이 작품 고유 영 학자 (81625002), 국립 자연 과학 재단의 중국 (81470389, 81270282, 81601238), 프로그램의 상하이 학술 연구 지도자 (18XD1402400), 상하이 시 국립 과학 기금에 의해 지원 되었다 교육 위원회 Gaofeng 임상 의학 보조금 지원 (20152209), 상하이 Shenkang 병원 개발 센터 (16CR3034A), 상해 Jiao 집게 대학 (YG2013MS42), 상해 Jiao 집게 대학 대학원 의학 (15ZH1003 및 14XJ10019), 상하이 항해 프로그램 (18YF1413000), 그리고 Bengbu 의학 대학 (Byycx1722)의 대학원 혁신 프로그램. 우리는 우리 실험실에서 그의 이전 도움 박사 Erhe가 오를 감사합니다.

모든 동물 실험 실험 동물의 사용에 건강 지침의 국가 학회에 따르면 실행 했다 하 고 연구소의 동물 윤리 위원회에 의해 승인 했다. (8-10 주 세) 남성 C57BL/6J 마우스는 모든 실험에 사용 되었다. 마우스는 24 ° C ± 4 ℃, 12 h 명암 주기, 물과 음식에 대 한 무료 액세스 아래에서 병원 체 자유로운 조건에서 보관 되어 있었다.
1입니다. 아 데 노비 루스 솔루션의 준비
<ol><li>순화 된 아 데 노 바이러스 솔루션의 도착-80 ° C 냉동 고에서 솔루션을 저장 합니다. 참고: 아 데 노 바이러스 주입 가능한 쥐에서 수행 되었다. 아 데 노 바이러스 벡터의 무 균을 보장 하기 위해, 아 데 노 바이러스 (인코딩 luciferase, VDR, 또는 대상으로 VDR shRNA) 준비 했다 고 정화 상업적으로9,10.</li>
	<li>작업 일에-80 ° C 냉동 고에서 순화 된 아 데 노 바이러스 솔루션 (3 x 1010 플 라크 형성 단위 [pfu] /mL) 밖으로 하 고 아 데 노 바이러스 벡터 솔루션 얼음에 녹여.</li>
	<li>안 면, 멸 균 장갑, 멸 균 가운에 넣어.</li>
	<li>50 µ L를 준비 작업 전날 소독 된 해밀턴 주사기. 참고: 살 균, 해밀턴 주사기는 거 즈에 싸서 및 높은 온도/높은 압력 소독 기에 배치. "고체에 대 한 살 균"의 모드를 선택 하 고 살 균 "시작" 버튼을 누르면 시작 했다.</li>
	<li>순화 된 아 데 노 바이러스 솔루션의 완전 한 녹고 후 75% 에탄올, 아 데 노 바이러스 솔루션을 포함 하는 튜브를 스프레이 하 고 층 류 살 균 후드에 아 데 노 바이러스 솔루션을 이동 합니다.</li>
	<li>층 류 살 균 후드, 30 G의 바늘의 첨부 파일 다음에 해밀턴 주사기, 바늘 없는 해밀턴 주사기를 사용 하 여 50 µ L 아 데 노 바이러스 솔루션 발음.</li>
	<li>30g 바늘 위쪽으로, 주사기를 누른 바늘 (바늘 끝에서 첫 번째 솔루션 상품의 외관에 의해 확인) 아 데 노 바이러스 솔루션으로 채워질 때까지 부드럽게 주사기의 플런저를 밀어. 참고: 30g 바늘을 채우기 위해 약 45 µ L 솔루션 걸립니다 그래서 지금은 거의 없는 솔루션 주사기에 표시 됩니다.</li>
	<li>위의 준비 된 주사기를 사용 하 여 신중 하 게 또 다른 30 µ L 아 데 노 바이러스 솔루션, 발음 하 고 사용에 대 한 얼음에 느슨하게 출장된 주사기를 놓습니다.</li>
</ol>2. 마 취와 수술 준비
<ol><li>20 mL isoflurane isoflurane 기화 기에 추가 하 고 산소 탱크 isoflurane 기화를 연결.</li>
	<li>밸브를 열고 고 산소 isoflurane 기화 기에 산소 탱크에서 흐름. 2 L/분 isoflurane 기화 기에 산소 흐름 모니터를 통해 산소 유량을 유지 합니다.</li>
	<li>플라스틱 케이지 isoflurane 기화 기에 연결 된에서 2 분 100% 산소 (2 L/min)에서 4 %isoflurane 마우스의 마 취를 유도.</li>
	<li>플라스틱 케이지에서 마 취 마우스를 꺼내 고 층 류 살 균 후드에서 발생 하기 쉬운 위치에 플라스틱 플랫폼에 보안을 코 콘을 통해 100% 산소 (2 L/min)에서 2 %isoflurane 마 취를 유지.</li>
	<li>발가락 핀치 응답의 부재에 의해 적절 한 마 취를 확인 합니다.</li>
	<li>건조에서 각 막을 보호 하기 위해 각 눈에 메 마른 눈 크림을 적용 합니다.</li>
	<li>가슴 및 위 복 부를 면도. Depilatory 크림을 제거 하는 1 분에 대 한 면도 사이트에 상용 depilatory 크림을 적용 하 고 남은 젖은 gauzes와 모피.</li>
	<li>기반으로 요오드 액체 살 균 (예: entoiodine)의 3 스크럽으로 외과 사이트 (가슴의 왼쪽된 아래 부분)을 소독. 무 균 드 레이프와 수술 부위의 커버.</li>
</ol>3. Intramyocardial 마우스 마음에 아 데 노 바이러스의 주입
<ol><li>장갑에서 고 멸 균 장갑 한 켤레를 입었다.</li>
	<li>집게, 마이크로-모기 hemostat, 수술가 위를 소독 하 고 높은 작업 전에 하루에 바늘 홀더 온도/높은 압력 소독 기 (단계 1.4 참고 참조).</li>
	<li>칼과 겨드랑이 연결 하는 선 따라 0.5 cm 피부 절 개를 확인 합니다. 퉁 명 스럽게 가슴 주요와 집게와 마이크로-모기 hemostat 가슴 작은 근육 해 부.</li>
	<li>큰 가슴 및 가슴 작은 근육을 제거 하 여 있는 공간을 노출 합니다. 통해 피어스 하 고 마이크로-모기 hemostat로 4 번째 있는 공간 (또는 관찰 하 여 넓은 있는 공간)을 엽니다.</li>
	<li>가슴 벽의 오른쪽에 부드럽게 눌러 비 지배적인 손 검지 손가락으로 하트를 외부화 하 절 개를 향해 마음을 밀어.</li>
	<li>부드럽게 검지 손가락과 엄지손가락의 비 지배적인 손 가진 외부화 심장 보호.</li>
	<li>지배적인 손을 가진 총 30 µ L 아 데 노 바이러스 솔루션 아 데 노 바이러스 (그림 1C)로 채워진 해밀턴 주사기를 통해 3 개의 사이트 (좌 심 실의 복 부, 등, 그리고 측면 벽)에 좌 심 실 심근으로 주사.</li>
	<li>주입의 완료 후 즉시 intrathoracic 공간으로 다시 마음을 놓습니다.</li>
	<li>수동으로 부드럽게 피부 절 개 사이트 쪽으로 가슴 벽을 누르면 intrathoracic 공간에서 공기를 철수. 참고: 성공적인 공기 피난 가슴 큰 가슴 작은 근육 퇴 학된 공기에 의해 발생의 펄 럭 여 명시 될 수 있다.</li>
	<li>수평 매트리스 5-0 비단 봉합 사로 봉합 하 여 피부를 닫습니다. 참고: 주요 가슴 및 가슴 작은 근육 해야 하지 수 봉합, 때문에 그들은 단지 솔직 해 부 그들의 해 부 구조는 작업을 통해 그대로.</li>
</ol>4. 수술 후 관리
<ol><li>관리 buprenorphine (3 mg/kg) 두번 매일 작업11후 첫 번째 48 h에 대 한 수술 후 통증을 줄이기 위해 피하 주사를 통해.</li>
	<li>수술 후, 완전히 복구 될 때까지 즉시 열 패드 (37 ° C)에 마우스를 유지. 그것은 완벽 하 게 복구 후 다시 감 금 소에 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>해밀턴 주사기 사용된 및 높은 온도/높은 압력 소독 기에 30 G 주사기 바늘 소독 (1.4 단계 참고). 소독된 30 G 주사기 바늘은 sharps 용기에 수집 합니다.</li>
</ol>5. 심장 Luciferase 식 측정에 대 한 Vivo에서 이미징
<ol><li>아 데 노 바이러스 주입 후 5 일에 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS)에 15 mg/mL에서 소의 신선한 재고 솔루션을 준비 합니다. 0.2 µ m 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.</li>
	<li>Intra-peritoneally 150mg/kg 몸 무게에서 소 솔루션 깨어 쥐를 주사.</li>
	<li>이미징 시스템을 켭니다.</li>
	<li>자동 이미징 시스템의 자체 검사 후 "발광"으로 영상 모드를 선택 하 고 다음 설정을: 노출: 자동; Binning: 8; FStop: 1; 여기: 블록; 방출: 오픈.</li>
	<li>소 주사 후 10 분 chloral 하이드 레이트 주입 (300 밀리 그램/kg 체중) 쥐를 anesthetize. 발가락 핀치 응답의 부재에 의해 적절 한 마 취를 확인 합니다.</li>
	<li>카메라를 향해 이동 하는 가슴으로 발생 하기 쉬운 위치에 온수 이미징 단계에 마 취 쥐 보안.</li>
	<li>이미지 (1 이미지 각 마우스에 대 한)를 수집 하 고 신호 강도 가슴 주위 관심 (ROI) 동일한 원형 측정 영역을 그려서 계량.</li>
	<li>이미지의 컬렉션 후 쥐를 희생 하 고 다음 섹션에서 설명 했 듯이 조직을 수집 합니다.</li>
</ol>6. 수확 조직
<ol><li>다른 시간 지점에서 바이러스 주사 (그림 1B) 후, 4 %isoflurane 쥐 anesthetize 및 코 콘을 통해 2 %isoflurane 마 취를 유지 하 고 경향이 위치에 플라스틱 플랫폼에 보안.</li>
	<li>앞쪽 목에 중간 복 부 절 개를 확인 합니다. Omohyoid 및 sternocleidomastoid 근육을 제거 하 여 바로 일반적인 경 동맥을 노출 합니다.</li>
	<li>바로 일반적인 경 동맥을 transecting 하 고 혈액을 배출 하 여 쥐를 희생.</li>
	<li>복 부에 중간 복 부 절 개를 확인 합니다. Midclavicular 라인을 따라 흉 곽의 양쪽에서 갈비뼈를 잘라내어 transect 횡 경 막.</li>
	<li>심장에 칼을 해제 하 여 노출. 오름차순 대동맥 찾아서 혈관 주위 지방 조직 제거.</li>
	<li>대동맥을 cannulate 하 고 retrogradely 30 G 바늘 4 ° C 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS)의 0.5 mL 가득 1 mL 주사기에 부착 된 마음을 perfuse.</li>
	<li>관류, 후 심장, 소비 세 그리고 왼쪽 및 오른쪽 심 나눕니다. 간, 폐, 그리고 비장을 삭제할.</li>
	<li>차가운 PBS (4 ° C)에 두 세척 후 액체 질소에 극저온 튜브에 수집 된 모든 조직을 별도로 저장 합니다.</li>
</ol>7입니다. 단백질 식의 결정
<ol><li>프로 테아 제 억제 물 칵테일 1: 100의 비율에서 상업적으로 사용 가능한 세포의 용 해 버퍼에 추가 하 여 균질 버퍼를 준비 합니다. 샘플 처리 수의 수에 따라 총 볼륨을 계산 합니다. 이후 사용에 대 한 4 ° C에서 준비 균질 버퍼를 유지.</li>
	<li>액체 질소 탱크에서 조직을 꺼내 주세요. 조직 높은-정밀 저울 (직물의 각 조각 위한 약 60 mg)에 무게.</li>
	<li>새로운 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 전송 조직. Microcentrifuge 튜브에 200 µ L 균질 버퍼 및 precooled 1.5 m m 강철 공 (4 ° C) 즉시 추가 합니다.</li>
	<li>Precooled (4 ° C)에서 microcentrifuge 튜브 금속 홀더 연 삭 기, 자동 조직에 고 다음 설정을 사용 하 여 컴퓨터를 시작 하 여 균질을 개시: 주파수: 70hz; 시간: 120 s.</li>
	<li>균질, 후 원심 (16000 × g, 4 ° C), homogenate 하 고는 상쾌한 100 µ L 피펫으로 새로운 1.5 mL 튜브에 신중 하 게 전송 합니다.</li>
	<li>추가 로드 1: 4의 비율로 단백질 표면에 뜨는 솔루션 (5 배)를 버퍼링 하 고 5 분 동안 100 ° C에서 단백질을 변성.</li>
	<li>심장 및 기타 장기 조직에서 단백질 식 레벨은 더 서쪽 오 점 분석 (대표 결과 그림 2C 와 그림 3에 표시 됩니다)에 의해 모니터링 프로토콜에 따라 앞에서 설명한12.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yancy, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2017+ACC/AHA/HFSA+Focused+Update+of+the+2013+ACCF/AHA+Guideline+for+the+Management+of+Heart+Failure:+A+Report+of+the+American+College+of+Cardiology/American+Heart+Association+Task+Force+on+Clinical+Practice+Guidelines+and+the+Heart+Failure+Society+of+America.">2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America.</a> J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).</li><li>Pu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte-expressed+farnesoid-X-receptor+is+a+novel+apoptosis+mediator+and+contributes+to+myocardial+ischaemia/reperfusion+injury.">Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury.</a> Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).</li><li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+melatonin+receptor+ROR&#945;+is+a+novel+endogenous+defender+against+myocardial+ischemia_reperfusion+injury.">The nuclear melatonin receptor ROR&#945; is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury.</a> J Pineal Res. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+the+contractile+phenotype+in+corpus+cavernosum+smooth+muscle+cells+by+Myocardin+gene+therapy+ameliorates+erectile+dysfunction+in+bilateral+cavernous+nerve+injury+rats.">Maintenance of the contractile phenotype in corpus cavernosum smooth muscle cells by Myocardin gene therapy ameliorates erectile dysfunction in bilateral cavernous nerve injury rats.</a> Andrology. 5 (4), 798-806 (2017).</li><li>Virag, J. A., Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+artery+ligation+and+intramyocardial+injection+in+a+murine+model+of+infarction.">Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction.</a> J Vis Exp. (52), (2011).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. 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저자는 공개 없다.

현재 보고서가 오 외. 심근 경색 유도 하는 방법에서 수정한 심장 유전자 조작에 대 한 바이러스 성 벡터의 intramyocardial 주입에 대 한 수정된 기술을 보여줍니다. 13 현재, vivo에서 특성의 특정 유전자 기능 대부분 포함 녹아웃 또는 유전자 변형 쥐3,,1415,16,17 세대 , 비싼, 시간이 걸리는, 및 노동 집약. 또는 유전자 벡터 또는 조직 또는 지방 주입 하 여 siRNA의 전달 또한 널리 심장 혈관 연구4,,57에 유전자 조작에 대 한 연습입니다. 특히, intramyocardial 주입 특정 상황에서 심장 유전자 조작에 대 한 대체 될 수 없습니다: 때 사이트 감독 주입 필요 (예, 심근 경색 모델에서 테두리 영역 주입)11; 때 기간 제한 유전자 조작 필요 (예를 들어, 아 데 노 바이러스 주입)입니다. 여기, 우리는 수정된 intramyocardial 주입 메서드는 단순, 시간-절약, 및 고효율을 보였다.
프로토콜 내에서 중요 한 단계 문제 해결:
이 프로토콜의 성공적인 운영에 대 한 몇 가지 중요 한 단계를 지적 한다. 전에 발음 바이러스, 해밀턴 주사기와 연결 된 바늘 공기 대피 해야 합니다, 그렇지 않으면 심근에 주입 하는 공기 발생할 수 있습니다 국 소 심장 상해 또는 죽음. 추가이 문제를 방지 하려면 준비-사용 해밀턴 주사기는 적절 한 바이러스 볼륨으로 가득 하지 두어야 한다 아래로, 플런저 끝이 자발적으로 금속 플런저의 중력에 의해 공기를 발음 수 있습니다 때문에. 마 취 해야 신중 하 게 모니터링, 깊은 마 취 후 작업 복구 지연 될 수 있습니다 그리고 심각 하 게 깊은 마 취 사망을 일으킬 수 있습니다. 적절 한 마 취 후 심장 해야 하지 수 externalized 가슴 구멍에서 힘에 의해 때문에이 심각한 폐 상해에 발생할 수 있습니다. 실제로, 적절 한 심장 외부화 마음, 부드럽게 밀어만 필요 하 고 어떤 저항 든 지 부적절 한 방향으로 밀어 나타낼 수 있습니다.
기술의 한계:
이 기법에서 절차에 필요한 시간을 줄여, 삽 관 법의 죽음을 피하기 위해 상대적으로 제한 된 시간 창에서 intramyocardial 주입 절차를 완료 해야 합니다 제안 합니다. 우리의 경험에의 하면 심장 해야 하지 이상 30 externalized 수 s,이 사망률을 증가 때문에 수술 후 회복 속도가 느려집니다. 따라서, 삽 관 법의 사용은 여기에서 설명 하는 프로토콜의 첫 번째 시도 대 한 권장 됩니다. 또 다른 한계는 또한 intramyocardial 주입7의 전통적인 방법에 있는이 방법으로 전달 하는 바이러스 성 벡터의 고르지 못한 배급 이다. 또한, 다른 심장 질환 모델18,,1920의 설립에 의해 지켜질 수 있다, 손상 되지 않은 마음에서 심장 관련 유전자 조작에 대 한 여기에 설명 하는 방법을 더 유용 21,,2223. 그러나, infarcted 마음 등 다친된 마음에 에이전트를 제공 하는 현재 메서드를 사용 하 여 있을 수 있습니다, 이러한 마우스 절차를 용납 하지 않을 수 있습니다.
기존의 방법에 관하여 의미:
기존의 intramyocardial 주입 삽 관 법 그리고 기계 환기24, 필요 하 고 빠른 마우스 심장 박동으로 인해 주사 사이트를 찾을 수 어렵습니다. 이러한 문제는 크게 작업 시간13, 따라서 증가 변화 시간 지연으로 인 한 연장 됩니다. 여기에 제시 된 수정된 기술 빠른 이며 수동으로 외부화 심장;을 확보 하 여 정밀 사출 사이트 위치를 수 있습니다. 전반적으로, 후속 연구를 크게 potentiating입니다. 또한, 삽 관 법 그리고 기계 환기의 제거 수정된 메서드를 액세스할 수 있도록 거의 모든 실험실에.

심장 질환은 병 적 상태와 사망률 전세계1,2의 주요 원인. 심근 경색, 심장 마비 등 생명이 심장 상태에 대 한 효과적인 치료 전략의 부족에는 기본 pathomechanisms의 집중 탐구와 새로운 치료 옵션3의 붐 빕니다. 이러한 과학적인 탐험에 대 한 심장 관련 유전자 조작 널리4,5입니다. 심장 유전자 조작과 강력한 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 nuclease (TALEN)를 사용 하 여 편집 하는 게놈에 의해 달성 될 수 있다 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) / CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9) 도구, 또는 소성 유전 물질 (예, 바이러스 벡터 관심사의 단백질을 부호화 하는 유전자를 나르는)의 전달6. 게놈 편집과 살아있는 생쥐에서 정확 하 고 spatiotemporal 게놈 수정 허용, 그것은 여전히 시간과 노동 집약 연습6. 또는, 바이러스 벡터 또는 작은 간섭 RNA (siRNA) 복잡 한 납품은 정기적으로 심장 관련 유전자 조작 수행6.
바이러스 벡터 배달 성인 마우스 마음에 대략 두 가지 전략에 의해 달성 된다: 조직 또는 지방 주입. Cardiotropic serotype AAVs AAV9 등의 조직의 주입은 심장 특정 유전자 조작7에 대 한 비 침 투. 그러나,이 메서드는 효율적인 변환 및 유전자 발현에 필요한 벡터의 상대적으로 높은 금액을 요구 하며 근육과 간7같은 nontarget 기관의 중요 한 변환에서 발생할 수 있습니다. 로컬 바이러스 주입 intramyocardial 주입 또는 intracoronary 배달7에 의해 이루어집니다. Intracoronary 납품 intramyocardial 주입에 비해 심장 내에서 바이러스의 더 동등한 배급에 지도 한다. 그러나,이 기술의 불리는 전신 순환과 nontarget 기관8, 그리고 작업 중 압력 측정 장치의 그 요구에 변환에 바이러스 성 벡터의 밖으로 빠른 세척. 대조적으로, intramyocardial 주입 하면 심근으로 사이트 특정 배달, 하지만 그것은 더 나은 바이러스 유지 실패 균일 하 게 배포 바이러스 성 벡터7. 작은 동물에 대 한 intracoronary 납품은 기술적으로 수행, 조직 AAV9 주입 intramyocardial 주입은 더 일반적으로 연습된4,,57어렵다. 조직의 주입은 실행 하기 쉬운, 기존의 intramyocardial 주입 기계 환기 및 thoracotomy, 광범위 한 조직 손상, 원인과 많은 시간이 소요 됩니다.
이 보고서에서 우리는 intramyocardial 주입에 대 한, 시간-절약, 쉽고 효율적인 방법 설명. 아 데 노비 루스 인코딩 luciferase와 VDR, 또는 shRNA 대상으로 VDR, 심장 유전자 발현 조작에 주입 했다. 일단 마스터, 셀 또는 마우스 마음에 다른 재료의 사출으로 서 유전자 조작,이 메서드를 사용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="914">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td colspan="4" height="40" style="height:40px;width:916px;">Equipments</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Laminar flow sterile hood</td>
			<td style="width:267px;">Fengshi Animal Experimental&#160; Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China)</td>
			<td style="width:143px;">FS-CJ-2F</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">75005282</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Tissue grinding machine</td>
			<td style="width:267px;">Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td>
			<td style="width:143px;">Scientz-48</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">High temperature/high pressure sterilizer</td>
			<td style="width:267px;">Hirayama (Saitama, Japan)</td>
			<td style="width:143px;">HVE-50</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Isoflurane vaporizer&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Matrix (Orchard Park, USA)</td>
			<td style="width:143px;">VIP3000</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">IVIS&#160; Lumina III imaging system</td>
			<td style="width:267px;">PerkinElmer (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">CLS136334</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Precision&#160;balance</td>
			<td style="width:267px;">Sartorius (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td style="width:143px;">28091873</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Instruments&#160;</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Eppendorf pipette (100 &#181;L)</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf (Westbury, USA)</td>
			<td style="width:143px;">&#160;4920000059</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Eppendorf pipette (10 &#181;L)</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf (Westbury, USA)</td>
			<td style="width:143px;">&#160;4920000113</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Forceps</td>
			<td style="width:267px;">Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.&#160;</td>
			<td style="width:143px;">JD4020</td>
			<td style="width:156px;">Curved tip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Hamilton syringe</td>
			<td style="width:267px;">Hamilton (Nevada, USA)</td>
			<td style="width:143px;">80501</td>
			<td style="width:156px;">Volume 50 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Micro-mosquito hemostat</td>
			<td style="width:267px;">F.S.T (Foster City, USA)</td>
			<td style="width:143px;">13011-12</td>
			<td style="width:156px;">Curved, tip width 1.3mm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Needle holder&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;">J32110</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:267px;">F.S.T (Foster City, USA)</td>
			<td style="width:143px;">14002-12</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">1-mL Syringe</td>
			<td style="width:267px;">WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Materials and reagents</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Anti-GAPDH antibody</td>
			<td style="width:267px;">CST (Danvers,&#160; USA)</td>
			<td style="width:143px;">#2118</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Anti-Luciferase antibody</td>
			<td style="width:267px;">Abcam (Cambridge, UK)</td>
			<td style="width:143px;">ab187340</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:267px;">CST (Danvers,&#160; USA)</td>
			<td style="width:143px;">&#160;#7074</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Anti-VDR antibody</td>
			<td style="width:267px;">Abcam (Cambridge, UK)</td>
			<td style="width:143px;">&#160;ab109234</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">PA175056</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Chloralic hydras</td>
			<td style="width:267px;">LingFeng Chemical (ShangHai, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Cryogenic Vials</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">375418</td>
			<td style="width:156px;">1.8 mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Depilatory cream</td>
			<td style="width:267px;">Veet (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Gibco (Grand Island,&#160; USA)</td>
			<td style="width:143px;">14040133</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Entoiodine</td>
			<td style="width:267px;">LiKang (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;">310132</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">EP tube</td>
			<td style="width:267px;">Sarstedt (Newton, USA)</td>
			<td style="width:143px;">PCR001</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Filter</td>
			<td style="width:267px;">Millipore (Bedford, USA)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;">Pore size 0.2 &#181;m&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:267px;">Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Luciferin</td>
			<td style="width:267px;">Promega (Madison, USA)</td>
			<td style="width:143px;">P1041</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Lysis buffer for western&#160; blot</td>
			<td style="width:267px;">Beyotime (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;">P0013J</td>
			<td style="width:156px;">Without inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Ophthalmic cream</td>
			<td style="width:267px;">Apex Laboratories ( Melbourne, Australia))</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">PBS</td>
			<td style="width:267px;">Gibco (Grand Island,&#160; USA)</td>
			<td style="width:143px;">10010023</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">78438</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">5-0 silk suture</td>
			<td style="width:267px;">Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Steel ball</td>
			<td style="width:267px;">Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;">Width 1.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:267px;">Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;">30 gauge&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Warm mat</td>
			<td style="width:267px;">Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China )</td>
			<td style="width:143px;">NF-GNCW</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and efficient method for in vivo cardiac-specific gene manipulation by intramyocardial injection in mice

유전자 조작에 특별히 크게 심장 질병 pathomechanisms 및 그들의 치료 잠재력 조사 약효. 심장 관련 유전자 배달 vivo에서 체계 또는 로컬 배달에 의해 일반적으로 이루어집니다. 꼬리 정 맥을 통해 조직의 주입은 간단 하 고 효율적인 재조합 형 adeno 관련 바이러스 9 (AAV9)를 사용 하 여 심장 유전자 발현 조작에. 그러나,이 메서드는 효율적인 변환에 대 한 벡터의 상대적으로 높은 금액을 요구 하며 nontarget 기관 유전자 변환에서 발생할 수 있습니다. 여기, 우리는 간단한, 효율적, 시간 절약 방법을 intramyocardial 사출의 비보에 심장 관련 유전자 조작 생쥐에 대 한 설명. (환기) 없이 마 취, 가슴 중요 하 고 작은 근육은 퉁 명 스럽게 해 부, 그리고 마우스 심장 4 있는 공간에 작은 절 개를 통해 수동 외부화에 의해 신속 하 게 노출 되었다. 그 후, 아 데 노 바이러스 인코딩 luciferase (루크)와 비타민 D 수용 체 (VDR), 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 대상으로 VDR, 심근에 해밀턴 주사기와 주입 했다. 후속 vivo에서 영상 시연 그 luciferase 성공적으로 특별히 마음에에서 overexpressed 했다. 또한, 서쪽 오 점 분석은 성공적인 overexpression 또는 마우스 마음에 VDR의 입을 확인 했다. 일단 마스터, 셀 또는 마우스 마음에 nanogels 같은 다른 물자의 주입으로 유전자 조작,이 기술을 사용할 수 있습니다.

실험 프로토콜 및 보고 방법에 대 한 주요 단계 중 일부는 그림 1에 표시 됩니다. 아 데 노비 루스 인코딩 luciferase (전진-루크)의 intramyocardial 주입 후 5 일, vivo에서 전진-뤽 주입 마우스에서 이미지 표시 했다 (그림 2A, B), 마음에 특별히 luciferase의 강력한 overexpression 서쪽 오 점 분석 (그림 2C), 제안 nontarget 장기 변환의 부재에 의해 확인. 대조적으로, 아무 luciferase 식 통제 쥐에 있는 발견 되었습니다. Luciferase의 성공적인 overexpression와 일치, 서양 분석 제안된 크게 증가 VDR 식 좌 심 실에 쥐의 VDR (전진-VDR) (그림 3A) 인코딩 하는 아 데 노 바이러스 주사 오 점. 또한, 전진 shVDR 주입 크게 좌 심 실 (그림 3B)에 VDR 식 감소. 대조적으로, VDR 식 변경 되지 않았습니다 크게 오른쪽 심도 전진 VDR 주입 마우스 또는 전진 shVDR 주입 마우스 (그림 3C, D)에 아 데 노 바이러스만 왼쪽된 심 실 심근에 주입 했다 때문에.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57074/57074fig1.jpg"> 그림 1 . 마우스 intramyocardial 주입 및 유전자 표현 검색 프로토콜에 대 한 스키마. (A) 그림의 좌 심 실 심근에 3 사출 사이트를 보여주는. 표시 된 바이러스의 주입 후 마우스 마음에 유전자 식 검색 (B) 프로토콜. 전진-luciferase: 아 데 노 바이러스 luciferase; 인코딩 AdVDR: 아 데 노 바이러스 VDR; 인코딩 AdshVDR, 아 데 노 바이러스 인코딩 shRNA VDR를 대상으로 (C) 대표 이미지 마우스 intramyocardial 주입에 대 한 수정된 방법의 여러 단계를 표시 합니다. a. 상용 depilatory 크림 모피의 제거. povidone-요오드의 3 스크럽과 외과 사이트의 b. 균 c. 무 균 드 레이프와 외과 사이트 취재. d. 칼 및 겨드랑이 연결 하는 선 따라 0.5 cm 피부 절 개. e. 무딘 가슴 큰 집게와 마이크로-모기 hemostat 가슴 작은 근육의 해 부. 심장의 f. 외부화입니다. 해밀턴 주사기를 통해 좌 심 실 심근에 30 µ L 아 데 노비 루스 솔루션의 g. 주입 h - 5-0 비단 봉합 사로 봉합 하는 지갑-문자열에 의해 피부 나 폐쇄. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57074/57074fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57074/57074fig2.jpg"> 그림 2 . 마음에 luciferase 식의 검출. (A) 이미지 제어 마우스 및 마우스 주입 후 5 일 luciferase 인코딩 하는 아 데 노 바이러스 주입에 심장의 발광 신호를 보여주는 이미징 시스템에 의해 수집 된. 서로 다른 그룹에 (B) 발광 신호 강도 (n = 3) t 검정에 의해 통계 분석을 복종 된다. p < 0.01 제어 마우스 대. (C) 서쪽 오 점 분석 결과 마음에 luciferase 단백질 수준을 보여주는, 폐, 간, 그리고 비장에 아 데 노 바이러스 주입 후 5 일에 그룹 표시 (n = 3). 이후 luciferase 식만 전진-뤽 주입 쥐의 심장에 감지 했다, 통계 분석은 수행 되지 않습니다. 전진-루크: 아 데 노 바이러스 luciferase 인코딩입니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57074/57074fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57074/57074fig3.jpg"> 그림 3 . 마음에 VDR 식의 검출. (A) 상단 패널: 서쪽 오 점 0 일, 5 일, 7 일, 14 일 adv VDR 주입 후에 (여기서는 아 데 노 바이러스 주입) 좌 심 실에서 보여주는 VDR 수준 밴드. 하단 패널: 서로 다른 그룹에 VDR 식 레벨의 반 정량적 분석 (n = 4 시간 마다). 결과는 GAPDH에 대 한 정규화 하 고 접어 0 하루를 기준으로 변경으로 변환 했다. 단방향 분산 분석 (ANOVA) Bonferroni 후 테스트 (등분산 가정) 다음 또는 Tamhane 테스트 후 (등분산 하지 생각) 통계 분석을 위해 수행 되었다. p < 0.05 또는 * *p < 0.01 0 일 대. (B) 상단 패널: 서쪽 오 점 0 일, 3 일, 5 일, 그리고 7 일 전진 shVDR 주입 후에 좌 심 실에서 보여주는 VDR 수준 밴드. 하단 패널: 서로 다른 그룹에 VDR 식 레벨의 반 정량적 분석 (n = 4 시간 마다). p < 0.05 0 일 대. (C) 상단 패널: 서쪽 오 점 0 일, 5 일, 7 일, 14 일 adv VDR 주입 후에 (여기서는 아 데 노 바이러스 하지 주입) 우 심 실에서 보여주는 VDR 수준 밴드. 하단 패널: 서로 다른 그룹에 VDR 식 레벨의 반 정량적 분석 (n = 4 시간 마다). (D) 상단 패널: 서쪽 오 점 0 일, 3 일, 5 일, 그리고 7 일 전진 shVDR 주입 후에 우 심 실에서 보여주는 VDR 수준 밴드. 하단 패널: 서로 다른 그룹에 VDR 식 레벨의 반 정량적 분석 (n = 4 시간 마다). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57074/57074fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

여기 선물이 쥐에서 심장 관련 유전자 조작에 대 한 프로토콜. 마 취, 마우스 마음 4 있는 공간을 통해 externalized 했다. 그 후, adenoviruses 인코딩 특정 유전자 단백질 식 측정 뒤에 vivo에서 이미징 및 서 부를 통해 심근에 주사기로 주입 했다 분석 오 점.

Intramyocardial 쥐에 주입 하 여 심장 관련 유전자 조작 비보에 대 한 간단 하 고 효율적인 방법

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

15.7K 조회수.  The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College. 여기 선물이 쥐에서 심장 관련 유전자 조작에 대 한 프로토콜. 마 취, 마우스 마음 4 있는 공간을 통해 externalized 했다. 그 후, adenoviruses 인코딩 특정 유전자 단백질 식 측정 뒤에 vivo에서 이미징 및 서 부를 통해 심근에 주사기로 주입 했다 분석 오 점.

비디오: A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing : 정확한 Genotyping을위한 간단한 방법

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

연구

생물학

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리<em&gt; 체외에서</em&gt; mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Ribosome 바운드 Polypeptides을 파악하는 도구로 SecM 체포 시퀀스를 사용하여

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

고환 세포 현탁액의 준비를 위해 간단하고 효율적인 기술

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

마우스의 빠른 비 침습 요추 경 막내 주사를 통해 생체 siRNA의 형질과 척수에있는 유전자 넉다운에

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.

신생아 마우스의 정맥 주사

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. Therefore, it is important to establish an efficient transient gene expression system in soybean. Here, we report a simple protocol for the preparation of soybean protoplasts and its application for transient functional analyses. We found that young unifoliate leaves from soybean seedlings resulted in large quantities of high quality protoplasts. By optimizing a PEG-calcium-mediated transformation method, we achieved high transformation efficiency using soybean unifoliate protoplasts. This system provides an efficient and versatile model for examination of complex regulatory and signaling mechanisms in live soybean cells and may help to better understand diverse cellular, developmental and physiological processes of legumes.

We developed a simple and efficient protocol for the preparation of large quantities of soybean protoplasts to study complex regulatory and signaling mechanisms in live cells.