この作品は、J.C.S.B. にユタ大学の病理からのスタートアップ助成金によって支えられました。

1. 重複2法 (O2M) による化学遺伝学データセットから相乗効果予測の突然変異を識別します。
注: これはニコルズらから公開されたデータセットを使用したシナジー予測変異を識別する方法です。17 大腸菌。ただし、これは任意の化学遺伝学データセットや微生物を行うことができます。これらのデータ セットには、各変異体それぞれの小さな分子の量的成長スコアを与える以上 100 の小さな分子の存在下で成長してノックアウト変異のライブラリが含まれています。知られなければ 1 つ相乗ペアと、データセットに含まれる両方の小さい分子の成長スコアする必要があります。
<ol><li>
各小分子の単一濃度の存在下で成長してすべての突然変異体の平均成長スコアと標準偏差を計算します。 メモ: これは実行することができます、スプレッドシート ソフトウェアを使用します。ブラウンの実験室を使用して、Excel や関数 =AVERAGE(B3:B3981) および小分子の各列の計算のための =STDEV(B3:B3981)。<ol>
<li>別のデータセットを使用している場合、この方向が異なる可能性がありますが、手段と小分子の各列からの標準偏差を計算します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>・ ニコルズらから同じデータセットを使用した小分子の各濃度の Z スコアを計算します。スプレッドシート プログラムで17 。このため、負の z スコアになります Z(2.5) = 意味 - 2.5 * 標準偏差と正の z スコア Z(2.5) になります = 平均 + 2.5 * 標準偏差。</li>
	<li>遺伝子変異体を含むそれらの分子のすべての濃度を確認されている既知の相乗ペアを作る小さな分子で重要な Z スコアを決定します。否定的な Z (2.5) 未満の変異体のスコアは、成長スコアまたはその小さな分子のための肯定的な Z (2.5) のスコアをより大きく、重要なと見なされます。</li>
	<li>オペロンに属している重大な遺伝子変異体のいずれかを決定します。 注:エシェリヒア属大腸菌、著者チェックお勧めします「Ecoli wiki」の情報について遺伝子がコードする RNA の一部として書き換えられます。</li>
	<li>異なる濃度で興味の小さい分子の大部分に共通する遺伝子/オペロン変異体を特定 (e.g抗生物質のトリメトプリムと相乗作用分子を識別する重要な Z を示す変異体を探しているとき、。スコア トリメトプリムとスルファメトキサゾールなど sulfamethizole 知られている相乗パートナーの存在下で育てられたとき)。これらは推定上シナジー予測変異体です。</li>
</ol>2. O2M によって化学遺伝学データセット内の Synergizers の予測
<ol><li>データセット17に戻ると、シナジー予測突然変異体から大きな成長スコアを引き出す小さな分子の各濃度を特定します。これは、Z スコアの小さい分子の各濃度の計算を見ることによって行われます。もう一度、大きな成長スコアは小分子の濃度の正の Z スコアを超える負の Z スコアよりも小さいかです。 注: 分子は、1 つでもその濃度に表示されている場合は、予測 synergizer が分子で見なされます。大きな成長スコアは発生しませんすべての分子は、予測非 synergizer です。</li>
</ol>3. 予測の相乗作用の検証
<ol><li>予測 synergizers の最小発育阻止濃度 (MIC) を見つけます。
	<ol>
<li>M9 最小媒体を 37 ° C での大腸菌の一晩の文化を育てる 注: 任意の一晩の文化は興味の有機体のための適切に定義された媒体で栽培できます。ブラウンの実験室では、LB や YPD のようなリッチ メディアは推奨しません。M9 最小媒体で構成される 10.5 g/L M9 スープ 0.2% カザミノ酸、0.1 M CaCl20.4% グルコース、1 M MgSO40.25% ニコチン酸 0.33% チアミン H2o.</li>
		<li>MIC データの関心の病原体は小分子を受け取ったら文学溶解する場合ないジメチルスルホキシド (DMSO) で高濃度 (> 10 mg/mL)。</li>
		<li>96 ウェル プレートで、M9 媒体の 100 μ L を各ウェルに追加します。200 μ L の合計が含まれていますので、M9 媒体の余分な 100 μ L を列 1 に追加します。</li>
		<li>1 列目の集中の小分子ソリューションの任意の量 (~ 10 μ L) を追加します。列 1 (プレートごと 8 小分子) の井戸あたり 1 つの小さい分子。 注: これらは相乗効果と予測されている関心の小さな分子です。ブラウンの実験室は一般に大腸菌を抑制することができます 100 %dmso 量以下である高濃度低分子溶液 10 μ L を追加します。</li>
		<li>小さな分子を追加すると、プレートの x 軸では小分子を希釈します。1 列からソリューションの 100 μ L を取る、2 列の配置し、混ぜます。列 2 から 100 μ L を取るの 3 列配置し、混ぜます。100 μ L は 11 の列に配置されるまで、このプロセスを続けます。ミックス 11 列、その列から 100 μ L を取るし、破棄します。データを正規化するだけのメディアで 12 列をまま。</li>
		<li>プレートを接種します。一晩かけて培養から光学濃度 (OD600) を取得します。文化と 0.002 の OD600 M9 メディア ソリューションを準備 (または興味の目的の有機体のための 500 細胞/μ L を表す濃度を適切な)。ウェルあたり 1000 個の細胞がありますので、プレートの各ウェルに培養液 2 μ L をピペットします。</li>
		<li>優しくプレートを振るし、読んで 0 h の OD600を取得します。24 時間取得を読んで 24 時間外径600の 37 ° C で成長板ができます。 注: 適切な関心を持つ他の有機体の条件を成長しています。</li>
		<li>よくスプレッドシート プログラムを使用してそれぞれの純成長率を計算します。</li>
		<li>取得平均ない薬成長する 12 柱の純成長率を平均します。スプレッドシート ソフトウェアを使用していない薬剤成長のなかに他の井戸を正規化します。10% 未満で、よく探して、MIC90 を識別するために成長します。50% 未満でも成長を示します、MIC50。これらの井戸で小さな分子の濃度を計算します。</li>
	</ol></li>
	<li>相乗作用の市松模様の試金
	<ol>
<li>前に、として M9 最小媒体のエシェリヒア属大腸菌の一晩の文化を育てます。 注: 適切な成長する他の有機体のための条件。</li>
		<li>M9 媒体の 100 μ L を各ウェルの 96 ウェル プレートと 1 列目の余分な 100 μ L に追加します。</li>
		<li>テスト小分子を追加 (~ 8 時マイク x) 各列 1 でよく、濃度 2 倍を追加 (~ 16 マイク x) も A1 に (1 つの小さな分子テスト プレートごと)。 注: この金額マイク テスト完了前から決定され、それぞれの潜在的な synergizer は異なります。</li>
		<li>X 軸の列 1 から 100 μ L を取り、列 2 に転送することによってグラデーションの希釈を作成します。11 列に 100 μ L を追加するまで、このプロセスを続けます。ミックス、列 11 から 100 μ L を取るし、処分します。12 (図 1 a) の列に任意の薬物を追加しないでください。</li>
		<li>入力の薬を y 軸に 2 つ目の薬のグラデーションを設定します。A. ミックスの行入力分子のマイクと行 A および B. 続行に 100 μ L が g. ミックスの行に配置されるまでを置くことから前に、希釈として、100 μ L x 2 を含むメディアの 100 μ L を追加、100 μ L と dispose をように行秀の任意入力の薬剤を追加これにより、H の行と列 (図 1 b) テスト薬ペアの個々 のマイクを含む 12。</li>
		<li>プレートを接種します。外径600 0.002 の大腸菌培養の 2 μ L を各ウェル (ウェルあたり 1,000 セル) に追加します。</li>
		<li>0 h 読書用プレートの各ウェルの OD600を測定します。</li>
		<li>37 ° C で 24 時間のプレートを孵化させなさい</li>
		<li>24 h での OD600を測定します。</li>
	</ol></li>
	<li>チェッカー ボードから小数の発育阻止濃度指数 (FICI) を計算します。
	<ol>
<li>スプレッドシート プログラムで 24 h で OD600 0 h 外径600を減算することによって、プレートの各ウェルの純成長率を計算します。</li>
		<li>除して各も H12 は、小分子が含まれていないソフトウェアの成長を正常化します。</li>
		<li>12 欄入力分子の MIC90 と行英に潜在的なレチノイドシナジストの MIC90 を見つける</li>
		<li>90% の成長を阻害するすべての井戸を探します。</li>
		<li>いずれか最も低い (相乗) 以下よくのため FICI90 を計算または最高 (拮抗) 上記方程式を使用して、両方の MIC90 値。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57241/57241eq1.jpg">
</li>
		<li>任意 FICI ≤ 0.5 として相乗効果を検討、FICI ≥ 4 拮抗 (図 2)。 注: これも行えます MIC50 と (成長の 50% 阻害) それらの MIC の値に基づいて、FICI50 を取得します。</li>
	</ol></li>
	<li>ブリス独立アッセイ 注: 至福の独立は、独自に、マイクを持っていなかったすべての潜在的なレチノイドシナジストが実行されます。<ol>
<li>37 ° C で M9 媒体のエシェリヒア属大腸菌の一晩文化を前に成長します。 注: 再度、関心を持つ他の有機体の適切な成長条件使用できますこの手順で。</li>
		<li>潜在的な相乗的分子、入力分子、組み合わせ、および無処理コントロール テストの 96 ウェルのプレートを準備します。</li>
		<li>M9 媒体の 50 μ L を各ウェルに追加することによって潜在的なレチノイドシナジスト プレートを作成します。行の各ウェルに、潜在的なレチノイドシナジストの設定濃度 (10 μ M または 100 μ M) を含むメディアの 50 μ L を追加します。プレートごと 8 分子をテストします。</li>
		<li>メディアの 50 μ L を各ウェルに追加することによって入力分子プレートを作成します。4 x を含む 50 μ L を追加 1 列目のウェルに入力薬剤の MIC。マイク板、列 1 から 50 μ L を取り、分散、2 カラムで混合する x 軸に沿ってグラデーション希釈を作成します。列、12 列 12 から 50 μ L を破棄までこのプロセスを続行します。各ウェルの最後の合計は 100 μ L 各ウェルにメディアの追加の 50 μ L を追加します。</li>
		<li>96 ウェル プレートを使用したコンビネーション プレートの作成、メディアの 50 μ L を各ウェルに追加します。4 x を含む 50 μ L を追加 1 列目のウェルに入力薬剤の MIC。X 軸のマイク プレート、列 1 から 50 μ L を取り、分散、列 2 の混合のように希釈します。これは列、12 列 12 から 50 μ L を破棄に全体の方法を続けます。10 μ M または行の各ウェルに 100 μ M で潜在的なレチノイドシナジストを含むメディアの 50 μ L を追加します。もう一度、1 つの濃度または行ごと薬する必要があります。</li>
		<li>無処理コントロールを作成するには、プレートのすべての井戸に M9 媒体の 100 μ L を追加します。</li>
		<li>前に各同様に 0.002 や 1000 個の細胞の OD600細菌培養の 2 μ L を追加することによってすべてのプレートを接種します。</li>
		<li>0 から 24 h での OD600を測定します。</li>
	</ol></li>
	<li>至福の独立性スコアを計算します。
	<ol>
<li>スプレッドシート プログラムを使用して 24 h に成長から 0 h 外径600を減算することによって、プレートの各ウェルの純成長率を計算します。</li>
		<li>スプレッドシート プログラムでない薬板から平均成長率に井戸を正規化します。</li>
		<li>表計算ソフトを使用して、1 から純増を差し引くことによって阻害を計算します。</li>
		<li>表計算ソフトで入力のグラデーションのみを含む制御板の列を平均します。</li>
		<li>式により各ウェルのブリス スコアを計算します。 至福のスコアも X を組み合わせる- (よく X + 入力列 X) =
</li>
		<li>入力の MIC90 の下の井戸で負のスコアを探してください。 注: 複数の濃度間で負のスコアの相乗作用を示します。</li>
	</ol></li>
</ol>4. 高スループット画面新規相乗ペアを識別するシナジー予測変異
<ol><li>
シナジー予測変異体を特定します。 注: ステップ 1.5 には、推定されるシナジー予測変異が識別されます。ここでは、相乗効果の薬剤のための高スループット画面で最高機能するこれらの変異体を決定します。Bioscreen マシンでこのアッセイを行ったが、96 well プレート リーダーは許容する必要があります。<ol>
<li>各推定シナジー予測変異体と野生型細胞 M9 最小媒体を成長します。</li>
		<li>100 の設定も適切な成長媒体、成長培地 + 入力薬、成長培地 + 入力薬物と成長培地 + 知られていた非相乗薬剤知られている相乗パートナー プレート (または 96 ウェル プレート) をハニカムします。車両のコントロールを含めることを確認します。 注: 各ひずみ/薬/集中のための井戸を複製 4 をお勧めします。</li>
		<li>まあ、空白制御井戸を含むあたり 1000 個の細胞を接種します。</li>
		<li>37 ° c、振動、48 h を成長し、OD600 20 分毎を読みます。</li>
		<li>予測入力の薬と知られている相乗パートナーの存在下で変異細胞に野生型との相乗効果の最大の成長の違いを示す薬物濃度と時間のポイントを決定します。最適な時点で濃度、べきである多く成長違い野生型と相乗効果予測変異細胞 (図 3) の入力の薬物と相乗的行動に知られている薬の存在下で成長しました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
相乗効果の薬剤のための高スループット画面
	<ol>
<li>野生型細胞とシナジー予測変異細胞 M9 最小媒体を成長します。 注: は、関心の有機体の適切な成長媒体を使用します。</li>
		<li>ライブラリからメディアにそれぞれを前の手順で設定濃度で低分子 100 μ L メディアが含まれる薬を追加します。(セル) を持たない空井戸などの車両コントロールと井戸 (e.g。、DMSO) 薬剤希釈車両によって任意の成長の抑制を考慮します。<ol>
<li>プレート、よく位置の影響を考慮して板に理想的に散在しているあたり、少なくとも 4 つの車両制御井戸を準備します。試金は変数である場合、行/列あたりも、少なくとも 1 つの車両の制御を含めるし、全体板 (ステップ 4.2.5) の代わりに各の行/列の Z スコアを計算するコントロールとしてよく行/列の各コントロールを使用します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>前に各同様に文化の 2 μ L を追加します。(野生型細菌と予測シナジー変異バクテリア用プレート 1 枚用プレート 1 枚)。</li>
		<li>クリプトコッカスに対する 0 と 18 h大腸菌または 48 h で OD600を評価します。</li>
		<li>表計算ソフトを使用して、車両制御井戸から空白の井戸の OD600を引いて純成長率を計算します。Z スコアが-2.5 の井戸を識別 (Z スコア = 平均 - 2.5 * 標準偏差)。これらの井戸には、潜在的なレチノイドシナジスト小分子が含まれています。</li>
		<li>手順 3 で説明した方法を使用して画面のヒットを検証します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

相乗効果の小さい分子のペアは、微生物感染症の治療に強力なツールをすることができますまだ彼ら相乗ペアが識別するために挑戦的なのでその完全臨床的可能性に達していません。本稿では、シンプルなペアの組み合わせよりもはるかに高速の相乗組み合わせを識別するためのメソッドについて説明します。化学遺伝学データセットを使用して、O2M は相乗的組み合わせを予測するために小分子の画面サイズの大きなライブラリに読み出しとして使用することができます遺伝子ノックアウトと変異を識別します。小さな分子を予測する能力は相乗パートナーの大規模識別のため順番に画面の高いスケーラビリティのためことができます。相乗ペアを識別した後 1 つは、分子機構の基になる相乗作用を解明し、追加相乗ペア11の合理的設計できます。
O2M は、化学遺伝学的データセットと知られている相乗ペアに必要です。幸いにも、化学遺伝学データセットはさまざまな微生物19,20,21共通です。ブラウンの実験室は以前、O2M は正常にクリプトコッカスと大腸菌の両方11,12の相乗のペアを見つけることができる示した。これは、広範な影響 O2M は、様々 な生物に広く適用されているスケーラブルな方法を示します。O2M 相乗ペアの一般的な識別のための貴重なツールになり、比較的同様の結果と異なる微生物の成長のため、ここに記載されているすべての手順を変更できます。いくつかの他のグループは異なる解析手法による化学遺伝学のデータセットの相乗的な組み合わせを識別する O2M にこれらのメソッドのいずれか少なくともプログラミングの知識が必要ですが。各メソッドは、異なる相乗抗生物質や抗真菌薬18,22,23,24, 相乗のペアの数が多いまま発見されることを示唆しているのセットを識別します。O2M その他シナジー予測方法が識別する癌薬の組み合わせを含む哺乳類のシステムに適用できる可能性も。
合計では、このメソッドは、化学遺伝学データセットから相乗的組み合わせは、画面を高速な方法をについて説明します。このメソッドは、他のクリニックでより現実的な治療選択肢になる相乗効果のペアを助けます。また、O2M の高速かつ一般的な方法それを裏付ける貴重なツール相乗小分子のペアを求めるとき。

抗生物質耐性菌は、1CDC によると米国の毎年以上 200 万感染症や 23,000 の死を引き起こします。新しい治療法は、これらの感染症を克服するために必要です。これらの新しい治療法を特定する戦略には、新しい抗菌薬の開発や小さな分子微生物感染症2,3、4を治療するために他の条件のために承認の転用が含まれます。しかし、新しい薬剤の発見は非常に高価な時間のかかるです。新薬を識別できないことがあります薬を転用または薬剤ターゲット5,6。私たちの研究室は、相乗的組み合わせ療法として知られている 3 番目の戦略について説明します。相乗的な組み合わせは、2 つの小さい分子は一緒に彼らの個々 の効能7の添加効果より大きい薬効を持つ場合に発生します。さらに、相乗的な組み合わせすることができますレンダリングすること偉大な潜在的な8,9、以下の不要なオフターゲット効果だけでなくペアの小さな分子のいずれかに耐性病原体に対して有効であります。 10。
相乗ペアは、薬物の組み合わせ11,12,13の約 4-10% に発生するまれな。このように、ペアワイズ画面などの伝統的な技法、挑戦的な 100 分子の小さなライブラリからの潜在的な組み合わせの何千もの時間がかかる。さらに、相乗作用通常予測できない化合物14の活動から。ただし、相乗的組み合わせは、重複2メソッド (O2M)12と呼ばれる画面に高スループットのアプローチを開発しました。このメソッドは、ここで説明はこれらの相乗のペアをより速くより効率的な識別するためことができます。O2M は、知られている相乗ペアと化学遺伝学データセットの使用を必要とします。ノックアウト変異体のライブラリは、多くの異なる小さな分子の存在下で育てられたとき、化学遺伝学データセットが生成されます。その同じ突然変異体の表現型を引き出す他の小さな分子が既知の各メンバーと相乗効果も知られている相乗ペアで 1 つの分子が 2 番目の相乗的分子として特定ノックアウト変異体から同じ表現型を引き起こす場合相乗のペア。この根拠は、相乗抗生物質ペアエシェリヒア属大腸菌 (E. 大腸菌)に対してアクティブと病原性の真菌クリプトコッカス ・ ネオフォルマンス(c. に対してアクティブな相乗的抗真菌薬のペアを識別するブラウンの実験室で使用されていますネオフォルマンス)11,12。O2M は様々 な病原体に適応できるだけでなく、分子の大規模なライブラリのスクリーニングは、簡単かつ迅速に相乗のペアを識別します。O2M によって識別される遺伝的変異スクリーニングの相乗効果の予測小さな分子のみを検証することができます。したがって、あった場合のみ 20 分子の相乗効果を予測したライブラリで、今相乗効果の試験日の問題を受け取る一方で、2,000 分子ライブラリーのペアワイズ テストと、月がかかるでしょう。O2M は、プログラミングスキルは不要、必要な機器はほとんどのラボや中核施設で利用可能です。薬の組み合わせに興味がある研究者に加えて O2M 分析薬物画面が完了し、重要な薬物相互作用を識別することによって彼らのヒット曲を拡大したい人誰にも興味深いものです。以下、細菌、相乗効果の小さい分子を識別するだけでなく、よく知られている試金15,16の予測の相乗作用を検証するプロトコルです。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="520">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:179px;">Bioscreen C</td>
			<td style="width:88px;">instrument</td>
			<td style="width:136px;">Growth Curves USA</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy H1</td>
			<td>instrument</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9 broth</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J863-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Casamino Acids</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1424-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-10KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinic Acid</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12683</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiamine</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>148991000</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2 Dihydrate</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4 Heptahydrate</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chemical-genetics dataset</td>
			<td>dataset</td>
			<td>examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trimethoprim (example input drug; any can be used)</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19552701</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sulfamethoxazole (example test drug; any can be used)</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN15671125</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput identification of synergistic drug combinations by the overlap2 method

抗菌薬は20 世紀に劇的に寿命や生活の質を増加している、抗菌薬耐性は、全身性の感染症を治療するために私たちの社会全体の能力を脅かしています。単独で米国で抗生物質耐性感染症は年とコスト追加医療で約 200 億米ドル約 23,000 人を殺します。抗菌薬耐性に対処する方法の 1 つは療法前に感染源の生物とその薬剤耐性プロファイルが確認されている感染症の重要な初期段階で特に有用であります。多くの抗菌薬治療は併用療法を使用します。しかし、これらの組み合わせのほとんどは、添加剤、結合された効果は個々 の抗生物質の効果の合計と同じであることを意味します。いくつかの併用療法は相乗効果: 結合された効果は添加物よりもはるかに大きい。相乗的な組み合わせは、抗菌薬耐性菌の成長を抑えることができますので特に便利です。ただし、これらの組み合わせが珍しいとを識別することは困難です。これはペアの方法でテストするために必要な分子の膨大な数によるもの: 1,000 分子のライブラリには 100 万の潜在的な組み合わせ。したがって、相乗効果のための分子を予測する努力がされました。この資料では、重複2法 (O2M) として知られている小分子で相乗ペアを予測するための私たちの高スループット方法について説明します。O2M が過敏相乗ペアの各分子が他の分子に変異を識別するのに化学遺伝的データセットのパターンを使用します。ブラウンの実験室は、変異がない野生型の細胞の増殖を抑制する分子の高スループットの画面を実行することによってこの成長の違いを悪用します。ラボの仕事は、以前抗生物質のトリメトプリムと抗真菌薬のフルコナゾールこの戦略を使用して相乗効果の分子を識別されます。著者らは、複数の微生物のため変更することができます新しい相乗的な組み合わせの方法画面を紹介します。

市松模様の試金は、相乗作用を測定するための半定量的方法です。出力の最終的なスコア、FICI、決定薬の組み合わせ相乗 (FICI ≤0.5) を考えると、非相互作用 (0.5 < FICI < 4)、または拮抗 (FICI ≥4.0)。図 1は、市松模様のアッセイで薬物グラデーションを設定する方法を示しています。図 2は、一般的な結果を示しています。90% の成長阻害未満表示成長 (紫井戸) を検討してください。プレートの各ウェルの OD600を測定した後我々 はすべてなしの薬物コントロールにも正規化します。正規化された値で何か > 0.1 (よくコントロールの OD600の 10%) を獲得して「成長」.FICI スコアすることができますが異なりますも拾うは、;よくは、各プレートの最も低い FICI を選択します。図 2 a、よく f9 キー (列番号が付けられます、文字行) になるで、FICI = 0.07。図 2 bの FICI はよく C3 から計算されます (FICI = 1.0)。拮抗作用は、可能な限り最高の FICI スコアを探してください。図 2、FICI は、8.0 の FICI を与えるよく A1 から計算されます。
最適なスクリーニング条件は時間とお金を節約画面から偽陽性の数が多いを防止します。真菌のクリプトコッカス ・ ネオフォルマンスのシナジー予測変異体を最適化した我々 がテスト入力薬 (フルコナゾール)、4 つの知られている非相乗薬 (カフェイン、climbazole、トリメトプリム、ブレフェルジン A) と 5 つのフルコナゾール相乗パートナー (リファマイシン、myriocin、nigericin、ラパマイシンのとチャンドラセ, s.らの議論すべて FK50618). 我々 は O2M 分析 (セクション 1 と 2)、選択的にシナジー予測変異細胞ですがない野生型の細胞の成長を阻害する知られている synergizers を期待私たちを通してこれらの分子を発見したので。予想される成長差を最大にするには、ほとんどの抗生物質がそれぞれの小分子の濃度の範囲をテストしました。
例の結果は図 3のとおりです。機能しない相乗的フルコナゾール、ブレフェルジン A、野生型との相乗効果の抑制予測の突然変異体成長、少しだけ分子とほぼ同じ量です。リファマイシン (図 3 b)、シナジー予測変異 (cnag_03917Δ) の成長が抑制され, は、野生型細胞の成長がなかった。最大の成長の違いが 32、49 時間後接種、検診 timepoint はこの範囲内だったので。その他相乗効果と非相乗的分子の成長曲線それぞれリファマイシンとブレフェルジン A のものに似ています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57241/57241fig1.jpg"> 図 1: 手順 3 からチェッカー ボード アッセイの描写。テスト薬物および入力薬物のグラデーションで示されます A と B、それぞれ。C. よう最終的なアッセイ プレートが表示されます<a href="/files/ftp_upload/57241/57241fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57241/57241fig2.jpg"> 図 2: チェッカー ボード試験の結果をグラフ。相乗効果、イラストなしの拮抗作用を示したものと A、B、および C は、それぞれ。<a href="/files/ftp_upload/57241/57241fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57241/57241fig3.jpg"> 図 3: 上映時間を識別するためのデータの例です。(A) 野生型 (緑) とシナジー予測変異体 (ブルー)クリプトコッカスないフルコナゾールとの相乗効果を知られているブレフェルジン A、小分子の存在下で成長しました。野生型制御 (ダーク グリーン) と薬物治療 (ライト グリーン) シナジー予測変異制御 (紺)、薬物治療 (ライトブルー) 成長に似たような違いがあります。(B) 野生型と相乗効果予測変異フルコナゾールとの相乗効果を知られているリファマイシン、小分子の存在下で成長しました。野生型制御 (ダーク グリーン) と薬物治療 (ライト グリーン) シナジー予測変異制御 (紺) と薬物治療 (ライトブルー) より小さい成長の違いがあります。最大の差は既知の相乗的分子の 48 h で、違いは知られている非相乗分子の時点で似ています。<a href="/files/ftp_upload/57241/57241fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

相乗効果の薬剤の組み合わせは難しいと経験的に識別するために時間がかかるです。ここでは、識別し相乗小分子を検証する手法について述べる。

重複2法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

high-throughput-identification-synergistic-drug-combinations-overlap2

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

11.6K ビュー.  University of Utah. 相乗効果の薬剤の組み合わせは難しいと経験的に識別するために時間がかかるです。ここでは、識別し相乗小分子を検証する手法について述べる。

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A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

遺伝学

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

ハイスループットは、ロボットに温度に敏感な致死変異体の単離を支援します<em&gt;クラミドモナス</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

誘導性一過性トランスフェクションを介して制御可能なイオンチャネルの発現

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

ネイティブのクロマチン免疫沈降のヌクレオソーム密度解析ライブラリをシーケンスの生成

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have been directed toward elucidation of the location and timing of initiation of genome duplication rather than its completion. However, it is critical that we understand regions of the genome that are last to complete replication, because these regions suffer elevated levels of chromosomal breakage and mutation, and they have been associated with both disease and aging. Here we describe how we have extended a technique that has been used to monitor replication initiation to instead identify those regions of the genome last to complete replication. This approach is based on a combination of flow cytometry and high throughput sequencing. Although this report focuses on the application of this technique to yeast, the approach can be used with any cells that can be sorted in a flow cytometer according to DNA content.

We describe a technique for combining flow cytometry and high throughput sequencing to identify late replicating regions of the genome.

G2-seq: 高スループット シーケンス ベースを識別する方法後半ゲノムの領域を複製します。

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus allowing a single investigator to screen more treatments or conditions over the same amount of time without loss of data quality. The method requires common equipment found in most laboratories working with C. elegans and is thus simple to adopt. The approach centers on assaying independent samples of a population at each observation point, rather than a single sample over time as with traditional longitudinal methods. Scoring entails adding liquid to the wells of a multi-well plate, which stimulates C. elegans to move and facilitates quantifying changes in healthspan. Other major benefits of the Replica Set method include reduced exposure of agar surfaces to airborne contaminants (e.g. mold or fungus), minimal handling of animals, and robustness to sporadic mis-scoring (such as calling an animal as dead when it is still alive). To appropriately analyze and visualize the data from a Replica Set style experiment, a custom software tool was also developed. Current capabilities of the software include plotting of survival curves for both Replica Set and traditional (Kaplan-Meier) experiments, as well as statistical analysis for Replica Set. The protocols provided here describe the traditional experimental approach and the Replica Set method, as well as an overview of the corresponding data analysis.

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Here we describe the Replica Set method, an approach to quantitatively measure C. elegans lifespan/survival and healthspan in a high-throughput and robust manner, thus allowing screening of many conditions without sacrificing data quality. This protocol details the strategy and provides a software tool for analysis of Replica Set data.

レプリカの設定方法: 定量的測定線虫の寿命を高スループット方法

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

ハイスループット DNA の抽出およびフィン クリッピングが 3dpf ゼブラフィッシュ仔のジェノタイピング

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT employs two purification steps. First, immunoprecipitation of a tagged RNP subunit is followed by mild RNase digestion and subsequent non-denaturing affinity elution. A second immunoprecipitation of another RNP subunit allows for enrichment of a defined complex. Following a denaturing elution of RNAs and proteins, the RNA footprints are converted into high-throughput DNA sequencing libraries. Unlike the more popular ultraviolet (UV) crosslinking followed by immunoprecipitation (CLIP) approach to enrich RBP binding sites, RIPiT is UV-crosslinking independent. Hence RIPiT can be applied to numerous proteins present in the RNA interactome and beyond that are essential to RNA regulation but do not directly contact the RNA or UV-crosslink poorly to RNA. The two purification steps in RIPiT provide an additional advantage of identifying binding sites where a protein of interest acts in partnership with another cofactor. The double purification strategy also serves to enhance signal by limiting background. Here, we provide a step-wise procedure to perform RIPiT and to generate high-throughput sequencing libraries from isolated RNA footprints. We also outline RIPiT&#39;s advantages and applications and discuss some of its limitations.

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Here, we present a protocol to enrich endogenous RNA binding sites or &#34;footprints&#34;&#160;of RNA:protein (RNP) complexes from mammalian cells. This approach involves two immunoprecipitations of RNP subunits and is therefore dubbed RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT).

ランデムにおけるRNA免疫沈殿によるRNAタンパク質複合体の足跡の同定、シーケンシング(RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...