cellule tramite piastre di coltura; astrocytes possono collegare facilmente alla cultura piatti50 e potrebbero essere trasportati dopo ogni passaggio sequenza delle cellule durante il protocollo di immunopanning. Il metodo proposto non rischia di introdurre contaminanti astrociti nella nostra frazione di purificazione.
Il nostro metodo modificato è più veloce rispetto agli altri due prendendo circa 4 h per eseguire. Raggiungiamo questo eliminando passaggi inutili e reagenti incorporati per gli altri protocolli. Ad esempio, rispetto ai Dincman protocollo40, che prende 5-6 h, abbiamo omesso sia l'uso di un kit per la dissociazione di tessuto neurale e l'incubazione della sospensione delle cellule OL con perline di IgM anti-topo ratto per rimuovere le cellule morte. Invece, abbiamo effettuato la dissociazione del cervello del mouse cortecce di papaina e cellule morte sono stati rimossi eseguendo centrifugazioni di bassa velocità (200 x g).
Un'importante modifica dalla Emery protocollo39, che dura circa 9 ore, è stata la rimozione della selezione immunopanning e la rimozione del requisito di un diretto O2Co2 linea utilizzato per pre-equilibrare il Buffer di papaina durante del tessuto digestione. Invece, abbiamo usato selezione immunomagnetica e incubazione diretta del mix di cortecce di cervello di topo e papaina buffer nell'incubatore CO2 .
Anche se non direttamente testati in questo studio, le microsfere di anti-O4 utilizzabile anche per isolare OLs da rat, tessuto cerebrale umano e transgenici del mouse. Questo mette in evidenza la versatilità della tecnica da utilizzare fonti multiple di tessuto per isolamento di OLs con il potenziale a beneficio di laboratori di ricerca interessati a lavorare con OLs da fonti diverse dal mouse.
In conclusione, il metodo di isolamento OPC modificato descritto in questo studio fornisce un'alternativa rapida e specifica per ottenere oligodendrociti primario del mouse che potrebbero essere applicati negli studi di mielinizzazione e malattie demielinizzanti.

Oligodendrociti (OLs) sono le cellule di mielinizzazione del sistema nervoso centrale (SNC)1. L'isolamento e la coltura degli oligodendrociti primari in un ambiente strettamente regolamentato è uno strumento prezioso per lo Studio in vitro di sviluppo di oligodendroglia, nonché la biologia di demyelinating malattie come la sclerosi multipla2 . Ciò richiede un'efficiente e robusto del oligodendrocyte isolamento e coltura metodo3. In questo studio, abbiamo approfittato dell'espressione di un indicatore della superficie delle cellule del oligodendrocyte distintivo per implementare una tecnica di isolamento modificate che è rapido e specifico.
Sono state identificate quattro distinte fasi di maturazione del oligodendrocyte, ognuna caratterizzata dall'espressione di marcatori di superficie cellulare distintivo per ogni stadio di sviluppo (Figura 1). Questi indicatori di superficie delle cellule possono essere riconosciuti da anticorpi specifici4,5e possono essere utilizzati per isolare OLs alle fasi specifiche. Nella prima fase, le cellule del precursore del oligodendrocyte (OPCs) hanno la capacità di proliferare, migrare e rapidi in particolare fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF-Rα) recettore6, ganglioside A2B5, proteoglicano NG27,8 , neuro-acido polisialico delle cellule adesione molecola9 e grassi-acido-legante proteina 7 (FABP7)10. Gli OPC hanno morfologia bipolare con alcuni processi brevi che emana dai poli opposti del corpo cellulare, che è caratteristico di cellule precursori neurali11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2.jpg"> Figura 1: espressione di marcatori di superficie delle cellule durante lo sviluppo del oligodendrocyte mouse. OLs cella marcatori di superficie come A2B5, GalC (O1), NG2, O4 e PDGF-Rα può essere utilizzato per isolare specificamente oligodendrociti in fase inerente allo sviluppo specifica utilizzando anticorpi specifici.   <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Nella seconda fase, OPCs danno luogo a preoligodendrocytes e rapidi alla membrana delle cellule non solo gli indicatori OPC, ma anche il sulfatide (un galattolipide solfonata) riconosciuto dal O4 anticorpo12,13e la proteina GPR1714, che persiste fino alla fase di oligodendrociti immaturi (OL). In questa fase, preoligodendrocytes estendere multipolari processi brevi. Preoligodendrocytes sono la grande fase OL al giorno postnatale 2 (P2) nella materia bianca cerebrale di ratto e topo con una popolazione secondaria di immaturi OLs15.
Durante la terza tappa, immaturi OLs continuano a esprimere O4, perdere espressione degli indicatori A2B5 e NG2 e cominciano ad esprimere Galattocerebrosidi C16. In questa fase, OLs sono impegnati alla stirpe oligodendroglial e diventare cellule post-mitotiche con rami lunghi ramificate17,18. Immaturo OL costituiscono più dell'80% della materia bianca del roditore in P7 e in questo momento si osservano le prime cellule MBP+ 15,19,20,21. Di conseguenza, isolamento di OLs presso P7 potrebbe garantire alto rendimento cellulare.
Nella fase finale e la quarta di sviluppo OL, OLs matura esprimono proteine myelinating (proteina basica della mielina (MBP), proteolipide (PLP), glicoproteina mielina associata (MAG) e myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)22,23 ,24,25,26. In questa fase, OLs matura estendere membrane quello compatto di forma economale guaine intorno gli assoni e sono in grado di mielinare. Questo coincide con l'osservazione che nel cervello di ratto e topo, cellule MBP+ diventano sempre più abbondanti a P1419,20,21.
Poiché il primo isolamento del oligodendrocyte Fewster e colleghi nel 196727, sono stati implementati diversi metodi per l'isolamento di OLs da roditore SNC compreso immunopanning28,29,30, fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) sfruttando delle cellule degli antigeni di superficie-specific28,31, differenziale mediante centrifugazione in gradiente32,33,34,35 e agitazione metodo basato sull'adesione differenziale di diverse CNS glia36,37. Tuttavia, i metodi di coltura esistenti hanno limitazioni, soprattutto in termini di purezza, rendimento e tempo necessario per eseguire la procedure38. Pertanto, i metodi più efficienti di isolamento per gli oligodendrociti sono necessari.
In questa carta, presentiamo un semplice e metodo di selezione efficace per l'isolamento di immunomagnetica di fase tre O4+ cellule preoligodendrocytes da cuccioli di topi neonatali. Questo metodo è una modificazione delle tecniche riportate da Emery et al. 39 e Dincman et al. 40 e fornisce una purezza di preparazione del oligodendrocyte superiore all'80% in circa 4 h.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10ml serological pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ml syringe Luer-Loc tip</td>
			<td>BD, Becton Dickinson</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40&#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22368547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml serological pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70&#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti-chicken IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>6032-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>6032-1102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Growth Serum (BGS)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30541.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP-1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desoxyribonuclease I (DNAse I)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Bx51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather disposable scalpels</td>
			<td>Andwin Scientific</td>
			<td>EF7281C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round</td>
			<td>NeuVitro</td>
			<td>GG-12-oz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator stand - MACS multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator-MiniMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex PES 0.22&#181;m filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLG033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media- Prolong Gold with DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-cysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural mouse laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium A</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrophin-3 (NT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-13A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection column-LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace elements B</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine (T3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27NBMA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter sterilize and store at 4 &#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27NBMA + 10% BGS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF solution stock (10 &#181;g/ml; 1000X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Order from Peprotech (450-50). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to Manufacturer&#8217;s instruction (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80 &#176;C. 
			Working solution (10 &#181;g/ml, 1000X) 
			1. Make on 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS solution and filter sterilize. 
			2. Dilute master stock aliquot to 10&#181;g/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 
			3. Aliquot (20&#181;l/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 
			4. Store aliquots at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Biotin stock solution (50 &#181;g/ml; 5000X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Resuspend d-Biotin (Sigma-B4639) in double-distilled H2O at 50 &#181;g/ml (e.g. 2.5 mg in 50 ml of ddH2O). Resuspension might take fair amount of agitation/vortexing, or mild warming briefly at 37&#176;C. If the d-Biotin still will not solubilize, it is fine to make up a less concentrated (e.g. 10&#181;g/ml), and to add a higher volume to the B27NBMA (1/1000), instead of 1/5000). Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1. Dissolve at 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml in HBSS chilled on ice. 
			2. Filter sterilize on ice 
			3. Aliquot at 200 &#181;l and freeze overnight at -20&#176;C. 
			4. Store aliquots at -20 to -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (w/o Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve pouch in 1 Liter of water to yield 1 liter of medium at 9.6 grams of powder per liter of medium. Store at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin stock solution (4.2 mg/ml; 1000X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1 ml of sterile DMSO to 50 mg Forskolin in bottle (Sigma-F6886) and pipette until resuspended. Transfer to a 15 ml centrifuge tube and add 11 ml of sterile DMSO to bring to 4.2 mg/ml. Aliquot (e.g. 20 &#181;l) and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salts (HBSS) (Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1. Measure 900 ml of water (temperature 15-20 &#176;C) in a cylinder and stir gently. 
			2. Add the power and stir until dissolved. 
			3. Rinse original package with a small amount of water to remove all traces of the powder. 
			4. Add to the solution in step 2. 
			5. Add 0.35 gr of sodium bicarbonate (7.5% w/v) for each liter of final volume. 
			6. Keep stirring until dissolved. 
			7. Adjust the pH of the buffer while stirring to 0.1-0.3 units below pH= 7.4 since it may rise during filtration. The use of 1N HCl or 1N NaOH is recommended to adjust the pH. 
			8. Add additional water to bring the final volume to 1L. 
			9. Sterilize by filtration using a membrane with a porosity of 0.22 microns. 
			10. Store at 2-8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin stock solution (4000 &#181;g/ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Thaw the bottle and aliquot 25 &#181;l per microcentrifuge tube and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Slowly thaw laminin in the cold (2&#176;C to 8&#176;C) to avoid gel formation. Then, aliquot into polypropylene tubes. Store at 5&#176; C to -20&#176; C in aliquots (e.g. 20 &#181;l) and do not freeze/thaw repeatedly. Laminin may be stored at these temperatures for up to six months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Cell Sorting (MCS) Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare the solution containing phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.2, and 0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.5 mM EDTA, 5&#181;g/ml Insulin, 1 g/L Glucose. Sterilize and degas by filtration the buffer by passing it through a 0.22 &#181;m Millex filter. Store the buffer at 4&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine (NAC) stock solution (5mg/ml; 1000X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-A8199) at 5 mg/ml in DMEM (e.g. 50 mg NAC in 10 ml B27NBMA). Filter sterilize and aliquot (e.g. 20 &#181;l). Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT3 stock solution (1 &#181;g/ml; 1000X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Master stock: 
			Order from Peprotech (450-03). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer&#8217;s instructions (may vary from lot to lot), in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80&#176;C. 
			 
			Working stock (1&#181;g/ml; 1000X): 
			1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize. 
			2. Dilute master stock aliquot to 1 &#181;g/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 
			3. Aliquot (e.g. 20&#181;l/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 
			4. Store aliquots at -80&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF stock solution (10 &#181;g/ml; 1000X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Master stock: 
			Order from Peprotech (100-13A). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer&#8217;s instructions (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS) + 0.2% BSA). Store at -80&#176;C. 
			 
			Working stock (1&#181;g/ml; 1000X): 
			1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize. 
			2. Dilute master stock aliquot to 1&#181;g/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 
			3. Aliquot (e.g. 20&#181;l/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 
			4. Store aliquots at -80&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Resuspend poly-D-lysine, molecular weight 70-150 kD (Sigma P6407) at 0.5mg/ml in 0.15M boric acid pH 8.4 (e.g. 50mg in 50ml borate buffer). Filter sterilize and aliquot (e.g. 100&#181;l/tube). Store at -20&#176;C. Prior to use, dilute the 100X stock (1mg/ml) to 50 &#181;g/ml in sterile water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligodendrocyte proliferation media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see Supplementary Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligodendrocyte differentiation media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see Supplementary Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sato supplement (100X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see Supplementary Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>References: the list of reagents and recipes were adopted from the protocols previously described by Emery et. al. 2013 (Emery, B. &#38; Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) and Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. &#38; Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and specific immunomagnetic isolation of mouse primary oligodendrocytes

L'efficiente e robusto isolamento e coltura dei oligodendrocytes primario (OLs) è uno strumento prezioso per lo Studio in vitro di sviluppo di oligodendroglia, nonché la biologia di demyelinating malattie come la sclerosi multipla e Malattia di Pelizaeus-Merzbacher-simile (PMLD). Qui, presentiamo un semplice e metodo di selezione efficace per l'isolamento di immunomagnetica di fase tre O4+ cellule preoligodendrocytes da cuccioli di topi neonatali. Poiché immaturo OL costituiscono più dell'80% della materia bianca roditore-cervello postnatale giorno 7 (P7) questo metodo di isolamento non solo assicura un alto rendimento cellulare, ma anche l'isolamento specifico di OLs già commesso alla stirpe oligodendroglial, diminuendo il possibilità di isolare cellule contaminanti quali gli astrociti e altre cellule del cervello del mouse. Questo metodo è una modifica delle tecniche segnalato precedentemente e fornisce del oligodendrocyte preparazione purezza superiore al 80% in circa 4 h.

Lo scopo di questo studio era di stabilire un metodo di isolamento migliorato per O4+ oligodendrociti primario del mouse che richiedono la manipolazione meno possibile delle cellule bersaglio. L'intera procedura dall'eutanasia dei cuccioli di placcatura delle celle di vetrini coprioggetti prende circa 4 h e i dati qui indicati rappresentano tre esperimenti indipendenti. Dopo dissociazione del tessuto, una media di 4,3 ± 0,46 x 107 cellule sono state isolate per ogni esperimento indipendente, con una redditività del 91% ± 5,6%. Dopo immunomagnetiche isolamento utilizzando anti-O4 etichetta microperle magnetiche una media di 6,9 ± 0,38 x 106 OLs sono stati ottenuti (1-1.5 x 106 per topo) che è di 16,2% ± 1,6% delle cellule totali inizialmente dissociata; attuabilità era 96,3% ± 3,5%.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57543/57543fig2.jpg"> Figura 2: Immunomagnetically isolate OLs marcatori express immaturi alle 1DIV. (A) OLs sotto microscopio a contrasto di fase Vedi morfologia bi - e tri-polare. OLs express NG2 (B), O4 (C) e O1 (D). Pochissimi gli astrociti erano presenti alla 1DIV (C, rosso), scala bar = 50 µm. i dati sono stati raccolti da 3 esperimenti indipendenti. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57543/57543fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per esaminare il fenotipo antigenico delle cellule immunomagnetically isolate, colorazione di immunofluorescenza era effettuato 24 h (1DIV) e 72 h (3DIV) dopo il placcaggio delle cellule. Alla 1DIV, la cella è sembrato essere bi - o tripolare sotto il microscopio di contrasto di fase (Figura 2A-B), una caratteristica di caratteristica della fase iniziale proliferazione OLs (OPCs e o preoligodendrocytes). 66,1 ± 8,4% di queste cellule erano NG2-etichetta (Figura 2B) e 58% ± 9,4% delle cellule erano O4-etichetta (Figura 2). O1 (GalC)-etichettatura, un marcatore delle cellule più mature nel lignaggio del oligodendrocyte, era molto meno comune (± 7,4% 6,0%, Figura 2D). Questo profilo di marcatore suggerisce che la maggioranza delle cellule a questo punto è pre-oligodendrociti con piccole percentuali acerbo o maturo oligos e possibilmente alcune cellule del progenitor del oligodendrocyte (OPCs). Astrociti, come evidenziato da GFAP macchiatura, composto del 0,57 ± 1,0% (Figura 2). Questi dati suggeriscono che i oligodendrocytes isolati con la tecnica modificata sono altamente purificati e la maggior parte Mostra pattern di espressione per un marcatore tipico di oligodendrociti immaturi.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57543/57543fig3.jpg"> Figura 3: espressione di marcatori di OLs maturi a 3DIV. (A) OLs sotto fase microscopio a contrasto di mostrare più complessa morfologia. Alle 3DIV, espressione di NG2 (B) diminuisce drasticamente, mentre O4 (C) e O1 (D) aumento. Pochi gli astrociti sono visibili presso 3DIV (C, rosso), scala bar = 50 µm. i dati sono stati raccolti da 3 esperimenti indipendenti. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57543/57543fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Alla 3DIV, morfologia del oligodendrocyte apparve più complessa rispetto alle celle al 1DIV (Figura 3A). A questo punto del tempo, la frequenza delle cellule positive per l'indicatore in anticipo del oligodendrocyte NG2 era molto più basso rispetto alla 1DIV. NG2-etichettati cellule comprende 31,2 ± 17,1% (contro il 66,1 ± 8,4% a 1DIV, t-test p < 0,0001, Figura 3B, Figura 4A). Anche se non analizzati qui, l'intensità media di macchiatura in cellule siano risultati positivi per NG2 è stato ridotto a 3DIV rispetto alla 1DIV. La maggior parte delle cellule (81,9% ± 4.884%, Figura 3) hanno mostrato O4-etichettatura, che era superiore alle 1DIV (58% ± 9,4%, t-test p < 0.0001, Figura 4B). Inoltre, quasi la metà delle cellule (47,2% ± 16,4%, Figura 3D) ha mostrato la macchiatura per O1 (GalC), un marcatore del lignaggio del oligodendrocyte più maturo, suggerendo che le cellule sono differenziando ad un fenotipo più maturo. L'aumento di O1+ cellule a 3DIV è stato anche significativo rispetto alla 1DIV (± 7,4% 6,0%, t-test p < 0.0001, Figura 4). La presenza di astrociti in questo tempo punto è rimasto estremamente bassa (0,8% ± 1,5%, Figura 3) e non era significativamente differente rispetto al 1DIV (0,57% ± 1,0%, non significativa (ns), Figura 4). Questi risultati indicano che, nel tempo, sono in grado di differenziare in vitro in terza fase di maturazione con molto poco contaminazione di altri tipi cellulari come gli astrociti oligodendrociti immunomagnetically isolate.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57543/57543fig4.jpg"> Figura 4: quantificazione dell'espressione di marcatori OL 1DIV e 3DIV (A-D). Alle 1DIV, il 66% delle cellule erano NG2+, il 58% delle cellule erano O4+, 7% delle cellule erano O1+ e 0,5% delle cellule erano GFAP+. 3DIV, 31% delle cellule erano NG2+, l'81% delle cellule erano O4+, 47% delle cellule sono stati O1+ e 0,7% delle cellule erano GFAP+. Valori di media ± SD sono presentati qui, * * * indica p < 0,0001, ns = non significativo. I dati sono stati raccolti da 3 esperimenti indipendenti. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57543/57543fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Descriviamo l'isolamento immunomagnetica degli oligodendrociti primario del mouse, che permette l'isolamento rapido e specifico delle cellule per coltura in vitro .

Rapido e specifico immunomagnetica isolamento degli oligodendrociti primario del Mouse

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

rapid-specific-immunomagnetic-isolation-mouse-primary

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.5K Views.  State University of New York Downstate Medical Center. Descriviamo l'isolamento immunomagnetica degli oligodendrociti primario del mouse, che permette l'isolamento rapido e specifico delle cellule per coltura in vitro .

Video: Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection e cultura primaria di neuroni embrionali di topo ippocampale e corticale

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

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Neuroscienze

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Isolamento e la coltura di astrociti corticali mouse

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Cultura primario di topo neuroni dopaminergici

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

Rapida genotipizzazione degli animali Seguito da Stabilire colture primarie di neuroni del cervello

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

Isolamento di cellule primarie murini cervello microvascolare endoteliali

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. Microglia are mesodermal cells that function similarly to macrophages in surveying inflammatory stress. The classical (M1-type) and alternative (M2-type) activations of macrophages have also been extended to microglia in an effort to better understand the underlying interplay these phenotypes have in neuroinflammatory conditions such as Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s, and Huntington&#39;s Diseases. In vitro experimentation utilizing primary microglia offers rapid and reliable results that may be extended to the in vivo environment. Although this is a clear advantage over in vivo experimentation, isolating microglia while achieving adequate yields of optimal purity has been a challenge. Common methods currently in use either suffer from low recovery, low purity, or both. Herein, we demonstrate a refinement of the column-free CD11b magnetic separation method that achieves a high cell recovery and enhanced purity in half the amount of time. We propose this optimized method as a highly useful model of primary microglial isolation for the purposes of studying neuroinflammation and neurodegeneration.

Here, we present a protocol to isolate microglia from postnatal mouse pups (day 1) for in vitro experimentation. This improvised method of isolation generates both high yield and purity, a significant advantage over alternate methods that allows broad range experimentation for the purposes of elucidating microglial biology.

Rapid e raffinato CD11b isolamento magnetico di primaria microglia con purezza migliorata e versatilità

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

Caratterizzazione e isolamento di Mouse Microglia primaria di centrifugazione in gradiente di densità

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Isolamento di cellule endoteliali microvascolari murino primario del muscolo scheletrico

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Isolamento rapido dei macrofagi di Ganglion dorsale

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials through saltatory conduction. Moreover, an increasing number of reports suggest that oligodendrocytes interact with neurons beyond myelination, notably through the secretion of soluble factors. Here, we present a detailed protocol allowing purification of oligodendroglial lineage cells from glial cell cultures also containing astrocytes and microglial cells. The method relies on overnight shaking at 37 &#176;C, which allows selective detachment of the overlying oligodendroglial cells and microglial cells, and the elimination of microglia by differential adhesion. We then describe the culture of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium (OCM). We also provide the kinetics of OCM treatment or oligodendrocytes addition to purified hippocampal neurons in co-culture experiments, studying oligodendrocyte-neuron interactions.

Herein, we display an efficient method for the purification of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium that can be used for co-culture experiments.

Generazione di Oligodendrociti e Mezzo Condizionato oligodendrocito per Esperimenti Co-Culture

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...