この作品は、国内機関の健康の付与 (CA206157-22 と GM118066) とアンジェリカ アモンにぞんざいな大理石がん研究基金によってコッホ研究所サポート (コア) グラント P30 CA 14051 国立がん研究所から一部支持されました。アンジェリカ アモンもハワード ヒューズ医学研究所と医歯薬学研究グレン財団法人の捜査官です。アメリカ イタリアがん財団 (AICF)、マリー ・ キュリー ・ アクションから癌研究 (AIRC) のためのイタリアの協会がん研究の交わりによって、キ Quinquennial がん研究員、s. s. がサポートされていました。E. m. は、ハワード ヒューズ医学研究所から奨学金によって支えられました。

培養条件
RPE 1 テロメラーゼ セルラインだったダルベッコ変更イーグル培地中で培養 (材料表) 10% を添加したウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン 100 U/ml ペニシリン/ストレプトマイシン。セル 5% CO2加湿環境で 37 ° C で培養。下記プロトコル 10 cm 皿を使用して開発されているし、報告されるすべての技術的な詳細は、これらの料理を参照してください。別の料理を使用している場合スケール アップまたはそれに応じてダウンします。
1. 網膜色素上皮細胞の同期
<ol><li>すべての実験のための以上 15 通路を受けていない新鮮な解凍のセルを使用します。1 日に解凍し、~2.5 - 10 cm 培養皿に 105 RPE 1 テロメラーゼ セル x 5.0 を調剤します。標準的な成長媒体の 8 mL を追加し、一晩インキュベートします。(診断) などの標準的な細胞カウンターを使用してセル数を決定します。 注: セル密度は RPE 細胞の成長条件を指します。成長条件が異なるセルは並ぶ; の間で異なる場合があります。それらをそれに応じて調整することを検討してください。</li>
	<li>2 日目、通常成長培地を吸引し、5 mM チミジンを含む 8 mL の培地を追加して G1/S のボーダーでセルを同期します。 注: チミジン濃度と治療期間を異なる細胞間で異なる場合があります。テストするセルの行の最適な条件を決定するためのパイロット実験を実行することをお勧めします。</li>
	<li>3 日目、24 h チミジン培地 (ステップ 1.2) を追加した後、培地を吸引・洗浄の 3 回 1 × PBS のセルによってチミジン ブロックからのリリースします。通常培 8 mL を追加し、インキュベーターにプレートを返します。</li>
</ol>2 世代異数性の細胞分裂期キナーゼ Mps1 の活動と干渉
<ol><li>3 日目、リリース後 6 h チミジン ブロックから (ステップ 1.3; 細胞が有糸分裂を入力する前に、これは約 3-6 時間)、培地を吸引、1 × PBS で 1 回洗浄し、500 nM リバーシン (Mps1 阻害剤) を添加した培地で置き換えます。 注: RPE 細胞有糸分裂 9 12 h を入力後チミジン ウォッシュ アウト10,11。ただし、細胞周期は異なる細胞株によって異なります。したがって、(例えば、DNA コンテンツを介してFACS 解析を測定することによって) 確立された方法によって細胞周期解析を実行してパイロット実験におけるそれらの動態を決定することが重要です。さらに、細胞間最適な作業 Mps1 阻害剤濃度が異なる場合があります。RPE1 細胞を用いた以前の実験は、500 nM10、11,12の作業濃度リバーシンを使用して成功しています。テストするセルの行の最適な濃度を決定するためのパイロット実験を実行することをお勧めします。</li>
	<li>日目 4、12 h リバーシン治療 (約 6 h 細胞有糸分裂後) 後、リバーシン培地を吸引し、洗浄 3 回 1 × PBS のセル。プレートに 8 mL の正規の成長培地を追加し、インキュベーターにセルを返します。</li>
</ol>3. Aneuploid サイクリング細胞と ArCK 人口の濃縮の除去
<ol><li>日 6、約 72 時間細胞を入力最初の細胞分裂後に (手順 2.2; リバーシン洗浄アウト後, 約に相当する約 66 時間は、この 2-3 細胞周期)、培地を吸引、1 × PBS で 1 回洗浄、300 nM ノコダゾールを含有する培地に置き換えます。 注: 最近の仕事は示した RPE 1 細胞の染色体の異数性 genomically 不安定について彼らの増殖を逮捕最初不良有糸分裂10の後の 2-3 細胞周期。ただし、この速度は異なる細胞の間で異なる場合があります。したがって、構成するサイクリング細胞の除去のための適切なタイミングを決定するためのパイロット実験を実行することが重要です。</li>
	<li>一日 7、ノコダゾール治療後 12 h 培地を吸引し、プレートに 3 mL の 1x PBS を追加します。プレートの側面をタップすることで分裂期の細胞を振り払います。分裂細胞も除去できるように各タップ プレートを回転させます。</li>
	<li>分裂期細胞の完全な除去を確実には、複数のラウンド (3-5 回を推奨)、吸引・追加 3 mL の 1x PBS 各ラウンド間の振り払いプロセスを繰り返します。</li>
	<li>振り払い後、軽く蓋または板のエッジに付着した液体を吸い出しなさい。簡単に言えば、10 倍の倍率の顕微鏡の下でプレートを確認してください。いくつかの分裂期の細胞が観察されることを確認します。5 つ以上の分裂期の細胞は、対物レンズ 10 倍の下で見られている、振り払いの別のラウンドを繰り返します。 注: 分裂期細胞は丸みを帯びているが、振り払い後部分的に切断可能性があります。ノコダゾール治療の次のラウンドに細胞を公開する前に分裂細胞の完全な除去のために重要です。そう失敗はおよび/または四倍体細胞生成の結果有糸分裂細胞死につながる可能性があります。</li>
	<li>最終的な揺れオフ後 5 mL の 1x PBS で 1 回細胞を洗います。プレートに 330 nM ノコダゾールを含む 8 mL の培地を追加し、12 時間インキュベートします。</li>
	<li>孵化後分裂細胞が観察されなくなるまでノコダゾール治療/振り払い (ステップ 3.1 3.5) 12 時間間隔を繰り返します。通常、治療/手ふれ off の 4-5 回を推奨します。 注: ここで提供される情報は、RPE 細胞を参照してください。治療/手ふれ off のラウンド数は、異なる細胞間で異なる場合があります。ノコダゾールに長引くと不必要な露出を避けるために、慎重に判断して、パイロット実験における異数サイクリング細胞の効率的かつ完全な除去のために必要なラウンド数に不可欠です。</li>
	<li>ノコダゾール治療/振り払い (ステップ 3.1 3.6) の 4 〜 5 ラウンドの後通常成長培地 10 mL を加えるし、孵化させなさい。将来の操作または試金の使用前に 12-24 時間の残りの部分にセルを許可します。 注: 最終振るオフ後セルが皿に残って逮捕細胞周期、最近10、示すように、複雑な染色体を抱きます。これらの細胞は、弧 (複雑核型で逮捕) 細胞と呼ばれます。分離の一週間以内 ArCK 集団でアッセイを実行することをお勧めします。</li>
	<li>必要に応じて、複雑な染色体で逮捕された細胞の割合を評価するために収集し、スタンダード セルのカウンターを使用して各シェイクオフからセルをカウントします。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig1.jpg"> 図 1: 生成し、複雑核型 (弧) と代表的な画像を構成する細胞の分離に使用するメソッドの全体的なスケマティック。(A)図の ArCK 細胞世代と分離のプロトコル。(B) RPE 1 テロメラーゼ細胞治療の各段階での代表的なイメージ。(赤で記載) の最後のパネルでは、分離の ArCK セルを表します。スケール バー 100 μ m.<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57215/57215fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
4. ArCK 人口の特性評価
<ol><li>次の試金の実行によって ArCK 人口の分離を成功させるを確認します。<ol>
<li>ロバ β-ガラクトシダーゼ (老化マーカー) を染色、市販を使用してキット (材料の表を参照してください)。</li>
		<li>市販キット (材料の表を参照) を用いて CCL2 などの炎症性サイトカインの分泌を測定します。</li>
		<li>細胞周期阻害剤 p53、p21、ウェスタンブロットで p16 の増加されたレベルを確認します。 注: これらのアッセイを正しく制御するため ArCK 集団は欠異数のサイクリング細胞と比較する必要があります。前者は低通過、野生型 RPE 1 テロメラーゼ細胞は指数関数的に成長しています。後者は RPE 1 テロメラーゼの偏析を誤染色体を誘導する、最初異常有糸分裂後 72 時間のセルを収穫して取得できます。これを行うには、最初のノコダゾール治療 (ステップ 3.1) の前に右ステップ 1.1 および収穫細胞から上記プロトコルに従います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>逮捕された細胞の核型を評価するために単一セルのシーケンスを実行します。 メモ: 単一セルの配列は、単細胞レベル13でセル人口の間で染色体とサブ染色体の変化を調べること確立された方法です。単一セルのシーケンスを実行する方法の詳細な手順は、他の場所で10で見つけることができます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Santaguida, S., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-+and+long-term+effects+of+chromosome+mis-segregation+and+aneuploidy.">Short- and long-term effects of chromosome mis-segregation and aneuploidy.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 473-485 (2015).</li><li>Pfau, S. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+instability+and+aneuploidy+in+cancer:+from+yeast+to+man.">Chromosomal instability and aneuploidy in cancer: from yeast to man.</a> EMBO reports. 13 (6), 515-527 (2012).</li><li>Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+aneuploidy+in+cancer.">Causes and consequences of aneuploidy in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (3), 189-203 (2012).</li><li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boveri+revisited:+chromosomal+instability,+aneuploidy+and+tumorigenesis.">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 478-487 (2009).</li><li>Meena, J. K., Cerutti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+abrogates+aneuploidy-induced+telomere+replication+stress,+senescence+and+cell+depletion.">Telomerase abrogates aneuploidy-induced telomere replication stress, senescence and cell depletion.</a> The EMBO Journal. , 1-14 (2015).</li><li>Ohashi, A., Ohori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+generates+proteotoxic+stress+and+DNA+damage+concurrently+with+p53-mediated+post-mitotic+apoptosis+in+SAC-impaired+cells.">Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells.</a> Nature Communications. 6, 7668 (2015).</li><li>Passerini, V., Ozeri-Galai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+extra+chromosomes+leads+to+genomic+instability.">The presence of extra chromosomes leads to genomic instability.</a> Nature Communications. 7, 10754 (2016).</li><li>Sheltzer, J. M., Blank, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+drives+genomic+instability+in+yeast.">Aneuploidy drives genomic instability in yeast.</a> Science. 333 (6045), 1026-1030 (2011).</li><li>Zhu, J., Pavelka, N., Bradford, W. D., Rancati, G., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyotypic+determinants+of+chromosome+instability+in+aneuploid+budding+yeast.">Karyotypic determinants of chromosome instability in aneuploid budding yeast.</a> PLoS Genetics. 8 (5), e1002719 (2012).</li><li>Santaguida, S., Richardson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Mis-segregation+Generates+Cell-Cycle-Arrested+Cells+with+Complex+Karyotypes+that+Are+Eliminated+by+the+Immune+System.">Chromosome Mis-segregation Generates Cell-Cycle-Arrested Cells with Complex Karyotypes that Are Eliminated by the Immune System.</a> Developmental Cell. 41 (6), 638.e5-651.e5 (2017).</li><li>Santaguida, S., Vasile, E., White, E., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy-induced+cellular+stresses+limit+autophagic+degradation.">Aneuploidy-induced cellular stresses limit autophagic degradation.</a> Genes &amp; Development. 29 (19), 2010-2021 (2015).</li><li>Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+MPS1+in+chromosome+biorientation+and+the+spindle+checkpoint+through+the+small+molecule+inhibitor+reversine.">Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).</li><li>L&#243;pez-Soto, A., Gonzalez, S., L&#243;pez-Larrea, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosurveillance+of+Malignant+Cells+with+Complex+Karyotypes.">Immunosurveillance of Malignant Cells with Complex Karyotypes.</a> Trends in cell biology. , 1-4 (2017).</li><li>Watson, E. V., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+Police+Detect+Chromosomal+Imbalance+Triggering+Immune+Crackdown!.">Aneuploidy Police Detect Chromosomal Imbalance Triggering Immune Crackdown!.</a> Trends in genetics: TIG. , 1-3 (2017).</li></ol>

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この新規メソッドを生成し、複雑な染色体 (弧) の逮捕された電池の豊かは、複数の染色体の利得または損失を持ち、分割停止細胞の研究のためことができます。方法セットアップは迅速かつ信頼性の高い方法で ArCK 細胞の分離を容易にする設計されています。
この試験で最も重要なステップは、薬物治療のタイムラインと、最も重要なは、構成するサイクリング細胞の除去厳密制御です。最適な結果を得るのためのノコダゾール治療と振るオフのタイミングは特に重要な彼らはまだ丸みを帯びたと分裂、G1 に分裂細胞死やスリッページの可能性を防止するプレートからサイクリングのセルを削除するには四倍体の人口を作成する可能性があります。推奨 12 h ノコダゾール インキュベーションから 2 時間以上を振り払いのタイミングに逸脱はお勧めできません。
将来に関する ArCK 細胞どのように複雑な染色体のより深い理解を促進する可能性がある細胞生理学に影響を与えます。特に、最近の研究は、免疫系の細胞と対話すること、トリガー免疫クリアランス ArCK の細胞10を示した。ここで述べる方法免疫クリアランス未変換細胞とどのように発癌の研究の基礎となる分子メカニズムの解明を含む ArCK セルのさらなる評価のため優秀な出発点を提供します。この監視のメカニズム、フィールド14,15の重大な質問をバイパスがあります。

染色体分配の過程でエラーは、異数性半数体補1,2,3,4の倍数ではない染色体数によって特徴付けられる条件に します。異数性染色体ゲノム不安定性5,が生成されますさらにトリガーのレプリケーション ストレス6,7,8,9,10増加核型の複雑さ、および最終的に細胞10個体の細胞周期の停止につながる。ここで紹介した方法の目的を生成し細胞をサイクリングからこのような個体を分離です。安価な培養技術を採用し、このプロトコル分離と複雑な染色体の異数性細胞の細胞周期逮捕の評価が容易になります。これらの細胞は、ArCK (複雑核型で逮捕) セルおよびコントロールとしてサイクリング欠の相手として呼ばれます。
このプロトコルは、この目的のために確立される最初の 1 つを分離することができ、さらなる研究の ArCK 線を含む、彼らの誘導老化と老化関連の分泌形質 (SASP) に限定されない、プロ炎症機能、および能力を免疫細胞に関与します。ここで紹介した方法未変換、不死化ひと細胞で開発されていますが、がんでまだテストされていません。いくつかの変換されたセルが 1 つまたは複数の経路の抑制による細胞周期の停止に敏感である可能性があります。さらにしたがって、他の細胞では検証を実行する必要があります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="953">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DMEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium)&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:319px;">11995-073</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thymidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reversine</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>10004412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nocodazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Anti-p53 antibody</td>
			<td style="width:311px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:319px;">sc-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Anti-p21 antibody</td>
			<td style="width:311px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:319px;">sc-6246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Anti-p16 antibody</td>
			<td style="width:311px;">BD</td>
			<td style="width:319px;">554079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Senescence b-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td style="width:311px;">Cell Signaling Technology&#160;</td>
			<td style="width:319px;">9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit&#160;</td>
			<td style="width:311px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:319px;">ARY005B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and isolation of cell cycle-arrested cells with complex karyotypes

染色体の誤った分離は、異数性、細胞が不均衡な染色体数を港を条件に します。証拠の複数のラインは強くその異数性をゲノムの不安定性は、最終的に彼らの増殖を阻止する複雑な染色体を持つ細胞を生成するトリガーを示します。細胞の複雑な染色体の分離と性状、細胞生理学的不均衡な染色体数の影響を検討することが重要です。日には、手法が確立されてないような構成する細胞を確実に分離します。このペーパーでは、標準の安価な培養技術を利用した複雑な染色体の濃縮と異数性細胞の解析のためのプロトコルを提供します。このプロトコルは、その誘導分泌老化関連の表現、プロ炎症性のプロパティ、および免疫細胞と対話する能力を含む複雑な染色体を構成する細胞のいくつかの機能を分析する使用することができます。がん細胞は、染色体数の不均衡をしばしば港、異数性が両方のプロと反 tumorigenic 効果を暴くの究極の目標と、正常細胞の細胞生理に及ぼす影響について解読することが重要です。

このメソッドは、彼らの増殖を阻止する複雑な染色体を構成する細胞を分離するための in vitro培養システムを利用しています。この人口は、ArCK (逮捕された複雑な染色体で) 細胞と呼ばれます。図 1 aは、実験の方法を示します。野生型サイクリング RPE 1 テロメラーゼ細胞チミジンと G1/S の国境で、同期化、染色体の誤った分離を誘発する Mps1 阻害剤と扱われます。スピンドルの毒ノコダゾールは、染色体の誤った分離の誘導後 72 時間のセルに追加されます。異数性の細胞増殖するまだことができるノコダゾール治療後 12 時間は有糸分裂を入力し、微小管重合の干渉のためには、この細胞周期段階に閉じ込められています。閉じ込められたこれらのセルが穏やかな振り払いによって簡単に削除されます。振り払いプロセスは繰り返し 3 - 5 回、サイクリング細胞を完全に除去です。図 1 bは、治療の各段階での RPE 細胞の代表的なイメージを示しています。
ArCK 細胞は、p53、p21、図 2 aに示すように、欠と異数性細胞をサイクリングに比べて p16 などの細胞周期阻害剤の増加されたレベルを表示します。また、図 2 bは、肯定的な β-ガラクトシダーゼ染色 ArCK 欠細胞と比較して細胞の細胞老化の十分に確立されたマーカーを示します。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig2.jpg"> 図 2: ArCK 細胞を利用した代表的な結果。((A))の西部のしみ欠、サイクリング、異数性、ArCK 細胞の細胞周期阻害剤レベルを評価します。P53、p21、p16 のレベルは、西部のしみの分析により決定しました。アクチンはローディング コントロールとして提供しています。(B) β-ガラクトシダーゼ染色 ArCK 細胞老化のレベルを評価します。欠細胞と ArCK 細胞老化関連 β ガラクトシダーゼ (β Gal) 活動を求めた。スケール バー 100 μ m.<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57215/57215fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
この細胞周期の停止は、ランダム染色体の利得そして損失で図 3ArCK セルが複数表示されるシーケンスの単一セルから代表的な核型分析によって示されている複雑な染色体を構成する細胞の顕著な特徴です。この発見は、以前のレポート10との完全な合意です。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig3.jpg"> 図 3: ArCK 細胞の代表的な単一セル配列。セグメンテーションは、六つの代表的な ArCK 細胞の核型を示すプロットされます。セグメント化プロットは、(RPE 1 野生型は女性の出自の 2 倍体細胞ライン) ログ2規模で欠基準 X に 1 からすべての染色体のコピー数が表示されます。染色体の利益は、緑色で、赤の染色体損失でハイライトされます。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57215/57215fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

異数性は、ゲノムの不安定性、複雑な染色体を持つ細胞を細胞周期逮捕を最終的に生成に します。このペーパーでは、複雑な染色体を分割するために停止を構成する細胞を分離する簡単で便利な方法を提供します。

世代と複雑な染色体と細胞周期逮捕細胞の分離

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

generation-isolation-cell-cycle-arrested-cells-with-complex

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.3K ビュー.  Massachusetts Institute of Technology. 異数性は、ゲノムの不安定性、複雑な染色体を持つ細胞を細胞周期逮捕を最終的に生成に します。このペーパーでは、複雑な染色体を分割するために停止を構成する細胞を分離する簡単で便利な方法を提供します。

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Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a common mechanism of disease progression and a prognostic-determinant feature of malignant tumors. In prostate cancer (PC), resistance to MTAs such as the taxane Docetaxel dictates treatment failure as well as progression towards lethal stages of disease that are defined by a poor prognosis and high mortality rates. Though studied for decades, the array of mechanisms contributing to acquired resistance are not completely understood, and thus pose a significant limitation to the development of new therapeutic strategies that could benefit patients in these advanced stages of disease. In this protocol, we describe the generation of Docetaxel-resistant prostate cancer cell lines that mimic lethal features of late-stage prostate cancer, and therefore can be used to study the mechanisms by which acquired chemoresistance arises. Despite potential limitations intrinsic to a cell based model, such as the loss of resistance properties over time, the Docetaxel-resistant cell lines produced by this method have been successfully used in recent studies and offer&#160;the opportunity to advance our molecular understanding of acquired chemoresistance in lethal prostate cancer.

Resistance to cancer therapies contributes to disease progression and death. Determining the mechanistic underpinnings of resistance is crucial for improving therapeutic response. This manuscript details the protocol to generate taxane-resistant cell models of prostate cancer (PC) to help dissecting the pathways involved in progression to Docetaxel resistance in PC patients.

抗有糸分裂エージェント ドセタキセルに対する抵抗性の前立腺癌細胞モデルの生成

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

がん研究

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been shown to be responsible for tumor initiation, metastasis, and drug resistance. Therefore, it is important to develop specific TIC-targeting therapy in addition to current chemotherapy strategies, which mostly focus on the bulk of non-TICs. In order to further understand the mechanism behind the malignancy of TICs, we describe a method to isolate and to characterize TICs in human sarcomas. Herein, we show a detailed protocol to generate patient-derived xenografts (PDXs) of human sarcomas and to isolate TICs by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using human leukocyte antigen class I (HLA-1) as a negative marker. Also, we describe how to functionally characterize these TICs, including a sphere formation assay and a tumor formation assay, and to induce differentiation along mesenchymal pathways. The isolation and characterization of PDX TICs provide clues for the discovery of potential targeting therapy reagents. Moreover, increasing evidence suggests that this protocol may be further extended to isolate and characterize TICs from other types of human cancers.

We describe a detailed protocol for the isolation of tumor-initiating cells from human sarcoma patient-derived xenografts by fluorescence-activated cell sorting, using human leukocyte antigen-1 (HLA-1) as a negative marker, and for the further validation and characterization of these HLA-1-negative tumor-initiating cells.

肉腫患者由来異種移植片からの腫瘍始発細胞の単離と特徴付け

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their antigen presentation and T cell activation capacities. Since most vaccinations of experimental tumor models require millions of DC, they are widely isolated from the bone marrow or spleen. However, these DC significantly differ from blood and tumor DC in their responses to immune complexes (IC), and presumably to other Syk-coupled lectin receptors. Importantly, given the sensitivity of DC to danger-associated molecules, the presence of endotoxins or antibodies that crosslink activation receptors in one of the isolating steps could result in the priming of DC and thus affect the parameters, or at least the dosage, required to activate them. Therefore, here we describe a detailed protocol for isolating MoDC from blood and tumors while avoiding their premature activation. In addition, a protocol is provided for MoDC activation with tumor IC, and their subsequent analyses.

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Monocyte-derived DC (MoDC) can sense minor amounts of danger-associated molecules and are therefore easily primed. We provide a detailed protocol for the isolation of MoDC from blood and tumors and their activation with immune complexes while highlighting key precautions that should be considered in order to avoid their premature activation.

マウス単球由来樹状細胞とその後続の in Vitro活性化腫瘍免疫複合体との隔離のプロトコル

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor environment and cell-cell interactions. Identification of cancer and stem cell interactions, including changes in extracellular environment, physical interactions, and secreted factors, might enable the discovery of new therapy options. We combine known co-culture techniques to create a model system for mesenchymal stem cells (MSCs) and cancer cell interactions. In the current study, dental pulp stem cells (DPSCs) and PC-3 prostate cancer cell interactions were examined by direct and indirect co-culture techniques. Condition medium (CM) obtained from DPSCs and 0.4 &#181;m pore sized trans-well membranes were used to study paracrine activity. Co-culture of different cell types together was performed to study direct cell-cell interaction. The results revealed that CM increased cell proliferation and decreased apoptosis in prostate cancer cell cultures. Both CM and trans-well system increased cell migration capacity of PC-3 cells. Cells stained with different membrane dyes were seeded into the same culture vessels, and DPSCs participated in a self-organized structure with PC-3 cells under this direct co-culture condition. Overall, the results indicated that co-culture techniques could be useful for cancer and MSC interactions as a model system.

We provide protocols for evaluation of mesenchymal stem cells isolated from dental pulp and prostate cancer cell interactions based on direct and indirect co-culture methods. Condition medium and trans-well membranes are suitable to analyze indirect paracrine activity. Seeding differentially stained cells together is an appropriate model for direct cell-cell interaction.

それらの相互作用を研究する歯髄組織と癌細胞との共培養から間葉系幹細胞の分離

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of patients with advanced cancer. Adoptive T cell transfer (ACT) of highly enriched tumor antigen-specific T cells has been shown to cause durable regression of metastatic cancer in some patients. However, during expansion, these cells may become exhausted or senescent, limiting their effector function and persistence in vivo. Induced pluripotent stem cell (iPSC) technology may overcome these obstacles by leading to in vitro generation of large numbers of less differentiated tumor antigen-specific T cells. Human iPSC (hiPSC) have the capacity to differentiate into any type of somatic cell, including lymphocytes, which retain the original T cell receptor (TCR) genomic rearrangement when a T cell is used as a starting cell. Therefore, reprogramming of human tumor antigen-specific T cells to hiPSC followed by redifferentiation to T cell lineage has the potential to produce rejuvenated tumor antigen-specific T cells. Described here is a method for generating tumor antigen-specific CD8&#945;&#946;+ single positive (SP) T cells from hiPSC using OP9/DLL1 co-culture system. This method is a powerful tool for in vitro T cell lineage generation and will facilitate the development of in vitro derived T cells for use in regenerative medicine and cell-based therapies.

This article describes a method to generate functional tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived CD8&#945;&#946;+ single positive T cells using OP9/DLL1 co-culture system.

腫瘍抗原特異的T細胞の生成にヒト誘導多能性幹細胞を用いた

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced killer (CIK) T cell therapy has been reported to exert significant cytotoxic effects against cancer cells and to reduce the adverse effects of surgery, radiation, and chemotherapy in cancer treatments. CIK can be derived from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), bone marrow, and umbilical cord blood. CIK cells are a heterogeneous subpopulation of T cells with CD3+CD56+ and natural killer (NK) phenotypic characteristics that include major histocompatibility complex (MHC)-unrestricted antitumor activity. This study describes a qualified, clinically applicable, flow cytometry-based method for the quantification of the cytolytic capability of PBMC-derived CIK cells against hematological and solid cancer cells. In the cytolytic assay, CIK cells are co-incubated at different ratios with prestained target tumor cells. After the incubation period, the number of target cells are determined by a nucleic acid-binding stain to detect dead cells. This method is applicable to both research and diagnostic applications. CIK cells possess potent cytotoxicity that could be explored as an alternative strategy for cancer treatment upon its preclinical evaluation by a cytometer setup and tracking (CS &#38; T)-based flow cytometry system.

Here, we present a protocol to perform the isolation and expansion of peripheral blood mononuclear cells-derived cytokine-induced CD3+CD56+ killer cells and illustrate their cytotoxicity effect against hematological and solid cancer cells by using an in vitro diagnosis flow cytometry system.

癌治療のための細胞傷害性サイトカイン誘発キラーT細胞の分離と拡張

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

直交トピック膵腫瘍の生成と腫瘍浸潤T細胞細胞傷害のEx生体内特性評価

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis as well as for the treatment selection and its response in cancer patients. The current gold standard method for detecting tumor mutations involves a genetic test of tumor DNA by means of tumor biopsies. However, this invasive method is difficult to be performed repeatedly as a follow-up test of the tumor mutational repertoire. Liquid biopsy is a new and emerging technique for detecting tumor mutations as an easy-to-use and non-invasive biopsy approach.
Cancer cells multiply rapidly. In parallel, numerous cancer cells undergo apoptosis. Debris from these cells are released into a patient&#8217;s circulatory system, together with finely fragmented DNA pieces, called cell-free DNA (cfDNA) fragments, which carry tumor DNA mutations. Therefore, for identifying cfDNA based biomarkers using liquid biopsy technique, blood samples are collected from the cancer patients, followed by the separation of plasma and buffy coat. Next, plasma is processed for the isolation of cfDNA, and the respective buffy coat is processed for the isolation of a patient&#39;s genomic DNA. Both nucleic acid samples are then checked for their quantity and quality; and analyzed for mutations using next-generation sequencing (NGS) techniques.
In this manuscript, we present a detailed protocol for liquid biopsy, including blood collection, plasma, and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

In this paper we present a detailed protocol for non-invasive liquid biopsy technique, including blood collection, plasma and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

がん患者の血漿サンプルにおける無細胞DNAの検出

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and composition. It is based on a microsurgical procedure designed to catheterize the trachea and aorta of a euthanized mouse to perfuse the heart and lungs with decellularizing agents. The decellularized cardiopulmonary complex can subsequently be immunostained to reveal the location of structural ECM proteins. The whole procedure can be completed in 4 days.
The ECM scaffolds resulting from this protocol are free of dimensional distortions. The absence of cells enables structural examination of ECM structures down to submicron resolution in 3D. This protocol can be applied to healthy and diseased tissue from mice as young as 4-weeks old, including mouse models of fibrosis and cancer, opening the way to determine ECM remodeling associated with cardiopulmonary disease.

This protocol aims to decellularize the heart and lungs of mice. The resulting extracellular matrix (ECM) scaffolds can be immunostained and imaged to map the location and topology of their components.

マウス心肺複合体の脱細胞化

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...