マリア ・ ゴットリープ ・ バウムガルテン (IQ バイオ テクノロジー プラットフォーム、感染症医療、ルンド大学) および走査電子顕微鏡像を提供することを目的として認められています。この作品は、イニシアチブの一環として、欧州 3 共同プログラミング抗菌抵抗 (JPIAMR) の呼び出し「伝達ダイナミクス」、スウェーデン研究評議会 Formas (2017-00100) からの助成金によって支えられました。資金提供者には、研究デザイン、通訳、執筆、著作物を出版する原稿、決定を提出、または決定の準備の役割はなかった。

1. ガラス カバー スリップ (テンプレート スタンプ) の修正
<ol><li>ガラス カバー スリップをきれいに順次に浸って 1.0 M HCl、脱イオン水、NaOH の 1.0 M の 10 mL、それぞれ室温で超音波洗浄機の各ステップで 10 分。<ol>
<li>乾燥した窒素ガスでガラス カバー スリップ。 注: カバー スリップは、窒素ガスの流れの下で蒸発によって乾燥されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>10% (v/v) の 3-アミノ-プロピル-プタデカフルオロテトラヒドロデシルトリエトキシシラン (APTES) 1 時間室温で、カバーガラス表面にアミノ基を導入するためにエタノールで 10 mL の溶液で洗浄・乾燥カバー スリップを浸します。<ol>
<li>脱イオン水でカバー伝票をすすいでください。</li>
		<li>乾燥した窒素ガスでカバー スリップ。</li>
	</ol>
</li>
	<li>APTES 変更カバー スリップ 5% (v/v)、2 時間室温6,15表面のアミノ グループをアクティブにするために 10 mM リン酸緩衝 (pH 7.4) におけるグルタールアルデヒドの 10 mL の溶液を浸します。<ol>
<li>表面から余分なグルタルアルデヒドを除去するために 10 mM リン酸緩衝 (pH 7.4) とカバー スリップをすすいでください。</li>
		<li>乾燥した窒素ガスでカバー スリップ。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.0 mL の 0.1 mg/mL の濃度に 10 mM リン酸バッファー (pH 7.4) にテンプレート (タンパク質/バクテリオファージ) 溶液を準備します。 注: は、1.0 mL のリン酸バッファー (10 mM、pH 7.4) の蛋白質の 0.1 mg を溶解します。分光光度計を必要な場合 (280 nm) タンパク質の濃度を測定するために使用可能性があります。<ol>
<li>変更されたカバー スリップの上にこのテンプレート ソリューションの 200 μ L を削除し、4 ° C で一晩インキュベートします。 注: 特性の研究で使用される 1-2 テンプレート切手を準備する余分なテンプレート ソリューションを使用できます。</li>
		<li>表面から非連結テンプレートを除去するために 10 mM リン酸緩衝 (pH 7.4) とカバー スリップをすすいでください。 注: 電極を洗浄で洗ってリン酸バッファー (10 mM、pH 7.4) 30 s。</li>
		<li>乾燥した窒素ガスでカバー スリップ。 メモ: 重合工程で使用されるまで、カバー スリップは 4 ° C で保存する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 容量性電極の修飾
<ol><li>エタノール (70%) 5 mL を含む、順番に小さなビーカーに電極を浸し、電極をきれいに脱イオン水、アセトン、脱イオン水、酸性ピラニア溶液 (3:1 H2SO4: H2O2v/v)、脱イオンと水は、それぞれの部屋の温度で超音波洗浄機に各ステップ 10 分。<ol>
<li>窒素ガスと電極を乾燥させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>チラミンの電解重合を行うために 10 mM リン酸バッファー (pH 7.4) 含んでいるエタノール (2 mL)15で 10 mM チラミン溶液 8 mL を準備します。 注: チラミン ソリューションの総容積はエタノール 2 mL を含む合計の 8 mL をする必要があります。<ol>
<li>循環ボルタンメトリーによるスキャン (15 サイクル) をカバーする潜在的な電気化学測定装置を使用してこのソリューションで実行 0 - 1.5 V (銀/塩化銀) とスキャン速度 50 mV/秒30。</li>
		<li>脱イオン水で電極をすすいでください。</li>
		<li>窒素ガスと電極を乾燥させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>塩化アクリル 30 mM と 30 mM トリメチルアミン トルエン溶液に電極を浸す (V合計= 5 mL) 室温で一晩6,15,30。<ol>
<li>脱イオン水で電極をすすいでください。 注: 塩化物イオン及びトリメチルアミン残留未反応アクリロイルのより良い除去を確保するために、脱イオン水後 NaOH で表面を洗うことも可能ですも。</li>
		<li>窒素ガスと電極を乾燥させます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. テンプレートの準備刻印容量電極
<ol><li>
バクテリオファージの準備刻印容量電極
	<ol>
<li>重合前に単量体 (N ヒドロキシメチル アクリルアミド) と 1 mL の 10 mM リン酸バッファー (pH 7.4) で (mol/mol) を 1:5 の比率で (ポリエチレング リコール-400-レート) 架橋剤を含むモノマー溶液を準備します。 注: モノマーおよび架橋剤、モノマー溶液は異なる比率で使用ことができます。 または特定の相互作用の最適化のテンプレートに従ってモノマーと架橋剤の種類を変更できます。</li>
		<li>光開始剤の 1 mg をこのソリューションに追加します。 注: 重合を紫外線の下で実行する場合、光開始剤を使わなければなりません、重合を開始します。ラジカル重合により、重合を実行すると、イニシエーターのタイプは変更する必要があります。</li>
		<li>金修飾金電極表面上にこのソリューションの 1.5 μ L をピペットします。 注:、金電極表面は、図 1に示す図式。</li>
		<li>テンプレート スタンプ金電極表面上にモノマー ソリューションとの接触をもたらします。</li>
		<li>UV 重合を開始 (365 nm、400 W)、続く 15 分31。 メモ: UV 重合は-25 ° C に重合を開始する前に設定されている冷却キャビネット内部実行されます。UV 光重合システムをオンにし、重合は UV 光重合システムをオフにする前に 15 分間継続します。</li>
		<li>表面からテンプレート スタンプを削除するには、鉗子を使用します。 注: 表面からテンプレート スタンプを除去しながら表面に高分子膜を損傷する可能性があります。したがって、スタンプ除去されるべき表面から非常に慎重に、ゆっくりと力を使用せず。</li>
		<li>脱イオン水で電極表面をすすぎ、窒素ガスで乾燥します。</li>
		<li>10 mM 1-ドデカンチ電極表面にピンホールをカバーするために 20 分間準備エタノール 1 mL に電極を浸します。</li>
		<li>脱イオン水で電極をすすいで乾燥窒素ガスで電極。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
タンパク質の調製刻印容量電極
	<ol>
<li>重合前のモノマーを含むモノマー ソリューションを準備 (アクリルアミド: 54 mg;N-hydroxymethylacrylamide: 140 μ;N-isopropylacrylamide: 85.6 mg) と架橋剤 (methylenebisacrylamide: 9.5 mg) 超純水30,32の 820 μ L で。</li>
		<li>準備 5% (v/v) N、N、N'、N'-tetramethylethyldiamine (TEMED) 超純水。</li>
		<li>モノマー溶液に TEMED 溶液 20 μ L を追加し、5 分の窒素ガスでパージします。</li>
		<li>超純水で 10% (w/v) アンモニウム過硫酸 (APS) を準備します。</li>
		<li>モノマー溶液に APS ソリューションの 20 μ L を追加します。</li>
		<li>修飾金電極表面上にモノマー溶液 1.5 μ L をピペットします。</li>
		<li>テンプレート スタンプ モノマー処理表面との接触をもたらします。</li>
		<li>常温重合を開始し、5 時間継続します。 注: UV 重合ではなく、タンパク質刻印金電極の作製室温 (25 ° C) で自由根本的な重合がイニシエーター触媒として APS TEMED を使用して実行されます。</li>
		<li>鉗子を使用して慎重に表面からテンプレート スタンプを削除します。</li>
		<li>脱イオン水で電極をすすいで、窒素ガスで乾燥します。</li>
		<li>10 mM 1-ドデカンチ電極表面にピンホールをカバーするために 20 分間準備エタノール 1 mL に電極を浸します。</li>
		<li>脱イオン水で電極をすすいで乾燥窒素ガスで電極。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 走査電子顕微鏡 (SEM) による電極表面のキャラクタリゼーション
<ol><li>接着カーボン テープでアルミのホルダーに試料をマウントします。</li>
	<li>10 nm パラジウム/金電極をコートします。</li>
	<li>SEM を使用電極を調べる</li>
</ol>5 テンプレート リアルタイムで静電容量計測刻印容量電極
<ol><li>静電容量センサーを統合電解フローセルに捺印された容量の金電極を挿入します。</li>
	<li>再生バッファー (25 mM グリシン塩酸、pH 2.5、50 mM トゥイーン 20 を含む) 100 mL、1 L 連続したバッファーを準備 (バクテリオファージの刻印システム: 10 mM リン酸塩、pH 7.4; タンパク質刻印システム: 50 mM トリス-HCl、pH 7.4)。</li>
	<li>システムと 25 分にシステムを再平衡に連続したバッファーを再生する再生バッファーの注入で分析を開始します。</li>
	<li>バッファーの実行に必要な濃度範囲で標準テンプレート ソリューションを準備します。 注: は最初 0.1 mg タンパク質, または約 108 pfu バクテリオファージ、1.0 mL りん酸緩衝 (10 mM リン酸塩、pH 7.4) を溶解することによりテンプレート ソリューションの在庫を準備します。原液から 10 の連続した 10 倍希釈することによって検量線用標準溶液を準備します。これらのソリューションは、ステップ 5.5 で静電容量式センサーと分析されます。分光光度計を用いたタンパク質濃度が測定できます (280 nm)。バクテリオファージの集中を測定するために二重層寒天法使用できますが、記述されている詳細以前19。</li>
	<li>最適な条件でシステムを順次これらの標準溶液の 250 μ L を注入 (流量: 100 μ L/分、気温: 25 ° C)。 注: このアプリケーションで標準的なタンパク質溶液調製 10-4 - 10-14、x 1.0 x 1.0 の濃度範囲でバクテリオファージ濃度が 1.0 × 10 の範囲1 - 10 pfu/mL の5 x 1.0 にいる間。ソリューションが噴射弁に置かれ、単一のシリンジ ポンプとマルチポート バルブ トリプリケートのサンプルを注入するシステムに順次注入します。刻印の空洞にテンプレートのバインディングから生じる標準溶液を注射した後の静電容量の減少は、計測器のソフトウェアによって自動的に監視されます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lin, T. Y., Hu, C. H., Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+albumin+concentration+by+MIP-QCM+sensor.">Determination of albumin concentration by MIP-QCM sensor.</a> Biosensors and Bioelectronics. 20 (1), 75-81 (2004).</li><li>Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitive+Biosensors.">Capacitive Biosensors.</a> Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).</li><li>Zhang, S., Garcia-D'Angeli, A., Brennan, J. 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K., Tameru, B., Samuel, T., Chin, B. 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この方法を行った場合、プロトコルに従いながら考慮する必要がありますいくつかの重要なステップがあります。酸性ピラニア溶液で洗浄のステップ 1 つ重要です。ステップ 2.1 は 10 分以上にはなりません。これらの値は、以前に最適化されているので、手順 1.4 テンプレート ソリューションは 0.1 mg/mL を超えない。繰返し voltametric スキャン最適膜厚を得るためには、15 サイクルを超えない。3.1.3 のステップ、1.5 μ L、最適化された値です。この値は、高い電極のこの特定の種類はなりません。UV 硬化システムは、400 W の電源は、10-15 分の最大重合が実行する必要があります。APS (イニシエーター) を TEMED 後ソリューションに追加すると、すぐに後続の手順は即時重合 (ステップ 3.2.5) を避けるために非常に迅速に実行する必要があります。
最も重要な手順の 1 つは、UV 重合後の表面からテンプレートのスタンプの取り外しです。電極の表面に高分子膜がかもしれないリスクがあるこのステップが正しく実行されなかった場合、スタンプが削除されます。したがって、重合後、電極と水の溶液に上タンパク質スタンプに没頭し、表面 (ステップ 3.1.6) から非常にゆっくりと慎重にスタンプを削除することをお勧めします。
使用されるテンプレートに基づいて、タイプおよびモノマー (機能性モノマーおよび架橋剤) の比率で変更はより高い感度を生成することに関して評価があります。これは経験的に決定する必要があります。さらに、テンプレート分子の親和性の結合は通常は同時にいくつかの異なる相互作用を伴います。したがって、これは再生の手順中に問題につながる可能性があります。バインドされるテンプレートは正しく表面からリリースされていない場合さらなる分析のための電極の再利用性に影響を与える可能性がありますこれ。これらの多地点間の親和性が弱い相互作用を通じて連結からもあります。このようなシステムで、非特異的結合はシステム16の選択性に悪影響を及ぼすことができる場所をかかることがあります。これらは、メソッドの一般的なそして、一般的な制限です。
これらの特定の制限から離れて、既存のメソッド上議論の方法の多くの重要な利点があります。Ria、Elisa、および蛍光測定は、非常に敏感なラベル素材 (テンプレートまたは検出器) の使用法、バイオ センサーは完全にラベル-無料が必要です。これらのメソッドは、またより高価な時間のかかる。バイオ センサー法は異なる組成で同じ時間16MIPs の急速な並列合成できます。モノマー溶液のだけいくつかマイクロリットルは準備に必要なため、高価なまたは別の方法で限られたモノマーを使用するとき、メソッドは便利です。さらに、単一の MIP 電極は、他の既存の方法30より有意に高いパフォーマンスが大幅に低下することがなく約 80 の解析に使用できます。既存のメソッドで苦しむ度合いは、低感度と選択度の説明メソッドできます午後範囲の分子の検出と定量高選択性を持つ。
費用対効果、既存の方法と比較して短い時間でリアルタイムの鋭敏な検出と、計測器を作動させる容易さのため、バイオ センサーは非常に有望ポイントのフィールド条件の下でケア検知システム例えば、環境モニタリングや発展途上国のアプリケーション。疾患の診断に多くのアプリケーションで血清などの複雑な混合物でバイオ マーカーのリアルタイム、選択的で高感度迅速検出は必要な15,25です。ここでは、バイオ センサーは、その堅牢性と感度のため既存のメソッドに優れています。感染性病原体の検出のため具体的にはバクテリオファージ最近そのホスト細菌特異性の33,34,35のためのバイオ センサーの代替生体認識要素とみなされます。バクテリオファージの抗体の交換はコストを削減し、安定性もさらに36を増加するために非常に有望です。このようなシステムはまた検出と環境では、臨床検体からの特異ファージの定量化のましょう。バクテリオファージ、そして細菌抗生物質耐性遺伝子37,38を変換する能力の有病率、ためこのような方法は耐性菌の広がりを学ぶ貴重なかもしれません。

生体分子の定量化は、科学、ラジオイムノアッセイ (RIA) や elisa 法1のような手法の中の多くのさまざまな研究分野で使用されます。これらのメソッドのいくつかをラベル付き必要と放射性同位体や酵素のような試薬標識抗体/抗原、手間と時間のかかる複雑な手順2となります。さらに、堅牢性、選択性、およびこれらの方法の感度不十分なもののすべての解析;特に attogram 量は、ピクトグラム数量3ではなく、分析する必要があるとき、彼らは十分ではありません。このため、バイオ センサーでは、堅牢性の向上のための分子インプリンティングとの組み合わせで特に注目4、5を得ています。
分子インプリントはテンプレート6、完全にテンプレート7のような人工的な認識サイトを作成する周辺機能性モノマーを重合して空洞を作成するのに依存しています。この手法は、バイオ センサー8,9,10生体認識要素としても薬物送達システム、分析分離など、いくつかのアプリケーションのために使用されています。しかし、まだ分子インプリント高分子 (MIPs) 蛋白質および細胞11,12のような高分子のテンプレートの設計にいくつかの困難があります。このため、多くの研究者がターゲット蛋白質12によって認識されるサーフェスを作成するため、基板上に直接テンプレート蛋白質を刷り込みに焦点を当てた。大きな分子のタンパク質を含むアセンブリ認識空洞を採用するために使用この表面のコーティング技術は、刷り込みの13,14μ と呼ばれます。法の一般的な手続きによって異なります - テンプレート スタンプと高分子サポート - テンプレートを 1 面15,16、吸着との接触に持って来られるのために 2 つサーフェス間重合、モノマー処理表面。この方法で薄いポリマー フィルムは、UV 重合を介してサポートに形成されます。最後に、テンプレート特定空洞刻印電極の表面を残して、テンプレートが削除されます。このメソッドでは、刻印の分子の減らされた活動の損失を含むの利点、刷り込みのテンプレート分子の同様に必要とする非常に少量処理16,17あります。したがって、ユーザーの選択の任意のテンプレートをターゲット センサー表面にこれらのコスト効果の高い、安定性、敏感、選択的な表面を作成できます。
バイオ センサーは、単一蛋白質のウイルスを含むより大きな生体高分子検出に使用できます。最近関心を集めてウイルスの特定のグループは、細菌に感染するウイルスであるバクテリオファージです。バクテリオファージの迅速・高感度検出は重要なバイオ中およびバクテリオファージ18細菌文化の感染症を特定するためにバイオ医薬品プロセス。バクテリオファージ検出のため最もよく使用される生物学的アッセイは二重層寒天法19、手間と時間のかかる作業であります。原子間力顕微鏡 (AFM)20、干渉法21、22、電気化学センサー システム23,などのウイルス (バクテリオファージを含む) 新しい診断ツールを開発するいくつかの試みを行った24. バイオ センサー操作が簡単、高感度、およびリアルタイム計測15、25の対応として彼らの利点のために多くの仕事が集中しています。バイオ センサーの特定の種類は、静電容量の変化に基づきます。これらの容量のバイオ センサー、電気化学センサーの変化を測定する誘電特性の検体は、センサー表面に生体認識要素を操作したときの容量の2,4 の低下を引き起こす.容量性バイオ センサーは、抗原、抗体、タンパク質、および重金属イオン6,26,27,28のような様々 な検体の検出のために使用されています。これらのタイプのバイオ センサー29をラベリングなし固有の速さ、高感度、シンプル、低コスト、簡単操作、リアルタイム測定のような多くの利点があります。
記載方法は、検出を可能にする非常に複雑なサンプル、すべてのラベルを使用する必要性なしで低豊富な生体分子の定量化を目指しています。特に、技術は、他の商業的に既存の計測器が正確に彼らのターゲットを量的に失敗生体分子の atto picogram 範囲で最適です。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:753px;" width="754">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Cover slips</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:224px;">102222</td>
			<td style="width:167px;">protein stamp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HCl</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758-500ML</td>
			<td>cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaOH</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>72068-100ML</td>
			<td>cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td style="width:147px;">Branson Ultrasonic</td>
			<td>BRANSONIC M1800- E</td>
			<td>cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648-100ML</td>
			<td>modification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EtOH</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>1009836010</td>
			<td>rinsing/cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glutaraldehyde</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-100ML</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acetone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>34850-1L-M</td>
			<td>cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">H2SO4</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741-100ML</td>
			<td>piranha solution</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">H2O2</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-500ML</td>
			<td>piranha solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tyramine</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T90344-5G</td>
			<td>modification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CompactStat</td>
			<td style="width:147px;">Ivium Technologies</td>
			<td>CompactStat.h: 30mA@10V/3MHz</td>
			<td>potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Platinum Counter Electrode Kit</td>
			<td style="width:147px;">Equilabrium</td>
			<td>AFCTR5</td>
			<td>potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reference Electrode</td>
			<td style="width:147px;">Equilabrium</td>
			<td>RREF0021</td>
			<td>potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acryloyl chloride</td>
			<td style="width:147px;">EMD Millipore</td>
			<td>8.00826.0100</td>
			<td>modification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">triethylamine</td>
			<td style="width:147px;">EMD Millipore</td>
			<td>8.08352.0100</td>
			<td>modification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">toluene</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511-100ML</td>
			<td>modification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-hydroxymethyl acrylamide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>245801-100G</td>
			<td>functional monomer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">poly ethylene glycol-400-dimethacrylate</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>409510-250ML</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>410896-50G</td>
			<td>functional monomer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV polymerizator</td>
			<td style="width:147px;">Dymax</td>
			<td style="width:224px;">Dymax 5000ECE</td>
			<td>UV-polymerization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">forceps</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z168777-1EA</td>
			<td>consumable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1-dodecanethiol</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>471364-100ML</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acrylamide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553-100G</td>
			<td>functional monomer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-hydroxymethylacrylamide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>245801-100G</td>
			<td>functional monomer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-isopropylacrylamide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>415324-50G</td>
			<td>functional monomer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">methylenebisacrylamide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>146072-500G</td>
			<td>cross-linking monomer</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">N,N,N&#39;,N&#39;-tetrametyhlethyldiamine (TEMED)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281-25ML</td>
			<td>catalyst</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ammonium persulphate</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td>initiator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Capacitive biosensor</td>
			<td style="width:147px;">CapSenze</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:147px;">Merck</td>
			<td>1042011000</td>
			<td>regeneration buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween-20</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td>regeneration buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trizma base</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>93352-1KG</td>
			<td>running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4&#160;&#8226; 2H2O</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>567547-1KG</td>
			<td>running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4&#160;&#8226; 2H2O</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>567549-1KG</td>
			<td>running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DELPHI correlative light and electron microscope</td>
			<td style="width:147px;">Phenom-World</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Capacitive gold electrodes</td>
			<td>CapSenze Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>consumables</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,2&#39;-azobis(2-methypropionitrile)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441090-25G</td>
			<td>photo-initiator</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">CapSenze Smart Software</td>
			<td style="width:147px;">CapSenze Biosystems</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td style="width:167px;">software program</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrasensitive detection of biomarkers by using a molecular imprinting based capacitive biosensor

能力を検出し、生体分子の複雑なソリューションを量的に表わす自然科学にレアピースずっとバイオ マーカー、汚染物質、および興味の他の分子を検出するために使用されています。この目的のための一般的な手法は、酵素 (60) ELISA)、多くの場合 1 つの抗体は特定のターゲット分子に向けて、第 2 標識抗体を一次抗体の検出用を可能にする、調査の下で生体分子の絶対定量。ただし、認識要素として抗体の使用制限メソッドの堅牢性使用する必要性は、分子をラベル付けします。これらの制限を克服するために分子インプリンティングが実装されている人工的な認識サイトのテンプレート分子に相補的な作成および初期バインドを抗体を使用しての必要性を時代遅れします。さらに、さらに高い感度、標識二次抗体はターゲット分子の定量化のための容量に依存するバイオ センサーによる置き換えることができます。このプロトコルが迅速かつ無料のラベルを検出し、ELISA など一般的に使用される検出システムよりかなりよい感度で低豊富な生体分子 (タンパク質とウイルス) 複雑なサンプルを量的手法について述べる。これはすべての容量バイオ センサーとの組み合わせで分子インプリンティングによって媒介されます。

次の図 1の模式図によると、プロトコルによって裸の金電極は、高分子の構造を表すテンプレートと刻印が。この電極は、テンプレートのバインド時に容量、電極上にテンプレートの安定したアプリケーションと変化の測定を可能にする静電容量センサー (図 2) で適用できます。
静電容量方式センサーの概略は図 2に示します。Centris ポンプは、フロー ・ セルに再生時に実行中のバッファー (10 mM リン酸塩、pH 7.4) と再生バッファー (25 mM グリシン塩酸、pH 2.5) の連続注入を担当は図に明確に見ることができます。フロー ・ セルは、作業、リファレンス、およびカウンター電極で構成されています。標準蛋白質/バクテリオファージのソリューションは、最初、脱通過の噴射弁を構成し、システムに順次注入します。ソリューションのフロー ・ セルに挿入された作用電極に達すると、すぐに結果がリアルタイムで監視されます。静電容量値は、コンピューターの画面上、sensorgrams に従うことによって登録できます。
図 3と図 4は、裸と刻印の金電極表面の違いを表しています。この評価手順は、インプリント後の電極表面の粗さと見られて、高分子の空洞があることを確認することが重要です。SEM から離れてまた接触角測定、原子間力顕微鏡を含むその他の評価方法、エリプソメトリー等インプリント後表面を特徴付けるために使用することができます。この方法では、刷り込みのプロセスが成功したことと、テンプレート空洞が表面に形成されることそれ確保できます。これらのキャビティ内で高い特異性と親和性を持つテンプレートをバインドできます。
静電容量方式のシステムに標準溶液を注入後、最後の 5 つの測定値の平均は、ソフトウェアによって自動的に計算だったし、検量線の濃度とキャパシタンスの変化をプロットすることによって得られた、検体。登録容量の減少は、テンプレートのバインドによって生じた。金電極に結合するより多くの分子表面、高い静電容量の減少容量測定の一般的な原則によると。図 5と図 6は、試料の濃度を増加させるで、ΔC が期待どおりを増加するを表示します。(間がシステムが特定のターゲットの検出に有用な濃度範囲) ダイナミック レンジと検出 (LOD) の制限は、これらのグラフを分析することによって評価できます。図 6によると刻印バクテリオファージ静電容量式センサーは、10 の濃度範囲でバクテリオファージを検出できます1 - 105 pfu/mL、今回 10 pfu/mL の LOD 値で。図 5と図 6テンプレートの濃度もハイライト同じ間隔で較正曲線の測定の必要性が必要なはずですが、回帰の直線性は濃度 (上異なる場合がありますので図 5)、または勾配が異なる (図 6)。低濃度のため使用を指摘する必要があります、システムが (サンプル、通風等の濁度) の変動に非常に敏感、したがって、それは、少なくとも実行する推奨の飛び地を含む可能性を軽減するトリプリケート.同じ理由で、標準偏差は、図 6に見られるように非常に希釈サンプルのかなり大幅にできます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig1.jpg"> 図 1.メソッドを刷り込み μ の略図。ガラス カバー スリップ (テンプレート切手) の (A) 準備 (B) 容量の金電極の作製 (C) μ 刷り込み UV 重合および (D) による金電極表面上にテンプレートの電極表面からのテンプレートの削除 (Ertürkら、バイオ テクノロジー レポート 2014 (3) からの転載: 65-72 権限を持つ)。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57208/57208fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig2.jpg"> 図 2。静電容量センサーの概略図。本研究で使用される容量性バイオ センサーの一般的なレイアウト (Ertürkら、バイオ テクノロジー レポート 2014 (3) からの転載: 65-72 権限を持つ)。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57208/57208fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig3.jpg"> 図 3。タンパク質の走査電子顕微鏡観察刻印電極。(A) 裸の金電極の SEM 像 (スケール バー = 20 μ m)、タンパク質 (B) プリント金電極の静電容量 (スケールバー = 10 μ m)。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57208/57208fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig4.jpg"> 図 4。バクテリオファージの走査電子顕微鏡観察刻印電極。裸の金電極の SEM 像 (スケール バー = 20 μ m) (A)、バクテリオファージ刻印異なる倍率で金電極の静電容量と (x、スケール バー 6600 = 10 μ m) (B)、11、500 X、スケール バー = 5 μ m) (C);矢印を示す付着バクテリオファージ)。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57208/57208fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig5.jpg"> 図 5。検量線のバッファー組成の影響。最適な条件でのタンパク質濃度対静電容量の変化を示すグラフ (実行バッファー: 50 mM トリス-HCl、pH 7.4;PH 2.5 トゥイーン 20; 50 mM を含むグリシン塩酸 25 mM 再生バッファー:流量: 100 μ L/分、試料体積: 250 μ L;T: 25 ° C)。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57208/57208fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig6.jpg"> 図 6。代表的な検量線を大きな生体高分子。最適な条件でバクテリオファージ濃度対静電容量の変化を示すグラフ (実行バッファー: 10 mM リン酸塩、pH 7.4;PH 2.5 トゥイーン 20; 50 mM を含むグリシン塩酸 25 mM 再生バッファー:流量: 100 μ L/分、試料体積: 250 μ L;T: 25 ° C)<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57208/57208fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

静電容量センサーとの組み合わせでの刷り込みが分子を使用して複雑なソリューションで検出および低分子の定量化のプロトコルを紹介します。

分子インプリントを用いたバイオ マーカーの超高感度検出による静電容量センサー

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

ultrasensitive-detection-biomarkers-using-molecular-imprinting-based

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K ビュー.  Lund University. 静電容量センサーとの組み合わせでの刷り込みが分子を使用して複雑なソリューションで検出および低分子の定量化のプロトコルを紹介します。

ビデオ: Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場で</emの迅速検出のための>ハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

免疫・感染学

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

カテゴリの検出細菌性病原体のための&quot;生物発光&quot;レポーターファージ

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1. These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon targets within the eukaryotic cytosol. Some AB toxins travel by vesicle carriers from the cell surface to the endoplasmic reticulum (ER) before entering the cytosol2-4. In the ER, the catalytic A chain dissociates from the rest of the toxin and moves through a protein-conducting channel to reach its cytosolic target5. The translocated, cytosolic A chain is difficult to detect because toxin trafficking to the ER is an extremely inefficient process: most internalized toxin is routed to the lysosomes for degradation, so only a small fraction of surface-bound toxin reaches the Golgi apparatus and ER6-12.

To monitor toxin translocation from the ER to the cytosol in cultured cells, we combined a subcellular fractionation protocol with the highly sensitive detection method of surface plasmon resonance (SPR)13-15. The plasma membrane of toxin-treated cells is selectively permeabilized with digitonin, allowing collection of a cytosolic fraction which is subsequently perfused over an SPR sensor coated with an anti-toxin A chain antibody. The antibody-coated sensor can capture and detect pg/mL quantities of cytosolic toxin. With this protocol, it is possible to follow the kinetics of toxin entry into the cytosol and to characterize inhibitory effects on the translocation event. The concentration of cytosolic toxin can also be calculated from a standard curve generated with known quantities of A chain standards that have been perfused over the sensor. Our method represents a rapid, sensitive, and quantitative detection system that does not require radiolabeling or other modifications to the target toxin.

In this report, we describe how surface plasmon resonance is used to detect toxin entry into the host cytosol. This highly sensitive method can provide quantitative data on the amount of cytosolic toxin, and it can be applied to a range of toxins.

表面プラズモン共鳴によるホストのサイトゾルへ毒素の転座の検出

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will die from the disease. The human leukocyte antigen (HLA) class I samples peptides derived from proteasomal degradation of cellular proteins and presents these fragments on the cell surface for interrogation by circulating cytotoxic T lymphocytes (CTL). Generation of T-cell receptor mimic (TCRm) monoclonal antibodies (mAbs) which recognize breast cancer specific peptide/HLA-A*02:01 complexes such as those derived from macrophage migration inhibitory factor (MIF19-27) and NY-ESO-1157-165 enable detection and destruction of breast cancer cells in the absence of an effective anti-tumor CTL response. Intact class I HLA/peptide complexes are shed by breast cancer cells and represent potentially relevant cancer biomarkers. In this work, a breakthrough biomarker screening system for cancer diagnostics incorporating T-cell receptor mimic monoclonal antibodies combined with a novel, label-free biosensor utilizing guided-mode resonance (GMR) sensor technology is presented. Detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated. The impact of this work could revolutionize personalized medicine through development of companion disease diagnostics for targeted immunotherapies.

Intact class I HLA/peptide complexes are shed by cancer cells, representing a potential relevant cancer biomarker. Utilizing label-free sensor technology and T-cell receptor mimicking monoclonal antibodies, detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated, enabling development of a novel cancer diagnostic platform.

ラベルフリーバイオセンサー技術を活用乳癌におけるヒト白血球抗原バイオマーカーの検出

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

インフルエンザウイルスAおよびBの急速な分子の検出と分化

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

ナノスケールPCRによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォーム/赤痢菌属

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally replicates through an episomal DNA intermediate; however, integration of HBV DNA fragments into the host genome has been observed, even though this form is not necessary for viral replication. The exact purpose, timing, and mechanism(s) by which HBV DNA integration occurs is not yet clear, but recent data show that it occurs very early after infection. Here, the in vitro generation and detection of HBV DNA integrations are described in detail. Our protocol specifically amplifies single copies of virus-cell DNA integrations and allows both absolute quantification and single-base pair resolution of the junction sequence. This technique has been applied to various HBV-susceptible cell types (including primary human hepatocytes), to various HBV mutants, and in conjunction with various drug exposures. We foresee this technique becoming a key assay to determine the underlying molecular mechanisms of this clinically relevant phenomenon.

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

We describe here the in vitro generation of HBV DNA via a Hepatitis B virus infection system and the highly sensitive detection of its (1&#8211;2 copies) integration using inverse nested PCR.

低コピーの検出数は B 型肝炎感染培養によって形成された統合ウイルス DNA

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay (CBA) is a widely used method to detect anti-AQP4 IgG in human serum with high sensitivity and specificity. Briefly, serum anti-AQP4 IgG is captured by AQP4-transfected cell that is fixed on the biochip then detected by a fluorescein-labelled secondary antibody. Fluorescence microscopy is utilized to visualize the fluorescence, and the intensity of fluorescence is evaluated by at least two experienced clinicians. A final diagnosis of NMOSD can be made based on the combination of anti-AQP4 IgG detection results, clinical manifestations, and neuroradiological findings. According to previous studies, CBA is more sensitive and specific than other anti-AQP4 IgG detection methods, and it can be applied to both clinical diagnosis and studies of NMOSD. The method has limitations; for example, an international scale to evaluate serum anti-AQP4 IgG titers is still lacking. Here, a detailed protocol for human serum anti-AQP4 IgG detection using CBA is described.

Cell-based assay is a widely used method to detect serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. This method could be applied to clinical diagnosis and scientific researches of neuromyelitis optical spectrum disorders.

細胞ベースのアッセイによるひと血清抗アクアポリン 4 免疫グロブリン G の検出

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration

Fine Needle Aspiration (FNA) is a routine diagnostic procedure essential to both medical and veterinary practices. It consists of the percutaneous aspiration of cells and/or microorganisms from palpable masses, organs or effusions (fluid accumulation in a body cavity) using a thin needle similar to the regular needle used for the venous puncture. The material collected by FNA is in general highly cellular, and the retrieved aspirate is then smeared, air dried, wet-fixed, stained and observed under a microscope. In the clinical context, FNA is an important diagnostic tool that serves as a guide to the appropriate therapeutic management. Because it is simple, fast, minimally invasive and requires limited investment in the laboratory and human resources, it is extensively used by veterinary practitioners, mostly in domestic, but also in farm animals. In studies using animal models, FNA has the advantage that it can be performed repeatedly in the same animal, enabling longitudinal studies through the collection of cells from tumors and organs/tissues over the course of the disease. In addition to routine microscopy, retrieved material can also be used for immunocytochemistry, electron microscopy, biochemical analysis, flow cytometry, molecular biology or in vitro assays. FNA has been used to identify the protozoan parasite Trypanosoma brucei in the gonads of infected mice, opening the possibility for a future diagnosis in cattle.

Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration

Fine Needle Aspiration is a technique, whereby cells are obtained from a lesion or organ using a thin needle. Aspirated material is smeared, stained and examined under a microscope for diagnosis or used for molecular biology, cytometry or in vitro analysis. It is cheap, simple, quick and causes minimal trauma.

分子インプリントを用いたバイオ マーカーの超高感度検出による静電容量センサー

分子インプリントを用いたバイオマーカーの超高感度検出による静電容量センサー