著者は、このプロジェクトの初期のイテレーションへの技術的な貢献のためにガブリエルアロムとマイケルYeranosianに感謝したいと思います。このプロジェクトはOREF臨床医科学トレーニンググラント（NL）によって資金を供給された、HHリー外科研究助成（NL）、退役軍人局BLR＆Dメリットレビュー1 I01 BX00012601（DM）と筋骨格移植財団若手研究賞（FP）。

注：すべての動物の手術は、実験を開始する前に、地元の獣医スタッフと動物使用委員会によって承認された。 エレクトロポリカプロラクトン足場の調製<ol><li>医療グレードのエステルを秤量し、溶解PCLポリマーの溶液を10％w / wを作成する1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールで顆粒状にポリ（εカプロラクトン）を終了する。均質な溶液を確保するために、少なくとも3時間、攪拌プレートを用いて溶液攪拌をしましょう​​。 </li><li>足場の製作のための高度に整列PCL繊維のカフを作成するためにPCLソリューションをエレクトロスピニング。 <ol><li>すべての回でのファンとの化学ドラフト内でエレクトロスピニングセットアップを準備します。これは、エレクトロスピニングプロセスの単離された真空媒体として機能する大型アクリルボックスで構成され、電圧源により駆動源のPCL溶液を、モーター駆動の収集マンドレル、及び真空ポートのエントリポイントを有している。 acryliを清掃してください完全にエタノールでCボックスとエレクトロ製品の品質を損なう可能性のある不純物を除去するためにパラフィルムシートのすべての表面を覆う。 </li><li>負荷を約3ミリリットル18 G、1 1/2インチの針を平滑末端で10mlシリンジに上記溶液の。注射器を上に押して、すべての気泡を除去。プログラム可能なシリンジポンプにソリューションをロックします。電圧源線の取り付けのためのアクリルボックスの外側針の1/2インチを約残しながらアクリルボックスに小さな穴を通して針を挿入します。 </li><li>高度に整列PCL繊維のための集電体としての旋盤マンドレルを回転さ30ミリメートルを使用します。アルミ箔の薄いストリップでしっかりとマンドレルをカバーしています。約15cm離れた注射針からボックスの反対側のモーターにマンドレルをロックします。 </li><li>真空ポートにプラスチック製のホースを挿入し、ヒュームフードの真空源に接続します。真空源をオンにして、蓋付きのアクリルボックスをカバーしています。 </li><li> Sら2.5ミリリットル/時プログラム可能なシリンジポンプの注入速度。 3,450 rpmでマンドレルを動作させるためにモーターの電源を入れ、ワニ口クリップを使用して、箱の外側針の先端に電圧源の正極リードを添付してください。 </li><li> PCL溶​​液の注入が開始されると、電源をオンにし、20kVの動作電圧に設定する。 </li><li> PCL溶​​液0.5mlから均質なカフを作成するために12分間この溶液を注入する。 注：平均して、それぞれのカフは、3~4層の足場の合計を作成するために使用できる2つの6ストリップシートを作成するのに十分な電界紡糸材料を有する。 </li></ol></li><li>レーザーは、低真空の設定、10.0 keVの着陸電圧、6.4ミリメートル作動距離、および3.0のプローブ径で運転VersaLaserカッター2.3上の複数の小さなシートを形成するPCLカフをカット。 注：この例では、コンピュータ支援設計が1.5mmの複数のシートを得るために、カッターを指示するために使用された×35ミリメートル×150ミクロンと足場均等に15％の孔面積で150μmの直径の穴を配布した。 </li><li>プラズマは、イオン加速をPCL表面の親水性を誘導するためにプラズマクリーナーを使用して、PCL足場をエッチングする。 450トルに真空を設定し、ハイパワー（29.6 W）で30秒間足場を扱う。 </li><li>無菌環境での70％エタノール中で足場を浸し。 </li><li>コートコラーゲンとの個々の足場は、in vivoでの細胞接着および増殖を促進する。 <ol><li> 4℃での1×PBS中で9：1のPurecolコラーゲン3 mg / mlの標準溶液、10×PBS、2.5滅菌溶液と0.1 N NaOHで1：8に希釈することによって、コラーゲンコーティング溶液を作成する。溶液の均一性を確保するために十分に混合する。 </li><li>コー​​ト個々1.5ミリメートル×35ミリメートル×上記のコラーゲン溶液の薄層フィルムと150μmの足場。無菌環境下で24時間乾燥することができます。 </li></ol></li><li> 5-0ビクリル縫合糸を使用して、スタックおよび4つの個々の1.5ミリメートル×35ミリメートル×150μmの足場を固定Krackowは、移植の準備ができている最終的な厚さ0.6mm、多層、コラーゲンコーティングされた足場を作成するためにステッチ使用。 </li></ol> 2.ラット手術プロトコル<ol><li>吸入チャンバーにラットを配置し、2リットル/分の酸素と2％のイソフルランを送達することにより麻酔を誘導する。確認してラットが十分に足を後肢に圧力をかけ、あらゆる応答を評価することにより麻酔している。 </li><li>非滅菌バックテーブルの上には、皮下に25mg / kgのアンピシリン及び0.03 mg / kgをブプレノルフィンを注入する。 </li><li>目に眼軟膏を適用します。手術後肢から毛皮をクリップし、3クロルヘキシジンの交互のスクラブと70％エタノールで手術部位を分取</li><li>低体温症を防ぐために加熱されたパッドの上に、手術台にラットを転送します。セキュアなノーズコーン、および2リットル/分の酸素の2％イソフルランで手続きを麻酔を維持は、ノーズコーンを提供しました。露出された作動肢を残して、無菌状態でドレープ。 </li><li&gt;手術を開始する前に、最初の足圧を後肢への応答の欠如によって十分な麻酔を確認。 </li><li>膝蓋骨のレベルを中心と膝に2cmの長さの垂直切開内側を、確認します。切開が膝の上にセンタリングされるまで横方向に皮膚を撤回。 </li><li>ちょうど膝蓋骨に外側から内側に切断し、大腿四頭筋の筋腱接合部のレベルに遠位脛骨結節に膝蓋腱挿入のレベルに近位に拡張することで、内側傍関節切開を作るためにメスを使用してください。膝蓋骨や大腿四頭筋の腱をカットしないように注意してください。 </li><li>膝蓋腱のすぐ横膝カプセルを通じて1センチメートル垂直切開することにより横方向にリリース膝蓋骨。 </li><li>膝が延長されることを確認してください。細かいハサミを取り、横方向から内側に膝蓋骨の下を通過。伸筋機構はどちらの側に変換することができるようにハサミを数回を広げた。 </li><li>トンを曲げながら彼の膝、膝関節の内部を露出させるために横方向に膝蓋骨を翻訳。顆間ノッチと大腿骨顆の明確な可視化を確認してください。メスを用いて、ノッチにACLとPCLを横断する。 </li><li> 1.6ミリメートルのKワイヤと負荷電力ドリル。顆間でACL原点にKワイヤ先端を置きます。 superolaterallyドリルとメスで、必要に応じて、任意の軟組織を除去し、大腿骨の外側面に出口点を視覚化。移植のための明確なの通路を確保するために数回内外Kワイヤを渡します。 </li><li>脛骨プラトー上のACLフットプリント上のKワイヤを配置します。前外側ドリルと前外側脛骨近位端上の出口点を視覚化。 Kワイヤが脛骨を出るポイントが完全に可視化されるように、必要に応じて、軟組織をクリアするためにメスを使用してください。 </li><li>大腿骨のトンネルを通って（理想的にはこれ以上の2よりインチ長）を短縮キース針を渡します。 Kの目を通して移植片の一端から二縫合糸末端を通すeith針。大腿骨トンネルを通じて移植片の一端を引っ張って針を使用してください。 </li><li>脛骨トンネルを通って移植片のもう一方の端を渡す前に、手順を繰り返します。 </li><li> 8の字ステッチで骨膜またはその他の周囲の軟組織への移植片の大腿骨の端を固定する4-0ビクリル縫合糸を使用してください。手動張力拡張子で膝移植片。 8の字ステッチで骨膜またはその他の周囲の軟組織への移植片の脛骨の端を固定します。 </li><li> 8の字ステッチ過去両端に1〜2ミリメートルを残して、両端の余分な移植片を切断するはさみを使用してください。 </li><li>膝を拡張し、膝蓋骨を減らす。 4-0ビクリルを使用して、膝蓋骨の横方向の亜脱臼を防止、内側関節包を閉じるには、シングル8の字ステッチを配置。 </li><li>下の筋肉を縫合や皮膚がクローズされると、目に見える縫合糸を持ってさせないように注意しながら、実行中の表皮下5-0モノクリルまたはビクリル縫合糸で皮膚を閉じます。 </li><li>麟蹄皮下にブプレノルフィンとCTラット術後3日間の合計ごとに12時間。注入時の任意の排水や縫合不全のために手術部位を確認してください。跛行といくつかの腫れ、手術後の最初の数日で正常であるが、速やかに獣医スタッフと一緒にすべての術後の懸念に対処する。外科的切開が完全に治癒したとき動物は、術後2週間後に社会住宅に戻ることができる。 </li></ol> 3.データ収集プロトコル<ol><li>屠殺時に、開胸続いクローズCO 2チャンバー内で個別にラットを窒息させる。 </li><li>股関節で分離することにより、外科的に再構築され、反対側の手足の両方を収穫。 <ol><li>再構成された手足のために、外科的に後十字靭帯および残骸を含むすべての軟組織を除去するだけで、大腿骨、脛骨、および移植片を分離するために微細な切開により、天然のACLを破壊した。 </li> &lt;李は&gt;対側肢の場合は、ネイティブACLだけでなく、細かい解剖による大腿骨と脛骨を除くすべての軟組織を取り除く。 </li><li>大腿骨 - グラフト - 脛骨複合体の各端部から骨から1cmに¾が、すべてを削除するには、そのようなドレメルなどの回転工具を使用してください。 </li><li>このプロセスの間、および生体力学的試験を通して、定期的かつ頻繁には誤った結果を変更することが収穫膝の乾燥を防ぐために、生理食塩水で靱帯領域をスプレー。 </li></ol></li><li>組織学的分析のために、48時間、25℃で4％パラホルムアルデヒド溶液中で個別に膝を固定する。次に、完全な脱灰用Immunocal試薬の溶液中で膝を沈める。このプロセスは、サンプルの石灰の内容に依存しており、5日ほどかかる場合があります。サンプルの品質を下げることができ、不完全な脱灰などの進捗状況を評価するために毎日の個々のサンプルを確認してください。切片を実行、完了したら、必要に応じて取り付け、及び染色スライドさせます。 </li><li> Perfor組織工学靱帯の機能的能力を評価するための生体力学的試験をメートル。 <ol><li>個別に各骨の骨端の周りに28 G亜鉛めっき鋼線を包むことにより、大腿骨と脛骨を固定します。これは骨ではなく、興味のある靭帯でサンプルの早期引張障害から不正確な生体力学的試験データを防ぐためです。 </li><li>ポットメタクリレート（PMMA）骨セメントの混合物中に大腿骨。これを行うには、2セメント成分を混合し、すぐに完全に自由に突出した骨端及び添付靱帯との接合鍋に骨の骨幹を包む、金属中に大腿骨を固定するために、粘性混合物を使用しています。徐々に締まりのない物質に、最終的には、固体硬化マトリックス中に混合粘性のコンポーネントを変換するための自​​発的なフリーラジカル重合を許可します。 注：このプロセスは数分かかり、手作業で作らボーラスの温度を評価することによってモニターすることができる残りのセメント。温度は一過発熱重合反応の間に増加し、材料が固化した後、室温に治まる必要があります。 </li><li>理想的な機械的試験のために20°屈曲時に膝の靭帯を維持しながら除き、脛骨を接合するため、上記と同じプロセスを繰り返します。 </li><li>引張試験装置の上に接合、大腿骨 - グラフト - 脛骨複合体をマウントして、障害に張力の開始からの時間の関数としての負荷及び変位を記録するために準備する。この例では、1 kNのロードセルをインストロンモデル5564を使用した。 </li><li>プリテンションが0.5N /分のランプ速度にて2 Nに移植した後は、0.5mm /秒の歪速度での故障までの移植片をテスト。プロセスの間、靱帯半ば物質で失敗していることと、骨の大腿骨と脛骨が安全であることと早まって不正確にテストさ靱帯の生体力学的特性を評価することができるもの、失敗しないことを確認してください。 </li><li>生成された荷重 - 変位を使用してください試験された靱帯の破壊荷重および剛性を計算する曲線。 </li></ol></li></ol>

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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+device+to+apply+controlled+flexion+and+extension+to+the+rat+knee+following+anterior+cruciate+ligament+reconstruction.">A novel device to apply controlled flexion and extension to the rat knee following anterior cruciate ligament reconstruction.</a> J Biomech Eng. 134 (4), 041008 (2012).</li><li>Brophy, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+short-duration+low-magnitude+cyclic+loading+versus+immobilization+on+tendon-bone+healing+after+ACL+reconstruction+in+a+rat+model.">Effect of short-duration low-magnitude cyclic loading versus immobilization on tendon-bone healing after ACL reconstruction in a rat model.</a> J Bone Joint Surg Am. 93 (4), 381-393 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

ACL損傷は現時点での再構築のための限られた選択肢で、整形外科スポーツ手術に共通する条件である。 インビボでの再生を可能にするACLのための適切な組織工学代替を開発するために、適切な動物モデルが必要である。無胸腺ラットにACL再建の再現可能なモデルを使用して、in vivoでの移植のように、本 ​​研究では、生分解性の操作された移植片の製造は、記載されている。このモデルは、細胞の移植片との法人成長因子を有するものを含む種々の生体材料からなる別の組織工学的ACL移植片を評価するために利用することができる。 この特定の研究では、無細胞、整列した繊維とエレクトロポリカプロラクトン移植片をテストしました。組織工学靱帯再建の以前の研究では、編組または絹を含む様々な材料で作られた押出成形移植片、PLLA、およびポリウレタン27-29に移植している。これらの物質はいずれも、ACL 7の機械的性質のグラフトと要約統合の成功の両方をもたらしていない。多くのポリマーは、靭帯再建に使用するための可能性を有するが、それは生物学的に不活性であるため、本研究では、PCLを調べ、非毒性、 生体内で徐々に劣化し、容易に所望の立体配座30に製造される。 PCLはまた、機械的に堅牢であり、機械的応力30の下に少し塑性変形を示しています。 31を電界紡糸する際、その使用は、その整列ナノファイバー構造に鉱化と私は堆積型コラーゲンための信頼性の高いリザーバーとして骨組織工学文献で ​​確立されている。また、制御された薬物送達のために有利で ​​あり、組織工学31で使用するエレクトロPCLマット体積と小さな直径の繊維の短い拡散長スケールの高い表面が示されている。 これは、ことが判明した移植された移植片は、臨床有害反応の欠如に基づいて、生体適合性であった、と術後16週で組織学的に見られるように、天然の細胞浸潤を促進した。それが最終的に移植片を移植したヒト細胞を利用する二段階のプロジェクトの第一段階で、無胸腺モデルは、ヒト細胞の拒絶反応に関する懸念を減少させるように、我々は、この研究における無胸腺動物モデルを利用した。エレクトロスピニングポリマー足場は、再生ACLで両方の細胞とマトリックスの配置を容易にした。移植片の断面図に見られるように、細胞の大部分は、繊維の方向に整列させた。注入された移植片は、時間の経過とともに増加した機械的特性を示した。ポリマーグラフトの故障への負荷はすぐに手術後に再構築されたACLに比べて倍増した。 PCLグラフトのピーク負荷と剛性がネイティブACLと比較して低いように思えるかもしれませんが、それはこれらの結果をfの光で見なければならないことを覚えておくことが重要ですでも、現在のゴールドスタンダード、自家移植または同種移植のことを行動する、術後16週までに健全なACLの機械的強度を達成することができません。例えば、徐らピーク荷重が20％-35％であり、剛性たウサギモデルにおけるACLの自家移植、で報告は23％で6ヶ月術後32による健康な天然のACLと-36％であった。さらに、イヌモデルにおける同種移植の研究では30週術後33で約30％のピーク負荷と40％のネイティブACLの剛性を実証した。 それは本書の範囲外であるが、多くの他の分析は、この動物モデルを使用した後に移植片の品質を評価するために行われてもよい。これには、しかし、生物発光画像化またはX線およびCTスキャン、インビボで 、そのようなコラーゲンマーカーまたは炎症マーカーの免疫組織化学のような汚れおよびアッセイの多数に限定されるものではない。たとえば、私たちは以前に整列共同の定量化の結果を公表この動物モデル26に植え込まエレクトロPCL骨格の移植後にピクロシリウスレッド染色を用いllagen繊維。 本研究の潜在的な制限は、動物モデル自体の選択肢があります。二足歩行の人間に比べて四足ラットにおける解剖学と歩行の固有の違いは、ACLの生体力学が変化しないことを意味し、モデル間の臨床パラメータの翻訳は、これらの制限についての知識を用いて行われるべきである。しかし、この問題は、動物実験では一般的であり、この研究の重要性または翻訳の可能性を否定するものではない。 将来的に設計されたACLの置き換えのために我々のモデルに適用することができる自家移植片を使用して、ラットのACL再建のための術後のプロトコル上の興味深い研究がありました。外部固定装置は、腱の自己移植モデルにおける改善された腱 - 骨の治癒を可能にするために、手術後、ラットを固定するために使用されている19。また、このようなStasiak ら 34によって記載屈曲-伸展装置のように、繰り返し荷重を遅延ことが示されており、さらに自家移植片の取り込み20を増強することができる。しかし、それはまた、短期間に低い強度の周期的な負荷も増加炎症を引き起こし、骨-腱界面35で骨形成を減少できることが示されている。さらなる調査は、このような移植片は腱同種移植よりも弱い初期の機械的特性を有するであろうように、電界紡糸、ポリマーベースのACL置換をこれらの知見の適用可能性を評価するために実施されなければならない。 本研究では、無胸腺ラットにおける無細胞エレクトロ移植でACL再建のモデルを開発し、以前に記載されたラット自家移植モデル17-22の修正をオフに基づいています。私たちは、失敗への負荷の同時改善に移植片全体に密な整列コラーゲンの精緻化を実証した時間をかけて移植片の。この研究はまたACL再建のための様々な組織工学移植片を評価するために、将来的にこのモデルを採用するためのコンセプトの証明を提供します。具体的には、無胸腺ラットは、異種ドナー細胞の播種を可能にします。

前十字靱帯（ACL）の破裂は、膝1の最も一般的な靱帯損傷の一つである。破裂したACLのは、外科的介入なしに治癒することができませんので、日常生活だけでなく、スポーツへの参加の活動には限界が毎年10億ドル3の推定コストで、毎年2手術を受けるために175000以上の患者をドライブ。現在、自家移植または同種移植腱のいずれかが靭帯再建のために使用されている。高い成功率は、自家移植および同種移植の交換の両方を達成することができるものの、深刻な合併症は、これらの再構成オプション4に関連している。自家移植片組織は、特に再破裂またはマルチ靭帯損傷の事例では、ドナー部位の病的状態と関連しており、供給が限られている。一方、同種移植組織は、遅延移植片統合、有害な炎症反応、理論的な感染のリスク、および限られたサップとリンクされているLY 5。合成非分解性移植片は、1970年代と1980年代に開発されたが、時期尚早グラフト破裂、異物反応、骨溶解、及び滑膜炎6によって妨げられた。これらの深刻な懸念の結果として、米国での臨床使用のために利用可能な合成移植片はまだありません。 原因既存の移植オプションと、生物学、工学、再生医療における最近の進展にこれらの制限のために、ACL移植のための組織工学的ソリューションに大きな関心が集まっている。現在の組織工学戦略が永久合成材料注入7に関連する制限を回避しながら宿主組織の内部成長を可能にするために、生物分解性合成材料を用いる。 ポリカプロラクトン（PCL）は、FDAがuのあった8ドレッシング癒着バリア、創傷などの医療用途の数、のために承認された生分解性ポリマーである血管、骨、軟骨、神経、皮膚、食道組織工学5,9-16を含む多種多様な用途でのsed。良好な生体適合性、比較的長い生体内半減期は、十分な機械的強度、高弾性、組織工学におけるこのポリマーの普及に貢献する。創傷治癒のげっ歯類モデルにおいて、移植エレクトロスピンPCLは、非免疫原性であること、および副作用13ずに局所組織に統合することが示された。エレクトロPCLのSEM像を図1に示されている。 現在のFDAの規制基準では、小規模および大規模の両方の動物モデルにおける有効性と安全性は、PCLまたは米国での臨床試験に移行するために、他の設計のACL移植のために必要とされるであろう。さらに、in vivoでの条件は、多くの場合、in vitroでの組織工学のACLグラフトのプロパティを増大させることができます。屈筋digitorと自家ACL再建のラットモデルumの伸筋腱が以前ネイティブACLが切断された、説明したが、大腿骨と脛骨のトンネルを掘削し、移植片は、縫合糸17〜22との代わりに渡され、固定した。本稿では、設計のACL置換の評価のためではなく、自家ベースの復興のために、このモデルの修正（ 図2）を説明します。 多くの動物モデルは、靱帯組織工学のために存在するが、ラットは、多くの理由のために、より大きなモデルに比べて有利である。これらの利点は、より簡単に飼育と取り扱い、より少ない倫理的配慮、そして低コスト17,23が含まれています。また、ラットモデルは、軟骨、腱、および骨組織工学24を含む整形外科組織再生のためのモデルとして広く使用されている。具体的には、無胸腺ヌードラットを最終的な移植oを可能にする、細胞媒介性免疫応答25の欠如に起因して選択したこのモデルにおけるfの異種ドナー細胞は、さらに、将来的に操作された移植片を強化する。このメソッドの論文では、ACL再建の無胸腺ラットモデルにおける製造および無細胞の外科的移植、生分解性ポリマーのグラフトを記述する。

<table><tbody><tr><td>Medical grade ester terminated poly (&amp;epsilon;-caprolactone), granule form (MW = 110,000)</td><td><a href="http://www.absorbables.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Lactel Absorbable Polymers</a></td><td></td><td>Custom synthesized polymer to desired molecular weight</td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>105228</td><td>Solvent for PCL polymer</td></tr><tr><td>18 G x 1&amp;#189;&quot; bevel needle</td><td>BD Medical</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Remote Infuse/Withdraw Programmable Syringe Pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702101</td><td></td></tr><tr><td>VersaLaser VLS2.30 Laser Engraver</td><td>Microgeo USA</td><td>VLS2.30</td><td></td></tr><tr><td>Expanded Plasma Cleaner 115&amp;nbsp;V</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td>Plasma etch just prior to collagen coating for surface modification</td></tr><tr><td>PureCol Collagen Standard Solution, 3&amp;nbsp;mg/ml</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5015-A</td><td>Mix 8:1:2.5 solution of PureCol, 10x PBS, 0.1&amp;nbsp;N NaOH 1:9 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Suture, 5-0 Vicryl</td><td>Henry Schein</td><td>1086471</td><td></td></tr><tr><td>Suture, 4-0 Vicryl</td><td>Henry Schein</td><td>6540072</td><td></td></tr><tr><td>Sharp-pointed Dissecting Scissors (Straight; 4.5&amp;nbsp;inch)</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>Buphrenorphine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9275</td><td>Use 0.03 mg/kg for both intra- and post-operatively for pain control</td></tr><tr><td>Ampicillin, injectable</td><td>Henry Schein</td><td>1185678</td><td>Use 25 mg/kg subcutaneously during the procedure</td></tr><tr><td>K-wire, 1.6 mm</td><td>Spectrum Surgical</td><td>SI040062</td><td></td></tr><tr><td>Keith Needle, Straight 1&amp;#189;&quot;</td><td>Delasco Dermatology Lab &amp;amp; Supply</td><td>KE-112</td><td></td></tr><tr><td>Immunocal Decalcifying Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9491030</td><td></td></tr><tr><td>Opticryl Acrylic Resin Bone Cement (PMMA) (Monomer and polymer)</td><td>US Dental Depot</td><td>OPTICRYL 100410&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Instron Model 5564 Tensile Testing Machine</td><td>Instron</td><td>5564</td><td>Any comparable tensile testing apparatus is suitable</td></tr></tbody></table>

athymic rat model for evaluation of engineered anterior cruciate ligament grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

シングル外科医による92ラットの手術の我々の経験では、切開から傷の完了までの平均手術時間は4.7分の標準偏差は、16.9分であった。屠殺時に、ラットは356±23グラムの重さであった。すべてのラットはよく手術を許容し、合併症を経験していない。すぐに手術後、ラットを手術四肢に体重を支えることが認めたが、わずかにぐったりを示した。手術後1週間では、すべてのラットはありませんかなりのぐったりとambulatingた。動物はすべての給餌、排尿、または排便習慣の無い観測された異常に、研究の過程で着実に体重が増加した。臨床的には、肉眼創傷裂開、紅斑、腫脹、滲出液、または排水は術後認められなかった。 前述した92ラット手術は、このメソッドの原稿を目的として、主に行われていなかった。むしろ、様々な操作された移植片の状態を試験するために使用した。 detaileながらD機械的試験および組織学的結果は、本論文の範囲外で、より多くの詳細はレオンら 26の論文に記載されています。簡潔には、再構成に続く16週目に、区分された膝関節の組織学的分析は、足場マトリクスは、主に骨トンネル（ 図3）に優れた統合好酸球性コラーゲンを分泌する線維芽細胞によって浸潤さになったことを示した。この時点で、足場が完全に再吸収され、ポリマーの証拠は、可視化されなかった。さらに、マクロファージマーカーCD68のための免疫組織化学は、術後16週目（ 図4）で最小の炎症反応を示した。 生体力学的特性を犠牲にした直後に評価した。すべての試験した試料は、ミッド物質（ 図5）で失敗しました。引張試験から生成された荷重-変位曲線（ 図6）、破壊荷重および剛性を使用して各群について計算した。 16週間後、移植では、エレクトロスピニングポリマー移植片はすぐに移植後、テスト、移植片の約倍のピーク負荷と剛性を持っていたが、これらの値は、ネイティブACL 26よりも低かった。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52797/52797fig1.jpg" /> 図1.整列した繊維とエレクトロスピニングポリカプロラクトン足場のSEM像。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52797/52797fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52797/52797fig2.jpg" /> ACL再建の図2.無胸腺ラットモデル。膝蓋腱の（A）の単離内側傍皮膚切開経由。 （B）大腿tunneの掘削1.6ミリメートルKワイヤを用いリットル。 （C）脛骨トンネルの掘削。を通して移植片を引っ張るために大腿骨トンネルを通って1.2ミリメートルキース針の（D）の配置。 （E）エレクトロポリカプロラクトングラフトは大腿骨トンネルを通して引か。端がトリミングし、骨膜に縫合し、層状の閉鎖が行われている前に、（F）移植片は、両方の大腿骨と脛骨トンネルを引っ張った。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52797/52797fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52797/52797fig3.jpg" /> 脛骨トンネル（左）、midsubstance（中央）、および大腿骨トンネル（右）での電界紡糸ポリマーグラフト（上部）の図3ヘマトキシリンおよびエオシン染色を示す。比較のために、天然のACLは、（脛骨挿入時、（下）に示されている左）、midsubstance（CENTER）と大腿原点（右）、10倍。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52797/52797fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52797/52797fig4.jpg" /> CD68、マクロファージのマーカーで図4.比色免疫組織化学染色は。定性的には、術後グラフトの関節内領域よりも、16週で8週で骨トンネルでややポジティブ染色があるように見える。移植片における最小の炎症があるように思われる。すべての画像は20倍の倍率である。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52797/52797fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52797/52797fig5.jpg" /><br移植片のmidsubstanceで故障を示す移植されたエレクトログラフトの機械的試験の /&gt; 図5.画像、。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52797/52797fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52797/52797fig6.jpg" /> 無胸腺ラットモデルにおける移植後16週で組織工学のACL移植片については図6.サンプル荷重-変位曲線。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52797/52797fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

エンジニアード前十字靭帯移植片の評価のための無胸腺ラットモデル

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

athymic-rat-model-for-evaluation-engineered-anterior-cruciate

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.3K ビュー.  University of California Los Angeles. Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

ビデオ: Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical deficiencies that impair function and stability. Current options for the treatment of partial ACL tears range from nonoperative, conservative management to multiple surgical options, such as: thermal modification, single-bundle repair, complete reconstruction, and reconstruction of the damaged portion of the native ligament. Few studies, if any, have demonstrated any single method for management to be consistently superior, and in many cases patients continue to demonstrate persistent instability and other comorbidities.
The goal of this study is to identify a potential cell source for utilization in the development of a tissue engineered patch that could be implemented in the repair of a partially torn ACL. A novel protocol was developed for the expansion of cells derived from patients undergoing ACL reconstruction. To isolate the cells, minced hACL tissue obtained during ACL reconstruction was digested in a Collagenase solution. Expansion was performed using DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin (P/S). The cells were then stored at -80 &#186;C or in liquid nitrogen in a freezing medium consisting of DMSO, FBS and the expansion medium. After thawing, the hACL derived cells were then seeded onto a tissue engineered scaffold, PLAGA (Poly lactic-co-glycolic acid) and control Tissue culture polystyrene (TCPS). After 7 days, SEM was performed to compare cellular adhesion to the PLAGA versus the control TCPS. Cellular morphology was evaluated using immunofluorescence staining. SEM (Scanning Electron Microscope) micrographs demonstrated that cells grew and adhered on both PLAGA and TCPS surfaces and were confluent over the entire surfaces by day 7. Immunofluorescence staining showed normal, non-stressed morphological patterns on both surfaces. This technique is promising for applications in ACL regeneration and reconstruction.

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

For future applications as a patch to repair partial tears of the Anterior Cruciate Ligament (ACL), human ACL derived cells were isolated from tissue obtained during reconstructive procedures, expanded in vitro and grown on tissue engineered scaffolds. Cellular adhesion and morphology was then performed to confirm biocompatibility on scaffold surface.

外科用回収、単離と<em&gt;インビトロ</em&gt;組織工学アプリケーションのためのヒト前十字靭帯由来細胞の拡大

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

生物工学

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, and translation of findings is often poor. Thus, there is ample opportunity for alternative experimental approaches. Here we present an approach in which human cells are isolated from human anterior cruciate ligament tissue remnants, expanded in culture, and used to form engineered ligaments. Exercise alters the biochemical milieu in the blood such that the function of many tissues, organs and bodily processes are improved. In this experiment, ligament construct culture media was supplemented with experimental human serum that has been &#39;conditioned&#39; by exercise. Thus the intervention is more biologically relevant since an experimental tissue is exposed to the full endogenous biochemical milieu, including binding proteins and adjunct compounds that may be altered in tandem with the activity of an unknown agent of interest. After treatment, engineered ligaments can be analyzed for mechanical function, collagen content, morphology, and cellular biochemistry. Overall, there are four major advantages versus traditional monolayer culture and animal models, of the physiological model of ligament tissue that is presented here. First, ligament constructs are three-dimensional, allowing for mechanical properties (i.e., function) such as ultimate tensile stress, maximal tensile load, and modulus, to be quantified. Second, the enthesis, the interface between boney and sinew elements, can be examined in detail and within functional context. Third, preparing media with post-exercise serum allows for the effects of the exercise-induced biochemical milieu, which is responsible for the wide range of health benefits of exercise, to be investigated in an unbiased manner. Finally, this experimental model advances scientific research in a humane and ethical manner by replacing the use of animals, a core mandate of the National Institutes of Health, the Center for Disease Control, and the Food and Drug Administration.

We present a model of ligament tissue in which three-dimensional constructs are treated with the human exercise-conditioned serum and analyzed for collagen content, function, and cellular biochemistry.

運動調節血清による靭帯構築物の治療：翻訳組織工学モデル

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

A Reliable and Reproducible Critical-Sized Segmental Femoral Defect Model in Rats Stabilized with a Custom External Fixator

Orthopedic research relies heavily on animal models to study mechanisms of bone healing in vivo as well as investigate the new treatment techniques. Critical-sized segmental defects are challenging to treat clinically, and research efforts could benefit from a reliable, ambulatory small animal model of a segmental femoral defect. In this study, we present an optimized surgical protocol for the consistent and reproducible creation of a 5 mm critical diaphyseal defect in a rat femur stabilized with an external fixator. The diaphyseal ostectomy was performed using a custom jig to place 4 Kirschner wires bicortically, which were stabilized with an adapted external fixator device. An oscillating bone saw was used to create the defect. Either a collagen sponge alone or a collagen sponge soaked in rhBMP-2 was implanted into the defect, and the bone healing was monitored over 12 weeks using radiographs. After 12 weeks, rats were sacrificed, and histological analysis was performed on the excised control and treated femurs. Bone defects containing only collagen sponge resulted in non-union, while rhBMP-2 treatment yielded the formation of a periosteal callous and new bone remodeling. Animals recovered well after implantation, and external fixation proved successful in stabilizing the femoral defects over 12 weeks. This streamlined surgical model could be readily applied to study bone healing and test new orthopedic biomaterials and regenerative therapies in vivo.

In vivo mammalian models of critical-sized bone defects are essential for researchers studying healing mechanisms and orthopedic therapies. Here, we introduce a protocol for the creation of reproducible, segmental, femoral defects in rats stabilized using external fixation.

ラットのカスタム創外固定器で安定した信頼性と再現性のある重要なサイズ分節大腿骨欠損モデル

Orthopedic research relies heavily on animal models to study mechanisms of bone healing in vivo as well as investigate the new treatment techniques. ...

Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across species, combined with the limited healing properties of this tissue, have prompted the search for cellular therapies and propelled the development of experimental models to study their efficacy. Umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem cells (UCM-MSC) are appealing candidates because they are abundant, easy to collect, circumvent the ethical concerns and risk of teratoma formation, yet resemble primitive embryonic stem cells more closely than adult tissue-derived MSCs. Significant interest has focused on chitosan as a strategy to enhance the properties of MSCs through spheroid formation. This paper details techniques to isolate UCM-MSCs, prepare spheroids on chitosan film, and analyze the effect of spheroid formation on surface marker expression. Consequently, creation of a bilateral patellar tendon injury model in rats is described for in vivo implantation of UCM-MSC spheroids formed on chitosan film. No complication was observed in the study with respect to morbidity, stress rising effects, or tissue infection. The total functional score of the operated rats at 7 days was lower than that of normal rats, but returned to normal within 28 days after surgery. Histological scores of tissue-healing confirmed the presence of a clot in treated defects evaluated at 7 days, absence of foreign body reaction, and progressing healing at 28 days. This bilateral patella tendon defect model controls inter-individual variation via creation of an internal control in each rat, was associated with acceptable morbidity, and allowed detection of differences between untreated tendons and treatments.

This paper describes the preparation and evaluation of umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem cells spheroids with a bilateral patellar tendon defect model in a rat. This model was associated with an acceptable morbidity and was found to detect differences between untreated and treated tendons, and between the two treatments tested.

ラットの両側膝蓋腱損傷モデルの幹細胞療法の評価

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across ...

医学

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely correlated with a history of articular cartilage damage and ligament avulsion. Surgical animal models of OA of the knee play an important role in understanding the onset and progression of post-traumatic OA and aid in the development of novel therapies for this disease. However, non-surgical models have been recently considered to avoid traumatic inflammation that could affect the evaluation of the intervention. 
In this study, an intra-articular cartilage lesion rat model induced by in vivo cyclic compressive loading was developed, which allowed researchers to (1) determine the optimal magnitude, speed, and duration of load that could cause focal cartilage damage; (2) assess post-traumatic spatiotemporal pathological changes in chondrocyte vitality; and (3) evaluate the histological expression of destructive or protective molecules that are involved in the adaptation and repair mechanisms against joint compressive loads. This report describes the experimental protocol for this novel cartilage lesion in a rat model.

Here, we present the cyclic loading-induced intra-articular cartilage lesion model of the rat knee, generated by 60 cyclic compressions over 20 N, resulting in damage to the femoral condylar cartilage in rats.

ラット膝の周期的負荷誘発関節内軟骨病変モデルを生成するための非侵襲的方法

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...

Development and Evaluation of a Rat Model of Full-Thickness Cartilage Defects

Cartilage defects of the knee joint caused by trauma are a common sports joint injury in the clinic, and these defects result in joint pain, impaired movement, and eventually, knee osteoarthritis (kOA). However, there is little effective treatment for cartilage defects or even kOA. Animal models are important for developing therapeutic drugs, but the existing models for cartilage defects are unsatisfactory. This work established a full-thickness cartilage defects (FTCD) model by drilling holes in the femoral trochlear groove of rats, and the subsequent pain behavior and histopathological changes were used as readout experiments. After surgery, the mechanical withdrawal threshold was decreased, chondrocytes at the injured site were lost, matrix metalloproteinase MMP13 expression was increased, and type II collagen expression decreased, consistent with the pathological changes observed in human cartilage defects. This methodology is easy and simple to perform and enables gross observation immediately after the injury. Furthermore, this model can successfully mimic clinical cartilage defects, thus providing a platform for studying the pathological process of cartilage defects and developing corresponding therapeutic drugs.

This protocol establishes a full-thickness cartilage defects (FTCD) model by drilling holes in the femoral trochlear groove of rats and measuring the subsequent pain behavior and histopathological changes.

全層軟骨欠損ラットモデルの開発と評価

Cartilage defects of the knee joint caused by trauma are a common sports joint injury in the clinic, and these defects result in joint pain, impaired ...

Implantation of Electrospun Vascular Grafts with Optimized Structure in a Rat Model

Here, we present a protocol to fabricate macroporous PCL vascular graft and describe an evaluation protocol by using a rat model of abdominal aorta replacement. The electrospun vascular grafts often possess relatively small pores, which limit cell infiltration into the grafts and hinder the regeneration and remodeling of the neo-arteries. In this study, PCL vascular grafts with thicker fibers (5 - 6 &#181;m) and larger pores (~30 &#181;m) were fabricated by using a modified processing technique. The long-term performance of the graft was evaluated by implantation in a rat abdominal aorta model. Ultrasound analysis showed that the grafts remained patent without aneurysm or stenosis occurring even after 12 months of implantation. Macroporous structure improved the cell ingrowth and thus promoted tissue regenerated at 3 months. More importantly, there was no sign of adverse remodeling, such as calcification within the graft wall after 12 months. Therefore, electrospun PCL vascular grafts with modified macroporous processing hold potential to be an artery substitute for long-term implantation.

Here, we present a modified electrospinning method to fabricate PCL vascular grafts with thick fibers and large pores, and describe a protocol to evaluate the in vivo performance in a rat model of abdominal aorta replacement.

エレクトロスピニング ラットモデルにおける最適化された構造を有する人工血管の移植

Here, we present a protocol to fabricate macroporous PCL vascular graft and describe an evaluation protocol by using a rat model of abdominal aorta ...

生物学

非侵襲的ACL損傷と手術がマウスのプロテアーゼ活性に及ぼす影響

Non-Invasive Compression-Induced Anterior Cruciate Ligament (ACL) Injury and In Vivo Imaging of Protease Activity in Mice

Traumatic joint injuries such as anterior cruciate ligament (ACL) rupture or meniscus tears commonly lead to post-traumatic osteoarthritis (PTOA) within 10-20 years following injury. Understanding the early biological processes initiated by joint injuries (e.g., inflammation, matrix metalloproteinases (MMPs), cathepsin proteases, bone resorption) is crucial for understanding the etiology of PTOA. However, there are few options for in vivo measurement of these biological processes, and the early biological responses may be confounded if invasive surgical techniques or injections are used to initiate OA. In our studies of PTOA, we have used commercially available near-infrared protease activatable probes combined with fluorescence reflectance imaging (FRI) to quantify protease activity in vivo following non-invasive compression-induced ACL injury in mice. This non-invasive ACL injury method closely recapitulates clinically relevant injury conditions and is completely aseptic since it does not involve disrupting the skin or the joint capsule. The combination of these injury and imaging methods allows us to study the time course of protease activity at multiple time points following a traumatic joint injury.

著者スポットライト:変形性関節症の進行に対するACL損傷の初期イベントと長期的影響の調査

Non-invasive ACL injury is a reliable and clinically relevant method for initiating post-traumatic osteoarthritis (PTOA) in mice. This injury method also allows for in vivo quantification of protease activity in the joint at early time points post-injury using protease-activatable near infrared probes and fluorescence reflectance imaging.

マウスにおける非侵襲的圧迫誘発性前十字靭帯(ACL)損傷とプロテアーゼ活性の in vivo イメージング

Traumatic joint injuries such as anterior cruciate ligament (ACL) rupture or meniscus tears commonly lead to post-traumatic osteoarthritis (PTOA) within ...

エンジニアード前十字靭帯移植片の評価のための無胸腺ラットモデル

要約

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外科用回収、単離と

運動調節血清による靭帯構築物の治療：翻訳組織工学モデル

ラットのカスタム創外固定器で安定した信頼性と再現性のある重要なサイズ分節大腿骨欠損モデル

ラットの両側膝蓋腱損傷モデルの幹細胞療法の評価

ラット膝の周期的負荷誘発関節内軟骨病変モデルを生成するための非侵襲的方法

全層軟骨欠損ラットモデルの開発と評価

エレクトロスピニングラットモデルにおける最適化された構造を有する人工血管の移植

マウスにおける非侵襲的圧迫誘発性前十字靭帯(ACL)損傷とプロテアーゼ活性の in vivo イメージング

マウスにおける非侵襲的圧迫誘発性前十字靭帯(ACL)損傷とプロテアーゼ活性の in vivo イメージング

マウスにおける非侵襲的圧迫誘発性前十字靭帯(ACL)損傷とプロテアーゼ活性の in vivo イメージング

エンジニアード前十字靭帯移植片の評価のための無胸腺ラットモデル

要約

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外科用回収、単離と

運動調節血清による靭帯構築物の治療：翻訳組織工学モデル

ラットのカスタム創外固定器で安定した信頼性と再現性のある重要なサイズ分節大腿骨欠損モデル

ラットの両側膝蓋腱損傷モデルの幹細胞療法の評価

ラット膝の周期的負荷誘発関節内軟骨病変モデルを生成するための非侵襲的方法

全層軟骨欠損ラットモデルの開発と評価

エレクトロスピニング ラットモデルにおける最適化された構造を有する人工血管の移植

マウスにおける非侵襲的圧迫誘発性前十字靭帯(ACL)損傷とプロテアーゼ活性の in vivo イメージング

マウスにおける非侵襲的圧迫誘発性前十字靭帯(ACL)損傷とプロテアーゼ活性の in vivo イメージング

マウスにおける非侵襲的圧迫誘発性前十字靭帯(ACL)損傷とプロテアーゼ活性の in vivo イメージング

エレクトロスピニングラットモデルにおける最適化された構造を有する人工血管の移植