この作品は、NSFC プロジェクト (81522023、81530059、91639113、81772000、81371699、および 81401534) によって財政的に支えられました。

実験動物の使用は動物実験倫理委員会の南海大学によって承認され、ケアと実験動物の使用のためのガイドに従い実施します。
1. エレクトロスピニング PCL 移植片の作製
注: ここで、エレクトロスピニング法は、人工血管を作製する利用されました。
<ol><li>それぞれ、クロロホルム、メタノールの混合物で PCL を溶解することにより 25 wt % と 10 の wt % の PCL ソリューションを準備 (1:5 容積比) 12 時間 (RT) 室温で。</li>
	<li>10 mL ガラス製注射器に PCL ソリューションを読み込みます。</li>
	<li>21 G 針とシリンジを配置します。</li>
	<li>コレクション楽器にステンレス製マンドレル (長さ 25 cm、直径 2 mm) を配置します。</li>
	<li>25 wt % の PCL ソリューション、コレクターに針先端から 17 cm の作動距離、8 mL/h の流量と 11 の電圧を使用して厚い繊維移植、エレクトロスピニング パラメーターとして kV。シンナー-光ファイバー移植、10 wt %、コレクターに針の先端から 20 cm の作動距離、2 mL/h の流量および 18 の電圧の PCL ソリューションを使用エレクトロスピニング パラメーターとして kV。</li>
	<li>残留溶媒を除去するため一晩に真空で得られた移植が置かれることを確認します。手続きの前にすべての機器を消毒し、全体の無菌技術を維持します。</li>
	<li>注入前に 30 分の 75% エタノール 10 mL でそれらを浸すと、一晩で露出紫外線にグラフトを消毒します。</li>
	<li>繊維と細孔のサイズ測定: 走査電子顕微鏡 (SEM) 像に基づく ImageJ ソフトウェアを使用して平均繊維径を計算。</li>
	<li>機械足場のテスト:<ol>
<li>かみそりの刃を使用して長さで 3 mm セクションに鋼管足場をカットします。マイクロメータを使用して足場の厚さを測定します。</li>
		<li>100 名の負荷容量を持つ引張試験機に鋼管足場を配置します。</li>
		<li>破裂まで 1 mm 間クランプと縦 10 mm/分の速度で引っ張り足場をクランプします。引張強さと伸びの究極を測定します。初期の線形領域からヤング率を計算する (5% 歪み最大) 応力-ひずみ曲線の。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ラット大動脈移植モデル
注: すべての材料、手術で使用される楽器は、滅菌です。外科の間に演算子がガーゼのマスクと感染症を避けるために滅菌手袋を着ていることを確認します。部屋の温度は動物の体温を維持するために 27-30 ° C に保たれてを確認します。鎮痛に関するローカル IACUC ガイドラインに従います。
<ol><li>血管の受信者として 240 270 グラムの重量を量る男性スプレイグ ラットを使用します。ラットは手術前に、24 時間絶食して、確認します。24 時間絶食ラットの目的は空腸内の糞便、十分に地平線を広げるオペレーターの。</li>
	<li>ラットの首の後ろをつかんで、その頭を保つ springe 針を下腹部の腹腔内に挿入します。腹腔内投与によって抱水クロラール (330 mg/kg) と麻酔ラットを誘発します。</li>
	<li>ラットが筋肉と安定した呼吸を緩和して確保することによって適切な anesthetization を確認します。手術顕微鏡下でラットを仰臥位で配置します。</li>
	<li>麻酔中の乾燥を防ぐため目に眼獣医のワセリン軟膏を適用します。手術前に尾静脈注射によってヘパリン生理食塩液 (50 UI/mL) 抗凝固療法 (100 UI/kg) を管理します。</li>
	<li>かみそりの刃を使用して前方の腹部壁の毛を剃り落とすし、ヨード溶液および医療アルコール溶液を使用して肌をきれい。</li>
	<li>外科はさみで正中開腹切開を行うと確実に約 4-5 cm 長く、切開し、腹腔内を公開します。</li>
	<li>撤回し、優先的に食塩水で湿らせたガーゼで腸をラップします。</li>
	<li>腹部大動脈を慎重に分析します。</li>
	<li>識別し、9-0 モノフィラメント ナイロン縫合糸を使用してすべての小さな枝を結紮します。</li>
	<li>孤立した部分をクランプ (長さ 1 cm まで) の 2 つの血管クランプを用いた大動脈。大動脈は、20-30 分の固定に残ることができます。</li>
	<li>吻合部のサイトを作成するマイクロはさみを使用して 2 つのクランプの間に腹部大動脈を縦断面します。</li>
	<li>ヘパリン生理食塩水 (50 UI/mL) ソリューションを使用して残血を削除する大動脈の 2 つの端をフラッシュします。</li>
	<li>マイクロはさみを使用して外膜をはがします。</li>
	<li>9-0 モノフィラメント ナイロン縫合糸を使っての 8の字縫合パターンを内径 2 mm とのラットの腹部大動脈に長さ 1 cm グラフトを吻合します。</li>
	<li>まず、9、3、12、および近位側で 6 位置の順序に従って 4 つの吻合を構築し、4 針縫合糸 2 つ間で切り口を吻合します。近位部の縫合を終えた後に、同じ方法で遠位側を縫合します。 注: すべてのステッチがネイティブ側やや移植に埋め込まれていることを確認する必要です。</li>
	<li>近位部のクランプを外し、接木に流れ込む血液を許可する遠位クランプを削除します。</li>
	<li>滅菌綿球または小さなガーゼを使用して出血を止めるため縫合糸の末端を押してください。止血まで約 3 分間押します。</li>
	<li>腹腔内に腸を返します。</li>
	<li>ゲンタマイシン (320 U/mL) 暖かい生理食塩液を用いた腹腔内をフラッシュします。</li>
	<li>筋肉と皮膚の層でそれぞれ 3-0 ナイロン縫合糸を使用して腹壁を縫います。</li>
	<li>清潔で乾燥したケージにラットを置き、動物の体の温度を維持するためにケージの下で加熱パッドを入れてください麻酔から回復するラットの待ちます。それは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻したまで動物に出席します。</li>
	<li>後意識を取り戻すことは、食品と水で単一のケージでラットを置きます。手術後の感染を防ぐために傷口にヨウ素を適用します。それが完全に回復するまで、他の動物の会社にネズミを返します。</li>
	<li>あらかじめ決められた時点で制度のガイドラインによるとラットを安楽死させます。</li>
</ol>

<ol><li>Coombs, K. E., Leonard, A. T., Rush, M. N., Santistevan, D. A., Hedberg-Dirk, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+effect+of+material+stiffness+on+valvular+interstitial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Isolated effect of material stiffness on valvular interstitial cell differentiation.</a> J Biomed Mater Res A. 105 (1), 51-61 (2017).</li>
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<li>Rnjak-Kovacina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+the+porosity+and+pore+size+of+electrospun+synthetic+human+elastin+scaffolds+for+dermal+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tailoring the porosity and pore size of electrospun synthetic human elastin scaffolds for dermal tissue engineering.</a> Biomaterials. 32 (28), 6729-6736 (2011).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+thick+fibers+and+large+pores+of+electrospun+poly%28epsilon-caprolactone%29+vascular+grafts+on+macrophage+polarization+and+arterial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of thick fibers and large pores of electrospun poly(epsilon-caprolactone) vascular grafts on macrophage polarization and arterial regeneration.</a> Biomaterials. 35 (22), 5700-5710 (2014).</li>
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</ol>

著者は金融利害の対立があります。

再生の重要な細胞浸潤は、生体内で血管16の改造。限られた細胞浸潤は頻繁に細胞の血管壁への移行を妨げるグラフトの比較的小さな毛穴に関連します。この困難に対処するため大規模な細孔構造を持つエレクトロスピニング PCL 血管を準備する修正法を開発しました。詳しくは、細孔径は処理のパラメーターによって容易に制御できる線維厚の増加に伴い増加しました。結果、宿主細胞が簡単に体内注入後この多孔体血管の壁に浸透し、手術後 12 ヶ月間で明白なセル回帰せず比較的高いレベルで残っている、セル。
ネイティブ動脈主に成っている 3 つの層、内皮、, 中膜と外膜。抗血栓性インターフェイスとして内皮血管の長期開存性を維持する上で重要な役割を果たしています。本研究では、3 ヶ月で移植における血管内皮形成が観察されました。さらに、平滑筋細胞のいくつかの層から成るチュニカ メディアは、血管機能を調節し、動脈の適切な機械的性質を提供することで非常に重要。本研究では、厚い繊維、エレクトロスピニング PCL 移植し、機能チュニカ メディアの再生を著しく強化された大細孔径を明らかにしました。また、再生の平滑筋の構造はネイティブ チュニカ メディアに似ています。平滑筋細胞の収縮の表現型を反映して円周エラスチン ネットワーク内で分散 MYH+細胞のいくつかの層を示した免疫蛍光染色します。重要なは、そのまま組織 (内皮細胞と平滑筋の両方) を再生成し、ECM の合成と分解の不均衡のための 12 ヶ月後も不利な改造はありませんでした。
石灰化は、血管を中心に心血管のインプラントに関連付けられている主要な問題です。血管平滑筋細胞 (VSMCs) は彼らの元の表現を失い方向 osteochondrogenic 血管石灰化のプロセス中に異所性石灰化につながるトランス分化を経験します。注入の 12 ヶ月後も血管壁内で発生するカルシウムの沈着があったことが分かった。マクロ多孔性血管抑制の石灰化の主な理由があります: (1) マクロ多孔性移植片の構造細胞と血液との間のイオン交換などの代謝を促進します。(グラフト構造の 2) の物理的な手がかりが規制または、細胞の1骨芽細胞への分化を抑制する、大きな細孔での (3) の良い細胞浸潤 ECM の分泌を促進、トリガーされますその劣化を抑制します。石灰化17、および (4) の通常または機能 VSMCs カルシウム沈着18を防止する可能性があります。
要約すると、ラット腹部大動脈モデルにおけるマクロ多孔質エレクトロスピニング PCL 血管移植の長期的な評価は、下記の調査を直接分解性血管の潜在的な課題の重要な洞察を提供します。

合成ポリマーから作られた血管は、心血管疾患 (スッテパー) の治療のためのクリニック広く使用されています。残念ながら、小口径人工血管の場合 (D < 6 mm) は、成功した製品が、しばしば血栓症、内膜増殖症などにつながる減らされた血流速によって引き起こされる低開存のために利用合併症1。
ティッシュ ・ エンジニア リングは、長期的な開存性と血管再生の足場誘導と再構成に基づく恒常性を実現するために別の方法を提供します。詳しくは、血管移植三次元テンプレートとしてことができるメカニカル ・ サポートやガイダンスを提供構造維管束組織と影響の細胞機能、細胞接着、移行、増殖などの再生時に、細胞外マトリックス2の分泌。今までは、維管束組織工学用各種合成樹脂を評価されています。これらの高分子の中で poly(ε-caprolactone) (PCL) は良いセルの互換性と数ヶ月から 2 年間3に至るまで劣化を遅らせるために集中的に検討されている.優れた構造健全性開存、増加だけでなく、継続的に細胞浸潤と血管新生ラット大動脈モデル4,5,6、PCL 血管静電紡糸法による処理が展示されて、最大 6 ヶ月の壁を移植します。しかし、細胞と毛細血管と石灰化、回帰を含む不利な組織の改造もで観測した長い縦長を 18 ヶ月。
Cellularization 血管移植の組織再生を決定し、修繕7キー要因であります。エレクトロスピニング、汎用性の高い手法として採用されている広くナノ繊維構造8血管移植の準備のため。残念なことに、比較的小さな細孔構造はしばしばその後の組織再生を制限エレクトロスピニング血管で不十分な細胞浸潤に します。この問題を解決するには、様々 なテクニックは、細孔径と塩/高分子溶出9,10、コレクター装置、レーザー放射11 による治療後の変更を含む、全体的な気孔率を高めるため試行されています。、等。実際には、エレクトロスピニング移植 (ファイバー径、孔径、気孔率を含む) の構造は処理条件12,13に密着します。エレクトロスピニング、中に繊維の直径は、高分子溶液、流量、電圧などの濃度など、パラメーターを変更することにより容易に制御できます。14,15としたがって、細孔径と気孔率がそれに応じて強化され。
我々 は最近、多孔体構造 (5-7 μ m の直径 30-40 μ m の細孔の繊維) と変更された PCL エレクトロスピニング移植を報告しました。ラット腹部大動脈を置き換えることによって体内注入は、3 ヶ月手術後16で開存、として良好な血管内皮形成と平滑筋再生率が高いを示した。もっと重要なは、不利な組織の石灰化とセルの回帰を含む改造が認められなかったのも移植の 1 年後。

<table><tbody><tr><td>Poly(&amp;epsilon;-caprolactone) (PCL) pellets (M&lt;sub&gt;n&lt;/sub&gt;=80,000)</td><td>Sigma</td><td>704067</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Tianjin Chemical Reagent Company</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol</td><td>Tianjin Chemical Reagent Company</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Tianjin Chemical Reagent Company</td><td>A1007</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Tianjin Fengchuan Company</td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley rats</td><td>Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal saline</td><td>Hebei Tiancheng Pharmaceutical company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloral hydrate</td><td>Tianjin Ruijinte chemical company</td><td>2223</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium Injection</td><td>Tianjin Biochem Pharmaceutical company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin Sulfate Injection</td><td>Jiangsu Lianshui Pharmaceutical company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-&amp;alpha;-SMA primary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab7817</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-smooth MYH primary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab683</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti-rat elastin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab23748</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-von Willebrand factor primary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6994</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG (Alexa Fluor 488)</td><td>Invitrogen</td><td>ab150117</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (Alexa Fluor 488)</td><td>Invitrogen</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>5% normal goat serum</td><td>Zhongshan Golden bridge</td><td>ZLI9022</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin and eosin (H&amp;amp;E)</td><td>Beijing leagene biotech</td><td>DH0006</td><td></td></tr><tr><td>Masson&#039;s trichrome</td><td>Beijing leagene biotech</td><td>DC0032</td><td></td></tr><tr><td>Verhoeff-van Gieson (VVG)</td><td>Beijing leagene biotech</td><td>DC0059</td><td></td></tr><tr><td>Von Kossa</td><td>Beijing leagene biotech</td><td>DS0003</td><td></td></tr><tr><td>Surgical sutures needles with thread,3-0 silk</td><td>Shanghai Jinhuan medical supplies company</td><td>G3002b</td><td></td></tr><tr><td>Surgical sutures needles with thread,9-0 silk</td><td>Shanghai Jinhuan medical supplies company</td><td>H901</td><td></td></tr></tbody></table>

implantation of electrospun vascular grafts with optimized structure in a rat model

ここでは、マクロポーラス PCL 人工血管を作製し、腹部大動脈置換のモデルラットを用いた評価プロトコルを記述するプロトコルを提案する.エレクトロスピニング血管は頻繁、グラフトに細胞浸潤を制限し、再生とネオ動脈の改造を妨げる比較的小さな毛穴を所有しています。本研究では厚い繊維 (5-6 μ m) と孔径が大きい (~ 30 μ m) PCL 血管を修正処理テクニックを使用して作製しました。腹部大動脈ラットモデルにおける注入によるグラフトの長期的なパフォーマンスを行った。超音波は、グラフト残った動脈瘤や狭窄注入の 12 ヶ月後も発生せず特許を示した。多孔体構造はセル成長を改善し、こうして推進組織 3 カ月で再生成されます。さらに、12 ヶ月後の血管壁内石灰化などの不利な改造の兆候だった。したがって、エレクトロスピニング PCL 血管処理変更した多孔体で保持長期的な注入のため動脈代替可能性を秘めて。

PCL 移植手術後 3ヶ月と 12 ヶ月で仔だったし、ヒアリン マッソン、その行動・ ヴァン ・維 (VVG)、コッサ、蛍光染色法による α-SMA のヘマトキシリンとエオシン (H & E) の標準的な組織学的手法による分析MYH、vWF とエラスチン。組織学的イメージは、正立型顕微鏡を使用して撮影された、ﬂuorescence 顕微鏡を用いた蛍光抗体法により画像が撮影されました。
すべてのデータは、平均 ± SD. 表現されました。2 尾対学生のt-テストの違いを比較に使用されました。Pの値 < 0.05 が統計的に重要であると考えられていた。
新規エレクトロスピニング PCL 移植最適化構造、厚い繊維と孔径が大きいと正常に、本研究で作製しました。平均繊維径が従来より変更された移植 (図 1 a) でほぼ 8 倍厚い SEM 像を示した 1 つ (5.59 ± 0.67 0.69 ± 0.54 μ m 対) (図 1 b)。その結果、平均細孔径が著しく増加から 〜 薄く繊維移植 4.66 μ m 〜 40.88 μ m 厚い繊維 1 つ。断面は、厚い繊維 (図 1-F) と (図 1-私) 薄く繊維グループの両方で鋼管の移植の壁内均一なファイバー分布を示した。壁の厚さは約 400-500 μ m。移植片の機械的性質は、引張試験、特徴づけられた、典型的な応力-ひずみ曲線は図 1に示した。2 移植の機械的性質は伸長の面で明らかに異なっていた。厚い繊維の移植後の対応する値は強化の靭性を示唆、薄く繊維移植に比べて約 3 倍だった。
準備の血管 (内径 2.0 mm)、長さ 1 cm (図 2 a) ラット (図 2 b) ネイティブの腹部大動脈の線分を置き換えるに移植されました。あらかじめ決められた時点で超音波によって移植グラフトの開存性を調べた。結果、移植のほとんどの特許を示した (図 2)。さらに、血流の速度は 12 ヶ月で移植と隣接するネイティブ血管と同様だった。Explanted 移植が動脈瘤 (図 2 D) なしの良い形態を保持し、狭窄や血栓が認められなかったの内腔の表面 (図 2 e)。
組織の再生と 3 ヶ月で ECM 分泌さらに組織解析によって評価されました。H & E 染色 (図 3-H) の血管の内腔に新組織の層が形成されたことを示した。また、vWF の染色を示す内腔が新たに形成された内皮細胞 (図 3 a)、ネイティブの大動脈 (図 3 b) に似たによって完全に覆われていた。一方 MYH 陽性細胞のいくつかの層を示す血管メディア (図 3-D) の再生、円周方向に沿って組織されました。細胞外マトリックスの合成は、マッソンと染色、それぞれ VVG で観測されました。コラーゲンとエラスチン線維性のかなりの量は、血管再生と改造で重要な役割を果たしている移植 (図 3 i-J K-L) 内で観察できます。エラスチンの構造は円周パターンでネイティブの動脈 (図 3E-F) そのような配置は示したさらに蛍光染色します。
さらに、血管内皮細胞と平滑筋の維持を含む再生の組織は統合され、注入 (図 4 a-C) の 12 ヶ月後に逆行でした。もっと重大に、コッサ染色 (図 4) に基づく血管壁内で発生する石灰化の兆候だった。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57340/57340fig1.jpg"> 図 1: 構造および PCL 移植片の機械的特性。厚い繊維 (A) と (B) 繊維が薄いマット PCL はエレクトロスピニングの SEM 画像。厚い繊維管状移植 (D-F)、(G-私) 薄く繊維移植の断面。(C) は、代表的なひずみ-応力曲線を示しています。これらの数字は、趙、らから変更されています。16<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57340/57340fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57340/57340fig2.jpg"> 図 2: 腹部大動脈ラットモデルにおける血管の移植後の着床します。(A) 長さ 1 cm の人工血管をエレクトロスピニング PCL はラット (B) 腹部の大動脈に外科的介在だった。超音波画像は、グラフトが 1 年 (C) 特許生体内であったことを示した。移植された脳動脈瘤 (D) せず隣接するネイティブ大動脈とうまく統合内腔表面がきれい、血栓 (E) の自由表面画像を示します。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57340/57340fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57340/57340fig3.jpg"> 図 3: 組織の再生およびネイティブ大動脈と比較して 3 か月 explanted 移植の ECM の沈着します。再生移植 (A C、およびE) とネイティブの動脈 (B D、およびF) の断面像は、血管内皮細胞、平滑筋細胞やエラスチンを検出する immunostained をだった。H & E 染色ネイティブ大動脈 (H) に比べて explanted 移植 (G) 組織再生を示しています。マッソンの染色 (私) explanted 移植およびネイティブ大動脈 (J) コラーゲンの存在。VVG 染色 explanted 移植 (K) とネイティブ大動脈 (L) のエラスチンの存在を示した。これらの数字は、趙、らから変更されています。16<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57340/57340fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57340/57340fig4.jpg"> 図 4: 12 ヶ月で explanted 移植片の組織学的解析.(A) H & E 染色示した explanted 移植組織の再生。(B) 血管内皮細胞は、vWF 抗体による immunostained だった。(C) 平滑筋だった α SMA 抗体による immunostained です。(D) 石灰化は、コッサ染色で評価しました。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57340/57340fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Implantation of Electrospun Vascular Grafts with Optimized Structure in a Rat Model

エレクトロスピニング ラットモデルにおける最適化された構造を有する人工血管の移植

PCL 血管太い繊維と、大きな細孔を製造するため腹部大動脈置換のラットモデルにおける生体内でのパフォーマンスを評価するためのプロトコルを記述する変更されたエレクトロスピニング法を紹介します。

Here, we present a protocol to fabricate macroporous PCL vascular graft and describe an evaluation protocol by using a rat model of abdominal aorta ...

implantation-electrospun-vascular-grafts-with-optimized-structure-rat

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.9K ビュー.  Nankai University. PCL 血管太い繊維と、大きな細孔を製造するため腹部大動脈置換のラットモデルにおける生体内でのパフォーマンスを評価するためのプロトコルを記述する変更されたエレクトロスピニング法を紹介します。

ビデオ: Implantation of Electrospun Vascular Grafts with Optimized Structure in a Rat Model

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

ラット心臓における培養組織の移植

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

生物学

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

組織工学血管移植片とその後の移植のために手術手技<em&gt;インビボ</em&gt;モニタリング

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

生物工学

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

マウスモデルにおける組織工学血管の生成とグラフト

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

エンジニアード前十字靭帯移植片の評価のための無胸腺ラットモデル

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. The long-term clinical results showed excellent patency rates, however, with significant incidence of stenosis. To investigate the cellular and molecular mechanisms of vascular neotissue formation and prevent stenosis development in tissue engineered vascular grafts (TEVGs), we developed a mouse model of the graft with approximately 1 mm internal diameter. First, the TEVGs were assembled from biodegradable tubular scaffolds fabricated from a polyglycolic acid nonwoven felt mesh coated with &#949;-caprolactone and L-lactide copolymer. The scaffolds were then placed in a lyophilizer, vacuumed for 24 hr, and stored in a desiccator until cell seeding. Second, bone marrow was collected from donor mice and mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation. Third, approximately one million cells were seeded on a scaffold and incubated O/N. Finally, the seeded scaffolds were then implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. The implanted grafts demonstrated excellent patency (&#62;90%) without evidence of thromboembolic complications or aneurysmal formation. This murine model will aid us in understanding and quantifying the cellular and molecular mechanisms of neotissue formation in the TEVG.

To improve our knowledge of cellular and molecular neotissue formation, a murine model of the TEVG was recently developed. The grafts were implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. This model achieves similar results to those achieved in our clinical investigation, but over a far shortened time-course.

マウスモデルにおける下大静脈介在移植の移植

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

医学

The Arteriovenous (AV) Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.
We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment. 
In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient's needs.

The Arteriovenous AV Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

We describe a microsurgical approach for the generation of an arteriovenous (AV) loop as a model for analyzing vascularization in vivo in an isolated and well-characterized environment. This model is not only useful for the investigation of angiogenesis, but is also optimally suited for engineering axially vascularized and transplantable tissues.

血管新生および血管組織工学を研究するための小さな動物モデルにおける動静脈（AV）ループ

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant technique with nutritional support. Recently, there have been many attempts at esophageal tissue engineering, but the success rate has been limited due to difficulty in early epithelization in the special environment of peristalsis. Here, we developed an artificial esophagus that can improve the regeneration of the esophageal mucosa and muscle layers through a two-layered tubular scaffold, a mesenchymal stem cell-based bioreactor system, and a bypass feeding technique with modified gastrostomy. The scaffold is made of polyurethane (PU) nanofibers in a cylindrical shape with a three-dimensional (3D) printed polycaprolactone strand wrapped around the outer wall. Prior to transplantation, human-derived mesenchymal stem cells were seeded into the lumen of the scaffold, and bioreactor cultivation was performed to enhance cellular reactivity. We improved the graft survival rate by applying surgical anastomosis and covering the implanted prosthesis with a thyroid gland flap, followed by temporary nonoral gastrostomy feeding. These grafts were able to recapitulate the findings of initial epithelialization and muscle regeneration around the implanted sites, as demonstrated by histological analysis. In addition, increased elastin fibers and neovascularization were observed in the periphery of the graft. Therefore, this model presents a potential new technique for circumferential esophageal reconstruction.

Esophageal reconstruction is a challenging procedure, and development of a tissue-engineered esophagus that enables regeneration of esophageal mucosa and muscle and that can be implanted as an artificial graft is necessary. Here, we present our protocol to generate an artificial esophagus, including scaffold manufacturing, bioreactor cultivation, and various surgical techniques.

ラットにおける円周食道再建のための組織工学型移植片

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

静脈介在モデル：バイパスグラフト開存を研究するための適切なモデル

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

A Rabbit Venous Interposition Model Mimicking Revascularization Surgery using Vein Grafts to Assess Intimal Hyperplasia under Arterial Blood Pressure

Although vein grafts have been commonly used as autologous grafts in revascularization surgeries for ischemic diseases, the long-term patency remains poor because of the acceleration of intimal hyperplasia due to the exposure to arterial blood pressure. The present protocol is designed for the establishment of experimental venous intimal hyperplasia by interposing rabbit jugular veins to the ipsilateral carotid arteries. The protocol does not require surgical procedures deep in the body trunk and the extent of the incision is limited, which is less invasive for the animals, allowing long-term observation after implantation. This simple procedure enables researchers to investigate strategies to attenuate the progression of intimal hyperplasia of the implanted vein grafts. Using this protocol, we reported the effects transduction of microRNA-145 (miR-145), which is known to control the phenotype of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the proliferative to the contractile state, into harvested vein grafts. We confirmed the attenuation of intimal hyperplasia of vein grafts by transducing miR-145 before implantation surgery through the phenotype change of the VSMCs. Here we report a less invasive experimental platform to investigate the strategies that can be used to attenuate intimal hyperplasia of vein grafts in revascularization surgeries.

The present protocol aims to experimentally create venous intimal hyperplasia by subjecting veins to arterial blood pressure for developing strategies to attenuate venous intimal hyperplasia following revascularization surgery using vein grafts.

静脈移植を用いた血管形成術を模したウサギ静脈間位置モデルによる動脈血圧下の内膜過形成の評価

Although vein grafts have been commonly used as autologous grafts in revascularization surgeries for ischemic diseases, the long-term patency remains poor ...

Implantation of Tissue-Engineered Vascular Graft in Mouse Carotid Artery via Cuff Technique

The development of small-diameter vascular grafts has been a global endeavor, with numerous research groups contributing to this field. Animal experimentation plays a pivotal role in assessing the efficacy and safety of vascular grafts, particularly in the absence of clinical applications. Compared to alternative animal models, the mouse implantation model offers several advantages, including a well-defined genetic background, a mature method for disease model construction, and a straightforward surgical procedure. Based on these advantages, the present study devised a simple cuff technique for the implantation of tissue-engineered vascular grafts in the mouse carotid artery. This technique began with the fabrication of polycaprolactone (PCL) small-diameter vascular grafts via electrostatic spinning, followed by the seeding of macrophages onto the grafts through perfusion adsorption. Subsequently,&#160;the cellularized tissue-engineered vascular grafts were transplanted into the mouse carotid artery using the cuff technique to evaluate patency and regenerative capability. After 30 days of in vivo implantation, vascular patency was found to be satisfactory, with evidence of neo-tissue regeneration and the formation of an endothelial layer within the lumen of the grafts. All data were analyzed using statistical and graphing software. This study successfully established a mouse carotid artery implantation model that can be used to explore the cellular sources of vascular regeneration and the mechanisms of action of active substances. Furthermore, it provides theoretical support for the development of novel small-diameter vascular grafts.

Here, a protocol is presented for the implantation of a tissue-engineered vascular graft into the mouse carotid artery using the cuff technique, providing a suitable animal model for investigating vascular tissue regeneration mechanisms.

エレクトロスピニングラットモデルにおける最適化された構造を有する人工血管の移植

要約

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ラット心臓における培養組織の移植

組織工学血管移植片とその後の移植のために手術手技

マウスモデルにおける組織工学血管の生成とグラフト

エンジニアード前十字靭帯移植片の評価のための無胸腺ラットモデル

マウスモデルにおける下大静脈介在移植の移植

血管新生および血管組織工学を研究するための小さな動物モデルにおける動静脈（AV）ループ

ラットにおける円周食道再建のための組織工学型移植片

静脈介在モデル：バイパスグラフト開存を研究するための適切なモデル

静脈移植を用いた血管形成術を模したウサギ静脈間位置モデルによる動脈血圧下の内膜過形成の評価

カフ法によるマウス頸動脈への組織改変血管移植片の移植

エレクトロスピニング ラットモデルにおける最適化された構造を有する人工血管の移植

要約

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ラット心臓における培養組織の移植

組織工学血管移植片とその後の移植のために手術手技

マウスモデルにおける組織工学血管の生成とグラフト

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血管新生および血管組織工学を研究するための小さな動物モデルにおける動静脈（AV）ループ

ラットにおける円周食道再建のための組織工学型移植片

静脈介在モデル：バイパスグラフト開存を研究するための適切なモデル

静脈移植を用いた血管形成術を模したウサギ静脈間位置モデルによる動脈血圧下の内膜過形成の評価

カフ法 による マウス頸動脈への組織改変血管移植片の移植

エレクトロスピニングラットモデルにおける最適化された構造を有する人工血管の移植

カフ法によるマウス頸動脈への組織改変血管移植片の移植