Name: ultrasensitive detection of biomarkers by using a molecular imprinting based capacitive biosensor
Uploaded: 2018-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor at JoVE.com

Maria Baumgarten (IQ Biotechnologie Plattform, Infektion Medizin, Universität Lund) ist für die Durchführung und Bereitstellung von scanning Electron Mikrographen anerkannt. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus The Swedish Research Council Formas (2017-00100) im Rahmen der dritten gemeinsamen Programmierung Initiative antimikrobielle Resistenz (JPIAMR) Bereitschaftsdienst "Übertragung Dynamik." Die Geldgeber hatten keine Rolle im Studiendesign, Interpretation, schreiben, Vorbereitung des Manuskripts, Beschluss einreichen oder Entscheidung, das Werk zu veröffentlichen.

1. Änderung der Glasabdeckung rutscht (Vorlage Briefmarken)
<ol><li>Um das Glas Deckel rutscht zu reinigen, tauche sie nacheinander in 10 mL von 1,0 M HCl, deionisiertes Wasser und 1,0 M NaOH, bzw. für 10 min in den einzelnen Schritten in einem Ultraschallreiniger bei Raumtemperatur.<ol>
<li>Trocknen Sie das Glas Deckel rutscht mit Stickstoffgas. Hinweis: Das Deckel rutscht durch Verdampfung unter dem Strahl des gasförmigen Stickstoff getrocknet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tauchen Sie die gereinigten und getrockneten Cover Liegeplätze auf 10 % (V/V), 10 mL Lösung von 3-amino-Propyl-Triethoxysilane (APTES) in Ethanol für 1 h Aminogruppen auf dem Abdeckung Glas, bei Raumtemperatur einzuführen.<ol>
<li>Spülen Sie das Deckel rutscht mit entionisiertem Wasser.</li>
		<li>Trocknen Sie die Cover-Slips mit Stickstoffgas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tauchen Sie APTES veränderte Cover rutscht in 5 % (V/V), 10 mL Lösung von Glutaraldehyd in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) für 2 h um die Aminogruppen auf der Oberfläche, bei Raumtemperatur6,15zu aktivieren.<ol>
<li>Spülen Sie die Deckel Zettel mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) um überschüssige Glutaraldehyd von der Oberfläche zu entfernen.</li>
		<li>Trocknen Sie die Cover-Slips mit Stickstoffgas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1,0 mL der Vorlage (Protein/Bakteriophagen) in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) in der Konzentration von 0,1 mg/mL Lösung vorzubereiten. Hinweis: Auflösung 0,1 mg Protein in 1,0 mL Phosphatpuffer (10 mM, pH 7.4). Wenn nötig, einem Spektrophotometer (280 nm) kann verwendet werden, um die Konzentration des Proteins zu bestimmen.<ol>
<li>Drop-200 µL dieses Template-Lösung auf der modifizierten Deckel rutscht und über Nacht bei 4 ° C inkubieren. Hinweis: Die überschüssige Template-Lösung lässt sich vorbereiten 1-2 weitere Vorlage Briefmarken in der Charakterisierung Studien verwendet werden.</li>
		<li>Spülen des Deckel rutscht mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) um die ungebundenen Vorlage von der Oberfläche zu entfernen. Hinweis: Um die Elektroden zu spülen, waschen Sie sie mit Phosphatpuffer (10 mM, pH 7,4) für 30 s.</li>
		<li>Trocknen Sie die Cover-Slips mit Stickstoffgas. Hinweis: Das Deckel rutscht sollte bei 4 ° C gespeichert werden, bis sie in der Polymerisation Schritt verwendet werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Änderung der kapazitiven Gold-Elektroden
<ol><li>Reinigen Sie die Elektroden, tauchen die Elektroden in ein kleines Becherglas, sequentiell, mit 5 mL Ethanol (70 %), deionisiertes Wasser, Aceton, deionisiertes Wasser, saure Piranha-Lösung (3:1 H2SO4: H2O2, V/V), und entionisiertem Wasser, jeweils für 10 min in den einzelnen Schritten in einem Ultraschallreiniger bei Raumtemperatur.<ol>
<li>Trocknen Sie die Elektroden mit Stickstoffgas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um die Electropolymerization von Tyramin durchzuführen, bereiten Sie 8 mL 10 mM Tyramin Lösung in 10 mM Phosphat-Puffer (pH 7,4) mit Ethanol (2 mL)15. Hinweis: Das Gesamtvolumen der Tyramin-Lösung muss 8 mL insgesamt einschließlich 2 mL Ethanol.<ol>
<li>Führen Sie zyklische voltammetrischen Scans (15 Zyklen) in diese Lösung mit einem Potentiostaten für ein Potential von 0 - 1,5 V (Ag/AgCl) und eine Scan-Rate von 50 mV/s30.</li>
		<li>Spülen Sie die Elektroden mit entionisiertem Wasser.</li>
		<li>Trocknen Sie die Elektroden mit Stickstoffgas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tauchen Sie die Elektroden in eine Lösung mit 30 mM Acryloyl-Chlorid und 30 mM Trimethylamin in Toluol (VGesamt = 5 mL) bei Raumtemperatur über Nacht6,15,30.<ol>
<li>Spülen Sie die Elektroden mit entionisiertem Wasser. Hinweis: Um eine bessere Entfernung von nicht umgesetztes Acryloyl-Chlorid und Trimethylamin Rückstände zu gewährleisten, ist es auch möglich, die Oberfläche mit NaOH nach deionisiertes Wasser zu waschen.</li>
		<li>Trocknen Sie die Elektroden mit Stickstoffgas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Vorbereitung der Vorlage bedruckt kapazitive Gold-Elektroden
<ol><li>
Vorbereitung der Bakteriophagen eingeprägt kapazitive goldene-Elektroden
	<ol>
<li>Bereiten Sie vor der Polymerisation eine Monomer-Lösung mit Monomer (N-Hydroxymethyl Acrylamid) und Vernetzer (Polyethylenglykol-400-dimethacrylat) in einem Verhältnis von 1:5 (Mol/Mol) in 1 mL 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,4). Hinweis: Die Monomer-Lösung mit Monomer und Vernetzer kann in unterschiedlichen Verhältnissen verwendet werden, oder die Arten von Monomeren und Vernetzer können entsprechend der Vorlage für die Optimierung der spezifischen Interaktion geändert werden.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mg Foto-Initiator in dieser Lösung. Hinweis: Erfolgt die Polymerisation unter UV-Licht, muss dann die Foto-Initiator verwendet werden, die Polymerisation zu initiieren. Wenn die Polymerisation durch radikalische Polymerisation erfolgt, muss der Typ des Initiators geändert werden.</li>
		<li>Pipette 1,5 µL dieser Lösung auf die Goldoberfläche der modifizierten gold-Elektrode. Hinweis: Die Goldoberfläche der Elektrode ist schematisch in Abbildung 1dargestellt.</li>
		<li>Bringen Sie die Vorlage-Stempel in Kontakt mit dem Monomer-Lösung auf der Oberseite der gold Elektrodenoberfläche.</li>
		<li>Die UV-Polymerisation zu initiieren (365 nm, 400 W) und für 15 min31weiter. Hinweis: UV-Polymerisation erfolgt in einem kühlen Schrank die bis-25 ° C eingestellt ist, vor dem Beginn der Polymerisation. Dann das UV-Licht aushärten System eingeschaltet ist und die Polymerisation wird für 15 Minuten vor dem Ausschalten das UV-Licht Härtungssystem fortgesetzt.</li>
		<li>Mit Pinzette entfernen des Vorlage-Stempels von der Oberfläche. Hinweis: Beim Entfernen des Vorlage-Stempels von der Oberfläche, die Polymere Film auf der Oberfläche beschädigt werden. Daher sollte der Stempel von der Oberfläche sehr vorsichtig und langsam entfernt werden ohne Gewaltanwendung.</li>
		<li>Spülen Sie der Elektrodenoberfläche mit entionisiertem Wasser und trocknen Sie ihn mit Stickstoffgas.</li>
		<li>Tauchen Sie die Elektroden in 1 mL 10 mM 1-Dodecanethiol in Ethanol für 20 min um Nadelstiche auf der Elektrodenoberfläche decken vorbereitet.</li>
		<li>Spülen Sie die Elektroden mit entionisiertem Wasser und trocknen Sie die Elektroden mit Stickstoffgas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung des Proteins eingeprägt kapazitive Gold-Elektroden
	<ol>
<li>Vor der Polymerisation, bereiten eine Monomer-Lösung mit Monomeren (Acrylamid: 54 mg; N-Hydroxymethylacrylamide: 140 µL; N-isopropylacrylamide: 85,6 mg) und Vernetzer (Methylenebisacrylamide: 9,5 mg) in 820 µL ultrareines Wasser30,32.</li>
		<li>Vorbereiten von 5 % (V/V) N, N, N', N'-Tetramethylethyldiamine (TEMED) in Reinstwasser.</li>
		<li>Fügen Sie 20 µL TEMED Lösung in die Monomer-Lösung und Spülen mit Stickstoffgas für 5 min.</li>
		<li>10 % (w/V) Ammonium Persulphate (APS) in ultrareines Wasser vorzubereiten.</li>
		<li>20 µL der APS-Lösung in die Monomer-Lösung hinzufügen.</li>
		<li>Pipette 1,5 µL der Monomer-Lösung auf der modifizierten gold Elektrodenoberfläche.</li>
		<li>Den Vorlage-Stempel mit dem Monomer-behandelten Oberfläche in Kontakt zu bringen.</li>
		<li>Starten Sie Polymerisation bei Raumtemperatur zu und fahren Sie 5 h. Hinweis: Für die Herstellung von Protein-Aufdruck gold-Elektroden, anstelle von UV-Polymerisation, radikalische Polymerisation bei Raumtemperatur (25 ° C) erfolgt mit APS-TEMED als des Initiator-Katalysators.</li>
		<li>Entfernen Sie Vorlage-Stempel von der Oberfläche vorsichtig mit Hilfe einer Pinzette.</li>
		<li>Die Elektrode mit entionisiertem Wasser spülen und trocknen mit Stickstoffgas.</li>
		<li>Tauchen Sie die Elektroden in 1 mL 10 mM 1-Dodecanethiol in Ethanol für 20 min um Nadelstiche auf der Elektrodenoberfläche decken vorbereitet.</li>
		<li>Spülen Sie die Elektroden mit entionisiertem Wasser und trocknen Sie die Elektroden mit Stickstoffgas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Charakterisierung der Elektrodenoberfläche mit Rasterelektronenmikroskopie (SEM)
<ol><li>Montieren Sie die Exemplare auf Aluminium-Halter mit selbstklebenden Carbon Band.</li>
	<li>Bestreichen Sie die Elektroden mit 10 nm Palladium/Gold.</li>
	<li>Untersuchen Sie die Elektroden mit SEM</li>
</ol>5. kapazitive Echtzeitmessungen mit Vorlage bedruckt kapazitive Gold-Elektroden
<ol><li>Einfügen Sie die aufgedruckten kapazitiven gold-Elektroden in die elektrochemische Messzelle integriert, um eine kapazitive biosensor</li>
	<li>100 mL Regeneration Puffer (25 mM Glycin-HCl, pH 2.5, einschließlich 50 mM Tween-20) und 1 L laufenden Puffer vorzubereiten (für Bakteriophage eingeprägt System: 10 mM Phosphat, pH 7,4; für Protein-Aufdruck System: 50 mM Tris-HCl, pH 7.4).</li>
	<li>Starten Sie die Analyse mit der Injektion von Regeneration Puffer, das System und laufenden Puffer, um das System für 25 min erneut equilibrate zu regenerieren.</li>
	<li>Bereiten Sie standard-Template-Lösungen im Bereich gewünschte Konzentration im laufenden Puffer vor. Hinweis: Bereiten Sie zuerst einen Vorrat an der Template-Lösung durch Auflösung 0,1 mg Protein oder ca. 108 Pfu Bakteriophagen, in 1,0 mL Phosphatpuffer (10 mM Phosphat, pH 7.4). Dann bereiten Sie die Standardlösungen für die Eichkurve indem man zehn sequentielle 10-divisibel Verdünnungen aus der Stammlösung. Diese Lösungen werden mit der kapazitiven Biosensor in Schritt 5.5 analysiert werden. Proteinkonzentration kann mit einem Spektralphotometer gemessen werden (280 nm). Um die Bakteriophagen-Konzentration zu messen, eine double-Layer-Agar-Methode eingesetzt werden, die beschrieben wird in Einzelheiten vorher19.</li>
	<li>Diese standard-Lösungen gegenüber dem Vorquartal um das System unter optimalen Bedingungen 250 µL zu injizieren (Volumenstrom: 100 µL/min, Temperatur: 25 ° C). Hinweis: In dieser Anwendung wurden die standard Proteinlösungen vorbereitet im Konzentrationsbereich von 1,0 x 10-4 - 1.0 x 10-14, während die Bakteriophagen-Konzentrationen im Bereich von 1,0 x 101 - 1.0 x 105 Pfu/mL waren. Die Lösungen wurden in das Einspritzventil gelegt und nacheinander in das System, Injektion Proben in Triplicates über die einzelnen Spritzenpumpe und multiport Ventil injiziert. Die Abnahme der Kapazität nach der Injektion der Standardlösungen aus der Bindung der Vorlage an den aufgedruckten Hohlräumen wird automatisch durch die Gerätesoftware überwacht.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lin, T. Y., Hu, C. H., Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+albumin+concentration+by+MIP-QCM+sensor.">Determination of albumin concentration by MIP-QCM sensor.</a> Biosensors and Bioelectronics. 20 (1), 75-81 (2004).</li><li>Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitive+Biosensors.">Capacitive Biosensors.</a> Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).</li><li>Zhang, S., Garcia-D'Angeli, A., Brennan, J. P., Huo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+detection+limits+of+enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISA)+and+bioanalytical+techniques+in+general.">Predicting detection limits of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and bioanalytical techniques in general.</a> The Analyst. 139 (2), 439-445 (2014).</li><li>Mattiasson, B., Teeparuksapun, K., Hedstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical+binding+assays+for+detection+and+quantification+of+trace+impurities+in+biotechnological+production.">Immunochemical binding assays for detection and quantification of trace impurities in biotechnological production.</a> Trends in Biotechnology. 28 (1), 20-27 (2010).</li><li>Limbut, W., Hedstr&#246;m, M., Thavarungkul, P., Kanatharana, P., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitive+biosensor+for+detection+of+endotoxin.">Capacitive biosensor for detection of endotoxin.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (2), 517-525 (2007).</li><li>Ert&#252;rk, G., Berillo, D., Hedstr&#246;m, M., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact-BSA+imprinted+capacitive+biosensor+for+real-time,+sensitive+and+selective+detection+of+BSA.">Microcontact-BSA imprinted capacitive biosensor for real-time, sensitive and selective detection of BSA.</a> Biotechnology Reports. 3, 65-72 (2014).</li><li>Arshady, R., Mosbach, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+substrate-selective+polymers+by+host-guest+polymerization.">Synthesis of substrate-selective polymers by host-guest polymerization.</a> Macromolecular Chemistry and Physics. 182 (2), 687-692 (1981).</li><li>Andersson, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imprinting:+developments+and+applications+in+the+analytical+chemistry+field.">Molecular imprinting: developments and applications in the analytical chemistry field.</a> Journal of chromatography. B, Biomedical sciences and applications. 745 (1), 3-13 (2000).</li><li>Li, X., Husson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+molecular+imprinting+approach+to+produce+optical+biosensor+recognition+elements.">Two-dimensional molecular imprinting approach to produce optical biosensor recognition elements.</a> Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 22 (23), 9658-9663 (2006).</li><li>Alexander, C., Davidson, L., Hayes, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinted+polymers:+artificial+molecular+recognition+materials+with+applications+in+synthesis+and+catalysis.">Imprinted polymers: artificial molecular recognition materials with applications in synthesis and catalysis.</a> Tetrahedron. 59 (12), 2025-2057 (2003).</li><li>Kryscio, D. R., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+imprinted+thin+polymer+film+systems+with+selective+recognition+for+bovine+serum+albumin.">Surface imprinted thin polymer film systems with selective recognition for bovine serum albumin.</a> Analytica Chimica Acta. 718, 109-115 (2012).</li><li>Inerowicz, H. D., Howell, S., Regnier, F. E., Reifenberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiprotein+immunoassay+arrays+fabricated+by+microcontact+printing.">Multiprotein immunoassay arrays fabricated by microcontact printing.</a> Langmuir. 18 (13), 5263-5268 (2002).</li><li>Lin, H. Y., Hsu, C. Y., Thomas, J. L., Wang, S. E., Chen, H. C., Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microcontact+imprinting+of+proteins:+The+effect+of+cross-linking+monomers+for+lysozyme,+ribonuclease+A+and+myoglobin.">The microcontact imprinting of proteins: The effect of cross-linking monomers for lysozyme, ribonuclease A and myoglobin.</a> Biosensors and Bioelectronics. 22 (4), 534-543 (2006).</li><li>Liao, P. C., Tyan, Y. C., Wang, C. Y., Hsu, J. F., Chou, T. C., Lin, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+binding+selectivity+of+molecularly+imprinted+polymer+artificial+antibodies+by+mass+spectrometry-based+profiling+system.">Assessing the binding selectivity of molecularly imprinted polymer artificial antibodies by mass spectrometry-based profiling system.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 91 (2), 597-604 (2009).</li><li>Ert&#252;rk, G., Hedstr&#246;m, M., T&#252;mer, M. A., Denizli, A., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+prostate-specific+antigen+detection+with+prostate-specific+antigen+imprinted+capacitive+biosensors.">Real-time prostate-specific antigen detection with prostate-specific antigen imprinted capacitive biosensors.</a> Analytica Chimica Acta. 891, 120-129 (2015).</li><li>Ert&#252;rk, G., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+imprinting+to+microcontact+imprinting-A+new+tool+to+increase+selectivity+in+analytical+devices.">From imprinting to microcontact imprinting-A new tool to increase selectivity in analytical devices.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1021, 30-44 (2016).</li><li>Ert&#252;rk, G., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Imprinting:+The+Creation+of+Biorecognition+Imprints+on+Biosensor+Surfaces.">Molecular Imprinting: The Creation of Biorecognition Imprints on Biosensor Surfaces.</a> Advanced Molecularly Imprinting Materials. , 523-560 (2017).</li><li>Janczuk-Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-period+fiber+grating+sensor+for+detection+of+viruses.">Long-period fiber grating sensor for detection of viruses.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 250, 32-38 (2017).</li><li>Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+bacteriophages+by+double+agar+overlay+plaque+assay.">Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay.</a> Methods in Molecular Biology. 501, 69-76 (2009).</li><li>Meillan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayer+for+AFM+measurements+of+Tobacco+Mosaic+Virus+(TMV)+at+the+atomic+level.">Self-assembled monolayer for AFM measurements of Tobacco Mosaic Virus (TMV) at the atomic level.</a> RSC Adv. 4 (23), 11927 (2014).</li><li>Ymeti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+ultrasensitive+virus+detection+using+a+Young+interferometer+sensor.">Fast, ultrasensitive virus detection using a Young interferometer sensor.</a> Nano Letters. 7 (2), 394-397 (2007).</li><li>Wei, Y., Wong, L. P., Toh, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fuel+cell+virus+sensor+using+virus+capture+within+antibody-coated+nanochannels.">Fuel cell virus sensor using virus capture within antibody-coated nanochannels.</a> Analytical Chemistry. 85 (3), 1350-1357 (2013).</li><li>Guliy, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+bacteriophages+by+a+piezoelectric+resonator+with+lateral+electric+field.">Immunodetection of bacteriophages by a piezoelectric resonator with lateral electric field.</a> Applied biochemistry and microbiology. 52 (4), 457-463 (2016).</li><li>Reta, N., Michelmore, A., Saint, C., Prieto-Sim&#243;n, B., Voelcker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+silicon+membrane-modified+electrodes+for+label-free+voltammetric+detection+of+MS2+bacteriophage.">Porous silicon membrane-modified electrodes for label-free voltammetric detection of MS2 bacteriophage.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 80, 47-53 (2016).</li><li>Ert&#252;rk, G., &#214;zen, H., T&#252;mer, M. A., Mattiasson, B., Denizli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+imprinting+based+surface+plasmon+resonance+(SPR)+biosensor+for+real-time+and+ultrasensitive+detection+of+prostate+specific+antigen+(PSA)+from+clinical+samples.">Microcontact imprinting based surface plasmon resonance (SPR) biosensor for real-time and ultrasensitive detection of prostate specific antigen (PSA) from clinical samples.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 224, 823-832 (2016).</li><li>Lebogang, L., Mattiasson, B., Hedstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitive+sensing+of+microcystin+variants+of+Microcystis+aeruginosa+using+a+gold+immunoelectrode+modified+with+antibodies,+gold+nanoparticles+and+polytyramine.">Capacitive sensing of microcystin variants of Microcystis aeruginosa using a gold immunoelectrode modified with antibodies, gold nanoparticles and polytyramine.</a> Microchimica Acta. 181 (9-10), 1009-1017 (2014).</li><li>Loyprasert, S., Hedstr&#246;m, M., Thavarungkul, P., Kanatharana, P., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-attomolar+detection+of+cholera+toxin+using+a+label-free+capacitive+immunosensor.">Sub-attomolar detection of cholera toxin using a label-free capacitive immunosensor.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 25 (8), 1977-1983 (2010).</li><li>Teeparuksapun, K., Hedstr&#246;m, M., Wong, E. Y., Tang, S., Hewlett, I. K., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+detection+of+HIV-1+p24+antigen+using+nanofunctionalized+surfaces+in+a+capacitive+immunosensor.">Ultrasensitive detection of HIV-1 p24 antigen using nanofunctionalized surfaces in a capacitive immunosensor.</a> Analytical Chemistry. 82 (20), 8406-8411 (2010).</li><li>Labib, M., Hedstr&#246;m, M., Amin, M., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+capacitive+biosensor+for+detection+of+staphylococcal+enterotoxin+B.">A capacitive biosensor for detection of staphylococcal enterotoxin B.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (5), 1539-1544 (2009).</li><li>Ert&#252;rk, G., Hedstr&#246;m, M., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+real-time+assay+of+trypsin+by+using+molecular+imprinting-based+capacitive+biosensor.">A sensitive and real-time assay of trypsin by using molecular imprinting-based capacitive biosensor.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 86, 557-565 (2016).</li><li>Ert&#252;rk, G., Uzun, L., T&#252;mer, M. A., Say, R., Denizli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fab+fragments+imprinted+SPR+biosensor+for+real-time+human+immunoglobulin+G+detection.">Fab fragments imprinted SPR biosensor for real-time human immunoglobulin G detection.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 28 (1), 97-104 (2011).</li><li>El-Sharif, H. F., Phan, Q. T., Reddy, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+selectivity+of+hydrogel-based+molecularly+imprinted+polymers+(HydroMIPs)+following+buffer+conditioning.">Enhanced selectivity of hydrogel-based molecularly imprinted polymers (HydroMIPs) following buffer conditioning.</a> Analytica Chimica Acta. 809, 155-161 (2014).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Salmonella+Typhimurium+on+Spinach+Using+Phage-Based+Magnetoelastic+Biosensors.">Detection of Salmonella Typhimurium on Spinach Using Phage-Based Magnetoelastic Biosensors.</a> Sensors (Basel, Switzerland). 17 (2), (2017).</li><li>Chin, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+small+quantities+of+specific+bacteria+using+phage-based+wireless+biosensors.">Rapid detection of small quantities of specific bacteria using phage-based wireless biosensors.</a> 2016 10th International Conference on Sensing Technology (ICST). , 1-5 (2016).</li><li>Park, M. -. K., Chin, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Approach+of+a+Phage-Based+Magnetoelastic+Biosensor+for+the+Detection+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+in+Soil.">Novel Approach of a Phage-Based Magnetoelastic Biosensor for the Detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium in Soil.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (12), 2051-2059 (2016).</li><li>Mack, J. D., Yehualaeshet, T., Park, M. -. K., Tameru, B., Samuel, T., Chin, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-Based+Biosensor+and+Optimization+of+Surface+Blocking+Agents+to+Detect+Salmonella+typhimurium+on+Romaine+Lettuce.">Phage-Based Biosensor and Optimization of Surface Blocking Agents to Detect Salmonella typhimurium on Romaine Lettuce.</a> Journal of food safety. 37 (2), 12299 (2017).</li><li>Colomer-Lluch, M., Jofre, J., Muniesa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+genes+in+the+bacteriophage+DNA+fraction+of+environmental+samples.">Antibiotic resistance genes in the bacteriophage DNA fraction of environmental samples.</a> Plos One. 6 (3), 17549 (2011).</li><li>Lood, R., Ert&#252;rk, G., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+antibiotic+resistance+spreading+in+wastewater+treatment+plants+-+bacteriophages+as+a+much+neglected+potential+transmission+vehicle.">Revisiting antibiotic resistance spreading in wastewater treatment plants - bacteriophages as a much neglected potential transmission vehicle.</a> Frontiers in microbiology. 8, (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wenn dieses Verfahren durchgeführt wird, gibt es einige wichtige Schritte, die berücksichtigt werden müssen, während im Anschluss an des Protokolls. Ein wichtiger Schritt ist die Reinigungsschritt mit sauren Piranha-Lösung. Schritt 2.1 darf nicht mehr als 10 Minuten sein. Template-Lösung für Schritt 1.4 darf 0,1 mg/mL nicht überschreiten, da diese Werte bereits optimiert wurden. Zyklische voltammetrische Scans müssen 15 Zyklen nicht überschreiten, um die optimale Dicke zu erhalten. Für Schritt 3.1.3 ist 1,5 µL einer optimierten Wert. Dieser Wert darf nicht höher für diese spezifische Art von Elektrode sein. Wenn die UV-Härtung System eine Leistung von 400 W hat, muss die Polymerisation für maximal 10-15 Minuten durchgeführt werden. Sobald die Lösung nach TEMED APS (Initiator) hinzugefügt wird, muss der nachfolgende Schritt sehr schnell durchgeführt werden, um sofortige Polymerisation (Schritt 3.2.5) zu vermeiden.
Einer der wichtigsten Schritte ist die Entfernung von der Vorlage-Stempel von der Oberfläche nach der UV-Polymerisation. Wenn dieser Schritt nicht ordnungsgemäß ausgeführt wird, gibt es ein Risiko, dass die Polymere Film auf der Oberfläche der Elektrode mit dem Stempel entfernt. Daher empfiehlt es sich, die Elektrode und der Protein-Stempel an der Spitze in einer Lösung von Wasser nach der Polymerisation eintauchen, dann entfernen die Stempel sehr langsam und vorsichtig von der Oberfläche (Schritt 3.1.6).
Basierend auf die Vorlage verwendet wird, können Änderungen in der Art und dem Verhältnis der Monomere verwendet (funktionelle Monomer und Vernetzer) im Hinblick auf die Erzeugung von höheren Empfindlichkeit bewertet werden. Dies muss empirisch ermittelt werden. Darüber hinaus beinhaltet die Affinität Bindung des Moleküls Vorlage in der Regel gleichzeitig mehrere verschiedene Interaktionen. Daher kann dies zu Problemen während der Regeneration Schritte führen. Wenn die gebundene Vorlage nicht richtig von der Oberfläche freigegeben ist, kann dies die Wiederverwendbarkeit von der Elektrode zur weiteren Analyse beeinflussen. Diese multipoint Affinitäten können auch aus der Bindung über schwächere Wechselwirkungen führen. In solchen Systemen kann unspezifische Bindung stattfinden, die die Selektivität des Systems16negativ beeinflussen können. Dies sind gewöhnliche und allgemeine, Grenzen der Methode.
Abgesehen von diesen spezifischen Einschränkungen gibt es viele wesentliche Vorteile der besprochenen Methode gegenüber bestehenden Methoden. RIAs, ELISAs und fluorometrisch Messungen sehr empfindlich sind, benötigen sie die Nutzung des beschrifteten Materials (Vorlage oder Detektor), während der Biosensor ist völlig markierungsfreie. Diese Methoden sind auch teuer und zeitaufwendig. Ein Biosensor-Ansatz ermöglicht schnelle, parallele Synthese von MIPs in verschiedenen Zusammensetzungen in der gleichen Zeit16. Da nur wenige Mikroliter Monomer-Lösung ist für die Vorbereitung erforderlich, eignet sich die Methode Verwendung teuer oder anderweitig beschränkt Monomere. Weitere, einzelne MIP-Elektroden können für ca. 80 Analysen ohne eine signifikante Abnahme der Leistung ist deutlich höher als andere vorhandene Methoden30verwendet werden. Bestehende Methoden leiden auch in unterschiedlichem Ausmaß, geringe Empfindlichkeit und Selektivität, während das beschriebene Verfahren für die Erkennung und Quantifizierung von Molekülen im Bereich von pM mit hoher Selektivität ermöglicht.
Aufgrund der Wirtschaftlichkeit, die einfache Bedienung des Instruments und die sensible Echtzeit-Erkennung in kurzer Zeit im Vergleich zu bestehenden Methoden der Biosensoren sind sehr vielversprechende Punkt der Pflege-Detection-Systeme unter Feldbedingungen; z.B.für die Umweltüberwachung und für Anwendungen in den Entwicklungsländern. In vielen Anwendungen in der Diagnose der Krankheit ist in Echtzeit, sensibel, selektive und schnelle Erkennung eines Biomarkers in einer komplexen Mischung wie Serum benötigt15,25. Biosensoren sind hier besser als bestehende Methoden, insbesondere aufgrund ihrer Robustheit und Empfindlichkeit. Speziell für den Nachweis von Infektionserregern gelten Bakteriophagen kürzlich als alternative Biorecognition Element für Biosensoren aufgrund ihrer Gastgeber Bakterien Spezifität33,34,35. Ersatz von Antikörpern mit Bakteriophagen ist sehr vielversprechend, um die Kosten zu senken und erhöhen die Stabilität noch weitere36. Ein solches System ermöglicht auch die Erkennung und Quantifizierung von spezifischen Phagen in der Umwelt und von klinischen Proben. Aufgrund der Prävalenz von Bakteriophagen und ihre Fähigkeit, Bakterien mit Antibiotika-Resistenz-Gene37,38transduzieren kann diese Methode wertvolle studieren die Verbreitung von resistenten Bakterien sein.

Die Quantifizierung von Biomolekülen ist in vielen verschiedenen Forschungsfeldern innerhalb der Wissenschaft, die Methoden wie die Radioimmunoassay (RIA) oder ELISA1verwendet. Einige dieser Methoden erfordern eine beschriftete Reagenz wie ein Radioisotop oder Enzym beschriftet Antikörper/Antigen, wodurch sie arbeitsintensiv und zeitaufwändig mit komplexen Verfahren2. Darüber hinaus sind die Robustheit, die Selektivität und die Sensitivität dieser Methoden nicht ausreichend für alle Analysen; insbesondere sind sie nicht ausreichend, wenn Attogram Mengen werden, anstatt Piktogramm Mengen3 analysiert müssen. Zu diesem Zweck haben Biosensoren beträchtliches Interesse4,5, insbesondere in Kombination mit molekularen Prägung für eine erhöhte Robustheit gewonnen.
Molekulare Prägung stützt sich auf Hohlräume durch funktionale Monomere um die Vorlage6, Erstellen von künstlichen Anerkennung Websites, die perfekt die Vorlage7ähneln dadurch zu schaffen. Diese Technik ist für verschiedene Anwendungen, einschließlich Drug Delivery Systeme und analytischen Trennung, sondern auch als Biorecognition Elemente in Biosensoren8,9,10verwendet worden. Allerdings gibt es noch einige Schwierigkeiten bei der Gestaltung von molekular geprägte Polymere (MIPs) für makromolekulare Vorlagen wie Proteinen und Zellen11,12. Aus diesem Grund haben viele Forscher konzentrierten sich auf Prägung der Vorlage Protein direkt auf einem Substrat, wodurch eine Fläche, die von der Ziel-Protein-12erkannt wird. Diese Oberflächenbeschichtung-Technik für den Einsatz von Anerkennung Hohlräume für große Moleküle und Baugruppen einschließlich Proteine verwendet wird Microcontact Prägung13,14bezeichnet. Die allgemeine Vorgehensweise der Methode richtet sich nach der Polymerisation zwischen zwei Oberflächen - eine Vorlage-Stempel und eine Polymer-Unterstützung - auf denen die Vorlage adsorbiert an eine Oberfläche15,16und brachte in Kontakt mit der Monomer-behandelte Oberfläche. Auf diese Weise bildet sich eine dünne Polymerfolie auf die Unterstützung durch UV-Polymerisation. Schließlich wird die Vorlage entfernt, hinterlässt Vorlage bestimmte Hohlräume an der Oberfläche der aufgedruckten Elektrode. Diese Methode hat einige Vorteile, unter anderem einen reduzierte Aktivität Verlust des aufgedruckten Moleküls, sowie eine sehr geringe Mengen an Vorlage Moleküle für die Bedruckung16,17verarbeiten. Somit können diese kostengünstige, stabile, empfindlichen und selektiven Oberflächen auf die Sensorflächen, Ausrichtung auf eine Vorlage der Wahl des Benutzers erstellt werden.
Der Biosensor kann für die Erkennung von einzelnen Proteine und viel größere Biomakromoleküle, inklusive Viren verwendet werden. Eine bestimmte Gruppe von Viren, die vor kurzem Interesse zu gewinnen ist die Bakteriophagen, das ist ein Virus, der Bakterien infiziert. Schnelle und empfindliche Detektion von Bakteriophagen ist wichtig bei biotechnologischen und biopharmazeutische Prozesse um die Infektionen von Bakterienkulturen mit Bakteriophagen18zu bestimmen. Die am häufigsten verwendete biologischen Test für Bakteriophage Erkennung ist der Doppelschicht Agar Methode19, mühsam und zeitaufwendig. Mehrere Versuche wurden unternommen, neuartige Diagnose-Tools für Viren (Bakteriophagen) entwickeln wie atomic Force Microscopy (AFM)20, Interferometrie21, Elektrochemie22und Sensor System23, 24. viel Arbeit konzentrierte sich auf Biosensoren aufgrund ihrer Vorteile als einfach zu bedienen, sehr empfindlich, und in der Lage, Echtzeit-Messung15,25. Eine bestimmte Art von Biosensor basiert auf Veränderungen in der Kapazität. Diese kapazitiven Biosensoren sind die elektrochemischen Sensoren zur Messung von Veränderungen in den dielektrischen Eigenschaften wenn ein Analyten mit einem Biorecognition Element auf die Sensoroberfläche interagiert, was zu einer Abnahme der Kapazität2,4 . Kapazitive Biosensoren wurden für den Nachweis der verschiedenen Analyten wie Antigene, Antikörper, Proteine und Schwermetall-Ionen6,26,27,28verwendet. Diese Arten von Biosensoren haben viele Vorteile, wie inhärente Schnelligkeit, hohe Empfindlichkeit, Einfachheit, geringe Kosten, einfache Handhabung und Echtzeit-Messung ohne Kennzeichnung29.
Die hierin beschriebene Methode zielt zu ermöglichen die Erkennung und Quantifizierung von niedrig-reichlich Biomoleküle in hoch komplexen Proben, ohne die Notwendigkeit der Verwendung Kennzeichnung. Insbesondere eignet sich die Technik im Bereich von Atto-Picogram von Biomolekülen, wo nicht andere kommerziell vorhandene Instrumente genau ihr Ziel quantitate.

<table><tbody><tr><td>Glass Cover slips</td><td>ThermoFisher</td><td>102222</td><td>protein stamp</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758-500ML</td><td>cleaning</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068-100ML</td><td>cleaning</td></tr><tr><td>Ultrasonic cleaner</td><td>Branson Ultrasonic</td><td>BRANSONIC M1800- E</td><td>cleaning</td></tr><tr><td>3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648-100ML</td><td>modification</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1009836010</td><td>rinsing/cleaning</td></tr><tr><td>glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-100ML</td><td>cross-linker</td></tr><tr><td>acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34850-1L-M</td><td>cleaning</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741-100ML</td><td>piranha solution</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-500ML</td><td>piranha solution</td></tr><tr><td>tyramine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T90344-5G</td><td>modification</td></tr><tr><td>CompactStat</td><td>Ivium Technologies</td><td>CompactStat.h: 30mA@10V/3MHz</td><td>potentiostat</td></tr><tr><td>Platinum Counter Electrode Kit</td><td>Equilabrium</td><td>AFCTR5</td><td>potentiostat</td></tr><tr><td>Reference Electrode</td><td>Equilabrium</td><td>RREF0021</td><td>potentiostat</td></tr><tr><td>acryloyl chloride</td><td>EMD Millipore</td><td>8.00826.0100</td><td>modification</td></tr><tr><td>triethylamine</td><td>EMD Millipore</td><td>8.08352.0100</td><td>modification</td></tr><tr><td>toluene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511-100ML</td><td>modification</td></tr><tr><td>N-hydroxymethyl acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>245801-100G</td><td>functional monomer</td></tr><tr><td>poly ethylene glycol-400-dimethacrylate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>409510-250ML</td><td>cross-linker</td></tr><tr><td>2-Hydroxy-4&amp;prime;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>410896-50G</td><td>functional monomer</td></tr><tr><td>UV polymerizator</td><td>Dymax</td><td>Dymax 5000ECE</td><td>UV-polymerization</td></tr><tr><td>forceps</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z168777-1EA</td><td>consumable</td></tr><tr><td>1-dodecanethiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471364-100ML</td><td>blocking agent</td></tr><tr><td>acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553-100G</td><td>functional monomer</td></tr><tr><td>N-hydroxymethylacrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>245801-100G</td><td>functional monomer</td></tr><tr><td>N-isopropylacrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415324-50G</td><td>functional monomer</td></tr><tr><td>methylenebisacrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>146072-500G</td><td>cross-linking monomer</td></tr><tr><td>N,N,N&#039;,N&#039;-tetrametyhlethyldiamine (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td>catalyst</td></tr><tr><td>ammonium persulphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td>initiator</td></tr><tr><td>Capacitive biosensor</td><td>CapSenze</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Merck</td><td>1042011000</td><td>regeneration buffer</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td>regeneration buffer</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352-1KG</td><td>running buffer</td></tr><tr><td>Na2HPO4&amp;nbsp;&amp;bull; 2H2O</td><td>Calbiochem</td><td>567547-1KG</td><td>running buffer</td></tr><tr><td>NaH2PO4&amp;nbsp;&amp;bull; 2H2O</td><td>Calbiochem</td><td>567549-1KG</td><td>running buffer</td></tr><tr><td>DELPHI correlative light and electron microscope</td><td>Phenom-World</td><td></td><td>equipment</td></tr><tr><td>Capacitive gold electrodes</td><td>CapSenze Biosystems</td><td></td><td>consumables</td></tr><tr><td>2,2&#039;-azobis(2-methypropionitrile)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441090-25G</td><td>photo-initiator</td></tr><tr><td>CapSenze Smart Software</td><td>CapSenze Biosystems</td><td></td><td>software program</td></tr></tbody></table>

ultrasensitive detection of biomarkers by using a molecular imprinting based capacitive biosensor

Die Fähigkeit zu erkennen und quantitate Biomoleküle in komplexe Lösungen seit jeher begehrte in Naturwissenschaften; für den Nachweis von Biomarkern, Schadstoffe und andere Moleküle des Interesses verwendet wird. Eine häufig verwendete Technik für diesen Zweck ist das Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA), wo oft ein Antikörper richtet sich an ein bestimmtes Ziel-Molekül, und ein zweite beschriftete Antikörper für den Nachweis des primären Antikörpers verwendet wird, ermöglicht die Absolute Quantifizierung von das Biomolekül unter Studie. Die Nutzung von Antikörpern als Erkennungselemente schränkt jedoch die Robustheit der Methode; genauso wie die Notwendigkeit der Verwendung von beschrifteten Moleküle. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde molekulare Prägung umgesetzt, Erstellen von künstlichen Anerkennung Websites ergänzen das Vorlage-Molekül und Bilddateien die Notwendigkeit der Verwendung von Antikörpern für die erste Bindung. Darüber hinaus kann für noch höhere Empfindlichkeit, beschrifteten Sekundärantikörper von Biosensoren, die unter Berufung auf die Kapazität für die Quantifizierung des Zielmoleküls ersetzt werden. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um schnell und markierungsfreie erkennen und quantitate Low-reichlich Biomoleküle (Proteine und Viren) in komplexen Proben mit einer Empfindlichkeit, die deutlich besser ist als die gängigen Systeme wie ELISA. Dies wird alles von molekularen Prägung in Kombination mit einer Kapazität Biosensor vermittelt.

Anhand des Protokolls gemäß Schaltplan in Abbildung 1wird eine nackte gold Elektrode mit einer Vorlage, eine Biomacromolecule Darstellung bedruckt werden. Diese Elektrode kann in eine kapazitive Biosensor (Abbildung 2), so dass die stabile Anwendung einer Vorlage auf die Elektrode und die Messung von Veränderungen in Kapazität bei der Bindung der Vorlage angewendet werden.
Eine schematische Darstellung der kapazitiven Biosensor ist in Abbildung 2dargestellt. Die MacOS-Pumpe, die für kontinuierliche Injektion von den laufenden Puffer (10 mM Phosphat, pH 7,4) und der Regeneration-Puffer (25 mM Glycin-HCl, pH 2,5) während der Regeneration in der Messzelle verantwortlich ist, ist in der Abbildung deutlich erkennbar. Die Messzelle besteht aus arbeiten, Referenz und Zähler-Elektroden. Das Einspritzventil besteht aus standard Protein/Bakteriophagen-Lösungen, die den Degasser zuerst auf der Durchreise sind und dann nacheinander in das System injiziert. Sobald die Lösungen die Arbeitselektrode eingefügt in der Messzelle erreicht, wird das Ergebnis in Echtzeit überwacht. Die Werte der Kapazität können registriert werden, indem Sie die Sensorgrams auf dem Computer-Bildschirm.
Abb. 3 und Abb. 4 zeigen die Unterschiede zwischen der Oberfläche des nackten und aufgedruckten gold-Elektroden. Diese Charakterisierung Schritt ist wichtig, um sicherzustellen, dass Polymere Hohlräume, gesehen als Rauheit auf der Oberfläche der Elektrode nach Prägung gibt. Abgesehen von SEM, gibt es auch andere Charakterisierungsmethoden AFM, Kontaktwinkel Messungen, einschließlich Ellipsometrie etc., die verwendet werden können, um die Oberfläche nach der Prägung zu charakterisieren. Auf diese Weise kann sichergestellt werden, dass der Prägung Prozess erfolgreich ist und dass Vorlage Vertiefungen auf der Oberfläche gebildet werden. In diesen Hohlräumen kann die Vorlage mit hoher Spezifität und Affinität binden.
Nach Einspritzen der Standardlösungen in der kapazitiven System, wurde im Durchschnitt der letzten fünf Lesungen automatisch von der Software berechnet, und die Kalibrierung Diagramme wurden durch die Veränderung der Kapazität gegen die Konzentration der Auftragen der Analyt. Der Rückgang der registrierten Kapazität entstand aus der Bindung der Vorlage. Je mehr Moleküle, die Bindung an das gold Elektrode Oberfläche, je höher die Verringerung der gesamten Kapazität nach dem allgemeinen Prinzip der kapazitiven Messungen. Abbildung 5 und Abbildung 6 zeigen, dass mit zunehmender Konzentration des Analyten, erhöht sich die ΔC wie erwartet. Der dynamische Bereich (zwischen denen ist der Konzentrationsbereich, wo das System für die Erkennung eines spezifischen Ziels nützlich ist) und der Nachweisgrenze (LOD) können durch die Analyse von diesen Diagrammen ausgewertet werden. Gemäß Abbildung 6, erkennt der Bakteriophagen eingeprägt kapazitive Biosensor Bakteriophagen im Konzentrationsbereich von 101 - 105 Pfu/mL, mit einem LOD-Wert von 10 Pfu/mL in dieser Studie. Abbildung 5 und Abbildung 6 auch Höhepunkt der Notwendigkeit zur Messung der Eichkurve im gleichen Intervall für die Vorlage-Konzentration erforderlich soll, da die Linearität der Regression über die Konzentrationen ( variieren Abbildung 5), oder haben unterschiedliche Neigungen (Abbildung 6). Es sollte auch angemerkt werden, dass aufgrund der niedrigen Konzentrationen verwendet, das System ist sehr empfindlich auf Schwankungen (Trübung in Probe, Luftzug, etc.) und es empfiehlt sich daher, mindestens laufen Triplicates, das Potenzial der einschließlich Ausreißer zu reduzieren . Aus dem gleichen Grund kann die Standardabweichung für stark verdünnte Proben ganz erheblich sein, wie in Abbildung 6zu sehen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig1.jpg"> Abbildung 1 . Schematische Darstellung der Methode Prägung Microcontact. (A) Vorbereitung von Glas Deckel rutscht (Vorlage Briefmarken), (B) Vorbereitung der kapazitiven gold Elektroden (C) Microcontact Prägung der Schablone auf das gold Elektrodenoberfläche über UV-Polymerisation und (D) Entfernung von der Vorlage aus der Elektrodenoberfläche (übernommen aus Ertürk Et Al., Biotechnologie Berichte 2014 (3): 65-72 mit Erlaubnis). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57208/57208fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig2.jpg"> Abbildung 2. Schematische Darstellung der kapazitiven Biosensor. Das allgemeine Layout des kapazitiven Biosensor, die in dieser Studie verwendeten (übernommen aus Ertürk Et Al., Biotechnologie Berichte 2014 (3): 65-72 mit Erlaubnis). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57208/57208fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig3.jpg"> Abbildung 3. Scanning Electron Microscopy of Protein eingeprägt Elektroden. REM-Bilder von (A) einer bloßen gold-Elektrode (Maßstabsleiste = 20 µm), und (B) ein Protein eingeprägt kapazitive gold Elektrode (Maßstabsleiste = 10 µm). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57208/57208fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig4.jpg"> Abbildung 4. Scanning Electron Microscopy von Bakteriophagen eingeprägt Elektroden. REM-Bilder einer nackten gold Elektrode (Maßstabsleiste = 20 µm) (A), und einem Bakteriophagen eingeprägt kapazitive gold Elektrode in verschiedenen Vergrößerungen (6600 x, Maßstabsleiste = 10 µm) (B), und 11, 500 X, Skala bar = 5 µm) (C); Pfeile bezeichnen eingehalten Bakteriophagen). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57208/57208fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig5.jpg"> Abbildung 5. Wirkung des Puffers Zusammensetzung für Kalibrierung Graphen. Kalibrierung-Diagramm, das die Änderung in Kapazität vs. einer Proteinkonzentration unter optimalen Bedingungen (Running Puffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7.4; Regeneration-Puffer: 25 mM Glycin-HCl, pH 2,5 einschließlich 50 mM Tween-20; Fördermenge: 100 µL/min, Probenvolumen: 250 µL; T: 25 ° C). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57208/57208fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig6.jpg"> Abbildung 6. Repräsentative Eichkurve für große Biomakromoleküle. Kalibrierung-Diagramm, das zeigt die Änderung im Kapazität vs. Bakteriophagen Konzentration unter optimalen Bedingungen (Puffer läuft: 10 mM Phosphat, pH 7.4; Regeneration-Puffer: 25 mM Glycin-HCl, pH 2,5 einschließlich 50 mM Tween-20; Fördermenge: 100 µL/min, Probenvolumen: 250 µL; T: 25 ° C) <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57208/57208fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor at JoVE.com

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Erkennung und Quantifizierung von niedrigen reichlich Moleküle in komplexe Lösungen mit molekularen Prägung in Kombination mit einer Kapazität Biosensor.

Gromer Nachweis von Biomarkern mithilfe einer molekularen Prägung basierte kapazitive Biosensor

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

ultrasensitive-detection-biomarkers-using-molecular-imprinting-based

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K Aufrufe.  Lund University. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Erkennung und Quantifizierung von niedrigen reichlich Moleküle in komplexe Lösungen mit molekularen Prägung in Kombination mit einer Kapazität Biosensor.

Serie: Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides an alternative strategy, capillary isoelectric focusing (cIEF), with many advantages compared to conventional immunoblotting. This is an antibody-based, automated, rapid, and quantitative method in which a complete western blotting procedure takes place inside an ultrathin capillary. This technique does not require a gel to transfer to a membrane, stripping of blots, or x-ray films, which are typically required for conventional immunoblotting. Here, proteins are separated according to their charge (isoelectric point; pI), using less than a microliter (400 nL) of total protein lysate. After electrophoresis, proteins are immobilized onto the capillary walls by ultraviolet light treatment, followed by primary and secondary (horseradish peroxidase (HRP) conjugated) antibody incubation, whose binding is detected through enhanced chemiluminescence (ECL), generating a light signal that can be captured and recorded by a charge-coupled device (CCD) camera. The digital image can be analyzed and quantified (peak area) using software. This high throughput procedure can handle 96 samples at a time; is highly sensitive, with protein detection in the picogram range; and produces highly reproducible results because of automation. All of these aspects are extremely valuable when the quantity of samples (e.g., tissue samples and biopsies) is a limiting factor. The technique has wider applications as well, including screening of drugs or antibodies, biomarker discovery, and diagnostic purposes.

Capillary isoelectric focusing is an antibody-based, ultrasensitive, high throughput technique, enabling detailed characterization of proteins and their isoforms from extremely small biological samples. The following describes a protocol for detection and quantification of specific proteins and their isoforms in an automated and robotized manner.

Hochsensible und quantitativen Nachweis von Proteinen und deren Isoformen durch Kapillare isoelektrischen Fokussierung Methode

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Forschung

Biochemie

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Einem mikrofluidischen Biochip-basierte Elektrochemische für Markierungsfreie DNA-Hybridisierungsanalyse

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Biotechnik

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 &#181;L of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Vollautomatische Schleuder Mikrofluidik-Vorrichtung zur Ultrasensitive Proteindetektion aus Vollblut

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Schnelle Homogene Detektion von biologischen Assays mit magnetischen Modulation Biosensorik-System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Biologie

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. Biomolecules such as proteins, carbohydrates, vitamins, fatty acids, nucleic acids, and enzymes are fundamental building blocks of living beings; they assemble into complex networks in biosystems to synchronize a myriad of life events. Proteins typically utilize complex interactome networks to carry out their functions; hence it is mandatory to evaluate such interactions to unravel their importance in cells at both cellular and organism levels. Toward this goal, we introduce a rapidly emerging technology, field-effect biosensing (FEB), to determine specific biomolecular interactions. FEB is a benchtop, label-free, and reliable biomolecular detection technique to determine specific interactions and uses high-quality electronic-based biosensors. The FEB technology can monitor interactions in the nanomolar range due to the biocompatible nanomaterials used on its biosensor surface. As a proof of concept, the protein-protein interaction (PPI) between heat shock protein 90 (Hsp90) and cell division cycle 37 (Cdc37) was elucidated. Hsp90 is an ATP-dependent molecular chaperone that plays an essential role in the folding, stability, maturation, and quality control of many proteins, thereby regulating multiple vital cellular functions. Cdc37 is regarded as a protein kinase-specific molecular chaperone, as it specifically recognizes and recruits protein kinases to Hsp90 to regulate their downstream signal transduction pathways. As such, Cdc37 is considered a co-chaperone of Hsp90. The chaperone-kinase pathway (Hsp90/Cdc37 complex) is hyper-activated in multiple malignancies promoting cellular growth; therefore, it is a potential target for cancer therapy. The present study demonstrates the efficiency of FEB technology using the Hsp90/Cdc37 model system. FEB detected a strong PPI between the two proteins (KD values of 0.014 &#181;M, 0.053 &#181;M, and 0.072 &#181;M in three independent experiments). In summary, FEB is a label-free and cost-effective PPI detection platform, which offers fast and accurate measurements.

Field-effect biosensing (FEB) is a label-free technique for detecting biomolecular interactions. It measures the electric current through the graphene biosensor to which the binding targets are immobilized. The FEB technology was used to evaluate biomolecular interactions between Hsp90 and Cdc37 and a strong interaction between the two proteins was detected.

Erforschung der biomolekularen Interaktion zwischen dem molekularen Chaperon Hsp90 und seiner Client-Proteinkinase Cdc37 unter Verwendung der Feldeffekt-Biosensortechnologie

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

Die Verwendung eines β-Lactamase-basierte Conductimetric Biosensor-Assays, biomolekulare Wechselwirkungen zu erkennen

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor analytes against the background of human serum are crucial.
Nanoimprinting lithography (NIL) was used to fabricate, at a low cost, sensing areas as large as 1.5 mm x 1.5 mm. The sensing surface was made of high-fidelity arrays of nanoholes, each with an area of about 140 nm2. The great reproducibility of NIL made it possible to employ a one-chip, one-measurement strategy on 12 individually manufactured surfaces, with minimal chip-to-chip variation. These nanoimprinted localized surface plasmon resonance (LSPR) chips were extensively tested on their ability to reliably measure a bioanalyte at concentrations varying from 2.5 to 75 ng/mL amidst the background of a complex biofluid-in this case, human serum. The high fidelity of NIL enables the generation of large sensing areas, which in turn eliminates the need for a microscope, as this biosensor can be easily interfaced with a commonly available laboratory light source. These biosensors can detect cardiac troponin in serum with a high sensitivity, at a limit of detection (LOD) of 0.55 ng/mL, which is clinically relevant. They also show low chip-to-chip variance (due to the high quality of the fabrication process). The results are commensurable with widely used enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based assays, but the technique retains the advantages of an LSPR-based sensing platform (i.e., amenability to miniaturization and multiplexing, making it more feasible for POC applications).

This work describes a nanoimprinting lithography method to fabricate high-quality sensing arrays that work on the principle of extraordinary optical transmission. The biosensor is low-cost, robust, easy to use, and can detect cardiac troponin I in serum at clinically relevant concentrations (99th percentile cutoff &#8764;10-400 pg/mL, depending on the assay).

Verwendung von außergewöhnlichen optischen Übertragung kardiale Biomarker in humanem Serum quantifizieren

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

Trockenen Film Photoresist-basierte elektrochemische mikrofluidischen Biosensor Plattform: Gerät Fertigung, On-Chip-Test Vorbereitung und Systembetrieb

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical communities. The resolution of results obtained from current methods of measuring certain biomarkers can take several days or weeks to obtain, as they can be limited in resolution both spatially and temporally (e.g., fluid compartment microdialysis of interstitial fluid analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA], high-performance liquid chromatography [HPLC], or mass spectrometry); thus, their guidance of timely diagnosis and treatment is disrupted. In the present study, a unique technique for detecting and measuring peptide transmitters in vivo through the use of a capacitive immunoprobe biosensor (CI probe) is reported. The fabrication protocol and in vitro characterization of these probes are described. Measurements of sympathetic stimulation-evoked neuropeptide Y (NPY) release in vivo are provided. NPY release is correlated to the sympathetic release of norepinephrine for reference. The data demonstrate an approach for the fast and localized measurement of neuropeptides in vivo. Future applications include intraoperative real-time assessment of disease progression and minimally invasive catheter-based deployment of these probes.

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Established immunochemical methods to measure peptide transmitters in vivo rely on microdialysis or bulk fluid draw to obtain the sample for offline analysis. However, these suffer from spatiotemporal limitations. The present protocol describes the fabrication and application of a capacitive immunoprobe biosensor that overcomes the limitations of the existing techniques.

Zeitaufgelöste In vivo Messung der Neuropeptiddynamik mittels kapazitiver Immunsonde im Schweineherzen

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

Dynamic Multiparameter Platelet Function Assessment Using a Capacitive Biosensor

Platelets play a fundamental role in blood clotting through a series of regulated responses, including adhesion, spreading, granular secretion, aggregation, and cytoskeletal contraction. However, current assays are limited to partial analysis of platelet function under non-physiological conditions. Thus, an improved assay that reflects the dynamic and multifaceted nature of platelet function in physiological settings is necessary. In this context, a novel approach is introduced to measure several key parameters related to platelet function in a more physiologically relevant ex vivo semi-rigid microenvironment compared to traditional assays. This method utilizes an advanced electrical biosensor, the membrane capacitance sensor (MCS), which provides unique insights into the clotting process through three distinct readouts. These readouts are highly sensitive to variations in platelet count, stimulation intensity, and specific activation pathways. As a purely electrical sensing platform, the MCS demonstrates significant potential as a diagnostic tool for detecting primary hemostatic function disorders, evaluating the efficacy of therapeutic treatments, and advancing the broader understanding of the roles of platelets in hemostasis and thrombosis.

A protocol for a novel dynamic multiparameter platelet functional assay using a capacitive biosensor is presented here. This approach, designed within a semi-rigid microenvironment to enhance physiological relevance, provides three output parameters sensitive to platelet count, stimulation strengths, and activation pathways.