私たちは緊張のため (国立衛生研究所 (NIH) 事務所の研究基盤プログラム P40 OD010440 出資) 線虫の遺伝学センターを感謝します。著者は、建設的なフィードバック、ccny、撮影の部分と彼らの支援のための彼らの実験室の使用のためニューヨーク市立大学真野研究室をご提供するバティスト Roelens と Eli Lessman を感謝したいです。この作品は、PSC CUNY 賞 TRADB-46-113 支えられて、NIH 付与 1SC2GM118275-01。社は、NIH/日の出の上昇によって支えられ、修士は健康 (機構) サキヤマ, のカナダの研究所によって部分的に支持された GM062981 を付与します。

1. セットアップrec 8 RNAi (図 2の 1-3 日)
このプロトコルは、Kamath および Ahringer30から変更されます。
<ol><li>エシェリヒア属大腸菌のrec 8 dsRNA 式の誘導、準備最終濃度 1 mM イソプロピル-β-D-2-thiogalactopyranoside (IPTG) と 100 μ g/mL を添加した線虫成長媒体 (NGM) 寒天培地プレート31アンピシリン。4 週間までの使用まで 4 ° C で暗闇の中で保管します。</li>
	<li>ストリーク HT115 細菌が 100 μ g/mL アンピシリン 50 μ G/ml テトラサイクリンと補われるルリア スープ (LB) プレートの上に Ahringer 研究所図書館30 rec 8クローンからrec 8 (W02A2.6) クローンを運ぶします。37 ° C でシェーカーで一晩成長します。</li>
	<li>1 日目に 4 mL LB 含む 100 μ g/mL アンピシリンと 50 μ G/ml テトラサイクリンにrec 8 RNAi クローンを行う HT115エシェリヒア属大腸菌細菌のたてすじ状シングル コロニーからシングル コロニーを接種します。シェーカーや 37 ° C でローラー ドラムで一晩細菌文化を成長します。</li>
	<li>次の朝 (日 2)、二本鎖 (ds) RNA rec 8 W02A2.6 37 ° C で 40 分間揺れを最終濃度 1 mM IPTG を追加して HT115 の細菌文化のための生産を誘発します。</li>
	<li>誘導後、NGM/IPTG HT115 rec 8細菌の 100-200 μ L をシードし、暗い一晩 (日 3) で室温でプレートを格納します。</li>
	<li>翌朝 (日 4) は、手順 2.1 以下で説明するよう誘導 HT115 rec 8細菌プレートに希望の線虫のひずみを追加します。</li>
</ol>2. 生成および四倍体 (図2 4 16 日) を分離すること
<ol><li>4 日目の 3-4 ヤング NMG/IPTG プレート二倍体ひずみの L4 (4) 幼虫の両性具有は前日に誘導されていた HT115 rec 8細菌とシードを配置 (上記 1.5 を手順)。暗闇の中で 15 ° C で線虫を成長します。</li>
	<li>3 日前に最初の子孫 (F1s) そのステップからなる L4s となる 1.3 と 1.4 の手順 2.1 後、3 日を開始手順を繰り返します。このステップのタイミングどれだけ速く線虫のひずみは、15 ° C での成長に依存します。遅い栽培者であり、このタイミングは微調整が必要ないくつかの二倍体の突然変異系統四倍体を隔離するためのチューニングします。</li>
	<li>(4 日後rec 8 RNAi 摂食治療) は 8 日、F1 (雑種第一代) L4 の両性具有をたて誘導 HT115 rec 8 RNAi に HT115 rec 8細菌の成長の 20 (2 の両性具有/シャーレ) を転送でき、self-fertilize へのそれら。<ol>
<li>また、転送 20 F1 L4 の両性具有のたてに HT115 rec 8細菌の成長は、同じひずみ (両性具有 2 4 6 男性/プレート) の未処理の男性と一緒に HT115 rec 8 RNAi 細菌を誘導しました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>日 13 日スタート表示長い子孫 F2 (雑種第二世代) のスクリーニング (Lon) にまたは全体的に野生型よりも大きい大腸菌の細菌の正規 OP50 や HB101 系統に経度個体を転送します。F3 (第三孝) 子孫; をスクリーニングを継続します。しかし、同じプレートから F3 子孫が定着する場合独立した系統は考慮できません、同じ兄弟で既に F2 母なる可能性があります。 注: 切片よりも明らかに長いので、推定四倍体、簡単に識別されます。野生型の両性具有は、四倍体より短い 3 分の 2 です。長いので、4 倍体になります余分なターン (図 3 a) の尾に頭から体曲げ波の正弦波を生成することによって進みます。</li>
	<li>Self-fertilize、経度子孫のみがrec 8 RNAi 治療の不在で子までイオンの子孫を選択することにより伝達する経度ワームを許可します。これは、2、3 追加世代をかかることがあります。経度ワームしばしば無菌のものであり、子孫に譲歩しません。</li>
</ol>3. 四倍体系統 (映画 1 および図 3 a, B) を確認します。
注: 自分の卵子の染色体の数を数えることによって四倍体系統を検証できます。蛍光顕微鏡を使用することができますひずみに染色体の蛍光マーカーがある場合、卵子 (前に減数分裂の部門) では、二倍体の染色体対の数の画面に。蛍光染色体マーカーがない場合は、四倍体線虫は線虫を固定および DNA 色素で染色によって選別することができます。エタノールを修正し、全体の動物 4 ′ のためのプロトコルについては後述 6-Diamidine-2-phenylindole 二塩酸塩 (DAPI) 染色します。
<ol><li>全体の動物 DAPI 染色 注: これらの動物を染色し、その卵子の DAPI 体の数を数える DAPI によって 12 接続された染色体のペアを運ぶ四倍体系統を検証できます。<ol>
<li>M9 バッファー31顕微鏡スライド上の 10 μ L を場所 5 ドロップ 6-10 線虫を転送します。</li>
		<li>解剖顕微鏡の下で糸くずクリーニング ティッシュで線虫を削除せずドロップから M9 のほとんどを描画します。すぐにワームに 90% のエタノールの 10 μ L のドロップを追加します。もはや秒のカップルよりも完全に、しかしのために乾燥するワームを許可します。</li>
		<li>エタノールが蒸発すると同時に (これともいえる解剖顕微鏡の下でそれが起こる)、ワームに 90% のエタノールの追加の 10 μ L を追加。</li>
		<li>3.1.3 のステップを 3 回繰り返します。</li>
		<li>エタノールの最後の一滴が蒸発した後の選択 (たとえば、M9 の 2 ng/μ L の DAPI ストック濃度の縮尺希釈) マウント メディア推奨の最終濃度に DAPI やヘキスト染料 6 μ L を追加します。スライドの長期保管は、0.5 %p-フェニレンジアミン M9 のみではなく 20 mM antifade ソリューションとして 90% のグリセロールの pH 8.8, トリス塩酸に溶解を使用する可能性があります。</li>
		<li>観察のスライドにワームをカバーし、マニキュア液をカバーガラスの端を密封します。蛍光顕微鏡 (ステップ 3.1.7) のスコア、coverslip を追加した後、少なくとも 10 分。4 ° C で数日間、得点する前に antifade することがなくスライドを格納できますが、蛍光性は数日後減少を開始します。</li>
		<li>100 倍の倍率で蛍光顕微鏡を用いた、交尾に隣接し、まだ入力していない、交尾、最も成熟した未受精卵細胞単一 DAPI ボディ (おそらく単一の染色体のペア) の数をスコアまたは子宮。<ol>
<li>卵母細胞の核内にある個々 の DAPI 体をスコア、カウント中に底に卵母細胞核の上からゆっくりと移動する顕微鏡のファインフォーカスを使用します。次に、DAPI ボディのカウント数を確認する反対の方向 (すなわち、下核の上から) にフォーカスを移動しながら同じ核を再集計します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>安定したイオン株あたり少なくとも 10 個の両性具有の 2 つの生殖腺の最も成熟した未受精卵をスコアします。野生型の卵母細胞は、平均、5 型のペア、および性染色体のペアに 6 の DAPI のボディを持っています。安定したイオン株の卵母細胞に 12 の DAPI 体の存在ことを示しますこのひずみの動物部分 (3 より座位の 4 セット) または完全な (座位、4 よりの 4 セット) 四倍体。</li>
		<li>DAPI 体ひずみあたり複数の (少なくとも 10) 卵から観察の平均数を計算します。いくつかの染色体のペアになるでしょうか、右側 1 つ別、DAPI の数体の卵のための上部が染色体ペアの実際の数よりも小さい頻繁。</li>
		<li>(省略可能)DAPI 体の平均数が 12 (4 a, 4 X) の全体または一部 (4 a、3 X) であるかどうかをテストするのには安定したイオン株をさらに検証 HTP 332など染色体軸蛋白質に対して染色蛍光抗体法によって四倍体。この染色は、単一の接続されていない染色体部分の四倍体で存在から十字形パターンを示すことによって染色体のペアを区別します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

半数体 (n) 配偶子の受精で二倍体 (2 n) の受精卵を生成するキーです。ゲノムのこの減少は、2 つ連続して細胞分裂と減数分裂の間単一ゲノム重複後に達成されます。半数体を生成する配偶子、線虫、他のほとんどのリザーバーと分離第一部門で母性と父性の由来同族体に対し妹各相同から染色分け体は 2 部で分離します。ゲノムの倍数性が自然に発生する方法 1 つはゲノムのサイズの半分に減数分裂に失敗した配偶子の生成です。
その倍が 50 年以上にわたって知られているC. elegans線虫が実行可能、肥沃な。ニゴン:23と後から Madl とハーマン22、生成され、減数分裂期染色体分離を中断することによって線虫四倍体の一握りを識別熱ショック療法を使用して、それぞれ遺伝子マーカーを使用します。追加シングルc. briggsae四倍体株は 30 年以上このプロトコルを使用して派生した後24。これらの四倍体は線虫を調べるになったり男性両性、倍数性成長とサイズを調節する方法とペアリングと減数分裂25,26,でシナプスを分析するかどうかを調査を利用しました。38,39,40。 まだこれらと他の研究は、特定の四倍体、三倍体系統を使用する必要がこのメソッドによって四倍体菌株を生成する難易度が限られていた。
ここで説明されているプロトコルは安定したフル 4 a, 4 X の生成を有効化や二倍体遺伝的背景の初期部分 4 a、3 X 4 倍体線虫線虫株いずれかから遺伝標識を使用せず核型
Tetraploidy線虫のメカニズムの 1 つ以上発生します。
Madl とハーマンは、彼らは可能性があります生成された四倍体系統が三倍体中間状態から派生したことを示唆しました。彼らの緊張は、複数世代にわたって、推定三倍体、二倍体雄22の中間を交差選択により得られました。染色体が二倍体の卵細胞と精子を生じrec 8変異体の分割の欠陥は、 rec 8 RNAi 方式27四倍体の動物を生じる別の可能な機構を提案します。
二倍体の卵母細胞、精母細胞、受精時に四倍体の動物に上昇を与える、 rec 8 RNAi 扱われる両性具有は作り出すことができます。この可能性と一貫性のあることクローンとして作られた F2 の両性具有のいくつかに上昇した安定した経度系統示唆している次世代のクローンの経度 F2 両性具有という事実は、ここで既に四倍体。交差方式でrec 8 RNAi 扱われる両性具有の第一世代は未処理の男性と交差します。二倍体精母細胞まだ男性十字架はrec 8 dsRNA を表現する細菌の存在下で行われ、したがって、男性、少なくとも 3 日間交尾中にrec 8 RNAi にさらされているので起こることができます。したがって、cross-fertilizing 方式で経度倍数体にも二倍体の卵母細胞の受精から形成二倍体精子があること。安定した四倍体系統は、二倍体の配偶子の間どちら施肥や半数体精子を生産 2 倍体の動物と変数の倍数性の卵母細胞を含む三倍体の動物の交差から生じることがあります。
重要な考慮事項:
自己・受精と:
Rec 8 RNAi を自殖性の方式は、F1 の両性具有を扱われ、未処理男性両方で扱われる両性具有の交差を含むスキームは、4 a、4 X に上昇を与えた、4 a、3 X 4 倍体系統。多くの倍数体が自家受精のスキームから最初に分離されたものの、これらの倍数性動物の多くが滅菌された、両方の方式ある同様に効率的に生産四倍体の安定株。高められた成功と自己肥やすスキームにおける不稔発生の理由は不明のまま。両方の方式が同様に効率的、自家受精方式交配のため男性の分離を必要としない簡単です。さらに、関心のひずみが非能率的なかで嵌合不良、自家受精方式が望ましかった。Cross-fertilizing スキームは、単一の染色体の 2 つ以上のバージョンを含む複雑な四倍体を生成に使用する可能性があります。
変更と限界:
現在、このプロトコルには、 rec 8遺伝子の dsRNA を表現する細菌を供給することによりrec 8 RNAi 治療が含まれます。したがって、このプロトコルでは働きません線虫種 RNAi に応答しない給電、または変異体組織41,42,43の RNAi の環境または全身性のスプレッド。生殖に直接関心の dsRNA の直接注入による RNAi 治療を導入することによりこの問題を解決可能性があります可能性があります。
三倍体の動物は、この方式は、安定した三倍体系統44,45を生成しませんので、派生した二倍体動物に四倍体を交配することによって生成されなければなりません。卵の 15% だけは、三倍体ハッチによって気もち、彼らの子孫は異数性による滅菌子孫主です。さらに、ほとんどの存続の肥沃な子孫は数世代以内完了前後の切片をする傾向がありません。これはおそらく、少なくとも部分的には、卵母細胞が第一減数分裂で極体に 3 番目の染色体を分離してトリソミーを部分的に修正されているので。
このプロトコルの克服できない制限は、RNAi 治療46にくいので RNAi 機械のコンポーネントに影響を与える突然変異体の四倍体を作るため働かないことです。
トラブルシューティング。
rec 8 RNAi:
いくつかの考慮事項が成功するためにこのプロトコルの重要です。最初は、 rec 8 dsRNA rec 8 (W02A2.6) クローンを行う細菌 HT115 細菌産生の誘導に新鮮な IPTG とたて IPTG NMG プレートを使用することです。IPTG は光に敏感とプレートに光の露出を減らすことが重要です。IPTG プレートは、暗闇の中で 4 ° C で 1 ヶ月分保存できます。第二に、Ahringer ライブラリ (Kamath および Ahringer 2003) からのrec 8 (W02A2.6) の RNAi 細菌 HT115 の緊張は他の利用可能なrec 8よりも強いrec 8表現型の HT115 クローンをもたらした。
四倍体のひずみのメンテナンス:
四倍体系統は非常にゆっくりと成長し、世代47あたりせいぜい 50 後代を生成します。すべての識別された四倍体系統が比較的安定しているが、打破でき、二倍体のとき強調 (ジョナサン ・ ホジキン個人的なコミュニケーションと未発表察) になります。したがって、餓死、25 ° c で熱ショックによる四倍体系統が栽培されてまたは冷凍、吉濱彼ら急速に戻すことがクラシファイヤシステム、これらの系統を解凍するときにイオン動物を選ぶを継続する上で重要なまたはときに注意することが重要です。これら系統に戻すそれらを引き起こす可能性がありますストレスの多い状況を公開します。
可能なアプリケーション:
効果の調査または多細胞生物における遺伝子発現、細胞周期進化ゲノム polyploidization の役割の比較に依存している: 同じセル異なる倍数を含む有機体のセル種類に密接に関連して異なる倍数性種や進化的近況 polyploidization および物理的な分離3,5,6,7,8 を受けた種 ,11,18,19,20,48,49,50。四倍体は、ゼブラフィッシュおよびマウスのモデル システムから派生することができます、彼らの子孫は滅菌または致命的な強肩16,17。また、これらのモデル システムc. の elegansに比べて長いライフ サイクル、倍数体の動物を生成する使用可能なメソッドは、複雑で非効率的な.したがって、このメソッドによって派生した線虫の系統は効果と全ゲノム多細胞生物における倍数性のロールに任意の調査を促進するため尽力されます。
三倍体は、元の二倍に、四倍体を交配することによって四倍体から派生することができます、ので二倍体、三倍体、四倍体ゲノムのコピーの数の表記だけが異なると比較がユニークで前例のない機会を提供します異なるゲノムのサイズ (または遺伝子投与) の等価動物、器官、細胞を評価します。柔軟性とここで説明した方式の容易さ二倍体の異なる遺伝的背景や染色体から四倍体株の多数を生成することができました。これらの系統の一部は既に減数分裂27の間に相同染色体対とシナプスのクエリ メカニズムに使用されました。
蛍光マーカーを運ぶ野生型と変異体の四倍体系統はスケーリング、全ゲノム細胞内/携帯/オルガンと全体の動物のゲノムのサイズと核/細胞質比の間の関係を理解するための調査の新しい道を提供します。適応、種分化、遺伝子量と表現、および組織と器官の開発に polyploidization。生物学的スケーリングに関する研究、ほか四倍体系統の世代が大幅さらに細胞外シグナル、ゲノム不安定性、表現、全ゲノムに関連する基本的な生物学的質問のクエリ重複、遺伝子量、ストレス、医薬品、および種分化の機構への抵抗の開発に適応。

全ゲノム倍数体が自然界に存在する、適応、種分化、器官形成、創傷治癒および生物学的スケーリング; 必要なステップで多くの場合がんと薬1,2,3,4,5,6,7,8,への抵抗を促進するために知られているも9,10,11,12. 農業・水産業化学処理 (例えばコルヒチン、orzalin) より高速な成長率とかさばる作物と家畜13,を取得する倍数性植物、魚および貝を生成する14,15。四倍体の実験と非効率的な生産は、マウスやゼブラフィッシュ モデル システム16,17に存在します。ただし、生成されるほとんどまたはすべての倍数性の多細胞動物は強肩致死または生殖不能およびこうして多細胞の有機体の倍数性の影響に関する実験的研究には適していません。その結果、多細胞生物におけるゲノム polyploidization のいずれかを理解されている限られた密接に関連種に進化最近 polyploidization イベント18,19,20 から.生物学的役割のクエリまたは polyploidization の結果を事前にパス線虫モデル システムの使用であります。重要なは、線虫は通常、二倍体として存在するのみ 5 常染色体 (A) とゲノムあたり 1 つの性染色体 (X) が含まれている、生物学的過程の生体内観察用透明になりますが扱いやすい遺伝的システムと(性的に成熟した大人に卵) から 3-4 日の短いライフ サイクルがあります。線虫ゲノム自然に倍数性の最も一般的なタイプは、四倍体として再現できるように示されています。三倍体の動物は、二倍体と四倍体を交配することによって生成できます、その倍数性が不安定で、世代のカップル以内に二倍体系統になります。
最後の数十年でほんの一握り実行可能、肥沃な線虫の四倍体系統で分離された研究室は骨の折れるし系統21,22,限られた種類のみを生成する戦略を使用して23. この戦略はおそらく遺伝マーカーを用いた推定の倍数性動物のためのスクリーニングに続いて、配偶子の染色体分配に影響を与える熱ショック処理による線虫の四倍体を生成します。これらの四倍体は、この線虫が男性または両性具有になるかどうかを決定する方法のお問い合わせに非常に有益だった。その後の研究は、成長、遺伝子量とこの線虫21,24,25,26の減数分裂期にシナプスの規制を検討するのに利用可能な系統を使用しました。残念ながら、これらの研究は、これらの系統に含まれる新しい四倍体系統と背景遺伝子マーカーを生成するの難しさによって限られていた。ここに示す、減数分裂27の間にシナプスの制御を勉強する菌株を生成するために使用されている安定した四倍体を生成する簡単かつ迅速なプロトコルです。
自然、半数体の配偶子ではなく二倍体の形成によって polyploidization が発生します。四倍体の子孫 (図 1)27の生産に減数分裂固有コヒーシン コンポーネント変異rec 8倍精子を生成して、 rec 8遺伝子ノックダウン卵母細胞が示された私達の見つけることになります 28,29。四倍体菌株を生成する単にノックダウンrec 8 RNA 干渉 (RNAi) phenocopy rec 8に 2 つの世代のために突然変異体の二倍体の配偶子が含まれます。彼らの長いによって推定される倍数体を簡単に識別できます通常の体のサイズよりも。倍数体は、安定したラインが確立されたら核あたりの染色体の数を数えることによって完全または部分的な四倍体で確認しています。
ここで説明されている方法では、初期の二倍体遺伝的背景または遺伝標識を使用せず核型から安定した四倍体の線虫線虫の系統の生成を可能。 にします。このプロトコルはより効率的、汎用性の高い、かつ以前を使用する方式よりも単純なため、拡大する開発、ゲノムの安定性と多細胞の進化の基本的なプロセスで polyploidization の役割を照会するために必要なツール生物。このプロトコルの使用で唯一可能な制限は、RNAi に耐性の遺伝的背景です。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Motic Microscopy</td>
			<td>SMZ171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM agar plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>T3305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>T3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological Agar, 5 kg</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89140-850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride, Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone, BD Bacto</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Trihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG, dioxane-free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Lennox Broth</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>89126-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Lennox</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>89126-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Trihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP912-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Fixation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP</td>
			<td>Koptec, VWR</td>
			<td>89125-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate, monobasic dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC271750025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Clones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA</td>
			<td>Source Bioscience</td>
			<td>W02A2.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>RCE1182-202299820</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulation of ploidy in caenorhabditis elegans

全ゲノム倍数体を含む機構開発と進化に重要な役割を再生します。また、四倍体細胞の異常発生は両方の癌の進行と薬剤耐性の開発に関連付けられています。今までは、ほとんど無菌子孫を生成することがなく、多細胞動物の倍数性を簡単に操作することはなかった。四倍体線虫を生成するための簡単かつ迅速なプロトコルは、ここで提示された任意の二倍体のひずみからの動物。このメソッドでは、最終的にc. の elegansの倍数性を増加、減数分裂期の染色体分離のバイアスを作成することができます。この戦略は、二倍体の配偶子を生成するrec 8遺伝子の発現の一時的な減少に依存します。Rec 8変異体には、受精時に四倍体を作り出すことができる可能性のある二倍体の配偶子が生成されます。この扱いやすいスキームは、四倍体株の突然変異とのペアリングと減数分裂におけるシナプスの間に染色体の動態と相互作用への洞察力を得るために染色体の語順換えを運ぶを生成する使用されています。このメソッドは、遺伝マーカーなし安定した四倍体菌株を生成する効率的です、任意の二倍体のひずみに適用することができます、使用、三倍体のc. の elegansを派生できます。この直接的な方法はゲノムの不安定性、遺伝子量、生物学的スケーリング、細胞シグナル伝達、適応ストレス、薬剤への抵抗の開発に関連するその他の基本的な生物学的質問を調査するため役に立つと種分化の機構。

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Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

このメソッドは、任意の二倍体のひずみから四倍体、三倍体線虫寄生線虫の生成できます。このメソッドによって生成される倍数体の系統は、減数分裂の前期では、染色体の相互作用の研究に使用されているし、このメソッドはセル、発達、進化、および癌生物学の重要な基本的な質問を調べる際に役立ちます。

カエノラブディティス ・ エレガンスにおける倍数性の操作

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

manipulation-of-ploidy-in-caenorhabditis-elegans

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

10.9K ビュー.  City University of New York. このメソッドは、任意の二倍体のひずみから四倍体、三倍体線虫寄生線虫の生成できます。このメソッドによって生成される倍数体の系統は、減数分裂の前期では、染色体の相互作用の研究に使用されているし、このメソッドはセル、発達、進化、および癌生物学の重要な基本的な質問を調べる際に役立ちます。

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Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

植物病原体の遺伝子操作<em&gt;ウスチラゴmaydis</em&gt;真菌生物と植物微生物相互作用を研究します

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

遺伝学

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

でヒストンminiSOGを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発<em&gt; C。エレガンス</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus allowing a single investigator to screen more treatments or conditions over the same amount of time without loss of data quality. The method requires common equipment found in most laboratories working with C. elegans and is thus simple to adopt. The approach centers on assaying independent samples of a population at each observation point, rather than a single sample over time as with traditional longitudinal methods. Scoring entails adding liquid to the wells of a multi-well plate, which stimulates C. elegans to move and facilitates quantifying changes in healthspan. Other major benefits of the Replica Set method include reduced exposure of agar surfaces to airborne contaminants (e.g. mold or fungus), minimal handling of animals, and robustness to sporadic mis-scoring (such as calling an animal as dead when it is still alive). To appropriately analyze and visualize the data from a Replica Set style experiment, a custom software tool was also developed. Current capabilities of the software include plotting of survival curves for both Replica Set and traditional (Kaplan-Meier) experiments, as well as statistical analysis for Replica Set. The protocols provided here describe the traditional experimental approach and the Replica Set method, as well as an overview of the corresponding data analysis.

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Here we describe the Replica Set method, an approach to quantitatively measure C. elegans lifespan/survival and healthspan in a high-throughput and robust manner, thus allowing screening of many conditions without sacrificing data quality. This protocol details the strategy and provides a software tool for analysis of Replica Set data.

レプリカの設定方法: 定量的測定線虫の寿命を高スループット方法

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and organs. The O9-1 cell line is derived from the endogenous mouse embryonic NCCs and maintains its multipotency. However, under specific culture conditions, O9-1 cells can differentiate into different cell types and be utilized in a wide range of research applications. Recently, with the combination of mouse studies and O9-1 cell studies, we have shown that the Hippo signaling pathway effectors Yap and Taz play important roles in neural crest-derived craniofacial development. Although the culturing process for O9-1 cells is more complicated than that used for other cell lines, the O9-1 cell line is a powerful model for investigating NCCs in vitro. Here, we present a protocol for culturing the O9-1 cell line to maintain its stemness, as well as protocols for differentiating O9-1 cells into different cell types, such as smooth muscle cells and osteoblasts. In addition, protocols are described for performing gene loss-of-function studies in O9-1 cells by using CRISPR-Cas9 deletion and small interfering RNA-mediated knockdown.

O9-1 is a multipotent mouse neural crest cell line. Here we describe detailed step-by-step protocols for culturing O9-1 cells, differentiating O9-1 cells into specific cell types, and genetically manipulating O9-1 cells by using siRNA-mediated knockdown or CRISPR-Cas9 genome editing.

養殖と O9 1 神経堤細胞の操作

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, including eye degeneration, albinism, sleep loss, hyperphagia, and sensory processing. Species of cavefish from around the world display a convergent evolution of morphological and behavioral traits due to shared environmental pressures between different cave systems. Diverse cave species have been studied in the laboratory setting. The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, with sighted and blind forms, has provided unique insights into biological and molecular processes underlying the evolution of complex traits and is well-poised as an emerging model system. While candidate genes regulating the evolution of diverse biological processes have been identified in A. mexicanus, the ability to validate a role for individual genes has been limited. The application of transgenesis and gene-editing technology has the potential to overcome this significant impediment and to investigate the mechanisms underlying the evolution of complex traits. Here, we describe a different methodology for manipulating gene expression in A. mexicanus. Approaches include the use of morpholinos, Tol2 transgenesis, and gene-editing systems, commonly used in zebrafish and other fish models, to manipulate gene function in A. mexicanus. These protocols include detailed descriptions of timed breeding procedures, the collection of fertilized eggs, injections, and the selection of genetically modified animals. These methodological approaches will allow for the investigation of the genetic and neural mechanisms underlying the evolution of diverse traits in A. mexicanus.&#160;

We describe approaches for the manipulation of genes in the evolutionary model system Astyanax mexicanus. Three different techniques are described: Tol2-mediated transgenesis, targeted manipulation of the genome using CRISPR/Cas9, and knockdown of expression using morpholinos. These tools should facilitate the direct investigation of genes underlying the variation between surface- and cave-dwelling forms.

メキシコの血脈遺伝子機能の操作

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

体内の内因性遺伝子操作のリモート制御システムのアプリケーション

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are two types of HM based on microscopic morphological evaluation, complete HM (CHM) and partial HM (PHM). These can be further subdivided based on the parental contribution to the molar genomes. Such characterization of HM, by morphology and genotype analyses, is crucial for patient management and for the fundamental understanding of this intriguing pathology. It is well documented that morphological analysis of HM is subject to wide interobserver variability and is not sufficient on its own to accurately classify HM into CHM and PHM and distinguish them from hydropic non-molar abortions. Genotyping analysis is mostly performed on DNA and tissues from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) products of conception, which have less than optimal quality and may consequently lead to wrong conclusions. In this article, detailed protocols for multiplex genotyping and flow cytometry analyses of FFPE molar tissues are provided, along with the interpretation of the results of these methods, their troubleshooting, and integration with the morphological evaluation, p57KIP2 immunohistochemistry, and fluorescence in situ hybridization (FISH) to reach a correct and robust diagnosis. Here, the authors share the methods and lessons learned in the past 10 years from the analysis of approximately 400 products of conception.

Hydatidiform moles are abnormal human pregnancies with heterogeneous aetiologies that can be classified according to their morphological features and parental contribution to the molar genomes. Here, protocols of multiplex microsatellite DNA genotyping and flow cytometry of formalin-fixed paraffin-embedded molar tissues are described in detail, together with results&#8217; interpretation and integration.

ホルマリン固定パラフィン埋め込みヒダチジフォームモル組織のマイクロサテライトDNAジェノタイピングとフローサイトメトリープロイディ解析

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

大規模混合ステージ カエノハブディティス・エレガンス集団の 文化とアッセイ

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

カエノラブディティス・エレガンスにおける倍数性の操作

要約

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植物病原体の遺伝子操作

でヒストンminiSOGを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発

線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

レプリカの設定方法: 定量的測定線虫の寿命を高スループット方法

養殖と O9 1 神経堤細胞の操作

メキシコの血脈遺伝子機能の操作

体内の内因性遺伝子操作のリモート制御システムのアプリケーション

ホルマリン固定パラフィン埋め込みヒダチジフォームモル組織のマイクロサテライトDNAジェノタイピングとフローサイトメトリープロイディ解析

大規模混合ステージカエノハブディティス・エレガンス集団の文化とアッセイ

カエノラブディティス ・ エレガンスにおける倍数性の操作

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でヒストンminiSOGを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発

線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

レプリカの設定方法: 定量的測定線虫の寿命を高スループット方法

養殖と O9 1 神経堤細胞の操作

メキシコの血脈遺伝子機能の操作

体内の内因性遺伝子操作のリモート制御システムのアプリケーション

ホルマリン固定パラフィン埋め込みヒダチジフォームモル組織のマイクロサテライトDNAジェノタイピングとフローサイトメトリープロイディ解析

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カエノラブディティス・エレガンスにおける倍数性の操作

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