この作品は、著名な若手学者 (81625002)、国家自然科学基金、中国の (81470389、81270282、81601238)、プログラムの上海学術研究リーダー (18XD1402400)、上海市の国立科学基金によって支えられました。教育委員会 Gaofeng 臨床医学助成 (20152209)、上海 Shenkang 病院開発センター (16CR3034A)、上海交通大学 (YG2013MS42)、上海 Jiao はさみ大学大学院医学 (15ZH1003、14XJ10019)上海セーリング プログラム (18YF1413000) と蚌埠市医科大学 (Byycx1722) の大学院イノベーション プログラム。私たちの研究室で彼の以前のヘルプ、博士 Erhe Gao に感謝します

すべての動物実験は、実験動物の使用に関する健康ガイドラインの国家機関によるとを実施し、研究所の動物倫理委員会で承認されました。男性 c57bl/6 j マウス (8-10 週齢) は、すべての実験のために使用されました。マウスは、24 の ° C ± 4 ° C、水や食料を無料での 12 h 明暗周期下で病原体フリーの条件の下で収容されました。
1 アデノ ウイルス溶液の調製
<ol><li>精製されたアデノ ウイルス ソリューションの到着後、-80 ° C のフリーザーでソリューションを保存します。 注: 実行可能なマウスのアデノ ウイルス注入を行った。アデノウイルスベクターの無菌性を確保するため、アデノ ウイルス (エンコード ルシフェラーゼ、VDR、またはターゲットに VDR shRNA) 調製し、, 市販9,10を精製しました。</li>
	<li>操作の日、-80 ° C のフリーザーから精製されたアデノ ウイルス ソリューション (3 x 1010プラーク形成単位 [pfu]/mL) を取り出すし、氷上アデノ ウイルスのベクトルのソリューションを解凍します。</li>
	<li>フェイス マスク、滅菌手袋、滅菌ガウンを着た。</li>
	<li>50 μ L の準備手術前日に滅菌されているハミルトン注射器。 注: 滅菌、ハミルトン注射器はガーゼに包まれ、高温・高圧滅菌器で配置。「ソリッドの滅菌」のモードが選ばれ、滅菌が「スタート」ボタンを押すことによって開始されました。</li>
	<li>精製されたアデノ ウイルス ソリューションの完全な融解後スプレーの 75% エタノール、アデノ ウイルス ソリューションを含む管、層流無菌フードにアデノ ウイルス ソリューションを移動します。</li>
	<li>層流無菌フードでは、ハミルトンのシリンジに 30 G の針の添付ファイルに続く針なしハミルトン注射器を使用して 50 μ L アデノ ウイルス ソリューションを吸引します。</li>
	<li>上方に 30 G の針とシリンジを保持、アデノ ウイルス ソリューション (針の先端から最初のソリューションの滴の外観で確認) と針が塗りつぶされるまで注射器のピストンがゆっくりと。 注: それは 30 G の針を合わせて約 45 μ L ソリューションをかかりますので、今はほとんどないソリューションが表示されるシリンジで。</li>
	<li>上記準備された注射器を使用して、別の 30 μ L のアデノ ウイルス ソリューションを慎重に吸引、その後の使用のための氷に緩くおおわれた注射器。</li>
</ol>2. 麻酔や手術の準備
<ol><li>イソフルラン気化器に 20 mL イソフルランを追加、イソフルラン気化器を酸素ボンベに接続します。</li>
	<li>バルブを開き、酸素を聞かせてイソフルラン気化器に酸素タンクからフローします。イソフルラン気化器で酸素フロー モニター経由で 2 L/分で酸素流量を維持します。</li>
	<li>イソフルラン気化器に接続されているプラスチック製のケージで 2 分間 100% 酸素 (2 L/分) で 4% イソフルランとマウスの麻酔を誘導します。</li>
	<li>プラスチック製ケージから麻酔下マウスを取り出しと層流無菌フードでは、腹臥位でのプラスチック製プラットフォーム上に固定、鼻の円錐形によって 100% 酸素 (2 L/分) で 2% イソフルレンで麻酔を維持します。</li>
	<li>つま先ピンチ応答の不在によって適切な麻酔を確認します。</li>
	<li>角膜を乾燥から保護するためにそれぞれの目に滅菌眼クリームを適用します。</li>
	<li>胸部と上腹部を剃る。1 分削除脱毛クリーム坊主のサイトに市販の脱毛クリームを適用し、残りのぬれたガーゼで毛皮。</li>
	<li>ヨウ素クロルヘキシジンによる消毒剤 (例えば entoiodine) の 3 のスクラブと手術部位 (左胸の下の部分) を消毒します。滅菌ドレープで手術部位をカバーしてください。</li>
</ol>3. 心筋内注射マウスの心臓におけるアデノ ウイルス
<ol><li>手袋を脱ぐし、滅菌手袋の新しいペアに置きます。</li>
	<li>外科はさみのペア、マイクロ モスキート止血鉗子を滅菌し、高の操作の前に日に針ホルダー温・高圧滅菌器 (手順 1.4 注記参照)。</li>
	<li>剣と腋窩を結ぶ線に沿って 0.5 cm の皮膚切開を行います。大胸筋と小胸筋とマイクロ モスキート止血鉗子を解剖ぶっきらぼう。</li>
	<li>大胸筋と小胸筋の取り消しによって肋間スペースを公開します。貫通し、マイクロ モスキート止血で第 4 肋間スペース (または観察によって広い肋間スペース) を開きます。</li>
	<li>そっと胸の壁の右側に押すことによって非利き手の人差し指でハートを外部化する切開に向けて心を押してください。</li>
	<li>優しく非利き手の親指と人差し指で外在の心臓を保護します。</li>
	<li>支配的な手で満ちているアデノ ウイルス (図 1) ハミルトン シリンジを介して 3 つのサイト (左心室の腹、背、左右壁) で左心室の心筋に 30 μ L アデノ ウイルス ソリューションの合計を挿入します。</li>
	<li>注入が完了したら、すぐに胸腔内の空間に心を配置します。</li>
	<li>手動で胸壁を皮膚切開部位に向かって軽く押す、胸腔内の空気を避難させます。 注: 成功した空気避難は主要な胸びれと追放された空気によって引き起こされるマイナーな胸筋の羽ばたきによって証明されることができます。</li>
	<li>5-0 シルク縫合糸で水平マットレス縫合で皮膚を閉じます。 注: 大胸筋と小胸筋がない縫合する、彼らは解剖だけぶっきらぼう、彼らの解剖学的構造、操作を通じてそのまま。</li>
</ol>4. 術後管理
<ol><li>二度毎日操作11の後最初の 48 時間の術後の痛みを軽減する皮下注射を介してブプレノルフィン (3 mg/kg) を管理します。</li>
	<li>手術後、完全に回復するまですぐに熱パッド (37 ° C) の上のマウスを維持します。それは完全に回復した後ケージにマウスを配置します。</li>
	<li>ハミルトンの使用済み注射器、高温・高圧滅菌器で 30 G 注射針滅菌 (手順 1.4 注記参照)。シャープス コンテナーの滅菌の 30 G の注射針を収集します。</li>
</ol>5. 心臓ルシフェラーゼ発現を測定するin Vivoイメージング
<ol><li>アデノ ウイルス注入後の 5 日目、ルシフェリン ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) で 15 mg/ml の新鮮な在庫ソリューションを準備します。0.2 μ m のフィルターを通してソリューションをフィルターします。</li>
	<li>150 mg/kg 体重でルシフェリン溶液注入目を覚ましマウス腹腔内ベンゼン。</li>
	<li>イメージング システムを入れます。</li>
	<li>自動イメージング システムの自己診断後、「発光」として画像モードを選択し、次の設定を行う: 露出: 自動;ビニング: 8;FStop: 1;励起: ブロック;排出: オープン。</li>
	<li>ルシフェリン注射後 10 分で抱水クロラール注入 (300 mg/kg 体重) によるマウスを麻酔します。つま先ピンチ応答の不在によって適切な麻酔を確認します。</li>
	<li>カメラに向けて胸を温水イメージング ステージ上腹臥位での麻酔下のマウスを固定します。</li>
	<li>画像 (各マウスの 1 画像) を収集し、胸の周りの利益 (率 ROI) の同一円測定領域を描画することによって信号の強さを数値化します。</li>
	<li>画像のコレクションの後マウスを犠牲にし、次のセクションで説明したように、組織を収集します。</li>
</ol>6. 組織の収穫
<ol><li>ウイルス注入 (図 1 b) 後の異なる時間ポイントで 4% イソフルランとマウスを麻酔の維持と鼻の円錐形によって 2% イソフルレン麻酔・腹臥位でのプラスチック製プラットフォーム上に固定します。</li>
	<li>前頸部で正中腹壁切開を行います。肩甲舌骨と胸鎖乳突筋の取り消しによって右総頚動脈を公開します。</li>
	<li>Transecting 右総頚動脈と血を流してによってマウスを犠牲に。</li>
	<li>腹部の正中腹壁切開を行います。鎖骨中央線上に沿って胸郭の両側から肋骨を切り、横隔膜のトランセクトします。</li>
	<li>剣を持ち上げることによって心を公開します。上行大動脈を見つけるし、血管周囲の脂肪組織を慎重に取り外します。</li>
	<li>Cannulate 大動脈と逆行性 4 ° C リン酸緩衝液 (PBS) の 0.5 ml、1 mL の注射器に接続されている 30 G 針で心臓を灌流します。</li>
	<li>灌流後、中心部を切除、左と右の心室に分割します。肝臓、肺と脾臓を切除します。</li>
	<li>冷 PBS (4 ° C) で、2 つの洗後液体窒素の極低温バイアルで収集されたすべての組織を個別に格納します。</li>
</ol>7. タンパク質発現の定量
<ol><li>均質化のバッファーを準備するには、1: 100 の比率で市販の換散バッファーにプロテアーゼ阻害剤のカクテルを追加します。処理されるサンプルの数に基づいて容量を計算します。その後の使用のための 4 ° C で準備された均質化バッファーを保持します。</li>
	<li>液体窒素タンクから組織を取る。組織の高精度スケール (組織の各部分の約 60 mg) 重量を量る。</li>
	<li>組織を新しい 1.5 mL 遠心チューブに転送します。すぐに遠心チューブに 200 μ L の均質化のバッファーと冷却 1.5 mm 鋼球 (4 ° C) を追加します。</li>
	<li>冷却 (4 ° c) マイクロ遠心チューブ用の研削盤、自動体内金属ホルダーをセキュリティで保護し、次の設定でコンピューターを起動することによって均質化を開始: 周波数: 70 Hz時間: 120 秒。</li>
	<li>均質化後、(16,000 × g, 4 ° C)、ホモジネートを遠心し、100 μ L ピペットを新しい 1.5 mL チューブに上清を慎重に転送。</li>
	<li>追加読み込みバッファーし、1:4 の割合で上清タンパク質溶液 (5 x) と 100 ° C で 5 分間でタンパク質を変性します。</li>
	<li>心臓や他の臓器組織に蛋白質の表現のレベルの西部のしみの分析 (結果を図 2および図 3に示す代表) によって監視されてさらにプロトコルに従って前述の12。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yancy, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2017+ACC/AHA/HFSA+Focused+Update+of+the+2013+ACCF/AHA+Guideline+for+the+Management+of+Heart+Failure:+A+Report+of+the+American+College+of+Cardiology/American+Heart+Association+Task+Force+on+Clinical+Practice+Guidelines+and+the+Heart+Failure+Society+of+America.">2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America.</a> J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).</li><li>Pu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte-expressed+farnesoid-X-receptor+is+a+novel+apoptosis+mediator+and+contributes+to+myocardial+ischaemia/reperfusion+injury.">Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury.</a> Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).</li><li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+melatonin+receptor+ROR&#945;+is+a+novel+endogenous+defender+against+myocardial+ischemia_reperfusion+injury.">The nuclear melatonin receptor ROR&#945; is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury.</a> J Pineal Res. (3), 313-326 (2016).</li><li>Yao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+D+receptor+activation+protects+against+myocardial+reperfusion+injury+through+inhibition+of+apoptosis+and+modulation+of+autophagy.">Vitamin D receptor activation protects against myocardial reperfusion injury through inhibition of apoptosis and modulation of autophagy.</a> Antioxid Redox Signal. 22 (8), 633-650 (2015).</li><li>He, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+liver-X-receptor+alpha+but+not+liver-X-receptor+beta+protects+against+myocardial+ischemia/reperfusion+injury.">Activation of liver-X-receptor alpha but not liver-X-receptor beta protects against myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> Circ Heart Fail. 7 (6), 1032-1041 (2014).</li><li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rAAV9+to+Overexpress+or+Knockdown+Genes+in+Mouse+Hearts.">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts.</a> J Vis Exp. (118), (2016).</li><li>Bish, L. T., Sweeney, H. L., Muller, O. J., Bekeredjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+delivery+to+the+heart.">Adeno-associated virus vector delivery to the heart.</a> Methods Mol Biol. 807, 219-237 (2011).</li><li>Michael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+gene+delivery+with+cardiopulmonary+bypass.">Cardiac gene delivery with cardiopulmonary bypass.</a> Circulation. 104 (2), 131-133 (2001).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Hepatic+Fatty+Acids+Uptake+and+Oxidation+by+LRPPRC-Driven+Oxidative+Phosphorylation+Reduces+Blood+Lipid+Levels.">Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels.</a> Front Physiol. 7, 270 (2016).</li><li>Zhang, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+the+contractile+phenotype+in+corpus+cavernosum+smooth+muscle+cells+by+Myocardin+gene+therapy+ameliorates+erectile+dysfunction+in+bilateral+cavernous+nerve+injury+rats.">Maintenance of the contractile phenotype in corpus cavernosum smooth muscle cells by Myocardin gene therapy ameliorates erectile dysfunction in bilateral cavernous nerve injury rats.</a> Andrology. 5 (4), 798-806 (2017).</li><li>Virag, J. A., Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+artery+ligation+and+intramyocardial+injection+in+a+murine+model+of+infarction.">Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction.</a> J Vis Exp. (52), (2011).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Gao, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+efficient+model+of+coronary+artery+ligation+and+myocardial+infarction+in+the+mouse.">A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse.</a> Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+protective+role+of+nuclear+melatonin+receptor+ROR&#945;+in+diabetic+cardiomyopathy.">Novel protective role of nuclear melatonin receptor ROR&#945; in diabetic cardiomyopathy.</a> J Pineal Res. 62 (3), (2017).</li><li>Nduhirabandi, F., Lamont, K., Albertyn, Z., Opie, L. H., Lecour, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+toll-like+receptor+4+in+melatonin-induced+cardioprotection.">Role of toll-like receptor 4 in melatonin-induced cardioprotection.</a> J Pineal Res. 60 (1), 39-47 (2016).</li><li>Wu, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JNK-TLR9+signal+pathway+mediates+allergic+airway+inflammation+through+suppressing+melatonin+biosynthesis.">JNK-TLR9 signal pathway mediates allergic airway inflammation through suppressing melatonin biosynthesis.</a> J Pineal Res. 60 (4), 415-423 (2016).</li><li>de Luxan-Delgado, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+reduces+endoplasmic+reticulum+stress+and+autophagy+in+liver+of+leptin-deficient+mice.">Melatonin reduces endoplasmic reticulum stress and autophagy in liver of leptin-deficient mice.</a> J Pineal Res. (1), 108-123 (2016).</li><li>Scofield, S. L., Singh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+Myocardial+Ischemia+and+Reperfusion+Injury+in+Mice+Using+Surface+Pad+Electrocardiography.">Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Cai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNA+H19+mediates+melatonin+inhibition+of+premature+senescence+of+c-kit(+)+cardiac+progenitor+cells+by+promoting+miR-675.">Long noncoding RNA H19 mediates melatonin inhibition of premature senescence of c-kit(+) cardiac progenitor cells by promoting miR-675.</a> J Pineal Res. 61 (1), (2016).</li><li>Chua, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardioprotective+effect+of+melatonin+and+exendin-4+treatment+in+a+rat+model+of+cardiorenal+syndrome.">The cardioprotective effect of melatonin and exendin-4 treatment in a rat model of cardiorenal syndrome.</a> J Pineal Res. 61 (4), 438-456 (2016).</li><li>Pei, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+attenuates+postmyocardial+infarction+injury+via+increasing+Tom70+expression.">Melatonin attenuates postmyocardial infarction injury via increasing Tom70 expression.</a> J Pineal Res. 62 (1), (2017).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+receptor-dependent+Notch1_Hes1+activation+by+melatonin+protects+against+myocardial+ischemia-reperfusion+injury_+in+vivo+and+in+vitro+studies.">Membrane receptor-dependent Notch1_Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury_ in vivo and in vitro studies.</a> J Pineal Res. 59 (4), 420-433 (2015).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+rescues+cardiac+thioredoxin+system+during+ischemia-reperfusion+injury+in+acute+hyperglycemic+state+by+restoring+Notch1/Hes1/Akt+signaling+in+a+membrane+receptor-dependent+manner.">Melatonin rescues cardiac thioredoxin system during ischemia-reperfusion injury in acute hyperglycemic state by restoring Notch1/Hes1/Akt signaling in a membrane receptor-dependent manner.</a> J Pineal Res. 62 (1), (2017).</li><li>Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramyocardial+cell+delivery:+observations+in+murine+hearts.">Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts.</a> J Vis Exp. (83), e851064 (2014).</li></ol>

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現在のレポートに示します Gaoらによって心筋梗塞誘導法から変更された心臓の発現ウイルスベクターの心筋内注入法が変更されました。13現在、体内特性特定遺伝子の機能のほとんどを含むノックアウト、トランスジェニック マウス3,14,15,16,17 の世代、高価な時間のかかる、労働集約型であります。また、遺伝子ベクターまたは全身またはローカル注入による siRNA の配信も広く循環器病研究4,5,7の遺伝子操作の練習します。特に、心筋内注入は、特定の状況下での心臓の遺伝子操作の置き換えができない: サイトが注入が必要 (例えば、心筋梗塞モデルにおけるボーダー ゾーン注入) を監督するとき11;期間限定の遺伝子操作が必要 (例えば、アデノ ウイルス注入) ときです。ここでは、変更された心筋内注入法が簡単な時間の節約、および非常に効率的なことを示した。
プロトコルの中で重要なステップとトラブルシューティングします。
このプロトコルの成功した操作は、いくつかの重要な手順を注意しなければなりません。吸引ウイルス、ハミルトン シリンジと接続されている針内にある空気を避難する必要があります、前に局所心筋傷害また更に死以外空気を心筋に注入される可能性があります。この問題を避けるためには、十分なウイルス量でいっぱい使える - ハミルトン注射器配置しないでくださいプランジャー端を下方に、これは自発的に金属のプランジャーの重力によって空気を吸引がありますので。麻酔は深い麻酔は術後回復を遅らせる可能性があり、深刻な深い麻酔は、死を引き起こす可能性があります注意深く監視する必要があります。十分な麻酔の後中心がない外部化胸部キャビティから力によって重篤な肺の傷害が生じるので。確かに、適切な心臓の外部化は、心の穏やかなプッシュのみを必要とし、抵抗も不適切な方向に向けてプッシュ可能性があります。
技術の制限:
挿管の手順に必要な時間が短縮されます、この技術での除去は、死を避けるために比較的制限された時間ウィンドウ内にある心筋内注入のプロシージャの終わるべきであることを示唆しています。心は、私たちの経験によると、30 人以上のない外部必要があります s、これは死亡率を増加し、手術後の回復が遅くなりますので。したがって、ここで説明したプロトコルの最初の試みには、挿管の使用の使用をお勧めします。別の制限は、心筋内注入7の従来の方法にも存在するこの方法で配信されるウイルスのベクトルの不均等な配分です。さらに、ここで説明する方法が役より別の心疾患モデル18,19,20の確立によって続くことができる、無傷の心の中の心臓特異的遺伝子操作 21,22,23。これらのマウス可能性があります手順を容認しないので、梗塞心などの傷ついた心にエージェントを提供する現在のメソッドの使用は限られているかもしれません。
既存のメソッドの意義:
従来の心筋内注入は、挿管および機械的人工換気24を必要とし、高速マウス ハートビートによる注射部位を見つけるが困難になります。これらの問題を操作時間13時間遅れによってもたらされるバリエーションが増えてさらに延長します。ここで示した修正手法はクイック、手動で外部化された心臓を保護することによってサイトの正確な注入の場所をことができます。全体的に、その後の研究を大幅に増強します。また、挿管および機械的人工換気の除去は修正法をほぼすべての研究室にアクセスできるようにします。

心臓病は、罹患率と死亡率の世界1,2の主要な原因です。心筋梗塞、心不全などの命にかかわる心臓疾患の効果的な治療戦略の欠如は、基になるある集中的な探査と新しい治療オプション3の身分証明書を集めています。これらの科学的な探検の心臓特異的遺伝子操作は広く使われている4,5です。心臓遺伝子操作ゲノム編集強力な転写活性化因子のようなエフェクター ヌクレアーゼ (TALEN) を使用することによって達成することができ、定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR) をクラスター化 CRISPR 関連タンパク質 9 (Cas9)/ツール、または異所性の遺伝物質 (例えば興味の蛋白質をコードする遺伝子を運ぶウイルスのベクトル) の配信6。生きているマウスに正確と時空間のゲノムの変更が許可されるゲノム編集、それはまだ6時間のかかり、労働集約的な練習。また、ウイルスのベクトルまたは小さな干渉 RNA (siRNA) 複雑な配信が日常的に心臓特異的遺伝子操作は6を実行しました。
成体マウスの心にウイルス ベクター配信は約 2 つの戦略によって達成される: 全身またはローカル注入。Cardiotropic 血清型 AAV9 など通気の全身投与は心筋特異的遺伝子操作7の非侵襲的です。ただし、このメソッドは、効率的な情報伝達と遺伝子発現に必要なベクトルの比較的高い量を必要とする、筋肉や肝臓7非標的臓器の重要な伝達があります。ローカル ウイルス注入は、心筋や冠動脈内配信7によって実現されます。冠動脈内の配信は、心筋内注入と比較して心の中でウイルスのより均等に配分をもたらします。ただし、この手法の欠点は、全身循環し、標的臓器8、および操作中に圧力測定器をその要件の伝達ウイルスのベクトルのうち急速洗浄です。対照的に、ウイルスを均等に失敗した心筋と同様に、サイト固有の配信でもより良いウイルス保持心筋内注入によりベクトル7です。小動物、冠動脈内の配信は技術的に困難、全身性 AAV9 注入と心筋がより一般的に用いられる4,5,7を実行します。全身注入が簡単に実行できますが、従来の心筋内注入機械換気と開胸を必要とする、広範な組織の損傷を引き起こすと時間がかかる。
本報告では、時間を節約、簡単な非常に効率的な心筋内注入法について説明しました。アデノ ウイルス shRNA VDR、ターゲットや VDR、ルシフェラーゼのエンコーディングは、心臓遺伝子発現を操作する注入しました。一度マスター、このメソッドはセルまたはマウスの心臓の他の材料の注入と同様、遺伝子操作の使用できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="914">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td colspan="4" height="40" style="height:40px;width:916px;">Equipments</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Laminar flow sterile hood</td>
			<td style="width:267px;">Fengshi Animal Experimental&#160; Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China)</td>
			<td style="width:143px;">FS-CJ-2F</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">75005282</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Tissue grinding machine</td>
			<td style="width:267px;">Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td>
			<td style="width:143px;">Scientz-48</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">High temperature/high pressure sterilizer</td>
			<td style="width:267px;">Hirayama (Saitama, Japan)</td>
			<td style="width:143px;">HVE-50</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Isoflurane vaporizer&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Matrix (Orchard Park, USA)</td>
			<td style="width:143px;">VIP3000</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">IVIS&#160; Lumina III imaging system</td>
			<td style="width:267px;">PerkinElmer (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">CLS136334</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Precision&#160;balance</td>
			<td style="width:267px;">Sartorius (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td style="width:143px;">28091873</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Instruments&#160;</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Eppendorf pipette (100 &#181;L)</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf (Westbury, USA)</td>
			<td style="width:143px;">&#160;4920000059</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Eppendorf pipette (10 &#181;L)</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf (Westbury, USA)</td>
			<td style="width:143px;">&#160;4920000113</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Forceps</td>
			<td style="width:267px;">Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.&#160;</td>
			<td style="width:143px;">JD4020</td>
			<td style="width:156px;">Curved tip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Hamilton syringe</td>
			<td style="width:267px;">Hamilton (Nevada, USA)</td>
			<td style="width:143px;">80501</td>
			<td style="width:156px;">Volume 50 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Micro-mosquito hemostat</td>
			<td style="width:267px;">F.S.T (Foster City, USA)</td>
			<td style="width:143px;">13011-12</td>
			<td style="width:156px;">Curved, tip width 1.3mm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Needle holder&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;">J32110</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:267px;">F.S.T (Foster City, USA)</td>
			<td style="width:143px;">14002-12</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">1-mL Syringe</td>
			<td style="width:267px;">WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Materials and reagents</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Anti-GAPDH antibody</td>
			<td style="width:267px;">CST (Danvers,&#160; USA)</td>
			<td style="width:143px;">#2118</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Anti-Luciferase antibody</td>
			<td style="width:267px;">Abcam (Cambridge, UK)</td>
			<td style="width:143px;">ab187340</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:267px;">CST (Danvers,&#160; USA)</td>
			<td style="width:143px;">&#160;#7074</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Anti-VDR antibody</td>
			<td style="width:267px;">Abcam (Cambridge, UK)</td>
			<td style="width:143px;">&#160;ab109234</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">PA175056</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Chloralic hydras</td>
			<td style="width:267px;">LingFeng Chemical (ShangHai, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Cryogenic Vials</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">375418</td>
			<td style="width:156px;">1.8 mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Depilatory cream</td>
			<td style="width:267px;">Veet (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Gibco (Grand Island,&#160; USA)</td>
			<td style="width:143px;">14040133</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Entoiodine</td>
			<td style="width:267px;">LiKang (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;">310132</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">EP tube</td>
			<td style="width:267px;">Sarstedt (Newton, USA)</td>
			<td style="width:143px;">PCR001</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Filter</td>
			<td style="width:267px;">Millipore (Bedford, USA)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;">Pore size 0.2 &#181;m&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:267px;">Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Luciferin</td>
			<td style="width:267px;">Promega (Madison, USA)</td>
			<td style="width:143px;">P1041</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Lysis buffer for western&#160; blot</td>
			<td style="width:267px;">Beyotime (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;">P0013J</td>
			<td style="width:156px;">Without inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Ophthalmic cream</td>
			<td style="width:267px;">Apex Laboratories ( Melbourne, Australia))</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">PBS</td>
			<td style="width:267px;">Gibco (Grand Island,&#160; USA)</td>
			<td style="width:143px;">10010023</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">78438</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">5-0 silk suture</td>
			<td style="width:267px;">Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Steel ball</td>
			<td style="width:267px;">Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;">Width 1.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:267px;">Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;">30 gauge&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Warm mat</td>
			<td style="width:267px;">Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China )</td>
			<td style="width:143px;">NF-GNCW</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and efficient method for in vivo cardiac-specific gene manipulation by intramyocardial injection in mice

中心部に特に遺伝子操作は、心疾患の病因と治療の可能性の検討を大幅増強します。心臓固有遺伝子デリバリー生体内で一般的全身またはローカルの配信を実現します。尾静脈から全身投与が簡単かつ効率的な組換えアデノ随伴ウイルス 9 (AAV9) を使用して心臓の遺伝子発現を操作します。ただし、このメソッドの効率的な伝達ベクトルの比較的高い量を必要とする、非標的臓器の遺伝子導入可能性があります。ここでは、生体内で心臓特異的遺伝子操作マウスの心筋内注入のシンプルで効率的、かつ時間を節約法について述べる。(換気) なし、麻酔下でメジャーとマイナーの胸筋は切除したぶっきらぼうとマウスの心臓だった第 4 肋間スペースに小さな切開を通してマニュアル外部によって公開されるすぐに。その後、エンコード ルシフェラーゼ (リュック) とビタミン D の受容器 (VDR) または短いヘアピン RNA (shRNA) ターゲットに VDR、アデノ ウイルスは、心筋にハミルトン注射器で注入されました。その後体内イメージングを示したそのルシフェラーゼ中心部に特に正常に発現。さらに、西部のしみの分析は成功の過剰発現またはマウスの心臓における VDR の沈黙を確認しました。一度マスター、細胞やマウスの心臓におけるナノゲルなど他の材料の注入と同様、遺伝子操作、このテクニックが使えます。

実験プロトコルおよび報告に関する主な手順のいくつかは、図 1に表示されます。アデノ ウイルス エンコード ルシフェラーゼ (Adv ・ リュック) の心筋内注射後 5 日目は、生体内でイメージ投射 adv リュック注入マウスで具体的にあった中心 (図 2 a、 B)、ルシフェラーゼの堅牢な過剰発現と示されました。ウエスタンブロット法 (図 2)、非標的臓器伝達の不在を示唆によって確認されました。対照的に、コントロール マウスにおけるルシフェラーゼ発現が検出されましたないです。ルシフェラーゼの成功の過剰発現と一致して、西部のしみの VDR (adv-VDR) (図 3 a) をエンコード アデノ ウイルスを注入したマウスの左心室内推奨の大幅に増加した VDR 発現解析。さらに、adv shVDR 注入は、VDR 発現左心室 (図 3 b) を大幅削減。対照的に、VDR 発現変更されませんでした大幅も adv VDR 注入マウスやマウスの adv-shVDR 注入 (図 3、 D)、右心室に、アデノ ウイルスだけ左心室筋内に注入されたので。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57074/57074fig1.jpg"> 図 1.マウス心筋注入と遺伝子発現検出プロトコルのスキーマします。(A) 図の左心室の心筋の 3 つの注射部位を示します。(B) の示されたウイルスの注入後マウスの心臓での遺伝子発現の検出のためのプロトコル。ホタルルシフェラーゼの Adv-ルシフェラーゼ: アデノ ウイルスエンコード VDR; AdVDR: アデノ ウイルスAdshVDR、アデノ ウイルス エンコード shRNA VDR を対象とします。(C) 代表的なイメージのマウス心筋内注入法の改良の複数手順を示します。a.市販の脱毛クリームで毛の除去。ポビドン ヨードの 3 スクラブと手術部位のb.殺菌。c.滅菌ドレープで手術部位をカバーします。0.5 cm d.剣と腋窩を結ぶ線に沿って切開e.は、大胸筋と小胸筋とマイクロ モスキート止血鉗子の郭清を鈍らせます。f.心の表出。ハミルトン シリンジを介して左心室の心筋に 30 μ L アデノ ウイルス ソリューションのg.注入。h-5-0 絹糸で巾着縫合により皮膚のi.閉鎖。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57074/57074fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57074/57074fig2.jpg"> 図 2.心のルシフェラーゼ発現の検出。(A) 画像コントロール マウスと注入後 5 日ホタルルシフェラーゼ アデノ ウイルス投与マウスの中心の発光信号を示す、イメージング システムによって収集されました。異なるグループに属する (B) 発光信号強度 (n = 3) t検定で統計解析にさらされます。p < コントロール マウスと 0.01。(C) 西部のしみ分析心のルシフェラーゼのタンパク質レベルを示す結果、肺、肝臓、および脾臓で示されるグループ アデノ ウイルス注入後 5 日目 (n = 3)。ルシフェラーゼ発現が Adv リュック注入マウスの心臓で検出されただけ後、は、統計分析が実行されませんでした。ホタルルシフェラーゼの Adv-リュック: アデノ ウイルス。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57074/57074fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57074/57074fig3.jpg"> 図 3.心の VDR 発現の検出。(A) 上部パネル: 西部のしみは、0 日、5 日、7 日、adv VDR 注入後 14 日で左心室 (アデノ ウィルスを注入して) 示す VDR レベルをバンドします。底板: 異なるグループに VDR 発現レベルの半定量的解析 (n = 4 時間ポイントごと)。結果は GAPDH に対して正規化され、0 日を基準に変更を倍に変換します。一方向の分散分析 (ANOVA) ボンフェローニの事後テスト (検定想定) 続いてまたは Tamhane 事後テスト (検定とは見なされません) 統計分析を行った。p < 0.05 または * *p < 0 日対 0.01。(B) 上部パネル: 西部のしみは 0 日、3 日、5 日と adv shVDR 注射後 7 日で左心室の示す VDR レベルをバンドします。底板: 異なるグループに VDR 発現レベルの半定量的解析 (n = 4 時間ポイントごと)。p < 0 日対 0.05。(C) 上部パネル: 西部のしみは、0 日、5 日、7 日、adv VDR 注入後 14 日で (場所、アデノ ウイルスが注入されていません) 右心室で示す VDR レベルをバンドします。底板: 異なるグループに VDR 発現レベルの半定量的解析 (n = 4 時間ポイントごと)。(D) 上部パネル: 西部のしみは 0 日、3 日、5 日と adv shVDR 注射後 7 日以内に右心室に示す VDR レベルをバンドします。底板: 異なるグループに VDR 発現レベルの半定量的解析 (n = 4 時間ポイントごと)。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57074/57074fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

ここでマウスの心臓特異的遺伝子操作するためのプロトコルを提案する.麻酔下マウス心が第 4 肋間スペースで外部化。その後、特定遺伝子が生体内イメージングと西洋を介してタンパク質発現の測定によって続いて心筋に注射器で注入したアデノ ウイルス ブロット分析です。

シンプルで効率的なマウスの心筋内注入による生体内の心臓特異的遺伝子操作法

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

a-simple-efficient-method-for-vivo-cardiac-specific-gene-manipulation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

15.7K ビュー.  The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College. ここでマウスの心臓特異的遺伝子操作するためのプロトコルを提案する.麻酔下マウス心が第 4 肋間スペースで外部化。その後、特定遺伝子が生体内イメージングと西洋を介してタンパク質発現の測定によって続いて心筋に注射器で注入したアデノ ウイルス ブロット分析です。

ビデオ: A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

パイロシーケンシング：正確なジェノタイピングのための簡単​​な方法

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

生物学

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離<em&gt; in vitroで</em&gt; mRNAに沿って並進一時サイトを識別するために

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

精巣細胞懸濁液の調製のためのシンプルで効率的な手法

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

マウスにおける急速な非侵襲腰椎髄腔内注射を経由して生体内 siRNAトランスフェクションと脊髄における遺伝子ノックダウン

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

仙台ウイルスのヒト体細胞からの効率的な次世代ヒューマン誘導多能性幹細胞

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.

新生児マウスにおける静脈注射

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

核酸の濾過単離：簡易迅速DNA抽出方法

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. Therefore, it is important to establish an efficient transient gene expression system in soybean. Here, we report a simple protocol for the preparation of soybean protoplasts and its application for transient functional analyses. We found that young unifoliate leaves from soybean seedlings resulted in large quantities of high quality protoplasts. By optimizing a PEG-calcium-mediated transformation method, we achieved high transformation efficiency using soybean unifoliate protoplasts. This system provides an efficient and versatile model for examination of complex regulatory and signaling mechanisms in live soybean cells and may help to better understand diverse cellular, developmental and physiological processes of legumes.

We developed a simple and efficient protocol for the preparation of large quantities of soybean protoplasts to study complex regulatory and signaling mechanisms in live cells.