本研究の一部はCSIC（I + DプロジェクトC022）とPEDECI​​BAによってサポートされていました。著者は優しく、このプロジェクトで使用されているすべてのモルモット標本を提供するために細胞生物学MoFloのセルソーターに関する彼らの寛大なコラボレーションのためのユニット（パスツール研究所デモンテビデオ）、およびメリアル·モンテビデオからマリエラBollatiとヴァレンティナポロに感謝したいと思います。 図1図2と図3、およびS. KargerのAG、バーゼルの許可を得て、表1;; BioMedの中央の許可を得て再現しましたし、 図4と図5は、ジョン·ワイリー＆サンズ株式会社（が所有する著作権の許可を得て複製したり、適応したワイリーブラックウェル、2011）。

1。細胞懸濁液の調製<ol><li>このような動物実験委員会または同等の専門委員会の勧告後に使用する試験片を生け贄に捧げる（ウルグアイ、国家委員会における動物実験のための[CNEA]）。我々のケースでは、ペントバルビタールの過剰摂取は、投与した。 </li><li>標準的な承認さ​​れた手順に従って、精巣を解剖し、氷冷DMEM、10 mlを入れ、氷の上に96ミリメートルのガラスペトリ皿に配置し、10％ウシ胎児血清を添加した。 </li><li>白膜を取り外し、2の平方根の部分にカプセル開放精巣をカット - それぞれの側に3ミリメートル。 </li><li>それらの作品は、その後Medimachine、組織があきステンレススクリーン、金属ローターを含む使い捨てユニットの内側に細分化され自動化された機械的な粉砕機で処理されます。 50μmの使い捨てユニット、disaggregatorのスイッチ、その過程で、これらの作品の5 - そのためには、風邪の代わりに1ミリリットルはDMEMと4を補足<html>メーカーからの簡単な指示に従う50秒のために。 </li><li>針なしの5ミリリットルの注射器 - 3を使用して分解ユニットから得られた細胞懸濁液を回復。 </li><li>以前にDME​​Mを補足0.5mlの浸し、50μmのナイロンメッシュを通して濾過する。 </li><li>氷の上で浸した25μmのナイロンメッシュ、と場所を使用して再度サスペンションをフィルタリング。 </li><li>ノイバウアー室にカウントし、1に対する細胞濃度を調整- 2×10 7細胞/ ml添加したDMEMで。精巣材料の少なくとも4×10 7細胞/グラムは、通常得られる。 </li><li>最後に、細胞凝集を防止するために0.2％の最終濃度にNDA（2 - ナフトール-6,8 - ジスルホン酸、カリウム塩）を追加する。 </li><li>オプション：製造者の指示に従って、動物細胞のための市販のキットに生存精巣細胞懸濁液の細胞生存率を確認する。 </li></ol> 2。フローサイトメトリー分析ve_content &quot;&gt;我々は、ヨウ化プロピジウムの高濃度（PI）により染色した細胞の分析のために488nmで発光するように調整されたコヒーレントアルゴンイオンレーザーを備えたベクトン·ディッキンソンFACSVantageフローサイトメーターを使用している。（未定着にPI入り口の問題ストレス下の細胞は、他の場所で9,10）対処されている。 <ol><li> PI染色のため、細胞懸濁液に50μgの/ mlの最終濃度で蛍光色素追加し、0℃で10分間インキュベート℃の暗所でC。 </li><li>レーザパワーは100mWに設定され、26分の575バンドパスフィルタFL2にPI-発せられる蛍光を収集するために使用される。 </li><li>私たちは、70μmのノズルをFC測定を行う。精母細胞集団を選別するため、エンベロープとして3並べ滴を使用して、通常の-Rやノーマル-Cモードでソート設定。 3でのサンプルとコレクションチューブ保つ - 4°冷却ユニットを使用してC。毎秒500〜1,500の割合で細胞を分析するサンプルの差を調整します。 </li><li>分析するセルクエストソフトウェア（BD）を使用次のパラメーター：前方散乱（FSC-H）、側方散乱（SSC-H）、総放出される蛍光またはパルス面積（FL2-）、および蛍光発光またはパルス幅（FL2-W）が持続。 </li></ol>代わりに、我々は5μgの/ mlの最終濃度に生体染色色素ヘキスト33342を採用し、37時10分°C、暗所でインキュベートした。細胞分析はMoFloサイトメーター（DakoCytomation）を用いて25mWでのUV励起波長のレーザを動作させて搭載し、70μmのノズルを用いて行った。データ操作はサミットv4.3のソフトウェア（DakoCytomation）を用いて行った。

<ol>
	<li>Meistrich, M. L., Prescott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cells+and+nuclei+from+rodent+testes.">Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes.</a> Methods of Cell Biology. 15, 15-54 (1977).</li><li>Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+separation,+physical+characterization,+and+differentiation+kinetics+of+spermatogonial+cells+of+the+mouse.">The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).</li><li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity.</a> Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).</li><li>Geisinger, A., Rodr&#237;guez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+for+gene+expression+studies+in+mammalian+spermatogenesis.">Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis.</a> Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).</li><li>Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+velocity+sedimentation.">Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).</li><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation.">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li><li>Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+schedule+of+the+postnatal+rat+testis+determined+by+flow+cytometry.">Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry.</a> Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).</li><li>Rodr&#237;guez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santi&#241;aque, F., L&#243;pez, B., Folle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+flow+sorting+of+early+meiocytes+based+on+DNA+analysis+of+guinea+pig+spermatogenic+cells.">High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells.</a> Cytometry A. 79, 625-634 (2011).</li><li>Davey, H. M., Hexley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+but+not+dead?+Membranes+of+stressed+Saccharomyces+cerevisiae+are+permeable+to+propidium+iodide.">Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide.</a> Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).</li><li>Rodr&#237;guez-Casuriaga, R., Geisinger, A., L&#243;pez-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-fast+and+optimized+method+for+the+preparation+of+rodent+testicular+cells+for+flow+cytometric+analysis.">Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis.</a> Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).</li><li>Span&#242;, M., Evenson, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+for+reproductive+biology.">Flow cytometric analysis for reproductive biology.</a> Biol Cell. 78, 53-62 (1993).</li></ol>

ここで説明する最適化された方法は、酵素と界面活性剤処理を回避し、良好な細胞の完全性と型の比率を維持し、非常に高速かつ再現可能な方法で、げっ歯類の精巣組織からの細胞懸濁液の調製を可能にする。手順（15分スパンが精巣解剖、組織の切断、および処理が含まれます）、関係する最小限の処理、酵素処理の不在の簡潔さは、主な利点のいくつかである。これらはすべて、元の細胞集団中に存在する化合物の代表的なサンプルが必要な場合に重要で短寿命の巨大分子の良好な保存、会計処理する。 PIまたはヘキスト33342のどちらかを使用することに関しては、我々は、1つまたは他の染料の雇用と精巣細胞懸濁液を用いたフローサイトメトリー解析に起因するプロファイルには明らかな違いが認められなかった。染料の選択ではなく、ユーザーの好みや利用可能性に依存し、のさらなる使用を計画した。一方の側に、PIは安価であり、広範なアプリケーションのようなフローサイトメーターやUVレーザを有するソーターの使用を必要としない。他方では、我々が正常に低い細胞毒性レベルの不純なソートと異なる遺伝子発現研究（ 図4）、ヘキスト33342または他の生体染色色素のためのPI染色した細胞を使用しているが、完全な細胞生存率が必要とされる用途に好適な選択肢かもしれない生殖細胞培養および/ ​​または移植4など。 我々は、別のDNA含量4（ 図3）で選択した精巣集団のために、あるいは同じDNA含量が異なるクロマチン凝縮レベル（ 図4）と亜集団の95％純度上で実現する特定の細胞集団をソートすることができた。興味のある集団は、サイトメトリープロファイルで個別化することができますので、この後者は、PA、長いように達成することができますrticularlyドットプロットである。例えば、これまでに我々はモルモットmeiocytes I 9のさまざまな段階を並べ替えることができましたが、単にDNAを染色することによって2Cの集団内集団を区別すると並べ替えることがありません。選別された細胞は、下流のディファレンシャルな遺伝子発現解析09（ 図5）ことができ、良質なRNAをレンダリングしている。 プロトコル記述から分かるように、容易に再現可能な、非常に単純であり、特に熟練した人員を必要としない。我々はそれをフローサイトメトリーかどうかを含む多種多様なアプリケーションを採用することができる考​​える。ここに示すように分取して、精子形成事前の迅速なチェックのためのシンプルな精巣の内容分析から他の人に前者範囲は、そのような不純分子の研究のための特定の細胞集団の流れの浄化などを目的としている。

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Medimachine system</td>
 <td>BD</td>
 <td>340587</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Medicon unit (50 &mu;m)</td>
 <td>BD</td>
 <td>340591</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filcon unit (50 &mu;m)</td>
 <td>BD</td>
 <td>340603</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>430-2100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal calf serum</td>
 <td>PAA</td>
 <td>A11-151</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NDA</td>
 <td>Chemos BmbH</td>
 <td>277081</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hoechst 33342</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>14533</td>
 <td>Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propidium iodide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>287075</td>
 <td>Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions

哺乳動物の精巣は、体精巣細胞と生殖細胞のさまざまな段階を含む、30以上の異なる種類の細胞が含まれている非常に複雑な器官である。精子開発の特定の段階で純粋なまたは濃縮された細胞集団は最も分子解析1のために必要とされるので、この不均一性は、哺乳類の精子形成の拠点の研究に関する重要な欠点である。 例えばStaput 2,3、遠心水簸1、およびフローサイトメトリー（FC）4,5等の各種戦略が異なる遺伝子発現研究を可能にするために、富化または精製された精巣細胞集団を得るために用いられてきた。 これは、細胞が最も濃縮/精製アプローチが懸濁液であることが必要である。理想的には、細胞懸濁液は、元の組織の代表となり、生細胞と少数multinucleatesの高い割合を持っている - ために形成する傾向があると不足細胞塊1 -精上皮6,7の合胞体性質。以前の報告では、もっぱら機械的な方法によって調製精巣細胞懸濁液は、トリプシン処理したもの1よりも容易に凝集していることも明らかでした。 RNアーゼおよび/または特定のダウンストリームアプリケーションのために望ましくない特定の高分子の劣化へのトリプシン及びコラゲナーゼ鉛のように分解する酵素で、一方、酵素処理。理想的なプロセスは、mRNAのようなその他の巨大分子の良好な保存を達成するために、可能な限り短くし、最小限の操作を含むべきである。固形組織からの細胞懸濁液の調製のための現在のプロトコルは、通常、時間がかかり、非常にオペレータに依存しており、選択的に特定の細胞型1,8に損傷を与えることができる。 ここで紹介するプロトコルは、と再現性の高い、非常に簡単な機械的な分解の利点を兼ね備えていますフローサイトメトリー分析および選別4、及び不純な遺伝子発現研究9に用いることができる良質の細胞懸濁液につながる酵素処理のbsence。

ここで説明されたプロトコルを用いて調製したラット精巣からよく分解された細胞懸濁液の例は、図1に示されている。 酵素処理6,8へと前述した機械的な分解方法2と比較すると、ここで紹介する1（特に他の機械に比べて、はるかに高速です少ないハンドリングを伴う、（not演算子に依存）を簡単に再現可能であり、希少細胞の破片をレンダリングメソッド）と非常に少ないmultinucleates（広範な組織操作1,2の結果として形成することが記載されている）。また、酵素処理とは対照的に、それは巨大分子の分解に有利に働く可能性がRNアーゼ、トリプシンおよびコラゲナーゼの使用を回避する。 一方、以前の報告は、排他的に機械的な方法により調製精巣細胞懸濁液をトリプシンでより容易に凝集していることも明らかたがエス1は、本発明の製造方法の適用は、非常に少ない、図1に見られるように、セルラ懸濁液に凝集レンダリング。その意味で、我々は、細胞凝集を防止し、その後流研究中にノズル詰まりを回避する上でNDAを含めることは非常に効率的な発見した。 図1は 、 図2に示すFCヒストグラムにおいても明らかである細胞破片の不足を明らかにする。 また、この方法で調製された細胞懸濁液は、精巣異なる細胞型の適切な表現を示す。これは、精細管の断面の細胞数から報告されたデータでここに示された方法により調製精巣細胞懸濁液の細胞組成を比較することにより締結し、細胞懸濁液と同様に、他の方法（ 表1）を用いて調製した。 FCヒストグラムpresaの複数形することにより調製懸濁液を得ntのプロトコルおよびヘキスト33342（ 図2A）またはPI（ 図2B）のいずれかで染色し、実質的に、プロシージャは、選択的に任意の特定の細胞型にダメージを与えないという仮定を支持し、以前に報告されたもの8異ならない。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> DNAの内容に基づいて精巣細胞タイプ </td><td> 無傷の精巣（％） </td><td> Medimachine -プリペア懸濁液B（％） </td><td> トリプシン処理懸濁液（％） </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> ） ハツカネズミ </td></tr><tr><td> C言語 </td><td> 66.2 </td><td> 62.5 </td><td> 79.6 </td></tr><tr><td> 2C </td><td> 16.4 </td><td> 18.4 </td><td> 7.3 </td></tr><tr><td> 4C &lt;/ TD&gt; <td> 17.9 </td><td> 18.7 </td><td> 8.7 </td></tr><tr><td>他人</td><td> - </td><td> - </td><td> 4.6 </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> B） モルモット </td></tr><tr><td> C言語 </td><td> 66.5 </td><td> 65.5 </td><td> N / D </td></tr><tr><td> 2C </td><td> 11.0 </td><td> 11.5 </td><td> N / D </td></tr><tr><td> 4C </td><td> 22.5 </td><td> 23.0 </td><td> N / D </td></tr><tr><td colspan="4">細胞数は、顕微鏡観察により評価した。 B細胞数をフローサイトメトリーにより評価した。 </td></tr></tbody></table> 表1。相対的なマウスからの細胞懸濁液のための彼らのDNA含量が異なる成人精巣細胞集団の割合（）とここに提示方法によって調製モルモット（B）、そのまま精巣と比較-マウス用の- T（ジンガーとロドリゲス·Casuriaga、Cytogenetから変更。 ゲノム解像度。128、46（2010））Oトリプシン準備懸濁液。 DNAの内容は以下のとおりです。C（円形および伸長精子細胞、精子）、2C（精巣体細胞、精原細胞、二次精母細胞）、および4C（一次精母細胞とG2の段階でいくつかの増殖精原細胞）。 <img src="/files/ftp_upload/50102/50102fig1.jpg" alt="図1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50102/50102fig1highres.jpg"/> 図1。成体ラット精巣からの細胞懸濁液の部分図は、本プロトコルによって調製され、位相差顕微鏡で可視化した。分かるように、細胞細胞質がよく保存されている。バーは25μmのに対応しています。ロドリゲス-Casuriaga ら、BIOLから再生。 Proced。オンラインで11、184（2009）。 <p class="jove_content" fo:keep-together.withinページ= &quot;常に&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50102/50102fig2.jpg" alt="図2" fo:content-width="5.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50102/50102fig2highres.jpg"/> 図2。成体ラット、マウス、モルモット、及び生体染色色素ヘキスト33342（）またはPI（B）で染色した21日から産後（DPP）ラット仔から精巣細胞懸濁液のFC DNA含量分析。すべてのケースでC、2Cと4Cの細胞集団は簡単に両方の染料と同様に、C群の左側に明らかにサブ半数体のピークを用いて得られたヒストグラムに開示することができます。この後者のピークはそれらの凝縮クロマチン状態12により別個未満、染色された亜集団として表示される精子を含むことが実証されている。すべてのグラフィックスにおける破片の不足に注意してください。これは、精子細胞と精子を欠い21 DPP（少年標本）プロファイル、特に明らかである。ジンガーとロドリゲス·Casuriaga、Cytogenetから変更。<html>ゲノム解像度。128、46（2010）。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50102/50102fig2large.jpg" target="_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。</a> <img src="/files/ftp_upload/50102/50102fig3.jpg" alt="図3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50102/50102fig3highres.jpg"/> 図3。 4Cの細胞集団は、成体ラットの精巣細胞懸濁液からの並び順。順番細胞をクリーンポリ-L-リジン処理したスライド上に堆積し、ギムザ染色（B）の後、位相差顕微鏡（A）又は明視野で観察した。バーは=20μmである。ジンガーとロドリゲス·Casuriaga、Cytogenetから再生。ゲノム解像度。128、46（2010）。 tp_upload/50102/50102fig4highres.jpg &quot;/&gt; 図4 A）FCここに記載されたプロトコルを用いて調製成体モルモット精巣細胞懸濁液の分析（）、ヒストグラム、（b）は 、ドットプロット。 PI-染色された細胞の4Cの細胞集団の2集団に注意してください。替え4CのR3からのセル（A、B）とR4（A &#39;、B&#39;）の領域B）の分析。（、 &#39;）、落射蛍光顕微鏡像。 R3地域から核は比較的小さくなっていることに注意してください。バー：10μmの（B、B &#39;）、Sycp3（シナプトネマ[SC]タンパク質3、横方向の元素成分）に対する抗体を用いたスプレッド細胞に対する免疫反応のレーザー共焦点顕微鏡。 R4はパキテン期meiocytesが含まれていますが、画像には、COMと、R3分数は単純軸とのSCの短いストレッチを見ることができるの早い段階で（lepto /接合期）meiocytes、に対応していることを結論することができます完全に組み立てられたのSC。ロドリゲス-Casuriaga ら 、 メトリから変更79、625（2011）。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50102/50102fig4large.jpg" target="_blank">大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。</a> <img src="/files/ftp_upload/50102/50102fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。精子形成フローソート細胞分画2C、R3及びR4（二後者の画分についての説明は、図4にある）から抽出した全RNAのA）アガロースゲル電気泳動。細胞懸濁液を、ここで記載されたプロトコルを用いて調製した。変性B）オートラジオグラムをキットからのプライマーの組み合わせのいずれかのために、 &quot;のmRNAディファレンシャルディスプレイ&quot;メソッド（GenHunterコーポレーション、ナッシュビル、TN RNAimage）によって得られた差分cDNAのバンドを示すポリアクリルアミド電気泳動ゲル。と同じ3つの細胞集団からmRNAを<strong&gt;）を比較した。全ての実験は、メーカーの指示に従って（逆転写とPCR）複製、隣接レーンで実行で行った。アスタリスク（おそらく差次的に発現する遺伝子に相当する）重複実験で現れるR3用の差cDNAのバンドを（早期減数分裂前期細胞）を示している。ロドリゲス-Casuriaga ら、メトリA. 79、625（2011）から再生。

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Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

酵素および洗剤を回避するげっ歯類の材料から精巣細胞懸濁液を機械的に調製するための新規なプロトコルは、記載されている。この方法は非常に簡単、迅速、再現性があり、フローソーティングおよびRNA抽出のために適している良質の細胞懸濁液を、レンダリングする。

精巣細胞懸濁液の調製のためのシンプルで効率的な手法

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

simple-efficient-technique-for-preparation-testicular-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.6K ビュー.  Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE). 酵素および洗剤を回避するげっ歯類の材料から精巣細胞懸濁液を機械的に調製するための新規なプロトコルは、記載されている。この方法は非常に簡単、迅速、再現性があり、フローソーティングおよびRNA抽出のために適している良質の細胞懸濁液を、レンダリングする。

ビデオ: Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

gentleMACS Dissociatorとマウス脾臓からの単細胞懸濁液の調製

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

生物学

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of dissociating whole organs requires specific parameters in order to obtain a high number of viable cells in a reproducible manner. The gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. The instrument contains pre-programmed settings that are optimized for the efficient but gentle dissociation of a variety of tissue types, including mouse lungs. In this publication the use of the gentleMACS Dissociator on lung tissue derived from mice is demonstrated.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue agitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on lung tissue is explained.

gentleMACS Dissociatorを使用してマウスの肺組織からの単細胞懸濁液の標準化の準備

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for mesenchymal stromal cells (MSCs), fibroblasts and endothelial colony-forming cells with platelets activated by thrombin3-5 or lysed by freeze/thaw cycles6-14 before the platelet releasate is added to the cell culture medium. The trophic effect of platelet derived growth factors has already been tested in several trials for tissue engineering and regenerative therapy.1,15-17 Varying efficiency is considered to be at least in part due to individually divergent concentrations of growth factors18,19 and a current lack of standardized protocols for platelet preparation.15,16 This protocol presents a practicable procedure to generate a pool of human platelet lysate (pHPL) derived from routinely produced platelet rich plasma (PRP) of forty to fifty single blood donations. By several freeze/thaw cycles the platelet membranes are damaged and growth factors are efficiently released into the plasma. Finally, the platelet fragments are removed by centrifugation to avoid extensive aggregate formation and deplete potential antigens. The implementation of pHPL into standard culture protocols represents a promising tool for further development of cell therapeutics propagated in an animal protein-free system.

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Human platelet lysate is a rich source of growth factors and a potent supplement in cell culture. This protocol presents the process of preparing a large pool of human platelet lysate by starting from platelet rich plasma, performing several freeze-thaw cycles and depleting the platelet fragments.

動物の無血清ヒト幹細胞培養のための効率的なサプリメントとしてプールしたヒト血小板可溶化物（pHPL）の調製

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

の電子顕微鏡のための胚の調製ショウジョウバエ胎児心臓の管

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Inositol pyrophosphates play an important role in human pathologies such cancer, diabetes and obesity; however, the exact mechanism of action is a matter of dispute. The lack of commercially available inositol pyrophosphates renders detailed studies problematic. Here we describe a simple protocol to produce and isolate milligrams of inositol pyrophosphates.

品質イノシトールピロリン酸塩の調製

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Vacuolar and cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in overall pH homeostasis. We describe protocols for ratiometric measurement of pH in vivo using pH-sensitive fluorophores localized to the vacuole or cytosol. Vacuolar pH is measured using BCECF, which localizes to the vacuole in yeast when introduced into cells in its acetoxymethyl ester form. Cytosolic pH is measured with a pH-sensitive GFP expressed under control of a yeast promoter, yeast pHluorin. Methods for measurement of fluorescence ratios in yeast cell suspensions in a fluorimeter are described. Through these protocols, single time point measurements of pH under different conditions or in different yeast mutants have been compared and changes in pH over time have been monitored. These methods have also been adapted to a fluorescence plate reader format for high-throughput experiments. Advantages of ratiometric pH measurements over other approaches currently in use, potential experimental problems and solutions, and prospects for future use of these techniques are also described.

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Vacuolar and cytosolic pH can be measured in live yeast (S. cerevisiae) cells using ratiometric fluorescent dyes localized to specific cellular compartments. We describe procedures for measuring vacuolar pH with BCECF-AM, which localizes to the vacuole in yeast, and cytosolic pH with a cytosolic ratiometric pH-sensitive GFP (yeast pHluorin).

液胞と細胞質のpHの測定<emインビボで&gt;</em&gt;酵母細胞懸濁液に

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

組換えタンパク質の高レベルの一過性発現のための植物の効率的なアグロ

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve the three-dimensional chromatin arrangement of testicular germ cells found in mice; this method has been termed as the three-dimensional (3D) slide method. In this method, testicular tubules are directly treated with a permeabilization step that removes cytoplasmic material, followed by a fixation step that fixes nuclear materials. Tubules are then dissociated, the cell suspension is cytospun, and cells adhere to slides. This method improves sensitivity towards detection of subnuclear structures and is applicable for immunofluorescence, DNA, and RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) and the combination of these detection methods. As an example of a possible application of the 3D slide method, a Cot-1 RNA FISH is shown to detect nascent RNAs. The 3D slide method will facilitate the detailed examination of spatial relationships between chromatin structure, DNA, and RNA during testicular germ cell differentiation.

The material here describes a method developed to preserve the three-dimensional chromatin structure of testicular germ cells. This has been termed the three-dimensional (3D) slide method. This method improves sensitivity for detection of subnuclear structures and is applicable for immunofluorescence, DNA, and RNA fluorescence in situ hybridization (FISH).

精巣生殖細胞の三次元クロマチンアーキテクチャを保存するためのスライド調製方法

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

エピソームおよびHDAC阻害剤を用いて血液からの効率的なiPS細胞の生成

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

効率的な哺乳動物細胞発現および結晶化のための細胞外糖タンパク質のシングルステップの精製

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...