Este trabalho foi apoiado financeiramente por projetos NSFC (81522023, 81530059, 91639113, 81772000, 81371699 e 81401534).

O uso de animais experimentais foi aprovado pela Animal experiências éticas Comitê de Nankai University e realizado em conformidade com o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório.
1. fabricação de enxertos Electrospun PCL
Nota: Neste documento, uma técnica de eletrofiação foi utilizada para fabricar os enxertos vasculares.
<ol><li>Preparar soluções PCL de 25% em peso e 10% em peso, dissolvendo PCL em uma mistura de metanol e clorofórmio, respectivamente, (relação de volume de 1:5), à temperatura ambiente (RT) para 12 h.</li>
	<li>Carrega a solução PCL em uma seringa de vidro de 10 mL.</li>
	<li>Coloque a seringa com uma agulha 21-G.</li>
	<li>Coloca o mandril de aço inoxidável (2 mm de diâmetro, 25 cm de comprimento) sobre o instrumento de coleta.</li>
	<li>Para enxertos de fibra mais grossa, use a solução PCL de 25% em peso, a distância de trabalho de 17 cm da ponta da agulha para colecionador, taxa de fluxo de 8 mL/h e tensão de 11 kV como eletrofiação parâmetros. Para enxertos de diluente-fibra, use a solução PCL de 10% em peso, distância de trabalho de 20 cm da ponta da agulha para colecionador, uma taxa de fluxo de 2ml/h e a tensão de 18 kV como eletrofiação parâmetros.</li>
	<li>Certifique-se que os enxertos obtidos são colocados no vácuo durante a noite para remover o solvente residual. Esterilizar todos os instrumentos antes do procedimento e manter técnica asséptica durante todo.</li>
	<li>Antes da implantação, desinfecte os enxertos por imersão-los em 10 mL de etanol a 75% por 30 min e expô-los à luz UV durante a noite.</li>
	<li>Medições de tamanho da fibra e dos poros: calcular o diâmetro da fibra média usando software ImageJ baseado na digitalização de imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV).</li>
	<li>Teste mecânico de andaimes:<ol>
<li>Corte os andaimes tubulares em seções de 3 mm de comprimento, usando uma lâmina de barbear. Medir a espessura de andaimes usando um micrômetro.</li>
		<li>Coloque os andaimes tubulares em uma máquina de ensaio de tração com capacidade de carga de 100 N.</li>
		<li>Fixe os andaimes com uma distância de 1 mm grampo inter e puxar longitudinalmente a uma taxa de 10 mm/min até ruptura. Medir a resistência à tração e alongamento final na ruptura. Calcular o módulo de Young da região linear inicial (até 5% de tensão) da curva tensão-deformação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. modelo de implantação do rato Aorta Abdominal
Nota: Todos os materiais e instrumentos utilizados na cirurgia são estéreis. Durante a cirurgia, certifique-se que o operador usa uma máscara de gaze e luvas estéreis para evitar infecções. Assegure que a temperatura é mantida a 27-30 ° C para manter a temperatura do corpo animal. Siga orientações IACUC locais sobre analgesia.
<ol><li>Use ratos Sprague Dawley masculinos pesando 240-270 g como destinatários da prótese vascular. Certifique-se do que rato tem jejuado 24 h antes da cirurgia. O objectivo dos ratos jejum por 24 h é vazio as fezes no trato intestinal suficientemente, assim, ampliam o horizonte do operador.</li>
	<li>Segure o pescoço costas do rato e mantenha sua cabeça para baixo, insira a agulha de springe na cavidade abdominal do abdômen inferior. Induzi o rato para anestesia com hidrato de cloral (330 mg/kg) por uma injeção intraperitoneal.</li>
	<li>Confirme anesthetization adequada, garantindo que o rato tem relaxado os músculos e respiração firme. Coloque o rato sob o microscópio de operação na posição supina.</li>
	<li>Aplica pomada de vaselina oftálmica veterinário sobre os olhos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia. Administre a anticoagulação (100 UI/kg) com fisiológico heparinizado (50 UI/mL) por injeção de veia cauda antes da cirurgia.</li>
	<li>Raspar a pele na parede abdominal anterior usando uma lâmina de barbear e limpar a pele usando solução de iodo e de solução de álcool.</li>
	<li>Realizar uma incisão laparotomia com tesoura cirúrgica e certifique-se de que a incisão é cerca de 4-5 cm de comprimento e em seguida expor a cavidade abdominal.</li>
	<li>Retraia e enrole os intestinos com gaze umedecida com soro fisiológico, preferencialmente.</li>
	<li>A aorta abdominal disse cuidadosamente.</li>
	<li>Identificar e ligar todos os pequenos ramos usando suturas de nylon monofilamento 9-0.</li>
	<li>Fixar a seção isolada (até 1 cm de comprimento) da aorta usando duas pinças vasculares. A aorta pode permanecer preso por 20-30 min.</li>
	<li>Transecto a aorta abdominal entre duas pinças usando microtesoura para criar os sites anastomótica.</li>
	<li>Lave as duas extremidades da aorta com solução salina heparinizada (50 UI/mL) para remover o sangue residual.</li>
	<li>Descole a adventícia usando microtesoura.</li>
	<li>Anastomose do enxerto com diâmetro interno de 2 mm e 1 cm de comprimento para a aorta abdominal de ratos com um padrão de sutura em forma de oito usando suturas de nylon monofilamento 9-0.</li>
	<li>Em primeiro lugar, construir quatro anastomoses de acordo com a sequência de 3, 9, 12 e 06:00 posições no lado proximal e, em seguida, se anastomosam as bordas cortadas em 4 pontos entre duas suturas. Depois de terminar a sutura proximal, sutura do lado distal pelo mesmo método. Nota: Cada ponto é necessário para garantir que o lado nativo ligeiramente é incorporado no enxerto.</li>
	<li>Remova a braçadeira distal para permitir que o sangue flua do enxerto e, em seguida, remova a braçadeira proximal.</li>
	<li>Pressione as extremidades de sutura para parar o sangramento usando uma bola de algodão estéril ou uma pequena compressa de gaze. Pressione para cerca de 3 min, a hemostasia.</li>
	<li>Retorne os intestinos na cavidade abdominal.</li>
	<li>Lave a cavidade abdominal com soro fisiológico morno com gentamicina (320 U/mL).</li>
	<li>Cosa a parede abdominal usando uma sutura de Nylon 3-0 na camada de músculo e pele, respectivamente.</li>
	<li>Coloque o rato em uma gaiola limpa e seca e coloque uma almofada de aquecimento sob a gaiola para manter a temperatura do corpo animal; Então espere o rato para se recuperar da anestesia. Cuidar do animal até que ele recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal.</li>
	<li>Depois de recuperar a consciência, coloque o rato em uma única gaiola com comida e água. Aplica iodo na ferida para prevenir a infecção após a cirurgia. Retorne o rato para a companhia de outros animais até que ele se recupere totalmente.</li>
	<li>Eutanásia em ratos de acordo com as normas institucionais em pontos de tempo predeterminado.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Coombs, K. E., Leonard, A. T., Rush, M. N., Santistevan, D. A., Hedberg-Dirk, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+effect+of+material+stiffness+on+valvular+interstitial+cell+differentiation.">Isolated effect of material stiffness on valvular interstitial cell differentiation.</a> J Biomed Mater Res A. 105 (1), 51-61 (2017).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sandwich+tubular+scaffold+derived+from+chitosan+for+blood+vessel+tissue+engineering.">A sandwich tubular scaffold derived from chitosan for blood vessel tissue engineering.</a> J Biomed Mater Res A. 77 (2), 277-284 (2006).</li><li>Thottappillil, N., Nair, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolds+in+vascular+regeneration:+current+status.">Scaffolds in vascular regeneration: current status.</a> Vasc Health Risk Manag. 11, 79-91 (2015).</li><li>Pektok, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+and+healing+characteristics+of+small-diameter+poly+(e-caprolactone)+vascular+grafts+in+the+rat+systemic+arterial+circulation.">Degradation and healing characteristics of small-diameter poly (e-caprolactone) vascular grafts in the rat systemic arterial circulation.</a> Circulation. 118 (24), 2563-2570 (2008).</li><li>Innocente, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paclitaxel-eluting+biodegradable+synthetic+vascular+prostheses:+a+step+towards+reduction+of+neointima+formation?.">Paclitaxel-eluting biodegradable synthetic vascular prostheses: a step towards reduction of neointima formation?.</a> Circulation. 120 (11 Suppl), S37-S45 (2009).</li><li>de Valence, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+bilayered+vascular+grafts+for+surgical+applicability+and+tissue+regeneration.">Advantages of bilayered vascular grafts for surgical applicability and tissue regeneration.</a> Acta Biomater. 8 (11), 3914-3920 (2012).</li><li>Assmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+autologous+in+vivo+recellularization+of+decellularized+aortic+conduits+by+fibronectin+surface+coating.">Acceleration of autologous in vivo recellularization of decellularized aortic conduits by fibronectin surface coating.</a> Biomaterials. 34 (25), 6015-6026 (2013).</li><li>Hasan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+scaffolds+for+tissue+engineering+of+vascular+grafts.">Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts.</a> Acta Biomater. 10 (1), 11-25 (2014).</li><li>Baker, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+to+improve+cell+infiltration+in+composite+fiber-aligned+electrospun+scaffolds+by+the+selective+removal+of+sacrificial+fibers.">The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers.</a> Biomaterials. 29 (15), 2348-2358 (2008).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+macropores+in+electrospun+silk+fibroin+scaffolds+using+sacrificial+PEO-microparticles+to+enhance+cellular+infiltration.">Creation of macropores in electrospun silk fibroin scaffolds using sacrificial PEO-microparticles to enhance cellular infiltration.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (12), 3474-3481 (2013).</li><li>Lee, B. L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+ablation+enhances+cell+infiltration+into+three-dimensional+electrospun+scaffolds.">Femtosecond laser ablation enhances cell infiltration into three-dimensional electrospun scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 8 (7), 2648-2658 (2012).</li><li>Rnjak-Kovacina, J., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+pore+size+of+electrospun+scaffolds.">Increasing the pore size of electrospun scaffolds.</a> Tissue Eng Part B Rev. 17 (5), 365-372 (2011).</li><li>Zhong, S., Zhang, Y., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+large+pores+in+electrospun+nanofibrous+scaffolds+for+cellular+infiltration:+a+review.">Fabrication of large pores in electrospun nanofibrous scaffolds for cellular infiltration: a review.</a> Tissue Eng Part B Rev. 18 (2), 77-87 (2012).</li><li>Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+poly(epsilon-caprolactone)+microfiber+and+multilayer+nanofiber/microfiber+scaffolds:+characterization+of+scaffolds+and+measurement+of+cellular+infiltration.">Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration.</a> Biomacromolecules. 7 (10), 2796-2805 (2006).</li><li>Rnjak-Kovacina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+the+porosity+and+pore+size+of+electrospun+synthetic+human+elastin+scaffolds+for+dermal+tissue+engineering.">Tailoring the porosity and pore size of electrospun synthetic human elastin scaffolds for dermal tissue engineering.</a> Biomaterials. 32 (28), 6729-6736 (2011).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+thick+fibers+and+large+pores+of+electrospun+poly(epsilon-caprolactone)+vascular+grafts+on+macrophage+polarization+and+arterial+regeneration.">The effect of thick fibers and large pores of electrospun poly(epsilon-caprolactone) vascular grafts on macrophage polarization and arterial regeneration.</a> Biomaterials. 35 (22), 5700-5710 (2014).</li><li>Hutcheson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+growth+of+extracellular-vesicle-derived+microcalcification+in+atherosclerotic+plaques.">Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques.</a> Nat Mater. 15 (3), 335-343 (2016).</li><li>Tara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-organized+neointima+of+large-pore+poly(L-lactic+acid)+vascular+graft+coated+with+poly(L-lactic-co-epsilon-caprolactone)+prevents+calcific+deposition+compared+to+small-pore+electrospun+poly(L-lactic+acid)+graft+in+a+mouse+aortic+implantation+model.">Well-organized neointima of large-pore poly(L-lactic acid) vascular graft coated with poly(L-lactic-co-epsilon-caprolactone) prevents calcific deposition compared to small-pore electrospun poly(L-lactic acid) graft in a mouse aortic implantation model.</a> Atherosclerosis. 237 (2), 684-691 (2014).</li></ol>

Os autores têm sem conflitos de interesses financeiros.

Infiltração de células é fundamental para a regeneração e remodelação do enxerto vascular na vivo16. Infiltração de célula limitada é muitas vezes relacionada com os poros relativamente pequenos do enxerto que dificultam a migração de células na parede da prótese. Para resolver esta dificuldade, desenvolvemos um método modificado para preparar enxertos vasculares de electrospun PCL com estrutura de poros grandes. No detalhe, o tamanho dos poros aumentou com o aumento da espessura da fibra, que pode ser facilmente controlado pelos parâmetros de processamento. Os resultados mostraram que as células hospedeiras poderiam facilmente infiltrar-se na parede deste enxerto se após implantação na vivo e a celularidade permaneceu a um nível relativamente elevado sem regressão de célula óbvio no pós-operatório de 12 meses.
Artéria nativa consiste principalmente de três camadas, ou seja, endotélio, túnica média e adventícia. Endotélio, como uma interface de antitrombogénico, desempenha um papel vital em manter a patência a longo prazo do vaso sanguíneo. Em nosso estudo, observou-se a endotelização completa no enxerto em 3 meses. Além disso, a túnica média consiste em várias camadas de células musculares lisas é muito importantes na regulamentação função do vaso sanguíneo e fornecendo propriedades mecânicas adequadas da artéria. O presente estudo revelou que a electrospun PCL enxertos com fibra grossa e grande pore marcadamente reforçada a regeneração de funcional da túnica média. Além disso, a estrutura do regenerada músculo liso é semelhante da mídia túnica nativo. Mancha da imunofluorescência mostrou várias camadas de células MYH+ distribuídas dentro da rede de elastina, refletindo o fenótipo contrátil das células musculares lisas circunferencialmente. Mais importante ainda, regenerado tecidos (endotélio e músculo liso) mantidos intactos e não havia nenhuma remodelação adversas mesmo após 12 meses devido o desequilíbrio entre a síntese de ECM e degradação.
Calcificação é ainda um grande problema associado com implantes cardiovasculares, especialmente no enxerto vascular. Células de músculo liso vascular (VSMCs) perdem seu fenótipo original e experimentam trans-diferenciação da direção osteochondrogenic, levando a gravidez ectópica mineralização durante o processo de calcificação vascular. Nosso estudo mostrou que não havia nenhuma deposição de cálcio ocorrendo dentro da parede da prótese, mesmo após 12 meses da implantação. As principais razões para a calcificação inibida no macro porosa enxerto vascular incluem: (1) a estrutura do enxerto macro porosa promove o metabolismo, tais como a troca iônica entre as células e o sangue; (2) as pistas físicas da estrutura de enxerto poderiam regular ou inibir a diferenciação do 2R no osteoblasto1, (3) infiltração celular bom nos poros grandes promove a secreção de ECM e inibe sua degradação que acionará calcificação de17e (4) VSMCs normais ou funcionais tem um potencial para impedir a deposição de cálcio18.
Em resumo, a avaliação a longo prazo dos enxertos vasculares de macro porosa electrospun PCL no modelo do rato de aorta abdominal fornece dicas importantes para possíveis desafios de enxertos vasculares degradáveis, que irão direcionar a pesquisa a seguir.

Enxertos vasculares feitos de polímeros sintéticos são amplamente utilizados na clínica para o tratamento de doenças cardiovasculares (doenças cardiovasculares). Infelizmente, no caso de enxertos vasculares de pequeno diâmetro (D < 6mm) não há nenhuma produtos de sucesso disponíveis devido a baixa permeabilidade desencadeada pela velocidade do fluxo de sangue reduzido, que muitas vezes leva a trombose, hiperplasia da íntima e outros complicações1.
Engenharia de tecidos fornece uma estratégia alternativa para realizar a patência a longo prazo e homeostase baseado na reconstrução e regeneração vascular andaime-guiada. No detalhe, o enxerto vascular, como um modelo tridimensional, poderia fornecer suporte mecânico e orientação estrutural durante a regeneração do tecido vascular e influência funções celulares, incluindo a adesão celular, migração, proliferação, e secreção de matriz extracelular2. Até agora, vários polímeros sintéticos foram avaliados para aplicações em engenharia de tecido vascular. Entre estes polímeros, poly(ε-caprolactone) (PCL) tem sido intensamente pesquisada devido à célula boa compatibilidade e degradação lenta que variam de vários meses a dois anos3. Em um rato aorta modelo4,5,6, enxertos vasculares PCL, processados por eletrofiação exibiram excelente integridade estrutural e patência, invasão da célula, bem como continuamente aumentado e neovascularização na parede da prótese por até 6 meses. No entanto, remodela o tecido adverso, incluindo regressão de células e capilares e calcificação, também foram observados em momentos mais, acima de 18 meses.
Celularização da prótese vascular é um factor-chave determinando a regeneração do tecido e remodelando o7. Eletrofiação, como uma técnica versátil, tem sido amplamente empregada para a preparação de enxertos vasculares com estrutura fibrosa nano8. Infelizmente, a estrutura relativamente pequenos poros conduz frequentemente a infiltração de células insuficientes no enxerto vascular electrospun, que limita a regeneração do tecido subsequentes. Para resolver este problema, tem sido tentadas várias técnicas para aumentar o tamanho dos poros e porosidade total, incluindo o sal/polímero lixiviação9,10, modificação do aparelho coletor, pós-tratamento por radiação laser11 , etc. Na verdade, a estrutura dos enxertos de electrospun (incluindo o diâmetro da fibra, tamanho dos poros e porosidade) está intimamente relacionada com as condições de processamento de12,13. Durante eletrofiação, o diâmetro da fibra pode ser facilmente controlado alterando os parâmetros, tais como a concentração da solução de polímero, vazão, tensão, etc. 14 , 15, e portanto, o tamanho dos poros e porosidade foram aprimorados em conformidade.
Recentemente, informou um enxerto de electrospun PCL modificado com estrutura se (fibras com diâmetro de 5 a 7 µm e poros de 30-40 µm). Implantação in vivo , substituindo aorta abdominal de ratos mostrou alta taxa de patência, bem como a boa regeneração endotelização e músculo liso no pós-operatório de 3 meses16. Mais importante, não remodela o tecido adverso incluindo regressão calcificação e célula podia ser observada mesmo após um ano de implantação.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly(&#949;-caprolactone) (PCL) pellets (Mn=80,000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>704067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Tianjin Chemical Reagent Company</td>
			<td>1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol</td>
			<td>Tianjin Chemical Reagent Company</td>
			<td>1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Tianjin Chemical Reagent Company</td>
			<td>A1007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Tianjin Fengchuan Company</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley rats</td>
			<td>Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal saline</td>
			<td>Hebei Tiancheng Pharmaceutical company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloral hydrate</td>
			<td>Tianjin Ruijinte chemical company</td>
			<td>2223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium Injection</td>
			<td>Tianjin Biochem Pharmaceutical company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulfate Injection</td>
			<td>Jiangsu Lianshui Pharmaceutical company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#945;-SMA primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-smooth MYH primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-rat elastin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab23748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-von Willebrand factor primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ab150117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% normal goat serum</td>
			<td>Zhongshan Golden bridge</td>
			<td>ZLI9022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and eosin (H&#38;E)</td>
			<td>Beijing leagene biotech</td>
			<td>DH0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson&#39;s trichrome</td>
			<td>Beijing leagene biotech</td>
			<td>DC0032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verhoeff-van Gieson (VVG)</td>
			<td>Beijing leagene biotech</td>
			<td>DC0059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Von Kossa</td>
			<td>Beijing leagene biotech</td>
			<td>DS0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical sutures needles with thread,3-0 silk</td>
			<td>Shanghai Jinhuan medical supplies company</td>
			<td>G3002b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical sutures needles with thread,9-0 silk</td>
			<td>Shanghai Jinhuan medical supplies company</td>
			<td>H901</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of electrospun vascular grafts with optimized structure in a rat model

Aqui, apresentamos um protocolo para fabricar se enxerto vascular de PCL e descrever um protocolo de avaliação, usando um modelo do rato de substituição da aorta abdominal. Os enxertos vasculares electrospun muitas vezes possuem relativamente pequenos poros, que limitam a infiltração de células os enxertos e dificultam a regeneração e remodelação das artérias-neo. Neste estudo, enxertos vasculares PCL com fibras mais grossas (5-6 µm) e poros maiores (~ 30 µm) foram fabricados usando uma técnica de processamento modificado. O desempenho a longo prazo do enxerto foi avaliado pela implantação de um modelo de aorta abdominal de ratos. Análise de ultrassom mostrou que os enxertos permaneceram patentes sem aneurisma ou estenose ocorrendo mesmo após 12 meses da implantação. Estrutura se melhorou o crescimento celular e assim promovido o tecido regenerado em 3 meses. Mais importante, não havia nenhum sinal de remodelação adversos, tais como calcificação na parede do enxerto após 12 meses. Portanto, enxertos vasculares de electrospun PCL com modificados se processamento têm potenciais para ser um substituto de artéria para implantação de longo prazo.

Os enxertos PCL foram explantados em 3 meses e 12 meses de pós-operatório e analisaram por técnicas histológicas padronizadas de hematoxilina e eosina (H & E), corante tricromo de Masson, Verhoeff-van Gieson (Wagner), Von Kossa e mancha para α-SMA, MYH, vWF e elastina. As imagens histológicas foram tiradas usando um microscópio na posição vertical, e as imagens de imunofluorescência foram tiradas usando um microscópio ﬂuorescence.
Todos os dados foram expressos como média ± SD Um bicaudal pareado de Student t-teste foi utilizado para comparar as diferenças. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Enxertos PCL electrospun romance com estrutura otimizada, ou seja, fibras mais grossas e poros maiores, foram fabricados com sucesso neste estudo. SEM imagens demonstraram que o diâmetro da fibra média foi quase 8 vezes mais espesso nos enxertos modificados (figura 1A) do que no convencional um (figura 1B) (5,59 ± 0,67 contra 0,69 ± 0,54 µm). Como resultado, o tamanho dos poros em média foi marcadamente aumentada, de ~ 4.66 µm em diluente-fibra do enxerto ~ 40.88 µm na mais espessa-fibra um. Secções transversais mostraram distribuição homogênea da fibra dentro da parede de enxertos tubulares em fibra mais grossa (Figura 1–F) e grupos de fibra mais fina (Figura 1–eu). A espessura da parede era sobre 400-500 µm. As propriedades mecânicas dos enxertos foram caracterizadas por meio de testes de tração, e as curvas tensão-deformação típico foram mostradas na Figura 1. As propriedades mecânicas dos dois enxertos eram evidentemente diferentes em termos de alongamento. O valor correspondente de enxertos de fibra mais grossa era cerca de 3 vezes maior do que os enxertos de diluente-fibra, sugerindo a dureza realçada.
Os enxertos vasculares preparados (diâmetro interno de 2,0 mm) e comprimento de 1 cm (Figura 2A) foram implantadas para substituir um segmento da aorta abdominal nativo de rato (Figura 2B). Nos pontos de tempo predeterminado, a patência dos enxertos implantados foi examinada por ultra-som. Resultados mostraram que a maioria dos enxertos eram patentes (Figura 2). Além disso, a velocidade do fluxo de sangue foi semelhante entre o enxerto e o nativos sangue dos vasos sanguíneos em 12 meses. Enxertos explantados manteve boa morfologia sem aneurisma (Figura 2D), e sem estenose ou trombos podem ser observados na superfície luminal (Figura 2E).
Regeneração tecidual e secreção de ECM em 3 meses foram de novo avaliadas por análises de histologia. Coloração H & E mostrou que uma camada de tecido-neo foi formada no lúmen do enxerto (Figura 3-H). Além disso, vWF coloração mostram que a superfície luminal estava totalmente coberta por endotélio recém-formado (Figura 3A), assemelhando-se a isso da aorta nativa (Figura 3B). Enquanto isso, várias camadas de células MYH-positivo organizaram-se ao longo da direção circunferencial, indicando a regeneração da mídia vascular (Figura 3–D). Síntese de matriz extracelular foi observado por Masson e Wagner, coloração, respectivamente. Uma quantidade significativa de colágeno e elastina fibrosa pode ser observada dentro do enxerto (Figura 3I–,J, K–L), que desempenha um papel importante na regeneração vascular e remodelação. Mancha da imunofluorescência revelou ainda que a estrutura da elastina foi alinhada circunferencialmente em um padrão assim na artéria nativa (Figura 3E–F).
Além disso, os tecidos regenerados, incluindo o endotélio e músculo liso mantida integrada e não regredir após 12 meses de implantação (Figura 4A–C). Mais importante, não havia nenhum sinal de calcificação ocorre dentro da parede da prótese baseada o Von Kossa coloração (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57340/57340fig1.jpg"> Figura 1 : A estrutura e as propriedades mecânicas do enxerto PCL. Imagens SEM de electrospun PCL esteiras com fibras mais grossas (A) e fibras mais finas (B). Secções transversais de fibra mais grossa enxertos tubulares (D–F) e enxertos de diluente-fibra (G–eu). A curva de tensão-estresse representativa é mostrada em (C). Estes números foram modificados de Zhao, et al 16 <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57340/57340fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57340/57340fig2.jpg"> Figura 2 : Implantação de enxertos vasculares em um modelo de aorta abdominal de ratos. Prótese vascular Electrospun PCL de 1 cm de comprimento (A) foi cirurgicamente interposta em aorta abdominal em ratos (B). A imagem do ultra-som mostrou que o enxerto foi patente na vivo em 1 ano (C). Stereomicroscopic imagens mostram que o enxerto foi bem integrado com aorta nativa adjacente sem aneurisma (D), e a superfície luminal está limpo e livre de trombo (E). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57340/57340fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57340/57340fig3.jpg"> Figura 3 : Regeneração tecidual e deposição de ECM nos enxertos explantados aos 3 meses, em comparação com a aorta nativa. Imagens transversais dos enxertos regenerados (A, Ce E) e artéria nativa (B, De F) foram immunostained para detectar as células endoteliais, células de músculo liso e elastina. Coloração H & E mostra a regeneração de tecidos nos enxertos explantados (G) em comparação com a aorta nativa (H). Masson está manchando revelou que a presença de colágeno no explantados enxertos (eu) e aorta nativa (J). Wagner coloração mostrou a presença de elastina na explantados enxertos (K) e aorta nativa (L). Estes números foram modificados de Zhao, et al 16 <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57340/57340fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57340/57340fig4.jpg"> Figura 4 : Análise histológica dos enxertos explantados aos 12 meses. (A) H & E mancha mostrou a regeneração de tecidos nos enxertos explantados. (B) o endotélio foi immunostained pelo vWF anticorpo. Músculo liso de (C) foi immunostained pelo anticorpo α-SMA. (D) calcificação foi avaliada por Von Kossa coloração. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57340/57340fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Implantation of Electrospun Vascular Grafts with Optimized Structure in a Rat Model

Implantação de enxertos vasculares Electrospun com estrutura otimizada em um modelo do rato

Aqui, apresentamos um método eletrofiação modificado para fabricar enxertos vasculares PCL com fibras grossas e poros dilatados e descrever um protocolo para avaliar o desempenho na vivo em um modelo do rato de substituição da aorta abdominal.

Here, we present a protocol to fabricate macroporous PCL vascular graft and describe an evaluation protocol by using a rat model of abdominal aorta ...

implantation-electrospun-vascular-grafts-with-optimized-structure-rat

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.9K visualizações.  Nankai University. Aqui, apresentamos um método eletrofiação modificado para fabricar enxertos vasculares PCL com fibras grossas e poros dilatados e descrever um protocolo para avaliar o desempenho na vivo em um modelo do rato de substituição da aorta abdominal.

Vídeo: Implantation of Electrospun Vascular Grafts with Optimized Structure in a Rat Model

The Structure of Skilled Forelimb Reaching in the Rat: A Movement Rating Scale

Skilled reaching for food is an evolutionary ancient act and is displayed by many animal species, including those in the sister clades of rodents and primates. The video describes a test situation that allows filming of repeated acts of reaching for food by the rat that has been mildly food deprived. A rat is trained to reach through a slot in a holding box for food pellet that it grasps and then places in its mouth for eating. Reaching is accomplished in the main by proximally driven movements of the limb but distal limb movements are used for pronating the paw, grasping the food, and releasing the food into the mouth. Each reach is divided into at least 10 movements of the forelimb and the reaching act is facilitated by postural adjustments. Each of the movements is described and examples of the movements are given from a number of viewing perspectives. By rating each movement element on a 3-point scale, the reach can be quantified. A number of studies have demonstrated that the movement elements are altered by motor system damage, including damage to the motor cortex, basal ganglia, brainstem, and spinal cord. The movements are also altered in neurological conditions that can be modeled in the rat, including Parkinson's disease and Huntington's disease. Thus, the rating scale is useful for quantifying motor impairments and the effectiveness of neural restoration and rehabilitation. Because the reaching act for the rat is very similar to that displayed by humans and nonhuman primates, the scale can be used for comparative purposes. from a number of viewing perspectives. By rating each movement element on a 3-point scale, the reach can be quantified. A number of studies have demonstrated that the movement elements are altered by motor system damage, including damage to the motor cortex, basal ganglia, brainstem, and spinal cord. The movements are also altered in neurological conditions that can be modeled in the rat, including Parkinson's disease and Huntington's disease. Thus, the rating scale is useful for quantifying motor impairments and the effectiveness of neural restoration and rehabilitation.

Experiments on animals were performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the University of Lethbridge Animal Care Committee in accordance with the regulations of the Canadian Council on Animal Care.

The skilled reaching scale divides the movement by a forelimb in a reach for food act into composite elements each of which are evaluated with a three-point scale. The rating scale is described for a normal rat and can be applied toward evaluating neurological motor disorders.

A Estrutura do Membro Anterior Skilled Chegar no Rato: A Escala de Avaliação Movimento

Skilled reaching for food is an evolutionary ancient act and is displayed by many animal species, including those in the sister clades of rodents and ...

Biologia

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

Implantação de engenharia de tecidos no coração de ratos

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Todo-mount Análise imuno-histoquímica para Vascularização embrionárias Limb pele: um sistema modelo para estudar Morfogênese Branching Vascular em Embrião

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.
The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.
PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per &mu;l. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.
Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit utilizes the polymerase chain reaction (PCR), which is established as the method of choice for highest sensitivity in the detection of Mycoplasma, Acholeplasma, and Ureaplasma contamination in cell cultures and other cell culture derived biologicals.

Detecção otimizada baseados em PCR de Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Reconstituição funcional e atividade do canal Medidas de purificada tipo selvagem e mutante CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby the permeability of the endothelium to blood cells, plasma macromolecules, and water can be adapted according to the physiological need. In certain diseases, cytokines and growth factors are released that target the endothelial barrier to transiently increase vascular permeability; however, their prolonged presence may cause chronic vascular hyperpermeability and thereby tissue-damaging edema. The Miles assay is an in vivo technique that allows researchers to study vascular hyperpermeability through the proxy measurement of vascular leakage. Here, we provide a detailed protocol on how to perform this procedure in the mouse, which is the most widely used model organism to study mammalian physiology and pathology. The procedure involves the intravenous injection of Evans blue dye to label the circulating albumin followed by multiple intradermal injections of permeability-inducing agents and vehicle control solutions into opposing flanks of the mouse. Consequently, Evans blue dye gradually leaks into the dermis, where it accumulates and can be extracted for quantification as leakage induced by the permeability-inducing agent relative to the vehicle. The Miles assay can be performed in wild type or genetically modified mouse models and may be combined with drug administration to study molecular mechanisms that regulate vascular permeability and identify agents/targets capable of inducing or blocking hyperpermeability.

Here, we present a protocol to measure the vascular leakage induced by intradermal administration of permeability promoting agents into the murine skin. This technique can be used to determine the ability of molecules to promote or inhibit vascular leakage or to study the molecular mechanisms that regulate vascular permeability.

Avaliação de agentes de indução Hyperpermeability vasculares na pele com o ensaio de milhas

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for developing methods to study the migration. The scratch assay has long been the most common in vitro method to test compounds with anti- and pro-migration properties because of its low cost and simple procedure. However, an often-reported problem of the assay is the accumulation of cells across the edge of the scratch. Furthermore, to obtain data from the assay, images of different exposures must be taken over a period of time at the exact same spot to compare the movements of the migration. Different analysis programs can be used to describe the scratch closure, but they are labor intensive, inaccurate, and forces cycles of temperature changes. In this study, we demonstrate an optimized method for testing the migration effect, e.g. with the naturally occurring proteins Human- and Bovine-Lactoferrin and their N-terminal peptide Lactoferricin on the epithelial cell line HaCaT. A crucial optimization is to wash and scratch in PBS, which eliminates the aforementioned accumulation of cells along the edge. This could be explained by the removal of cations, which have been shown to have an effect on keratinocyte cell-cell connection. To ensure true detection of migration, pre-treating with mitomycin C, a DNA synthesis inhibitor, was added to the protocol. Finally, we demonstrate the automated optical camera, which eliminates excessive temperature cycles, manual labor with scratch closure analysis, while improving on reproducibility and ensuring analysis of identical sections of the scratch over time.

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Here we describe a procedure to test the cell migration in vitro with an automated optical camera microscope. The scratch assay has been widely used where the closure of the scratch is followed for a set period. The optical microscope enables dependable and cheap detection of cell migration.

Otimizado zero ensaio para In Vitro testes de migração celular com uma câmera óptica automatizada

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.

Análise de espectrometria de massa para identificar a ubiquização do CENP-A marcado pelo EYFP (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a critical yet enigmatic biological event that has been historically difficult to study due to technical and ethical limitations. Implantation is initiated by the development of the trophectoderm to early trophoblast and subsequent differentiation into distinct trophoblast sublineages. Aberrant early trophoblast differentiation may lead to implantation failure, placental pathologies, fetal abnormalities, and miscarriage. Recently, methods have been developed to allow human embryos to grow until day 13 post-fertilization in vitro in the absence of maternal tissues, a time-period that encompasses the implantation period in humans. This has given researchers the opportunity to investigate human implantation and recapitulate the dynamics of trophoblast differentiation during this critical period without confounding maternal influences and avoiding inherent obstacles to study early embryo differentiation events in vivo. To characterize different trophoblast sublineages during implantation, we have adopted existing two-dimensional (2D) extended culture methods and developed a procedure to enzymatically digest and isolate different types of trophoblast cells for downstream assays. Embryos cultured in 2D conditions have a relatively flattened morphology and may be suboptimal in modeling in vivo three-dimensional (3D) embryonic architectures. However, trophoblast differentiation seems to be less affected as demonstrated by anticipated morphology and gene expression changes over the course of extended culture. Different trophoblast sublineages, including cytotrophoblast, syncytiotrophoblast and migratory trophoblast can be separated by size, location, and temporal emergence, and used for further characterization or experimentation. Investigation of these early trophoblast cells may be instrumental in understanding human implantation, treating common placental pathologies, and mitigating the incidence of pregnancy loss.

Here, we describe a method for warming vitrified human blastocysts, culturing them through the implantation period in vitro, digesting them into single cells and collecting early trophoblast cells for further investigation.

Coleção celular única de células trophoblastos em embriões humanos de estágio de peri-implantação

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

Isolamento de Hepatócitos Primários de Ratos com Controle de Perfusão Multiparâmetro

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...