この研究は次の補助金によって財政上支えられる: 中国の自然科学基礎 (号 81572198;81772394 号)深セン大学 (第 2016031638); の高レベルの医療分野建設のための基金広東省、中国 (号の医学研究の基礎A2016314);深センの科学と技術のプロジェクト (No.JCYJ20170306092215436;違います。JCYJ20170412150609690;違います。JCYJ20170413161800287;違います。SGLH20161209105517753;違います。JCYJ20160301111338144)。

地域倫理委員会ガイドラインに従ってすべての動物実験を行い、動物のすべてのプロシージャは、機関動物ケアおよび使用委員会の深セン第二人民病院、深セン大学によって承認されました。
1. 分離し、rbSF MSCs の文化
<ol><li>
動物のプロシージャのための準備
	<ol>
<li>RbSF のコレクションの骨格成熟女性ニュージーランド白ウサギを準備-MSCs。 1 日麻酔と穿刺のプロシージャ前にウサギの臨床検査を実行します。 注: 身体検査は、心拍数と呼吸数、体温 (女性) の性別 (2.0 〜 2.5 kg) の重量を含める必要があります。臨床的に健康なウサギのパラメーター間隔は 38-39 ° C の体温、心拍数 220-280 分呼吸率 30-50 分。</li>
		<li>麻酔の前に 6 時間動物を高速です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
薬品および動物の麻酔の手順
	<ol>
<li>ケージでウサギを抑制 (材料の表を参照)、し、全身麻酔のための 1 mL/kg の用量で耳静脈に 3% ペントバルビ タール ナトリウムを注入します。</li>
		<li>快適な背臥位でウサギを配置します。</li>
		<li>麻酔中に呼吸数、心拍数、ウサギの体の温度を監視します。</li>
		<li>麻酔中の乾燥を防ぐために、その目に眼科の軟膏を使用します。</li>
		<li>Guedel の分類14の後麻酔の深さを評価します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MSCs の分離と培養のための準備
	<ol>
<li>RbSF MSCs を育成する培地商業の 500 mL を準備 (材料の表を参照) を添加した商業 10% 補足 (材料の表を参照)、10% 牛胎児血清 (FBS)、および 1% ペニシリン-ストレプトマイシン。</li>
		<li>水お風呂で 37 ° C で培養液を孵化させなさい。</li>
		<li>電池隔離および細胞洗浄用リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) の 500 mL を準備します。</li>
		<li>膝窩洞穿刺プロシージャの等張生理食塩水液 100 mL を準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ウサギの膝関節の関節滑膜溝 uid のコレクション
	<ol>
<li>膝の周囲サイズが約 5 × 5 cm の領域を選択し、安全の電気シェーバーを使用してこのエリアからウサギの毛を剃る。</li>
		<li>また、消毒手順サイト 3 ポビドン ヨード ソリューションと 75% エタノールと x。そして、地域は完全に乾燥した後に滅菌ドレープを適用します。</li>
		<li>3-4 x 横関節領域から膝の関節腔に滅菌皮下注射器 (2 mL) を使用して、膝を移動、等張食塩水の 1-2 mL を注入し、室温ですべての滑液を吸います。</li>
		<li>4 時間以内の任意の残骸を削除する 40 μ m ナイロン携帯こし器を通って滑膜の気体をフィルターします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RbSF MSCs の文化
	<ol>
<li>50 mL 遠沈管、室温で 10 分間、1,500 rpm で遠心分離フィルターの気体を収集します。</li>
		<li>遠心分離後に上清を破棄、PBS でペレットを洗浄、完全な培養液中でペレットを再懸濁します、プレート 100 mm 料理中。</li>
		<li>37 ° c 5% CO2を含む加湿雰囲気で料理を孵化させなさい。</li>
		<li>48 時間後に、任意の非付着性細胞を除去する新鮮な培地で料理を補充します。0 (P0) の通路として 2 週間週 2 回、媒体を交換します。 注: 約 1 × 104付着性のセルが必要があります。実行可能なセル/平方フィートの ml は約 2 × 102/mL です。</li>
		<li>初期のめっきの後 14 日後の培養皿で多くの植民地を形成している必要があります。直径 2 mm 以上のコロニーを選択します。マーク選択したコロニーが皿の底に彼らのまわりを追跡することであります。</li>
		<li>< 2 mm 幅、セルのスクレーパーを使用してコロニーを破棄します。0.25% トリプシン、クローニング シリンダーを使用しての約 5 μ L で選択したコロニーを消化し、通路 1 (P1) として植民地を新しい料理に転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
術後の動物の世話
	<ol>
<li>術後監視と麻酔からの回復のための標準的な制度運用手順に従います。</li>
		<li>意識を取り戻したがそれまでウサギの 10 分ごとのバイタル サインを監視します。最終的に、理性的な動物を檻に転送します。それは完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けているウサギは返されません。</li>
		<li>術後、0.1% ポビドン ヨード、3 日間の日 x 2 とサイトを消毒します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CD90 正磁気活性化セルの並べ替え (MAC) rbSF MSCs と初代培養の
<ol><li>
サンプル準備
	<ol>
<li>セルの周りに達する場合 80% の confluency、培地を吸引、0.25% の 1-2 の mL を追加してそれぞれの皿にトリプシン-EDTA。</li>
		<li>細胞の剥離を許可するように 2 〜 3 分の料理を孵化させなさい。</li>
		<li>一度セルを取り外したら、トリプシンを不活化する培地の等しい量を追加します。</li>
		<li>細胞懸濁液を 40 μ m 細胞のストレーナー通過 15 mL チューブに濾液を収集し、後、スピンダウン 600 × g 10 分間室温でのセル。</li>
		<li>バッファーを実行する MAC で細胞ペレットを再懸濁します (PBS、pH 7.2, 0.5% ウシ血清アルブミン、2 ミリメートルの EDTA) のセル数をカウントすると。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
磁気ラベリング 注: は、列、スタンド、および区切り記号 (材料の表を参照) を含むキットを並べ替え磁気活性化細胞と rbSF MSCs を並べ替えます。<ol>
<li>診断を使用して細胞の数を決定します。</li>
		<li>4 ° C で 10 分間 300 × g の細胞懸濁液を遠心分離します。完全に上清を吸引します。</li>
		<li>10 の7の合計セルごと再懸濁バッファーの 80 μ L を追加します。</li>
		<li>10 総細胞、モノクローナル抗家兎 CD90 抗体の共役のマイクロ ビーズの 20 μ L を追加します。</li>
		<li>磁気ビーズと均等に管内細胞をミックスし、暗闇の中で 15 分間の 4 ° C でそれらを孵化させなさい。</li>
		<li>チューブに 1 mL の 10 の7セルごとのバッファーを追加し、セルを洗浄する 4 ° C で 10 分間 300 × g で遠心分離します。遠心分離後、上清を破棄します。</li>
		<li>500 μ L の 10 の7セルごとのバッファーでペレットを再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
磁気分離
	<ol>
<li>磁気分離装置の磁気フィールドに前面に列翼を持つ列を配置します。</li>
		<li>10 の7セルごとのバッファーの 500 μ L と磁気分離装置 (MS) 列をすすいでください。</li>
		<li>列に単一細胞懸濁液を転送します。これらのラベルのない細胞を破棄する磁場を通過する否定的な細胞ができます。</li>
		<li>列バッファーの 500 μ L で 1-2 x 10 の7セルごと洗って流れを破棄します。</li>
		<li>遠心分離機管 (15 mL) に列を転送します。</li>
		<li>列に 1 mL の 10 の7セルごとのバッファーを追加し、磁気標識細胞を洗い流すため列にプランジャーをすぐにプッシュします。</li>
		<li>CD90 の純度を高めるため MS 欄に前述の手順を繰り返して、+細胞は、溶出画分を豊かにすることができます。</li>
		<li>300 × g 10 分で細胞懸濁液を遠心、上清を吸引、培養培地でそれを再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
文化、CD90 の+ rbSF MSCs
	<ol>
<li>磁気活性化細胞選別後 100 mm の料理の細胞を接種します。</li>
		<li>37 ° c 5% CO2加湿セル インキュベーターで料理を孵化させなさい。</li>
		<li>初代培養の 80-90% の合流点を達成すると、約 7-10 日で消化 0.25% トリプシン-EDTA と通路付着性のセル 2 (P2) の通路に 1:2 の希釈でそれら。</li>
		<li>同じメソッドを使用して、細胞を通過通過 3 (P3)の in vitroアッセイに使用ことができます。 注: サブカルチャー、浄化後約 1 × 107 rbSF MSCs が取得されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. rbSF MSCs の同定
<ol><li>
フローサイトメトリーによる rbSF MSCs の表面マーカー確認
	<ol>
<li>MSCs が P3 で 80-90% の合流は、PBS のセルを洗浄し、0.25% の 1 mL とそれらを扱うトリプシン-EDTA。次に、セルを取り外すまで 2 〜 3 分の 37 ° C で MSCs をインキュベートします。</li>
		<li>10 mL の PBS を使用してセルを収穫、円錐管 (15 mL) にそれらを転送、室温で 5 分間 300 × g で遠心分離機のこと。</li>
		<li>培養上清を捨てます。500 μ L の PBS で細胞ペレットを再懸濁し、1.5 mL チューブにそれを転送します。</li>
		<li>FITC 結合し、PE 標識抗体 (アイソタイプ、FITC CD34/PE CD45、FITC CD105 PE CD44) 4 ° C で暗闇の中で 1 時間の 1: 100 希釈を孵化させなさい</li>
		<li>室温で 5 分間 300 × g でこの混合物を遠心し、各時間 5 分 300 × g で遠心分離によって PBS で 2 回細胞を洗浄します。培養上清を捨てます。</li>
		<li>500 μ L の PBS で細胞を再懸濁します、細胞懸濁液を丸底チューブ (5 mL) に転送し、流れの cytometer を使用してそれを分析します。 注: 2 つの蛍光チャンネル cytometer でデータの集録: 533/30 と 585/40。各アイソタイプ蛍光アイソタイプ コントロールを使用して、適切なレーザーの電圧を調整し、ピークの左と右の両方のエッジを表示する蛍光ヒストグラムを取得するために必要な最低の強度を設定します。統計解析 10,000 イベントの最小値を収集します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RbSF MSCs の multidifferentiation 注: 使用 P3 rbSF - multidifferentiationの in vitroアッセイの MSCs。<ol>
<li>
骨分化誘導
		<ol>
<li>骨誘導培地を準備: L-アスコルビン酸-2-リン酸、α-グリセロリン酸の 10 ミリメートルと 100 の 50 mM を含む DMEM basic (1 x) デキサメタゾンの nM。</li>
			<li>6 ウェル培養プレートの 10 の3セル/cm2で細胞を播くし、骨誘導培地でそれらを文化します。</li>
			<li>3 週間ごとに 3 日間誘導培地を変更します。</li>
			<li>分化が完了した後、室温で 30 分間 4% ホルムアルデヒドとセルを修正、セルの汚れ 1 %5 分洗いそれら 3 アリザリン赤と PBS15x。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
脂肪細胞分化
		<ol>
<li>脂肪分化誘導培地を準備: DMEM basic (1 x) インドメタシンの 100 mM、組換えヒトインスリンの 10 mg/mL、デキサメタゾン、1 mM と 0.5 mM 3-イソブチル-1 - メチルキサンチンから成る。</li>
			<li>P3 rbSF MSCs の脂肪分化誘導培地で 3 週間治療します。</li>
			<li>3 週間後オイル赤い O を使用して脂肪細胞の分化を確認する中性脂質液胞を染色します。常温で 30 分 4% ホルムアルデヒド溶液セルを修正し、洗い、そして PBS163 x。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
軟骨細胞分化
		<ol>
<li>軟骨細胞誘導培地を準備: DMEM basic (1 x)、サプリメント、L-プロリン、100 nM デキサメタゾンの, ピルビン酸ナトリウムの L-アスコルビン酸-2-リン酸と 1 mM の 50 mM の 0.35 mM TGFβ1、1% の 10 ng/mL から成る。</li>
			<li>ペレット培養軟骨細胞誘導を使用します。MSCs ではペレットを形成するポリプロピレン チューブ (15 mL) で 10 分間 1500 rpm - 5 × 105 P3 rbSF を遠心します。</li>
			<li>ペレットを培養軟骨細胞誘導培地で 3 週間。</li>
			<li>3 週間ごとに 3 日間媒体を変更します。</li>
			<li>3 週間誘導後パラフィン包埋細胞ペレットを埋め込む、4 mm スライスにセクションおよび 0.1% を使用してそれらを染色トルイジン ブルー17部屋の温度で 30 分間。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
総 RNA の抽出および量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (qRT PCR) による解析
	<ol>
<li>商業の RNA の抽出を使用して 3 週間分化誘導後細胞の総 RNA キット (材料の表を参照) を特定します。<ol>
<li>培養皿で培養液を削除し、分離試薬の 1 つの mL を追加します。</li>
			<li>ソリューションが均質になるまで繰り返しピペッティングにより細胞を溶解させます。それを 3 分間室温でインキュベートします。</li>
			<li>1.5 mL 遠心チューブに細胞ライセートを転送します。</li>
			<li>100 μ L のクロロホルムを加えて手 15 x でそれを振る 3 分間室温で混合物を孵化させなさい。</li>
			<li>4 ° C で 15 分間、12,000 × g でチューブを遠心分離します。培養上清を新しい 1.5 mL 遠心チューブに転送します。</li>
			<li>500 μ L のイソプロパノールを加えて室温で 10 分間の RNA の沈殿物します。</li>
			<li>12,000 × g で遠心する 10 minat 4 ° CRNA ペレットが管の下部に表示されます。</li>
			<li>上澄みを除去し、75% エタノール 500 μ L を追加します。RNA ペレットを洗浄するか、数秒間管を簡単にスピンします。4 ° C で 5 分間 7,500 × g で遠心分離します。</li>
			<li>残留エタノールを削除します。</li>
			<li>10 μ L の DEPC 水に RNA ペレットを溶かし、氷の上にチューブを配置します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>逆 DNA 合成と cDNA に総 RNA の転写キット (材料の表を参照してください)。 注: は、氷の上すべての次の手順を実行します。<ol>
<li>逆のトランスクリプションのマスター ミックスを準備します。</li>
			<li>RNA の 1 μ g と各チューブに DNase 処理 RNA の 25 μ L を追加します。</li>
			<li>PCR サーマルサイクラーを使用して以下の温度で混合物を孵化させなさい: 26 ° C (ランダムな hexamers をアニールする) 10 分で 42 ° C 45 分 (逆転写) と (逆転写酵素を不活性化) に 10 分間、75 ° C。</li>
			<li>すぐに量的なリアルタイム PCR によって生成される cDNA を分析したり、-20 ° C で保存</li>
		</ol>
</li>
		<li>定量的リアルタイム PCR システムと遺伝子発現解析を実行します。<ol>
<li>QRT PCR マスター ミックスを使用 (材料の表を参照) PCR を行う。Ppar γ、Agg、Runx2 GAPDH の PCR のプライマーは、表 1に表示されます。</li>
			<li>2−ΔΔCT法を用いた遺伝子発現を計算します。</li>
			<li>標準的な統計解析ソフトウェアを使用して統計分析を行います。独立したサンプルの t 検定を使用して、グループの平均を比較します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Oreffo, R. O., Cooper, C., Mason, C., Clements, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells:+lineage,+plasticity,+and+skeletal+therapeutic+potential.">Mesenchymal stem cells: lineage, plasticity, and skeletal therapeutic potential.</a> Stem Cell Reviews. 1 (2), 169-178 (2005).</li><li>Asakura, A., Rudnicki, M. A., Komaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cells+are+multipotential+stem+cells+that+exhibit+myogenic,+osteogenic,+and+adipogenic+differentiation.">Muscle satellite cells are multipotential stem cells that exhibit myogenic, osteogenic, and adipogenic differentiation.</a> Differentiation. 68 (4-5), 245-253 (2001).</li><li>De, B. C., Dell'Accio, F., Tylzanowski, P., Luyten, F. 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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

滑液の MSCs の存在は、細胞ベースの治療のための代替を提供します。以前の研究では、受傷後の期間5と相関する可能性があります彼らの滑液で間葉系幹細胞の多量を含む傷害のサイトを示しています。滑液の MSCs は、負傷18,19後自然治癒を高めるための組織に有益な可能性があります。SF MSCs の臨床応用は主な理由は関節で SF MSCs の機構のまま未定義20ほとんど文献でカバーされています。・ ジョーンズら。21膝関節の hSF MSC 数大幅 7 増加することを報告した変形性関節症 (OA) の初期段階。彼らは増加の SF MSCs が関節の生理的恒常性を維持することに貢献できると思った。
理想的な動物モデルは、再生医療を利用した治療法の開発に欠かせないツールです。ウサギ、ウサギ人間間の明らかな違いは存在が組織再生の7、従って SF MSCs の我々 の研究のためのモデルとして選択するに私たちを求める研究の動物モデルとして広く使用します。この努力で困難な障害の 1 つは、しばしば SF MSCs の分離が植民地低頻度と種類豊富な成功率の結果を以前の研究5で報告しました。したがって、多くの研究者は、成功率と MSCs SF からの分離の最適化に焦点を当てています。
この studyeffectively は CD90 の生存率やソート純度の高い MAC 手順を使用+ MACSs ウサギ滑膜液22から。この MAC システムはこの場合、特定の細胞表面抗原、CD90 に結合特異性の高い抗体を共役磁性ビーズを利用して、特定のターゲット細胞型、すなわち CD90 発現細胞の選択できます。CD90 のマイクロ ビーズを浄化する前に通常 14 日間のプライマリ rbSF MSCs を文化します。この期間中に多くのコロニーは、培養皿で形成されます。このプロトコルでは、直径 2 mm 以上のコロニーを選択することを示唆しています。植民地選択のクローニング シリンダーを使用している場合我々 は慎重に顕微鏡の下でそれを観察します。単一のコロニーは、浄化のためさらに伝達されます。
分離・精製の過程では、ラベルのない細胞を通過するのに対し、列の区切り文字の磁場印加によるラベルの貼られた磁気 CD90 発現細胞は引き付け。洗浄工程後、区切りの磁気フィールドから列を削除、標的細胞にカラムから溶出されます。この特定の MAC ビーズ アプローチにより、幹細胞表面マーカー CD44 と CD105、これらの隔離されたセルが造血細胞23ではなく、間葉系幹細胞であることを示す特異的に発現する rbSF MSCs の分離です。これらの精製 rbSF MSCs は形態学的特徴とマーカー発現の重要な変更せず長い時間をかけて体外培養できます。また、MAC で濃縮 rbSF MSCs は、複数系統の細胞で骨形成系細胞、脂肪細胞、軟骨細胞などに多能性分化能力を発揮いたします。
MAC の操作は容易に行うプロトコルであり、ベンチ23に行うことができます。また、米国食品医薬品局 (FDA) は、MAC ビーズ ベースの技術を承認した、従って臨床応用24を実行する簡単です。CD90 は間葉系幹細胞の表面マーカー、CD90 の肯定的な MSCs が良い軟骨分化能力25,26ある研究者は示した。形態および幹細胞27の特定のマーカーの表現に基づいて MSCs の多能性が特徴づけられています。
本研究では、いくつかの制限があります。このプロトコルの最初の欠点を行った表面マーカーに関連しています。国際社会によって声明に基づく細胞療法 (ISCT)、多能性 MSCs を定義するための最低限の条件は CD90 ・ CD105、CD44、CD73、正と負 CD11b、CD14、CD34、CD45 と CD79a または HLA-DR28。努力と全体のパネルをテストするために必要な費用を軽減する目的として、本研究の研究者は否定的なマーカーの 2 つと 2 つの推奨される肯定的なマーカーの慎重に選択。第二に、それはさらなる研究のために選択されるコロニーを形成する長い時間がかかります。さらに、肥大軟骨 SF MSCs体外誘導中に主要な問題では。後の段階、肥大軟骨細胞常に特急型 X コラーゲン (COLX)、マトリックスメタロプロテアーゼ 13 (MMP13)、因子 2 (Runx2)29アルカリ性ホスファターゼ (ALP) とラント関連転写。研究ことを示唆三次元 (3 D) ペレット文化、ダイナミックな文化システム、および軟骨細胞培養 MSC の利益安定軟骨分化30,31。本研究でペレット文化システムは肥大を避けるために MSC の軟骨細胞誘導のために使用されました。
結論としては、簡易分離と関節腔洗浄液からの MSCs の精製法を確立し、そこに得られる MSCs を特徴としました。このプロトコルは、探査と関節滑液由来 Msc の新規共同再生戦略の潜在的有用性の検討のためのプラットフォームを提供しています。

MSCs は、特に軟骨病変のための再生医療のための貴重な情報源として提案されています。MSCs では、軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞と内臓の間質細胞を含む広くその高膨張率と多系統分化潜在的な1のための幹細胞移植の領域を展開します。MSCs は、骨格筋、滑膜、骨髄、脂肪2,3,4から分離できます。調査結果にも、あるビジョ滑液の MSCs の存在と前の研究が関節再生5,6の有望な候補として滑液由来 Msc (SF MSCs) を発見します。
しかし、研究と人間のサンプルの臨床実験は多くの倫理的な問題の対象となります。代わりに、ウサギはされているし、MSCs の移植が軟骨の損傷を修復することができますを示すために最も一般的に使用される動物種であり続けます。近年、研究者数の増加は、両方生体外でウサギ間葉系幹細胞 (rbMSCs) を研究しているし生体内で、これらの細胞は、細胞生物学、組織生理学におけると同様に人間の MSCs。同様に、rbMSCs は人間の MSCs のように軸線維芽細胞の形態を表示するプラスチックの表面に付着することがあります。さらに、ウサギ間葉系サンプル、シンプルで簡単に7を入手します。さらに、最も重要なポイントは、CD44、CD90, CD105 などの表面マーカーを rbMSCs に表現として MSC 集団の同定の基準に一致してである多系統分化の能力が維持されること細胞療法8,9国際社会によって定義されます。特に、滑膜液 chondroprogenitors、非肥大軟骨分化表現型関節軟骨再生10、11、適切な細胞源のため TGF-β 1 による場合の対応 12。
しかし、SF MSCs の分離は臍帯、脂肪組織、末梢血、骨髄など、他の組織から大きく異なる。現在、浄化および SF MSCs の並べ替えのための最も一般的なアプローチはフローサイトメトリー ・免疫ビーズに基づく並べ替え、フローサイトメトリー法には、特定の環境と非常に高価な楽器13が必要ですが。
この記事は、白ウサギ ニュージーランドから滑液のサンプル集のシンプルで低侵襲の手順を示します。中には、rbSF MSCs 安定拡大培養CD90 正磁気ビーズによるプロシージャで分離されたし。最後に、プロトコルは、高純度と収穫の細胞源から生存率 MSCs を取得する方法を示します。
このプロトコルでは、形態、特定のマーカーと幹細胞の多能性の式に基づいて分離 rbSF MSCs が特徴です。CD45 と CD34 の式が負の値に対し、流れの cytometry ベース診療は CD44 と CD105 の重要な肯定的な表現を明らかにします。最後に、rbSF mscsの in vitroアッセイは、これらの細胞の骨、軟骨、脂肪細胞の分化を示しています。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MesenGro</td><td>StemRD</td><td>MGro-500 1703</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>MesenGro Supplement</td><td>StemRD</td><td>MGro-500 M1512</td><td>Component of MSCs culture medium</td></tr><tr><td>DMEM basic</td><td>Gibco Inc.</td><td>C11995500BT</td><td>MSCs differentiation medium</td></tr><tr><td>Isotonic saline solution</td><td>Litai, China</td><td>5217080305</td><td>Cavity arthrocentesis procedure reagent</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>HyClone Inc.</td><td>SH30256.01B</td><td>PBS, free of Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco Inc.</td><td>10099-141</td><td>Component of MSCs culture medium</td></tr><tr><td>Povidone iodine solution</td><td>Guangdong, China</td><td>150605</td><td>Sterilization agent</td></tr><tr><td>75% ethanol</td><td>Lircon, china</td><td>170917</td><td>Sterilization agent</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA</td><td>Gibco Inc.</td><td>25200-056</td><td>Cell dissociation reagent</td></tr><tr><td>1% Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco Inc.</td><td>15140-122</td><td>Component of MSCs medium</td></tr><tr><td>MACS Running Buffer</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>5160112089</td><td>Containing phosphate-buffered saline (PBS), 0.5% bovine serum albumin(BSA), and 2 mMEDTA</td></tr><tr><td>CD90 antibody conjugated MicroBeads</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>5160801456</td><td>For magnetic activated cell sorting</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>Component of MSCs chondrogenic differentiation</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td>Component of MSCs osteogenic differentiation</td></tr><tr><td>ITS</td><td>BD</td><td>354352</td><td>1%, Component of MSCs chondrogenic differentiation</td></tr><tr><td>L-proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5607</td><td>0.35 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation</td></tr><tr><td>L-ascorbic acid-2-phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td>50 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation</td></tr><tr><td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td>0.5 mM, Component of adipogenic differentiation</td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td>100 mM, Component of adipogenic differentiation</td></tr><tr><td>TGF&amp;beta;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>10 ng/mL, Component of MSCs chondrogenic differentiation</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-glycerophsphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6751</td><td>Component of MSCs osteogenic differentiation</td></tr><tr><td>CD34 Polyclonal Antibody, FITC Conjugated</td><td>Bioss</td><td>bs-0646R-FITC</td><td>Hematopoietic stem cells marker</td></tr><tr><td>Mouse antirabbit CD44</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA806GA</td><td>Thy-1 membrane glycoprotein (MSCs marker)</td></tr><tr><td>CD45 (Monoclonal Antibody)</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA808GA</td><td>Hematopoietic stem cells marker</td></tr><tr><td>CD105 antibody</td><td>Genetex</td><td>GTX11415</td><td>MSCs marker</td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030</td><td>Precipitates RNA extraction organic phases</td></tr><tr><td>Trichloromethane</td><td>Wenge, China</td><td>61553</td><td>Extract total RNA</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>Isolate total RNA</td></tr><tr><td>SYBR green master mix</td><td>Takara Bio, Japan</td><td>RR420A</td><td>PCR test</td></tr><tr><td>cDNA synthesis kit</td><td>Takara Bio, Japan</td><td>RR047A</td><td>Reverse-transcribed to complementary DNA</td></tr><tr><td>Alizarin Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td>Staining of calcium compounds</td></tr><tr><td>Toluidine Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89640</td><td>Staining of cartilaginous tissue</td></tr><tr><td>Oil Red O solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1391L</td><td>Lipid vacuole staining</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-102</td><td>For magnetic activated cell sorting</td></tr><tr><td>MultiStand</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-303</td><td>For magnetic activated cell sorting</td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-201</td><td>For magnetic activated cell sorting</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>FALCON Inc.</td><td>352340</td><td>40 &amp;mu;m nylon</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>ISOLAB Inc.</td><td>075.03.001</td><td>Cell counting</td></tr><tr><td>Falcon 100 mm dish</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>Cell culture dish</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>RNA Extraction and PCR</td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91050</td><td>Gamma-sterilized</td></tr><tr><td>High-speed centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>Centrifuge cells</td></tr><tr><td>Carbon dioxide cell incubator</td><td>Thermo scientific</td><td>3111</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Real-Time PCR Instrument</td><td>Life Tech</td><td>QuantStudio</td><td>Real-Time quantitative polymerase chain reaction</td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>342975</td><td>Cell analyzer</td></tr><tr><td>Pipettor</td><td>Eppendorf</td><td>O25456F</td><td>Transfer the liquid</td></tr><tr><td>Cloning cylinder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3983-50EA</td><td>Isolate and pick individual cell colonies</td></tr><tr><td>Sterile hypodermic syringe</td><td>Double-Dove, China</td><td>131010</td><td>Arthrocentesis procedure</td></tr><tr><td>Rabbit cage</td><td>Zhike, China</td><td>ZC-TGD</td><td>Restrain the rabbit</td></tr></tbody></table>

magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model

間葉系幹細胞 (Msc) は、細胞ベースの治療の主要な細胞ソースです。MSCs 関節腔滑液から軟骨組織工学用をされる可能性があります可能性があります。滑液 (SF MSCs) から MSCs は関節の再生のための有望な候補と考えられてきたし、彼らの潜在的な治療効果は重要な研究課題の後半。ニュージーランド白ウサギの膝関節腔から SF MSCs は人間の再生医療を評価するために最適化された並進モデルとして用いることができます。CD90 ベース磁気活性化細胞 (MAC) 技術を並べ替え、このプロトコルこの家兎モデルからウサギが SF MSCs (rbSF-MSCs) 正常取得ならびにさらに完全に区別するためにそれらを誘導することによってこれらの細胞の MSC の表現型を示します骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞。したがって、このアプローチは、細胞生物学の研究と簡単な装置や手順を使用してティッシュ エンジニア リングで適用できます。

分離・精製・ rbSF MSCs の文化: このプロトコルは、rbSF-MSCs MSC 表面マーカー CD90 の式に基づいて分離するのに MAC を使用します。RbSF MSCs の分離・精製とキャラクタリゼーション ・体外培養のプロトコルのプロセス フロー図を図 1に示します。
磁気活性化細胞と CD90 (MAC) を並べ替え後細胞の形態: まずの MAC、CD90 磁気ビーズの MSCs immunolabel。遠心分離の後冷却並べ替えバッファーの 80 μ L の 10 の7セルの最大再懸濁します、続いてボルテックスと 4 ° c 15 分インキュベーション CD90 磁気ビーズの 20 μ L を追加します。その後、並べ替えバッファーの 1 mL の細胞を洗浄し、並べ替えバッファーの 500 μ L でそれらを再懸濁します。磁気の並べ替えの前に、洗濯の手順を繰り返します。この重要な手順を図 2に示します。
並べ替え、する前に付着性ウサギ滑膜細胞集団は、多様な細胞のタイプおよびサイズ (図 3 a・ C) を含む異種の形態を表示されます。MAC では、次のセル人口は均質な形態を展示しました。細胞の数は、サブカルチャー (図 3 DF) とともに増加しました。
表面特性の MAC 濃縮 rbSF MSCs: 蛍光活性化セルの並べ替え (FACS) は CD90 と MAC で rbSF MSCs の濃縮を分析を行った.MAC の前で、セル人口は、約 40 %mscs (図 4、D;図 4 a、Bのアイソタイプ コントロール) から成っていた。MAC では、次は、豊かな人口は、約 > 99 %mscs (図 4 e,F) を含まれています。造血系統の細胞マーカー CD34 と CD45、0.318% 両方ほとんど表現された MAC の後 25.9% で彼らの最初の式からの減少であります。選択の前に約 28 %cd90 があった+は細胞 (図 4)。浄化、CD90 の約 98%+後細胞 (図 4 H) が得られました。
能分化ポテンシャル rbSF MSCs の: RbSF MSCs など様々 な系統に分化する能力を特徴付ける、骨、脂肪細胞、軟骨細胞、MAC で濃縮 rbSF MSCs 同時に培養した特定分化培地と、分化培地コントロールとして機能するサイトカインなし。系統特異的マーカーを染色によって分析された誘導が完了したときと RT-PCR。アリザリン赤カルシウム化合物の染色 (図 5 a) 骨誘導条件下で 3 週間後 rbSF MSCs で石灰化結節を形作ったことを示した。脂肪分化誘導の 3 週間後脂質豊富な液胞の蓄積は細胞内オイル赤 O 染色 (図 5 b) によって検出でした。軟骨細胞誘導の 21 日間、細胞ペレットはトルイジン ブルー染色で組織学的試金。(するプロテオグリカン) 染色陽性細胞は軟骨細胞様細胞 (図 5) として見なされていた。この結果と同様に、潜在的な分化の遺伝子発現定量解析もこれらの細胞の分化能力を証明しています。Agg (軟骨細胞マーカー)、ppar γ (脂肪細胞マーカー) と Runx2 の発現量 (骨芽細胞マーカー) 誘導条件下で誘導されました。これらのデータは、trilineages (図 5) に rbSF MSCs の多能性分化能力を証明しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57466/57466fig1.jpg"> 図 1: 分離・精製・ ニュージーランド白ウサギの SF MSCs の特性の詳細回路図。<a href="/files/ftp_upload/57466/57466fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57466/57466fig2.jpg"> 図 2: 磁気活性化細胞 (MAC) CD90 で並べ替えを行うためのプロトコル。<a href="/files/ftp_upload/57466/57466fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57466/57466fig3.jpg"> 図 3: 単分子膜の形態の前に rbSF MSCs を培養し、MAC と普通の下で検査後倒立顕微鏡。A C)並べ替えの前に付着性ウサギ滑膜細胞集団の不均一性が表示されます。彼らには、多様な細胞の種類とサイズ、楕円形、長いスピンドル、短紡錘形状形態などが含まれています。P2 および P6 の主な形態はスピンドル形態 (A: P2、 B: P3、 C: P6)。D F)次の CD90 と MAC、細胞集団は均質な形態を展示します。サブカルチャー、細胞数増加 (D: P2, E: P3、 F: P6)。スケールバー = 100 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57466/57466fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57466/57466fig4.jpg"> 図 4: rbSF MSC 表面マーカーの同定します。フローサイトメトリー解析を使用して、rbSF MSCs、正に内皮細胞のマーカー CD34 と造血細胞マーカー CD45 陰性、MSC のマーカー CD44 と CD105、です。MAC の前にこれらの細胞 CD44 の CD105 陽性の低レートであります。ただし、MAC 後の陽性率は高かった。A、B)これらのトップの 2 つの画像は、アイソタイプ コントロール データを表示します。C, D)これらの結果は、マックの前に、rbSF MSC 人口が約 40 %msc 細胞で構成されているを示しています。E、F)MAC の後は、豊かな人口には > 99 %msc 細胞が含まれています。G, H)これらの画像表示、CD90 の流れフローサイトメトリー解析+マーカー、前に(G)と(H) MAC 並べ替え後。<a href="/files/ftp_upload/57466/57466fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57466/57466fig5.jpg"> 図 5: 汚損によって系統特異マーカーの解析と RT-PCR。A)アリザリン赤染色 3 週間骨誘導の下で石灰化結節を形成することを示します。B)脂肪分化誘導の 3 週間後脂質豊富な液胞の蓄積が検出された細胞内オイル赤 O 染色によって。C)軟骨細胞誘導の 3 週間は、細胞ペレットは組織学的アッセイは、トルイジン ブルー染色します。(するプロテオグリカン) 染色陽性細胞は軟骨細胞様細胞とみなされました。スケールバー = 100 μ m. D) 3 週間培養後骨芽細胞マーカー (Runx2)、脂肪分化マーカー (ppar γ) と軟骨マーカー (Agg) の式は、相対 mRNA 検出.すべての解析についてp値 < 0.01 として考慮された統計的クラスカル ・ ウォリス検定を用いて有意差 (として示されて *)。<a href="/files/ftp_upload/57466/57466fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>遺伝子</td>
			<td>プライマー (5'-3') を転送します。</td>
			<td>逆プライマー (5'-3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>Runx2</td>
			<td>TATGAAAAACCAAGTAGCAAGGTTC</td>
			<td>GTAATCTGACTCTGTCCTTGTGGAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>AGG</td>
			<td>GCTACACCCTAAAGCCACTGCT</td>
			<td>CGTAGTGCTCCTCATGGTCATC</td>
		</tr>
<tr>
<td>PPARΓ2</td>
			<td>GCAAACCCCTATTCCATGCTG</td>
			<td>CACGGAGCTGATCCCAAAGT</td>
		</tr>
<tr>
<td>GAPDH</td>
			<td>GGAGAAAGCTGCTAA</td>
			<td>ACGACCTGGTCCTCGGTGTA</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1:一覧遺伝子と量的なリアルタイム PCR 本研究で使用されるプライマー 。

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Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

磁気活性化細胞を分離し、滑膜液由来間葉系幹細胞が家兎モデルからの浄化戦略を並べ替え

この記事では、簡単な分離そしてニュージーランド白ウサギ滑液からの間葉系幹細胞の浄化のためのシンプルで経済的プロトコルを示します。

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

magnetic-activated-cell-sorting-strategies-to-isolate-purify-synovial

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.1K ビュー.  Guangzhou Medical University. この記事では、簡単な分離そしてニュージーランド白ウサギ滑液からの間葉系幹細胞の浄化のためのシンプルで経済的プロトコルを示します。

ビデオ: Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

脂肪デポ固有のSca1の免疫磁気分離<sup&gt;高</sup&gt;脂肪由来幹細胞（ASCに）

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

発生生物学

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34- pericytes and vascular CD34+CD146- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Human cardiac tissue harbours multipotent perivascular precursor cell populations that may be suitable for myocardial regeneration. The technique described here allows for the simultaneous isolation and purification of two multipotent stromal cell populations associated with native blood vessels, i.e. CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells, from the human myocardium.

ヒト心臓組織からの血管周囲多能前駆細胞集団の単離

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Treatment of Osteochondral Defects in the Rabbit's Knee Joint by Implantation of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Fibrin Clots

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular cartilage and subchondral bone in recent years led to increased attention to restoration of the entire osteochondral unit. In comparison to chondral lesions the regeneration of osteochondral defects is much more complex and a far greater surgical and therapeutic challenge. The damaged tissue does not only include the superficial cartilage layer but also the subchondral bone. For deep, osteochondral damage, as it occurs for example with osteochondrosis dissecans, the full thickness of the defect needs to be replaced to restore the joint surface 1. Eligible therapeutic procedures have to consider these two different tissues with their different intrinsic healing potential 2. In the last decades, several surgical treatment options have emerged and have already been clinically established 3-6.
Autologous or allogeneic osteochondral transplants consist of articular cartilage and subchondral bone and allow the replacement of the entire osteochondral unit. The defects are filled with cylindrical osteochondral grafts that aim to provide a congruent hyaline cartilage covered surface 3,7,8. Disadvantages are the limited amount of available grafts, donor site morbidity (for autologous transplants) and the incongruence of the surface; thereby the application of this method is especially limited for large defects.
New approaches in the field of tissue engineering opened up promising possibilities for regenerative osteochondral therapy. The implantation of autologous chondrocytes marked the first cell based biological approach for the treatment of full-thickness cartilage lesions and is now worldwide established with good clinical results even 10 to 20 years after implantation 9,10. However, to date, this technique is not suitable for the treatment of all types of lesions such as deep defects involving the subchondral bone 11.
The sandwich-technique combines bone grafting with current approaches in Tissue Engineering 5,6. This combination seems to be able to overcome the limitations seen in osteochondral grafts alone. After autologous bone grafting to the subchondral defect area, a membrane seeded with autologous chondrocytes is sutured above and facilitates to match the topology of the graft with the injured site. Of course, the previous bone reconstruction needs additional surgical time and often even an additional surgery. Moreover, to date, long-term data is missing 12.
Tissue Engineering without additional bone grafting aims to restore the complex structure and properties of native articular cartilage by chondrogenic and osteogenic potential of the transplanted cells. However, again, it is usually only the cartilage tissue that is more or less regenerated. Additional osteochondral damage needs a specific further treatment. In order to achieve a regeneration of the multilayered structure of osteochondral defects, three-dimensional tissue engineered products seeded with autologous/allogeneic cells might provide a good regeneration capacity 11.
Beside autologous chondrocytes, mesenchymal stem cells (MSC) seem to be an attractive alternative for the development of a full-thickness cartilage tissue. In numerous preclinical in vitro and in vivo studies, mesenchymal stem cells have displayed excellent tissue regeneration potential 13,14. The important advantage of mesenchymal stem cells especially for the treatment of osteochondral defects is that they have the capacity to differentiate in osteocytes as well as chondrocytes. Therefore, they potentially allow a multilayered regeneration of the defect.
In recent years, several scaffolds with osteochondral regenerative potential have therefore been developed and evaluated with promising preliminary results 1,15-18. Furthermore, fibrin glue as a cell carrier became one of the preferred techniques in experimental cartilage repair and has already successfully been used in several animal studies 19-21 and even first human trials 22.
The following protocol will demonstrate an experimental technique for isolating mesenchymal stem cells from a rabbit's bone marrow, for subsequent proliferation in cell culture and for preparing a standardized in vitro-model for fibrin-cell-clots. Finally, a technique for the implantation of pre-established fibrin-cell-clots into artificial osteochondral defects of the rabbit's knee joint will be described.

An experimental technique for the treatment of osteochondral defects in the rabbit's knee joint is described. The implantation of allogeneic mesenchymal stem cells into osteochondral defects provides a promising development in the field of tissue engineering. The preparation of fibrin-cell-clots in vitro offers a standardized method for implantation.

フィブリン塊における同種間葉系幹細胞の注入によってウサギの膝関節における骨軟骨欠損の治療

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular ...

医学

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and can be easily separated from the hematopoietic stem cells (HSCs) due to their plastic adherence. This protocol describes how to isolate MSCs from rat femurs and tibias. The isolated cells were further enriched against two MSCs surface markers CD54 and CD90 by magnetic cell sorting. Expression of surface markers CD54 and CD90 were then confirmed by flow cytometry analysis. HSC marker CD45 was also included to check if the sorted MSCs were depleted of HSCs. MSCs are naturally quite heterogeneous. There are subpopulations of cells that have different shapes, proliferation and differentiation abilities. These subpopulations all express the known MSCs markers and no unique marker has yet been identified for the different subpopulations. Therefore, an alternative approach to separate out the different subpopulations is using cloning cylinders to separate out single-colony derived cells. The cells derived from the single-colonies can then be cultured and evaluated separately.

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

Rat MSCs were isolated from femurs and tibias and then enriched by magnetic cell sorting. Sorted cells were confirmed for the expression of surface markers by flow cytometry. These cells were also cultured at clonal density to form single colonies and then these colonies were separated by cloning cylinders.

ラット間葉系幹細胞（MSC）とMSCを派生シングルコロニーの分離の分離と濃縮

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and ...

生物学

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

軟骨再生のための3次元磁気幹細胞凝集およびバイオリアクター成熟

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

生物工学

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

ミニブタの滑液および骨髄由来の間葉系幹細胞の単離および細胞表現型

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

CD146の単離<sup&gt; +</supラット肺から&gt;常駐肺間葉系幹細胞

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

血管壁からのマウスCD34+ 幹細胞の単離と磁気分離

Immunomagnetic Isolation of the Vascular Wall-Resident CD34+ Stem Cells from Mice

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury and repair. Establishing a stable and efficient method to culture functional murine CD34+ VW-SCs is essential for further investigating the mechanisms involved in the proliferation, migration, and differentiation of these cells under various physiological and pathological conditions. The described method combines magnetic bead screening and flow cytometry to purify primary cultured resident CD34+ VW-SCs. The purified cells are then functionally identified through immunofluorescence staining and Ca2+ imaging. Briefly, vascular cells from the adventitia of the murine aorta and mesenteric artery are obtained through tissue block attachment, followed by subculturing until reaching a cell count of at least 1 &#215; 107. Subsequently, CD34+ VW-SCs are purified using magnetic bead sorting and flow cytometry. Identification of CD34+ VW-SCs involves cellular immunofluorescence staining, while functional multipotency is determined by exposing cells to a specific culture medium for oriented differentiation. Moreover, functional internal Ca2+ release and external Ca2+ entry is assessed using a commercially available imaging workstation in Fura-2/AM-loaded cells exposed to ATP, caffeine, or thapsigargin (TG). This method offers a stable and efficient technique for isolating, culturing, and identifying vascular wall-resident CD34+ stem cells, providing an opportunity for in vitro studies on the regulatory mechanisms of VW-SCs and the screening of targeted drugs.

著者スポットライト:磁気ビーズスクリーニング結合フローサイトメトリーを使用した血管壁常在マウスCD34+ 幹細胞の分離と特性評価の強化

This study has established a stable and efficient method for the isolation, culture, and functional determination of vascular wall-resident CD34+ stem cells (CD34+ VW-SCs). This easy-to-follow and time-effective isolation method can be utilized by other investigators to study the potential mechanisms involved in cardiovascular diseases.

マウスからの血管壁常在型CD34+ 幹細胞の免疫磁気的単離

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury ...

磁気活性化細胞を分離し、滑膜液由来間葉系幹細胞が家兎モデルからの浄化戦略を並べ替え

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脂肪デポ固有のSca1の免疫磁気分離

ヒト心臓組織からの血管周囲多能前駆細胞集団の単離

フィブリン塊における同種間葉系幹細胞の注入によってウサギの膝関節における骨軟骨欠損の治療

ラット間葉系幹細胞（MSC）とMSCを派生シングルコロニーの分離の分離と濃縮

軟骨再生のための3次元磁気幹細胞凝集およびバイオリアクター成熟

ミニブタの滑液および骨髄由来の間葉系幹細胞の単離および細胞表現型

CD146の単離

マウスからの血管壁常在型CD34⁺ 幹細胞の免疫磁気的単離

マウスからの血管壁常在型CD34⁺ 幹細胞の免疫磁気的単離

マウスからの血管壁常在型CD34⁺ 幹細胞の免疫磁気的単離