この作品は、中国の国家自然科学基金 (許可番号 81570912、81771016、81100717) によって支えられました。

動物愛護と中国の首都医科大学の利用委員会のガイドラインによるとすべてのプロシージャと動物の手術を行った。
1. デバイスの準備
<ol><li>注入カニューレ (図 1 a) をするためには、ポリイミド チューブを接続 (内径 114.3 μ m、外径 139.7 μ m、長さ 3 ~ cm) ポリエチレン チューブに (内径 280 μ m、外径 640 μ m、長さ ~ 40 cm)。瞬間接着剤を使用して、少なくとも 3 つのアプリケーションとの接続をシールします。酸化エチレンと注入カニューレを消毒します。 注: 管を密閉する際は、ポリイミド チューブ、カニューレの閉塞になることができますを入力してから瞬間接着剤を防止します。ガス滅菌は、接続時の漏洩を引き起こす可能性があります少なくとも 3 回でチューブをシールします。</li>
	<li>30 G の針を使用して、食塩を含む 1 cc シリンジにポリエチレン管の端を接続します。通常生理食塩水で漏洩またはポリエチレン チューブ、ポリイミド チューブと接続で閉塞をチェックする 1 cc のシリンジでの注入によるカニューレを埋めます。 注: 漏れや接続の閉塞、カニューレが次の手順で使用できません。</li>
	<li>通常生理食塩水で 10 μ L のマイクロ注射器を避難し、注入カニューレと前述の 30 G 針に接続します。インジェクション ポンプ (図 1 b) にマイクロ シリンジをインストールします。射出速度を 0.5 μ L/分と高速グリーン色素と AAV8-GFP、1 μ L にボリュームまたはストレプトマイシンの 2 μ L を設定します。 注: 射出速度の推奨範囲は 0.1−0.5 μ L/分、および注入量の推奨範囲は 0.5−2 μ L。</li>
	<li>1 μ L にマイクロ シリンジを引き戻すし、試薬の注入を抽出します。通常の生理食塩水と注射剤 (図 1) の間に空気の隙間が形成されます。</li>
	<li>必要に応じてマーカーペンを使ってポリエチレン チューブのガス-液境界線の位置にラベルを付けます。これは、注入中に試薬の流れを監視する使用ことができます。</li>
</ol>2。 成体マウスの Canalostomy
<ol><li>成体マウスの麻酔 (女性、FVB/N、5、6 週齢) ケタミン塩酸 (120 mg/kg 腹腔内投与による、キシラジン塩酸 (7 mg/kg)。動物が痛みを伴う刺激 (つま先ピンチ反射) への応答を示さないまで 5−10 分間待ちます。麻酔後、予熱した電気パッドに動物を配置します。メロキシカム (1 mg/kg)、鎮痛薬は、手術の前に皮下に適用されました。</li>
	<li>眼軟膏と動物の目をカバーします。電気動物クリッパーと左後耳介領域を剃るし、75% エタノールで 3 回皮膚を消毒します。</li>
	<li>予熱した電気パッドに動物を配置します。~ 37 ° c. に電気パッドの温度を設定します。左耳の手術を容易にするために右側臥位に動物を配置します。</li>
	<li>1 1.5 cm 後耳介切開 〜 3 mm 左着けた溝 (図 2 a) を作る。</li>
	<li>位置決め (PSC) 後半規管、外側半規管 (LSC): PSC と LSC、通常 9 に 3 として原点と、calvarium に平行な平面として耳介 (図 2 bで大胆なドット) のルートを定義するとき〜 3 mm 2 と 3 (図 2 b) 耳介のルートをあります。</li>
	<li>にべもなく PSC と余白がはっきりと側頭骨 (図 2) の暗い縞として見える LSC を公開するマイクロ鉗子で頭骨を覆う筋肉を解剖します。LSC では、calvarium に平行な平面から角度を約 30 ° と PSC は、LSC (図 2) に垂直。マイクロ鉗子で筋肉の小片を収集し、乾燥させてください。次の手順でこの筋肉が穴をシールに使用されます。 注: は、筋肉への損傷を最小限にするために組織の過剰なテアリングを回避します。PSC (図 2 D) を公開するとき隣接する船の損傷を防ぐ。</li>
	<li>26 G 針 (図 2 D) を使用して PSC の真ん中の部分に小さな穴を作る。穴から液漏れは、PSC の骨の壁の成功浸透を示します。適切なサイズ、ポリイミド チューブの直径よりわずかに大きい穴を拡大します。 注: ドリルし、優しく、徐々 に穴を拡大、PSC の破壊を避けるために。</li>
	<li>胸水綿ペレットを使用して PSC の穴の周囲をクリーンアップします。</li>
	<li>1−2 mm (図 2 e) の深さに cru コミューンに向かって PSC に優しくポリイミド チューブの先端を挿入します。ポンプの '実行' ボタンを押して注射を開始します。</li>
	<li>注入後の拡散試薬 〜 2 分を待ちます。マイクロはさみで 2.6 ステップで収集され筋肉の小さな部分をトリミングします。次に、注入カニューレを削除し、すぐに PSC の穴に筋肉を配置します。 注: は、穴が完全に密封されていることを確認する接続した後穴から漏れる液体を確認します。</li>
	<li>区切られた筋肉と皮下組織を返します。5-0 縫合糸を使用して切開部を縫合します。ポビドン ヨードと切開の地域を消毒します。 注: 上記すべての手術は、約 25 分かかります。</li>
	<li>~ 37 ° C に予熱した電気パッド上に動物を配置します。右側臥位の回復のために動物を配置します。</li>
	<li>聴性脳幹反応 (ABR) の測定を行い、水泳のテスト18手術後 1 週間。</li>
	<li>必要な場合は、PSC や LSC の別の領域に繰り返し注射を実行します。</li>
</ol>3. 新生児マウス Canalostomy
<ol><li>低体温症を誘導し、生後 1、2 (P1-2) で新生児マウス (FVB/N) で鎮静を維持に使用してください。~ 4 分の砕いた氷のプラスチックのラップで覆われたベッドの上には、子犬を配置します。次に、氷で満たされたプラットフォームで子犬を置きます。75% エタノールで 3 回手術野を消毒します。 注: は、子犬の頭が氷のことを確認します。氷で満たされたプラットフォームで子犬と全体の手術を行います。</li>
	<li>次の手順で異なる大人のマウスと比較して新生児の。<ol>
<li>耳介の折り目に後方から ~ 2 mm 〜 3 mm 耳介後部切開を作る (図 3 a -B)。</li>
		<li>優しく 26 G 針を使用してソフトの PSC に開口部を作る。開口部を拡大せずに、PSC にカニューレを挿入 (図 3 -E)。</li>
		<li>注入後、ソフト PSC (図 3 f) の破壊につながることができます、後者として、開口部を接続するのではなく、カバー、筋の部分を使用します。</li>
		<li>6-0 縫合糸を使って皮膚を閉じます。</li>
		<li>ABR の測定を行い、P3030水泳のテスト。</li>
	</ol>
</li>
	<li>親の共食いは新生児手術後一般的な問題です。次の手順は、親の共食いの可能性を減らします。<ol>
<li>周囲のアルコール綿を使用して切開手術後血をクリーンアップします。</li>
		<li>新生児がダムに戻る前に自由に移動できることを確認します。</li>
		<li>新生児を母親のケージと新生児がゴミの真ん中に戻って配置から汚れた寝具に汚します。</li>
		<li>似たような耳介後部切開や縫合手術を受けるしないいずれかが表示されます。</li>
		<li>飼育ケージから男性を分離します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stachler, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice+guideline:+sudden+hearing+loss.">Clinical practice guideline: sudden hearing loss.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 146 (3 Suppl), S1-S35 (2012).</li><li>Lentz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+hearing+and+vestibular+function+by+antisense+oligonucleotides+in+a+mouse+model+of+human+deafness.">Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness.</a> Nat Med. 19 (3), 345-350 (2013).</li><li>Rivera, T., Sanz, L., Camarero, G., Varela-Nieto, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+delivery+to+the+inner+ear:+strategies+and+their+therapeutic+implications+for+sensorineural+hearing+loss.">Drug delivery to the inner ear: strategies and their therapeutic implications for sensorineural hearing loss.</a> Curr Drug Deliv. 9 (3), 231-242 (2012).</li><li>El Kechai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+local+drug+delivery+to+the+inner+ear.">Recent advances in local drug delivery to the inner ear.</a> Int J Pharm. 494 (1), 83-101 (2015).</li><li>Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., Lustig, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+method+for+virally+mediated+gene+delivery+to+the+mouse+inner+ear+through+the+round+window+membrane.">Surgical method for virally mediated gene delivery to the mouse inner ear through the round window membrane.</a> J Vis Exp. (97), e52187 (2015).</li><li>Ahmed, H., Shubina-Oleinik, O., Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Gene+Therapies+for+Genetic+Hearing+Loss.">Emerging Gene Therapies for Genetic Hearing Loss.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 18 (5), 649-670 (2017).</li><li>Murillo-Cuesta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Drug+Delivery+Methods+Targeted+to+the+Mouse+Inner+Ear:+Bullostomy+Versus+Transtympanic+Injection.">A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection.</a> J Vis Exp. (121), e54951 (2017).</li><li>Stevens, S. M., Brown, L. N., Ezell, P. C., Lang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mouse+Round-window+Approach+for+Ototoxic+Agent+Delivery:+A+Rapid+and+Reliable+Technique+for+Inducing+Cochlear+Cell+Degeneration.">The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration.</a> J Vis Exp. (105), e53131 (2015).</li><li>Salt, A. N., Plontke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+local+drug+delivery+to+the+inner+ear.">Principles of local drug delivery to the inner ear.</a> Audiol Neurootol. 14 (6), 350-360 (2009).</li><li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+hearing+in+the+VGLUT3+knockout+mouse+using+virally+mediated+gene+therapy.">Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy.</a> Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).</li><li>Pan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+restores+auditory+and+vestibular+function+in+a+mouse+model+of+Usher+syndrome+type+1c.">Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c.</a> Nat Biotechnol. 35 (3), 264-272 (2017).</li><li>Kilpatrick, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus-mediated+gene+delivery+into+the+scala+media+of+the+normal+and+deafened+adult+mouse+ear.">Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear.</a> Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).</li><li>Izumikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+hair+cell+replacement+and+hearing+improvement+by+Atoh1+gene+therapy+in+deaf+mammals.">Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals.</a> Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).</li><li>Chang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virally+mediated+Kcnq1+gene+replacement+therapy+in+the+immature+scala+media+restores+hearing+in+a+mouse+model+of+human+Jervell+and+Lange-Nielsen+deafness+syndrome.">Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome.</a> EMBO Mol Med. 7 (8), 1077-1086 (2015).</li><li>Chen, Z., Mikulec, A. A., McKenna, M. J., Sewell, W. F., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+intracochlear+drug+delivery+in+the+mouse.">A method for intracochlear drug delivery in the mouse.</a> J Neurosci Methods. 150 (1), 67-73 (2006).</li><li>Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+and+structural+outcome+of+inner+ear+gene+transfer+via+the+vestibular+and+cochlear+fluids+in+mice.">The functional and structural outcome of inner ear gene transfer via the vestibular and cochlear fluids in mice.</a> Mol Ther. 4 (6), 575-585 (2001).</li><li>Bowers, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin-3+transduction+attenuates+cisplatin+spiral+ganglion+neuron+ototoxicity+in+the+cochlea.">Neurotrophin-3 transduction attenuates cisplatin spiral ganglion neuron ototoxicity in the cochlea.</a> Mol Ther. 6 (1), 12-18 (2002).</li><li>Wang, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus-mediated+gene+transfer+targeting+normal+and+traumatized+mouse+utricle.">Adeno-associated virus-mediated gene transfer targeting normal and traumatized mouse utricle.</a> Gene Ther. 21 (11), 958-966 (2014).</li><li>Isgrig, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+Restores+Balance+and+Auditory+Functions+in+a+Mouse+Model+of+Usher+Syndrome.">Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome.</a> Mol Ther. 25 (3), 780-791 (2017).</li><li>Gassner, D., Durham, D., Pfannenstiel, S. C., Brough, D. E., Staecker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canalostomy+as+a+surgical+approach+for+cochlear+gene+therapy+in+the+rat.">Canalostomy as a surgical approach for cochlear gene therapy in the rat.</a> Anat Rec (Hoboken). 295 (11), 1830-1836 (2012).</li><li>Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+transgene+expression+after+adenoviral+vector+inoculation+in+the+endolymphatic+sac.">Inner ear transgene expression after adenoviral vector inoculation in the endolymphatic sac.</a> Hum Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).</li><li>Xia, L., Yin, S., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+gene+transfection+in+neonatal+mice+using+adeno-associated+viral+vector:+a+comparison+of+two+approaches.">Inner ear gene transfection in neonatal mice using adeno-associated viral vector: a comparison of two approaches.</a> PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).</li><li>Chien, W. W., McDougald, D. S., Roy, S., Fitzgerald, T. S., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+gene+transfer+mediated+by+adeno-associated+virus:+Comparison+of+two+surgical+approaches.">Cochlear gene transfer mediated by adeno-associated virus: Comparison of two surgical approaches.</a> Laryngoscope. 125 (11), 2557-2564 (2015).</li><li>Zhu, B. Z., Saleh, J., Isgrig, K. T., Cunningham, L. L., Chien, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+Loss+after+Round+Window+Surgery+in+Mice+Is+due+to+Middle+Ear+Effusion.">Hearing Loss after Round Window Surgery in Mice Is due to Middle Ear Effusion.</a> Audiol Neurootol. 21 (6), 356-364 (2017).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+postnatal+virus+inoculation+into+the+scala+media+achieved+extensive+expression+of+exogenous+green+fluorescent+protein+in+the+inner+ear+and+preserved+auditory+brainstem+response+thresholds.">Early postnatal virus inoculation into the scala media achieved extensive expression of exogenous green fluorescent protein in the inner ear and preserved auditory brainstem response thresholds.</a> J Gene Med. 15 (3-4), 123-133 (2013).</li><li>Lee, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+human+embryonic+stem+cells+implanted+in+the+guinea+pig+auditory+epithelium.">Survival of human embryonic stem cells implanted in the guinea pig auditory epithelium.</a> Sci Rep. 7, 46058 (2017).</li><li>Ishimoto, S., Kawamoto, K., Kanzaki, S., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+supporting+cells+of+the+organ+of+Corti.">Gene transfer into supporting cells of the organ of Corti.</a> Hear Res. 173 (1-2), 187-197 (2002).</li><li>Okada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+targeting+mouse+vestibule+using+adenovirus+and+adeno-associated+virus+vectors.">Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors.</a> Otol Neurotol. 33 (4), 655-659 (2012).</li><li>Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+gene+therapy+with+ancestral+AAV+in+adult+mice:+complete+transduction+of+inner+hair+cells+without+cochlear+dysfunction.">Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction.</a> Sci Rep. 7, 45524 (2017).</li><li>Guo, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochleovestibular+gene+transfer+in+neonatal+mice+by+canalostomy.">Cochleovestibular gene transfer in neonatal mice by canalostomy.</a> Neuroreport. 28 (11), 682-688 (2017).</li><li>Beyea, J. A., Agrawal, S. K., Parnes, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmastoid+semicircular+canal+occlusion:+a+safe+and+highly+effective+treatment+for+benign+paroxysmal+positional+vertigo+and+superior+canal+dehiscence.">Transmastoid semicircular canal occlusion: a safe and highly effective treatment for benign paroxysmal positional vertigo and superior canal dehiscence.</a> Laryngoscope. 122 (8), 1862-1866 (2012).</li><li>Naples, J. G., Eisen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+History+and+Evolution+of+Surgery+on+the+Vestibular+Labyrinth.">The History and Evolution of Surgery on the Vestibular Labyrinth.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 155 (5), 816-819 (2016).</li><li>Hamilton, L., Keh, S., Spielmann, P. M., Hussain, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+we+do+it:+locating+the+posterior+semicircular+canal+in+occlusion+surgery+for+refractory+benign+paroxysmal+positional+vertigo:+a+cadaveric+temporal+bone+study.">How we do it: locating the posterior semicircular canal in occlusion surgery for refractory benign paroxysmal positional vertigo: a cadaveric temporal bone study.</a> Clinical Otolaryngology. 41 (2), 190-193 (2016).</li><li>Jung, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+targeting+Hes5+augments+hair+cell+regeneration+in+aminoglycoside-damaged+mouse+utricle.">siRNA targeting Hes5 augments hair cell regeneration in aminoglycoside-damaged mouse utricle.</a> Mol Ther. 21 (4), 834-841 (2013).</li><li>Kamiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transplantation+accelerates+hearing+recovery+through+the+repair+of+injured+cochlear+fibrocytes.">Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes.</a> Am J Pathol. 171 (1), 214-226 (2007).</li><li>Pfannenstiel, S. C., Praetorius, M., Plinkert, P. K., Brough, D. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgene+expression+in+the+guinea+pig+cochlea+mediated+by+a+lentivirus-derived+gene+transfer+vector.">Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector.</a> Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).</li></ol>

利害の対立が宣言されていません。

本研究で我々 は canalostomy による薬物が蝸牛と前庭エンドの臓器全体で試薬の広範な分布の結果を示した。内耳遺伝子配達方法として canalostomy は、聴覚と前庭の機能に最小限のダメージで成人と新生児マウスの内側の耳の GFP 発現をもたらした。さらに、同じ動物の複数の注射を簡単に実行できます。
Canalostomy の最大の強みの 1 つは、成体マウス16,18,28,29,30のために重要である、特に内耳機能に与えるダメージを最小限を引き起こすということです、保護効果の評価については並進。いくつかのグループは、マウス内耳18,19,28,29にウイルスのベクトル、siRNA、幹細胞は、アミノグリコシド系などの様々 な試薬を提供するのに canalostomy を使用しています。 34,35,36,37。現在の研究では、成人および新生児マウスにおける canalostomy の手順を追って、詳細な手術手技について説明しました。前の調査と比較して、我々 の研究は、手術の成功のキーの手順である半規管の位置の追加詳細をします。図 2 bとCに示すように、PSC と LSC は 2-3 で耳介のルートから一般に 〜 3 mm でした。LSC は昨日、約 30 °、calvarium に平行な平面から角度し、PSC は、LSC に垂直。さらに、手術の手順を簡略化し、同等の結果29と約 25 分に手術時間を短縮します。
Canalostomy、中に、注射部位とカニューレの閉塞で漏れを避けるために不可欠です。ポンプに切り替え、前に、カニューレの先端が半規管に挿入されていると、カニューレの曲げまたはブロックされていないことを確認することが重要です。乾燥筋肉お勧めしますので、拡張し、プラグ穴半規管液の存在下で成体の半規管の穴をシールする際 (2.6 と 2.10 の手順を参照してください)。新生仔マウスの半規管の壁が柔らかく、壊れやすい、開口部をシールで覆って自家筋または医療接着剤30。我々 はまた筋肉; と開口部をカバーすることがなくカニューレを削除結果明らかに匹敵する AAV 伝達効率 (データは示されていない)、内耳には、新生仔マウスの PSC の開口部が十分に閉じられたことを示します。
Canalostomy の別の利点は、同じまたは別の試薬 (図 6) の反復的なアプリケーションを可能にする、複数のプロシージャの可能性です。線維化と肉芽組織は頻繁に以前の手術のサイトで見られると手術34後半規管が阻害されることがあります、横方向の別の領域に繰り返し手術中に注射を実行するお勧めおよび/または後部の半円形運河18。
Canalostomy の主な制限は、タイトジャンクショや内リンパ腔注入カニューレを挿入するかどうかを決定するの困難です。Canalostomy を介して内耳16にアデノ ウイルスのベクトルの投与後最も導入された細胞はタイトジャンクショ スペース、注射は、その領域で実行可能性がありますが示唆されたに位置していた。低分子量化合物 (例えば、AAV、ストレプトマイシン、siRNA) することができます外リンパと内リンパとの間の障壁を通過し、タイトジャンクショまたは内スペースの18,19 注入後感覚上皮に到達 ,34。ただし、外リンパへの注入後、外リンパと内リンパの16,,3940間の障壁を突き通すことができない場合、試薬はタイトジャンクショ空間に残ることがあります。したがって、canalostomy を使用する前に挿入された試薬の透過性を見なす必要があります。
結論としては、canalostomy は、聴覚と前庭の機能の影響を最小限と蝸牛と前庭の試薬の広範な分布の結果します。手術は成人と新生児マウスで簡単に実装し、必要に応じて、複数のプロシージャを実行することができます。Canalostomy 齧歯動物の内耳への薬剤投与の有効で安全なアプローチは、将来、人間 cochleovestibular 疾患を治療するために臨床的に使用される可能性があります、.

難聴と前庭機能障害に影響を与える患者の相当な数を密接に感音難聴内耳障害に関連付けられています。内耳への治療薬の配達は、内耳障害の治療のための約束を示しています。全身またはローカル アプローチは、内耳に薬を提供する使用できます。いくつかの内耳疾患は、突発性難聴、全身ステロイド1と扱われる一般的などの全身性の薬物投与による正常に扱われます。さらに、レンツらはアンチセンス オリゴヌクレオチドの全身投与は難聴を改善し、バランスの Ush1c 突然変異体マウス モデル2で機能することを示した。ただし、内耳疾患の大部分が効果的に扱われません全身投与による内耳の3,4薬へのアクセスを制限する血液迷路障壁のため。対照的に、局所薬物配送戦略は内耳障害をより効率的に扱うことができます。確かに、内耳は潜在的薬剤の局所投与; の理想的なターゲット1 サイトの拡散や注射後薬の普及を促進する液体でみたされている、それは比較的孤立した隣接臓器から副作用5,6を制限します。
局所薬物配送戦略鼓と intralabyrinthine のメソッドがあります。鼓の経路の有効性は大きく薬物透過 RWM3,4,7,8薬の滞留時間と丸い窓膜 (RWM) に依存します。したがって、薬物や、RWM を突き通すことができない試薬の配信に適したはありません。Intralabyrinthine 方法は、薬の高用量との広範な分布の結果、内耳に直接接種を含みます。ただし、intralabyrinthine 方法は繊細な手術を必要とし、侵略的、内耳機能へのダメージに 。現在、人間9で使用するため十分に安全であることは実証されていないと、intralabyrinthine 注射薬は動物実験でのみ使用されます。したがって、手術の手順を簡略化する必要がありますと怪我のリスク低減、クリニックに intralabyrinthine アプローチを翻訳します。
RWM5,10、11 scala メディア12,13,14スカラー座索注入による動物のいくつかの intralabyrinthine アプローチが評価され15,16、スカラー座附17、18,16,2019,半規管、および内リンパ嚢21。それぞれのアプローチには長所と短所6。RWM による配信は、新生児マウス5,22の非外科的です。ただし、軽度の聴力損失は RWM 注入23、中耳手術24後胸水のため後成体マウスで観察されます。感覚上皮を含む内の空間に直接試薬の注入が含まれます、Scala 媒体注入ターゲット エンド臓器12,14,の高い試薬濃度を実現します。25,26。 このアプローチ複雑な手順が必要ですし、生後 5 (P5) よりも後に実行された場合、聴覚閾値の有意な上昇の結果25,は27、そのアプリケーションを制限します。
Canalostomy は特に成体マウス16,18,28,29,30である内側の耳に与えるダメージを最小限を引き起こす intralabyrinthine の上記のアプローチと比較して、保護効果と並進の側面の評価にとって重要です。さらに、齧歯類では半規管は肺嚢胞手術を容易にし、手術中に中耳の障害を回避する以外にあります。クリニック、半規管の手術では、難治性良性発作性頭位めまい症31,32,33, canalostomy の臨床的可能性を示唆しているが使用されます。以来、まず、河本らによって記述されていた。マウス内耳18,19,28,29 にウイルスのベクトル、siRNA、幹細胞は、アミノグリコシド系などの様々 な試薬を提供する16年では、canalostomy が使用されています ,34,35,36,37。Canalostomy によるアデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターの接種感覚上皮における外来遺伝子の過剰発現と蝸牛と前庭エンドの臓器18,28,の一次ニューロンの特性を有効にする29,30。Canalostomy による遺伝子治療を有バランス機能を復元し、人間アッシャー症候群19、その canalostomy が cochleovestibular の遺伝的疾患に対する遺伝子治療の研究に有用のマウスモデルで聴覚を向上させます。Canalostomy による間葉系幹細胞の移植は、蝸牛線維細胞と急性の感音難聴の聴力損失35のラットモデルにおける聴力回復の再編成の結果します。また、前庭神経病変18,34,38, を確立する内耳にアミノグリコシド系抗生物質を導入する canalostomy を使用できます、18を必要な場合、複数の注射を実行できます。,34。
本稿で述べる、成人および新生児マウスにおける canalostomy 技術。緑色蛍光タンパク質 (GFP) 遺伝子 (AAV8-GFP) とストレプトマイシン、高速グリーン色素と AAV 血清型 8 (AAV8) などを含むさまざまな試薬を接種したマウス内耳 canalostomy 後即時および長期的な成果を評価するために。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polymide Tubing</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>823400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing</td>
			<td>Scientific Commodities Inc.</td>
			<td>BB31695-PE/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#956;l Microsyringe</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>80001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. Llc.</td>
			<td>X-1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Miroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Optical LLC.</td>
			<td>Pico</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forceps</td>
			<td>Dumont Dumostar</td>
			<td>10576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast-green Dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. Llc.</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV8-GFP</td>
			<td>BioMiao Biological Technology Co. Ltd (Beijing, China)</td>
			<td>20161101</td>
			<td>Titer: 2&#215;10e12 vg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. Llc.</td>
			<td>S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection Pump</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td>789100S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric Pad</td>
			<td>Pet Fun</td>
			<td>11072931136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 cc Syringe</td>
			<td>Mishawa Medical Industries Ltd. (Shanghai, China)</td>
			<td>2011-3151258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCL</td>
			<td>Gutian Pharmaceutical Co., Ltd. (Fujian, China)</td>
			<td>H35020148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric Animal Clipper</td>
			<td>Codos Electrical Appliances Co., Ltd. (Guangdong, China)</td>
			<td>CP-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Pellet</td>
			<td>Yatai Healthcare Ltd. (Henan, China)</td>
			<td>Yu-2008-1640081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. (Shanghai, China)</td>
			<td>Hu-2013-2650207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment</td>
			<td>Beijing Shuangji Pharmaceutical Ltd. (Beijng China)</td>
			<td>H11021270</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

canalostomy as a surgical approach to local drug delivery into the inner ears of adult and neonatal mice

内耳に治療薬の局所投与は、内耳疾患に対する有望な治療法です。半規管 (canalostomy) を注入は、内耳への薬剤の局所投与に有用なアプローチをする示されています。この記事の目的は、について、詳しく説明、成人と新生児の両方のマウスの canalostomy に関与する手技です。蝸牛と前庭のエンドの聴覚に損傷が少なく臓器で注入された試薬の広範な分布を容易に、canalostomy として高速グリーン色素と緑色蛍光タンパク質遺伝子をアデノ随伴ウイルス血清型 8 によって示されると前庭の機能。成人および新生児マウス; 手術が実施されました確かに、必要な場合は、複数の手術を実行でした。結論としては、canalostomy は成人および新生児マウス内耳に薬物送達への効果的かつ安全なアプローチで、将来的に人間の内耳疾患を治療に使用することがあります。

高速グリーンの色素は、成人および新生児マウス内耳における即時分布を評価するための PSC に注入されました。手術 (図 4) 直後後、蝸牛、前庭、半規管の中で染料が検出されました。
安全性と内耳遺伝子送達用 canalostomy の効率を評価するには、AAV8 GFP は成人および新生児マウス内耳に注入されました。すべての動物は、通常 ABR 閾値と AAV8 GFP 注入18,30後のテストの点数を水泳を展示しました。Immunohistology は、聴覚の感覚上皮、内有毛細胞 (Ihc) と、いくつか外有毛細胞 (内耳) 堅牢な GFP 発現30を示した基底のターンで、明らかにしました。前庭感覚上皮の卵形嚢、球形嚢、およびロレンチーニ30GFP 発現が検出されました。(図 5) 前庭有毛細胞と支持細胞の高効率18,30増殖型でした。
Canalostomy によるストレプトマイシンの注入は、卵形嚢18,34,38深刻な有毛細胞の損失を誘発します。Canalostomy を介して複数の注射の有効性をテストするには、マウスは PSC を通じて AAV8 GFP を懸濁液で 7 日間を後 LSC を通じてストレプトマイシンを与えられました。この実験は、HC 損失18後破損した内耳の遺伝子治療研究有用と考えられた AAV8 GFP の破壊の卵形嚢での伝達特性を評価するも設計されました。GFP は、破壊の卵形嚢 (図 6) 全体に分散されました。多数の GFP 陽性細胞はミオシン VIIA、彼らが導入されたことを示す陰性 SCs。未熟な毛束をいくつか HCs (ミオシン VIIa 陽性細胞) は、GFP を表明しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57351/57351fig1.jpg"> 図 1: デバイスの準備。(A)ポリイミド チューブ (i) と (ii) ポリエチレン チューブを作るために、注入カニューレ (iii) 密封します。(B)カニューレは 30 G 針と 10 μ L マイクロ注射器に接続し、ポンプのインストールします。矢印は、カニューレの先端を示しています。(C)注入試薬、生理食塩水入り空気ギャップで区切られます。<a href="/files/ftp_upload/57351/57351fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57351/57351fig2.jpg"> 図 2: アダルト マウスで Canalostomy。(A)後耳介切開 (矢印)。(B)側頭骨を覆う筋肉が公開されます。原点と平面として耳介 (大胆なドット) のルートを定義し、後半規管 (PSC) 3/9 としての並列、calvarium する時、外側半規管 (LSC) 2 と 3 (五芒星) の間の領域であります。、原点から 〜 3 mm。方向の挿入: 低倍率画像。点線は、calvarium 面を示します。(C) 、PSC、LSC が露出 (点線) です。Inset: LSC は、calvarium に平行な平面から角度を約 30 ° と PSC は、LSC に垂直。(D)小さな穴は、PSC で行われます。(PSC に E) カニューレの先端を挿入し、その試薬を注入します。(F)穴は筋肉の小片と密封されます。A スケール バーは 5 mm、B で 1 mm (B f B)、B にはめ込み式では 1 cm で、C にはめ込み、5 ミリメートル<a href="/files/ftp_upload/57351/57351fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57351/57351fig3.jpg"> 図 3: 新生児マウス Canalostomy.(A)後耳介切開 (矢印)。(B)は側頭骨を覆う筋肉は公開されて、後半規管 (PSC) は 2-3 (五芒星) で耳介 (大胆なドット) のルートから ~ 2 mm。向きは、成体マウス (図 2 b) と同じです。(C) 、PSC、外側半規管 (LSC) が公開されている (点線) です。(D)小さな開口部は、PSC で行われます。(E) カニューレは、PSC に挿入されます。(F)注入後に開口部をカバーする筋の小片を使用します。A のバーと B インセットが B で 1 ミリメートル、5 ミリメートル C は 1 mm (C C f) をスケールします。<a href="/files/ftp_upload/57351/57351fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57351/57351fig4.jpg"> 図 4: 大人の内側の耳のステレオ顕微鏡画像 (-') と新生児マウス (B B') canalostomy を介して高速グリーン色素を投与した。手術後すぐに採取しました。(A と B)頭蓋外表面。(A' と B')頭蓋表面。高速グリーンの色素は、蝸牛、前庭、半規管の中で配布しています。スケール バーは、1 mm (A' の A A 'と B' B b')。PSC は、後半規管。LSC、外側半規管。SSC は、優れた半規管。<a href="/files/ftp_upload/57351/57351fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57351/57351fig5.jpg"> 図 5: 蝸牛 (A") と成体マウスの卵形嚢 (B」) の全体のマウントの代表的な共焦点画像準備 canalostomy AAV8 GFP 注入後 30 日.サンプルと汚れる抗体 (緑) GFP とミオシン VIIa (赤)。(A")GFP は、最も内側の有毛細胞 (IHC) で表されます。(B」)卵形嚢のクチクラ プレートの焦点の面では、数多くの有毛細胞は GFP (矢印) を表現します。緑色蛍光タンパク質 GFP。OHC、外有毛細胞。スケール バーは 25 μ m (A"の A A」、B「B」の).<a href="/files/ftp_upload/57351/57351fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57351/57351fig6.jpg"> 図 6: トラウマの卵形嚢の代表的な共焦点画像 canalostomy AAV8 GFP 注入後 30 日を取得します。大人のマウスは外側半規管、後半規管を介して AAV8 GFP を注入後の 7 日間でストレプトマイシンを注射されました。GFP (緑)、ミオシン VIIa (赤)、およびアクチン (青)。AAV8 GFP 導入した代表的な支持細胞を示す矢印 (GFP + ミオシン VIIa 細胞)、矢印を示す代表的な有毛細胞に AAV8 GFP 導入と (GFP + ミオシン VIIa + 細胞) 未熟な毛束と。スケール バーは、20 μ m (A ~ D の D)。<a href="/files/ftp_upload/57351/57351fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

成人および新生児マウス内耳への薬剤の局所投与への外科的アプローチとしての Canalostomy

ここで我々 は聴覚と前庭の機能に最小限のダメージで半規管を介して成人および新生児マウスの内耳への薬剤の局所投与を可能にする canalostomy の手順をについて説明します。このメソッドは、マウス内耳へのウイルスのベクトル、医薬・小分子を接種する使用ことができます。

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

canalostomy-as-surgical-approach-to-local-drug-delivery-into-inner

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

10.6K ビュー.  Capital Medical University. ここで我々 は聴覚と前庭の機能に最小限のダメージで半規管を介して成人および新生児マウスの内耳への薬剤の局所投与を可能にする canalostomy の手順をについて説明します。このメソッドは、マウス内耳へのウイルスのベクトル、医薬・小分子を接種する使用ことができます。

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In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process requires multi-subunit DNA-dependent RNA polymerase (RNAP) and a series of transcription factors that act to modulate the activity of RNAP during gene expression. Sequencing gel electrophoresis of radiolabeled transcripts is used to provide detailed mechanistic information on how transcription proceeds and what parameters can affect it. In this paper we describe the protocol to study how the essential elongation factor NusA regulates transcriptional pausing, as well as a method to identify an antibacterial agent targeting transcription initiation through inhibition of RNAP holoenzyme formation. These methods can be used a as platform for the development of additional approaches to explore the mechanism of action of the transcription factors which still remain unclear, as well as new antibacterial agents targeting transcription which is an underutilized drug target in antibiotic research and development.

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

in vitro転写アッセイおよび創薬への応用

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

遺伝学

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

複数の蛍光によるインター染色体安定型異常の検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（mFISH）と照射されたマウスにおけるスペクトル核型分析（SKY）

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

誘導性一過性トランスフェクションを介して制御可能なイオンチャネルの発現

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. In recent years, miRNA-mediated gene regulation has shown potential for treatment of neurological disorders caused by a toxic gain of function mechanism. However, efficient delivery to target tissues has limited its application. Here we used a transgenic mouse model for spinal and bulbar muscular atrophy (SBMA), a neuromuscular disease caused by polyglutamine expansion in the androgen receptor (AR), to test gene silencing by a newly identified AR-targeting miRNA, miR-298. We overexpressed miR-298 using a recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype 9 vector to facilitate transduction of non-dividing cells. A single tail-vein injection in SBMA mice induced sustained and widespread overexpression of miR-298 in skeletal muscle and motor neurons and resulted in amelioration of the neuromuscular phenotype in the mice.

Here we describe the delivery of microRNA using a recombinant adeno-associated virus serotype 9 in a mouse model of a neuromuscular disease. A single peripheral administration in mice resulted in sustained miRNA overexpression in muscle and motor neurons, providing an opportunity to study miRNA function and therapeutic potential in vivo.

マイクロ Rna の齧歯動物の神経筋疾患を治療する遺伝子組換えアデノ随伴ウイルス血清型 9 を使用しての全身配信

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our entire society's ability to treat systemic infections. In the United States alone, antibiotic-resistant infections kill approximately 23,000 people a year and cost around 20 billion USD in additional healthcare. One approach to combat antimicrobial resistance is combination therapy, which is particularly useful in the critical early stage of infection, before the infecting organism and its drug resistance profile have been identified. Many antimicrobial treatments use combination therapies. However, most of these combinations are additive, meaning that the combined efficacy is the same as the sum of the individual antibiotic efficacy. Some combination therapies are synergistic: the combined efficacy is much greater than additive. Synergistic combinations are particularly useful because they can inhibit the growth of antimicrobial drug resistant strains. However, these combinations are rare and difficult to identify. This is due to the sheer number of molecules needed to be tested in a pairwise manner: a library of 1,000 molecules has 1 million potential combinations. Thus, efforts have been made to predict molecules for synergy. This article describes our high-throughput method for predicting synergistic small molecule pairs known as the Overlap2 Method (O2M). O2M uses patterns from chemical-genetic datasets to identify mutants that are hypersensitive to each molecule in a synergistic pair but not to other molecules. The Brown lab exploits this growth difference by performing a high-throughput screen for molecules that inhibit the growth of mutant but not wild-type cells. The lab's work previously identified molecules that synergize with the antibiotic trimethoprim and the antifungal drug fluconazole using this strategy. Here, the authors present a method to screen for novel synergistic combinations, which can be altered for multiple microorganisms.

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistic drug combinations are difficult and time-consuming to identify empirically. Here, we describe a method for identifying and validating synergistic small molecules.

重複2法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus allowing a single investigator to screen more treatments or conditions over the same amount of time without loss of data quality. The method requires common equipment found in most laboratories working with C. elegans and is thus simple to adopt. The approach centers on assaying independent samples of a population at each observation point, rather than a single sample over time as with traditional longitudinal methods. Scoring entails adding liquid to the wells of a multi-well plate, which stimulates C. elegans to move and facilitates quantifying changes in healthspan. Other major benefits of the Replica Set method include reduced exposure of agar surfaces to airborne contaminants (e.g. mold or fungus), minimal handling of animals, and robustness to sporadic mis-scoring (such as calling an animal as dead when it is still alive). To appropriately analyze and visualize the data from a Replica Set style experiment, a custom software tool was also developed. Current capabilities of the software include plotting of survival curves for both Replica Set and traditional (Kaplan-Meier) experiments, as well as statistical analysis for Replica Set. The protocols provided here describe the traditional experimental approach and the Replica Set method, as well as an overview of the corresponding data analysis.

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Here we describe the Replica Set method, an approach to quantitatively measure C. elegans lifespan/survival and healthspan in a high-throughput and robust manner, thus allowing screening of many conditions without sacrificing data quality. This protocol details the strategy and provides a software tool for analysis of Replica Set data.

レプリカの設定方法: 定量的測定線虫の寿命を高スループット方法

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is inherently a single-cell assay, however prior to molecular analysis, the target cells are often prospectively isolated in bulk, thereby losing single-cell resolution. Single-cell gene expression analysis provides a means to understand molecular differences between individual cells in heterogeneous cell populations. In bulk cell analysis an overrepresentation of a distinct cell type results in biases and occlusions of signals from rare cells with biological importance. By utilizing FACS index sorting coupled to single-cell gene expression analysis, populations can be investigated without the loss of single-cell resolution while cells with intermediate cell surface marker expression are also captured, enabling evaluation of the relevance of continuous surface marker expression. Here, we describe an approach that combines single-cell reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) and FACS index sorting to simultaneously characterize the molecular and immunophenotypic heterogeneity within cell populations.
In contrast to single-cell RNA sequencing methods, the use of qPCR with specific target amplification allows for robust measurements of low-abundance transcripts with fewer dropouts, while it is not confounded by issues related to cell-to-cell variations in read depth. Moreover, by directly index-sorting single-cells into lysis buffer this method, allows for cDNA synthesis and specific target pre-amplification to be performed in one step as well as for correlation of subsequently derived molecular signatures with cell surface marker expression. The described approach has been developed to investigate hematopoietic single-cells, but have also been used successfully on other cell types.
In conclusion, the approach described herein allows for sensitive measurement of mRNA expression for a panel of pre-selected genes with the possibility to develop protocols for subsequent prospective isolation of molecularly distinct subpopulations.

Bulk gene expression measurements cloud individual cell differences in heterogeneous cell populations. Here, we describe a protocol for how single-cell gene expression analysis and index sorting by Florescence Activated Cell Sorting (FACS) can be combined to delineate heterogeneity and immunophenotypically characterize molecularly distinct cell populations.

組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast permitting in vivo phenotypic analysis. This method does not rely on maize transformation but exploits microbial genetics and secretory capabilities of pathogens. Herein, it allows inspection of in vivo delivered secreted proteins with high spatiotemporal resolution at different kinds of infection sites and tissues. The Trojan horse strategy can be utilized to transiently complement maize loss-of-function phenotypes, to functionally characterize protein domains, to analyze off-target protein effects, or to study onside protein overdosage, making it a powerful tool for protein studies in the maize crop system. This work contains a precise protocol on how to generate a Trojan horse strain followed by standardized infection protocols to apply this method to three different maize tissue types.

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

This work describes the cloning of an Ustilago maydis Trojan horse strain for the in situ delivery of secreted maize proteins into three different types of maize tissues.

トロイの木馬として経路を用いたトウモロコシ蛋白質場配信で

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

MRNA の構造変化を誘導培養と細胞の形で使用して小分子を調査するには

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the differentiation of hiPSCs derived from a patient with the triplication of the alpha-synuclein gene (SNCA) locus into Parkinson&#8217;s disease (PD)-relevant dopaminergic neuronal populations. Accumulating evidence has shown that high levels of SNCA are causative for the development of PD. Recognizing the unmet need to establish novel therapeutic approaches for PD, especially those targeting the regulation of SNCA expression, we recently developed a CRISPR/dCas9-DNA-methylation-based system to epigenetically modulate SNCA transcription by enriching methylation levels at the SNCA intron 1 regulatory region. To deliver the system, consisting of a dead (deactivated) version of Cas9 (dCas9) fused with the catalytic domain of the DNA methyltransferase enzyme 3A (DNMT3A), a lentiviral vector is used. This system is applied to cells with the triplication of the SNCA locus and reduces the SNCA-mRNA and protein levels by about 30% through the targeted DNA methylation of SNCA intron 1. The fine-tuned downregulation of the SNCA levels rescues disease-related cellular phenotypes. In the current protocol, we aim to describe a step-by-step procedure for differentiating hiPSCs into neural progenitor cells (NPCs) and the establishment and validation of pyrosequencing assays for the evaluation of the methylation profile in the SNCA intron 1. To outline in more detail the lentivirus-CRISPR/dCas9 system used in these experiments, this protocol describes how to produce, purify, and concentrate lentiviral vectors and to highlight their suitability for epigenome- and genome-editing applications using hiPSCs and NPCs. The protocol is easily adaptable and can be used to produce high titer lentiviruses for in vitro and in vivo applications.

Targeted DNA epigenome editing represents a powerful therapeutic approach. This protocol describes the production, purification, and concentration of all-in-one lentiviral vectors harboring the CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene for epigenome-editing applications in human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons.

レンチウイルスベクター人間にエピゲノム編集ツールの効率的な配信用誘導多能性幹細胞由来の疾患モデル

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...