思いやりのある指導を安定したトランスジェニックゼブラフィッシュの行の世代のこのプロトコル、および Eva Ma、アシュリー ジョージとゲイル ・ スタントンを開発しながら、ラルフ ・ ネルソンとダニエル Possin に感謝します。仕事は、m. g. w. c. と m. g.、NIH ネイ 5T32EY007031 に NSF GRFP 2013158531 と j. h. s. b. に EY026020 によって支持されました。

<ol>
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Sci. 48 (2), 522-529 (2007).</li><li>George, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptojanin+1+is+required+for+endolysosomal+trafficking+of+synaptic+proteins+in+cone+photoreceptor+inner+segments.">Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments.</a> PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).</li><li>Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+homologous+recombination-mediated+genome+engineering+in+zebrafish+using+TALE+nucleases.">Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases.</a> Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).</li><li>Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Real-time+Glucose+Uptake+Reveals+Distinct+Transport+Among+Cell+Types.">Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types.</a> Invest. 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Vis. Exp. (99), (2015).</li></ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

新鮮なゼブラフィッシュ網膜スライスのex vivoイメージング光受容体生物学20,21,22を勉強するための多彩なツールがあると証明した、ユニークなことは完全に成熟した、単一細胞の解析を可能に差別化された網膜。練習では、網膜の同じ部分からシリアル スライスを使用して、1 つの魚からの組織と複数の実験を行うことが可能です。課題と電気生理学研究14両生類網膜スライスの準備などに関する提案に加え、イメージング実験に関する重要な考慮事項があります。
光受容体の RPE が削除された後に特に最低でも、繊細な網膜を処理する上で重要な細胞生存率が一般に細胞の形態と相関します。スライスした後まっすぐにスライスを持ち上げるのではなくスライスの商工会議所 (図 1 f) 梯子にそれらを転送するから水平方向にスライスを慎重にスライドさせて、常にリンゲル液に浸漬スライスする微細鉗子を使用します。可能であれば、網膜スライス輸送中の揺れからスライスへのダメージを最小限に抑えるための共焦点顕微鏡の近くのはしごを組み立てます。
濾紙に網膜組織の強い接着注入または灌流実験中でも安定したスライスの作成にとって重要です。形態と安定性 (図 2 a); をイメージングする直前の各スライスを慎重に検査する必要があります。特定のスライスの安定性を明らかに共焦点接眼レンズを通してスライスの動きを表示しながらやさしく顕微鏡テーブルをタッピングします。注入中に Z 方向にドリフトの注意、にもかかわらずまたは灌流することができます分析、課題を提示するコントロール色素をロード、脂溶性色素膜とミトコンドリアのために安定などラベルの識別可能なセル構造に便利ですので正規化 (図 4 aマゼンタ)。スライスは、Z 方向の > 10 μ m をドリフトする場合それは使用可能な単一セルのデータを抽出することが可能かもしれない。X、Y 方向に適度なドリフトは、ImageJ (RRID:SCR_002285) の登録ソフトウェア MultiStackReg などを使用して、後処理で修正できます。
イメージング中に退色が発生が静的な条件の下で網膜スライスにおけるマーカーの蛍光で安定してなければなりません。レーザー強度などのパラメーターを調整して、時間の経過中にレーザ露光を最小限に抑える、スキャン速度、およびフレーム レートに注意が必要があります。画像コントロールは、各蛍光マーカーの使用に適しています。コントロールには、注入または灌リンゲル液別実験薬理学的エージェントを使用せず恒常蛍光を発する非バイオ マーカー イメージング実験の実施が含まれます。
によって使用されている共焦点励起レーザー、RPE の顔料は蛍光に貢献できるし、スライスする前にこの組織の大部分を削除することが重要ですので、イメージング中にも熱を生成します。基になる網膜への損傷を最小限に抑えながら、RPE の除去 dark-adapting 動物のエイズ。これは透明な RPE とアルビノ動物を使用して克服することがありますが、RPE をイメージすることができないはこのスライス標本の制限です。別の制限は、網膜神経節細胞とミューラー細胞の最後の足がなるによって隠されることビューからフィルター ペーパー;代替の準備として、網膜は、フィルター紙の上を光受容側とマウントされ、最も内側にある網膜の明確なビューを提供するために、スライス フラットにあります。また、広いフィールド アマクリン細胞など、いくつかのセルの長い水平投影が郭清またはスライス中に切断されるかもしれない注意してくださいすることが重要です。最終的な制限は、網膜のこの部分にインジケーターの染料ではなく、遺伝子にエンコードされた使用バイオ センサーをお薦めしますので、このような多くの蛍光染料に蓄積特異的視細胞外側セグメントです。
組織の染料23,24使用可能な蛍光セル記者の広い範囲を与えられ、遺伝子ゼブラフィッシュ2,3,4、で正常に使用される蛍光バイオ センサーをエンコード5、いくつかの網膜細胞型 (図 3, 図 4の例を参照してください) で多数の生物学的過程を研究するこのスライスの準備をされる可能性があります。新鮮な網膜スライス生細胞超解像顕微鏡を用いたイメージングと、また、細胞レベルで網膜機能と健康にエキサイティングな新しい洞察を提供できます。さらに、このメソッドはマウス網膜スライス25 ex vivoイメージングのために適応することができます。新鮮な網膜スライスの成功の準備には、練習が必要ですが、それは成熟した網膜細胞固有の生物学的質問の広い範囲に対処するために役立つ強力なツールです。

ゼブラフィッシュ (動脈分布) は、広く医療や基礎科学研究1, その小さなサイズ、急速な発展と脊椎動物の器官系のために使用となっています。遺伝子導入のための確立された方法と組み合わせてゼブラフィッシュ幼虫の自然の透明性は、生きている動物の細胞プロセスの詳細な可視化を可能にしました。遺伝的コード化蛍光バイオ センサーの数は、特定のゼブラフィッシュ細胞 Ca2 + 2過酸化水素3、アポトーシス活性化4 ATP5検知する対象となっています。
ゼブラフィッシュ幼虫のin vivoイメージング脳回路6のマッピングを含む、神経科学の分野でブレークスルーをもたらしたし、中枢神経系治療薬の開発の障害7。ゼブラフィッシュは、網膜機能層構造と高等脊椎動物の神経型、彼らは堅牢な視覚的な動作8,9を表示するためにビジョンの研究に適しています。人間の病気に類似している網膜変性のいくつかの種類を正常にモデル化されているし、ゼブラフィッシュ10,11, 個々 の視細胞変性網膜2、内のライブ イメージングなどで勉強 12。
ゼブラフィッシュ稚魚イメージング体内の貴重なツールですが、いくつかの薬理学的治療は、全体の動物を超えることはできませんし、魚が成長し、色素沈着を開発より困難となります。さらに、特定の細胞プロセス変更開発と年齢、後の時間ポイント理解機能と病気の進行に重要な大人の動物。イムノブロット、quantitiative PCR、O2消費、メタボローム解析などの生化学的な方法は、全体として網膜の生物学についての重要な手がかりを提供できますが、貢献によって影響を受ける個々 のセルの種類を見分けることは困難です。病気。これらの問題をバイパスする前のヴィヴォ孤立した網膜組織イメージングとイメージング フラット マウントされた網膜が外側の網膜13のビューを提供より深い内部の網膜の機能が隠されています。横網膜スライス、すべてのレイヤーおよびセルの種類を明確に表示を有効にするが、正常機能と疾患に関与する動的なプロセスの 1 つのスナップショットを提供するだけもので免疫組織化学的解析を固定します。
ここでは、イメージングのための大人のゼブラフィッシュから横網膜スライス前のヴィヴォを生成する手法を提案する.それは電気生理学的・形態学的研究14,15、時間経過前のヴィヴォ共焦点を使用してイメージングの重要な変更との水陸両用機およびゼブラフィッシュ網膜スライスを準備するための方法と同様顕微鏡検査。バイオ センサーやスライスで染料の蛍光反応は灌流を用いた薬理学的エージェントを提供しながら、共焦点顕微鏡を用いたリアルタイムで監視されます。メソッドは、光受容体イメージングのため開発された、適切な蛍光マーカーとミュラー細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、または網膜神経節細胞を可視化するために使用する実行可能な場合があります。さらに、スライスは、レポート セル実行可能性、小胞輸送、ミトコンドリア機能または酸化還元状態に細胞膜透過性の蛍光染料をロードできます。この多目的な準備は、Ca2 +動態、シグナル伝達、代謝の状態など、網膜全体の細胞プロセスの広い範囲の可視化をことができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1153">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">zebrafish</td>
			<td style="width:239px;">Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:401px;">stocks maintained in-house as stable transgenic lines</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">petroleum jelly</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">19-090-843</td>
			<td style="width:401px;">for petroleum jelly syringe</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">3-mL slip tip syringe</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">14-823-436</td>
			<td style="width:401px;">for petroleum jelly syringe</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">20g 3.8 cm slip tip needle</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">14-826-5B</td>
			<td style="width:401px;">for petroleum jelly syringe</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">12-550-A3</td>
			<td style="width:401px;">for eyecup dissection, slicing chamber</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Seche Vite clear nail polish</td>
			<td style="width:239px;">Amazon</td>
			<td style="width:181px;">B00150LT40</td>
			<td style="width:401px;">for slicing chamber</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">18 mm X 18 mm #1 glass coverslips</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td style="width:401px;">for imaging ladders</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">unflavored dental wax</td>
			<td style="width:239px;">Amazon</td>
			<td style="width:181px;">B01K8WNL5A</td>
			<td style="width:401px;">for imaging ladders</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">double edge razor blades</td>
			<td style="width:239px;">Stoelting</td>
			<td style="width:181px;">51427</td>
			<td style="width:401px;">for tissue slicing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">tissue slicer with digital micrometer</td>
			<td style="width:239px;">Stoelting</td>
			<td style="width:181px;">51415</td>
			<td style="width:401px;">for tissue slicing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">filter paper - white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:239px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:181px;">HAWG01300</td>
			<td style="width:401px;">filter paper for mounting retinas</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">FB0875712</td>
			<td style="width:401px;">for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">15 cm plain-tipped wood applicator stick</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">23-400-112</td>
			<td style="width:401px;">for wire eye loop tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">30g (0.25 mm diameter) tungsten wire</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">AA10408G6</td>
			<td style="width:401px;">for wire eye loop tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-glucose</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">G8270</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sodium L-lactate</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">L7022</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sodium pyruvate</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P2256</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">G3126</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;L-glutathione, reduced</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">G4251</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-ascorbic acid</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">A5960</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">S7653</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P9333</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CaCl2 &#183; 2H2O</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">C3881</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">S8282</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MgCl2 &#183; 6H2O</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">M0250</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">H3375</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris base</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">BP152</td>
			<td style="width:401px;">component of Na+-free Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 N HCl</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">02-003-063</td>
			<td style="width:401px;">component of Na+-free Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P5655</td>
			<td style="width:401px;">component of Na+-free Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:239px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:181px;">C1062-P</td>
			<td style="width:401px;">container for Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Vannas scissors - 8 cm, angled 5 mm blades</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:181px;">501790</td>
			<td style="width:401px;">micro-scissors for eyecup dissection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Swiss tweezers - #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:181px;">504510</td>
			<td style="width:401px;">fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">single edge razor blades</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">12-640</td>
			<td style="width:401px;">for eyecup dissection and trimming filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">EMD Millipore filter forceps</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">XX6200006P</td>
			<td style="width:401px;">flat forceps for handling wet filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">C12 558/568 BODIPY</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">D3835</td>
			<td style="width:401px;">stains live cell nuclei; incubate 5 &#181;g/mL for 15 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">propidium iodide (PI)</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">P3566</td>
			<td style="width:401px;">stains dead cell nuclei; incubate 5 &#181;g/mL for 20 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">62249</td>
			<td style="width:401px;">stains live cell nuclei; incubate 5 &#181;g/mL for 20 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">T668</td>
			<td style="width:401px;">stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">tissue perfusion chamber</td>
			<td style="width:239px;">Cell MicroControls</td>
			<td style="width:181px;">BT-1-18/BT-1-18BV [-SY]</td>
			<td style="width:401px;">imaging chamber for injection or perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:332px;">2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG)</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">N13195</td>
			<td style="width:401px;">fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Olympus laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:239px;">Olympus</td>
			<td style="width:181px;">FV1000</td>
			<td style="width:401px;">confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">C2759</td>
			<td style="width:401px;">experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">miniature aspirator positioner</td>
			<td style="width:239px;">Cell MicroControls</td>
			<td style="width:181px;">FL-1</td>
			<td style="width:401px;">for perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder</td>
			<td style="width:239px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:181px;">various</td>
			<td style="width:401px;">for perfusion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing fresh retinal slices from adult zebrafish for ex vivo imaging experiments

網膜は、開始し、ビジョンの最初のステップを統合する複雑な組織です。網膜細胞の機能不全はまばゆいばかりの多くの病気の認刻極印、細胞は正常にどのように異なる網膜について基礎的な理解にかかっている未来の療法。網膜細胞環境で特定の細胞のタイプの貢献が減少されるため、生化学的な方法でそのような情報を得ることが困難に証明しています。ライブ眼底イメージングは、細胞レベルで、遺伝子にエンコードされた蛍光バイオ センサーの増加のおかげで、多数の生物学的プロセスのビューを提供できます。ただし、この手法については、オタマジャクシやゼブラフィッシュ幼虫、孤立した網膜の最も外側の網膜層または生きている動物の網膜の低解像度画像に制限されていますこれまで。共焦点顕微鏡を介してライブ イメージングのための大人のゼブラフィッシュからライブ前のヴィヴォ網膜スライスを生成する手法をご紹介します。この準備には、網膜のすべてのレイヤーと灌流を用いた共焦点イメージング実験を実行するため目に見えるほとんどの携帯型横スライスが得られます。トランスジェニックゼブラフィッシュ表現する蛍光タンパク質や特定の網膜細胞の種類や細胞内小器官のバイオ センサーを使用して、そのまま網膜から単一セル情報を抽出します。さらに、網膜のスライスは、蛍光指示薬染料、メソッドの汎用性を追加することでロードできます。このプロトコルは、Ca2 +ゼブラフィッシュ錐体視細胞内のイメージングのため開発されましたが、Ca2 +やミュラー細胞、バイポーラと水平細胞、ミクログリア、アマクリン細胞や網膜の代謝産物を測定する適切なマーカーを合わせることができます。神経節細胞。網膜色素上皮細胞は、このメソッドはそのセル型の勉強に適してないので、スライスから削除されます。実際には、複数の実験の 1 つの動物からシリアル スライスを生成することが可能です。この適応手法は、網膜細胞生物学、Ca2 +、およびエネルギー恒常性について多くの質問に答えるための強力なツールを提供します。

安定したポジショニングとスライスの横方向は、注入または灌流薬理学的エージェントの成功イメージング鍵です。慎重に確認し、網膜のすべてのレイヤーが表示されます (図 2 a、スライス ii) ことを確認するために必要な共焦点レーザー顕微鏡の前にスライスの位置を変更します。スライスを回転する場合 (図 2 a、スライス iii) を若干前方外側セグメントの束が表示されます、フォーカスに必要な網膜層をもたらすに鉗子で微調整を行うことができます。スライスは不十分な濾紙に付着した (図 2 a、私をスライス) または RPE を保持 (図 2 aiv をスライス) タイムラプス イメージング用は使用しないでください。
細胞の生理的過程前のヴィヴォ; 観察に重要です。細胞染色など propidium ヨウ化 (PI) は網膜スライス練習しながら細胞の健康を試金すること勧めします。すべてのスライスのカットのエッジ近く死んだ細胞はスライスに 5-10 μ m より深いながら、原子核 (図 2 b、左のパネル)、PI が蓄積されます、通常形態とない PI の染色と健康な細胞のイメージを作成することができます。たとえば、光受容体、切断端面の下の PI 否定的な細胞は通常、ステレオタイプの偏光、細長い形態 (図 2 b、右パネル) が表示されます。光受容体は網膜スライス酸素リンゲル液で格納されている場合、少なくとも 4 時間のために実行可能に残る。
遺伝子マーカーと染料の組み合わせを使用して、多くの網膜細胞構造を視覚化できます。ダブル、トリプルの蛍光標識と新鮮な網膜スライスの共焦点画像の例は、図 3に掲載されています。錐体視細胞核を基準にして小胞体 (ER) の動態を可視化、核染付 (図 3 a) コーン ER17を対象とした gfp 遺伝子導入魚から網膜スライスを counterstained することができます。アクチン細胞骨格アクチンの GFP 融合18 (図 3 b) を表現するトランスジェニックゼブラフィッシュから網膜スライスを使用してを表示するのには、同様の戦略を用いることができます。別のセルに固有のプロモーターとミュラー細胞を赤色蛍光タンパク質 tdTomato19ラベルの付いたおよび網膜スライス (図 3、上部パネル) で視覚化できます。試金される生体内で蛍光ブドウ糖アナログ (NBDG)、網膜スライス21 (図 3、下部パネル) で表示されているセルに組み込むとなると口頭で gavaging アダルト ゼブラフィッシュ網膜へのグルコース取り込みができます。複数の細胞プロセスやコーンのサブタイプにおける Ca2 +動態など、タンデムでの細胞の種類を監視するダブル トランスジェニックゼブラフィッシュを用いることができます。図 3 Dは、tdTomatomitochondrially をターゲットとした Ca 2 +センサー (水戸-GCaMP) すべてのコーン22単位と長波長の円錐形2単位の実験では、このタイプのトリプル ラベル付けスキーム核の染色。
網膜細胞タイムラプス イメージングは、このスライスの準備の重要な利点です。例えば、円錐形の光受容体の細胞質の Ca2 +変動を観察し、図 4で示す実験薬理学的操作中に後で定量化できます。図 4 aは、Ca2 +センサー GCaMP2 (上) またはコントロール eGFP16 (下) 赤脂溶性色素 counterstained 錐体光受容体で表現する網膜のスライスを示しています。この実験では Na+は isotonically から枯渇、灌流を用いたイメージング室 GCaMP (図 4 a、上部パネル) を反映してゾル性細胞質 Ca2 +外側セグメントと細胞体が大幅に増加を引き起こします。網膜の蛍光スライス表現する Ca2 +-鈍感 eGFP です (図 4 a、下部パネル) この処理によって影響を受ける。時間経過の映画は、ImageJ ソフトウェアを使用して単一の円すいの外側セグメントや細胞体シナプス (図 4 b) から蛍光応答を定量化分析できます。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">ソリューションを補完します。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>株式 * 濃度 (mM) x 50</td>
			<td>使用濃度 (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-グルコース</td>
			<td>500</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>乳酸ナトリウム</td>
			<td>50</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>ピルビン酸ナトリウム</td>
			<td>25</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-グルタミン</td>
			<td>25</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>還元型グルタチオン</td>
			<td>25</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>アスコルビン酸</td>
			<td>15</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* 保存-20 ° C で因数 < 6 ヶ月;リンゲル液に新鮮なを追加します。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1。50 X のコンポーネントは、原液および最終的な作業濃度を補います。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">リンゲル液</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>濃度 (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化ナトリウム</td>
			<td>133</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2 ·2 H2O</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>1.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 ·6 H2O</td>
			<td>1.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">NaOH を使用して 7.4 に pH</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">< 1 ヶ月滅菌ボトルに 4 ° C で保存します。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2。標準リンゲル液の成分。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Na+-無料のリンゲル液</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>濃度 (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>トリス</td>
			<td>147</td>
		</tr>
<tr>
<td>HCl</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2 ·2 H2O</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>1.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 ·6 H2O</td>
			<td>1.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">pH 7.4 HCl を使用するには</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">< 1 ヶ月滅菌ボトルに 4 ° C で保存します。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 3。Na のコンポーネント+-無料のリンゲル液。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">共焦点イメージングの設定</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">蛍光体</td>
			<td colspan="2">励起</td>
			<td rowspan="2">排出フィルター</td>
		</tr>
<tr>
<td>波長</td>
			<td>レーザ強度</td>
		</tr>
<tr>
<td>GFP (GCaMP を含む)</td>
			<td>488 nm</td>
			<td>2-5%</td>
			<td>eGFP または AlexaFluor 488</td>
		</tr>
<tr>
<td>tdTomato</td>
			<td>559 nm</td>
			<td>5%</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
		</tr>
<tr>
<td>PI</td>
			<td>559 nm</td>
			<td>2%</td>
			<td>PI</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヘキスト 33342</td>
			<td>405 nm</td>
			<td>1%</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
<tr>
<td>NBDG</td>
			<td>488 nm</td>
			<td>10%</td>
			<td>eGFP または AlexaFluor 488</td>
		</tr>
<tr>
<td>C12 558/568 BODIPY</td>
			<td>559 nm</td>
			<td>1%</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
		</tr>
<tr>
<td>TMRM</td>
			<td>559 nm</td>
			<td>3%</td>
			<td>RFP</td>
		</tr>
</tbody></table>表 4。蛍光マーカーの染料の図 2-4 を提示条件をイメージングします。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56977/56977fig1.jpg"> 図 1。新鮮なゼブラフィッシュ網膜スライスを準備するスケマティック。(A)は離れて、アイカップを解剖し、レンズと強膜 (ステップ 2.4.1。) を破棄します。(B)は 3 つの部分にアイカップをカットします。小さなエッジ部分 (ステップ 2.4.2。) を破棄します。(C)は、フィルター紙 (ステップ 2.5.1.-2.5.2) に向かって内側の網膜にアイカップ部分の下でろ紙をドラッグします。(D)リンゲル液下方 (ステップ 2.5.3。)、フィルター ペーパーを通して芯に紙タオルを使用して Flatten 網膜優しくはがして鉗子 (ステップ 2.6) で RPE を離れて残り。組織スライサー ステージにろ紙をスライスの商工会議所に移動し、400 μ m のスライスをカット (2.8 を手順します。、2.9。)。スライス スライスと商工会議所とリンゲル液 (ステップ 2.10.1。) のシャーレにワックスやワセリンのはしご(E)移転(F)は、冠水したスライスを保ちながらはしごにスライスの商工会議所から単一スライスのスライドに微細鉗子を使用します。(G)回転フィルター紙 (黒) 90 ° をストリップし、ワックスやワセリン (手順 2.10.2.-2.10.3) におけるろ紙の端を埋めます。(H)最終的なイメージング室の模式図は、はしごとスライス読み込まれます。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56977/56977fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56977/56977fig2.jpg"> 図 2。新鮮なゼブラフィッシュ網膜の例スライスろ紙と細胞生存率を表示する適切な接着します。(A)ワセリンはしごで新鮮な網膜スライスの明視野イメージ。スライス ii および iii は、良好な接着性と横網膜層を表示します。スライス i と iv 実質的な RPE を保持しているか非常に湾曲した、ろ過紙ないよく付着としないイメージを作成する必要があります。スケール バー = 200 μ m の範囲(B)トップダウン Z 錐体光受容体 (Tg(gnat2:eGFP)16) 内を表現するトランスジェニックゼブラフィッシュから新鮮な網膜スライスのモンタージュ。ヘキスト染料ラベルすべて核;propidium ヨウ化 (PI) counterstaining ラベル (左) のスライスのカットのエッジ付近に表示死んだ細胞の核です。Z スタック ステップ サイズ 1 μ m を =スケール バー = 20 μ m 蛍光イメージング条件は表 4で概説されます。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56977/56977fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56977/56977fig3.jpg"> 図 3。サンプルの共焦点画像アダルト トランスジェニックゼブラフィッシュから網膜スライス前のヴィヴォダブルとトリプル ラベルします。(A)遺伝子 GFP を用いた 2 色イメージング方式はヘキスト核対比染色 (青、下) と錐体 (Tg(gnat2:calr-GFP)17, 上部) 小胞体をタグ付けされます。(B) GFP はヘキスト核対比染色 (青、下) と錐体 (Tg(gnat2:LifeAct-GFP)18, 上部) アクチンをタグ付き。(C) RFP、ゼブラフィッシュから標識ミュラー細胞 (Tg(GFAP:tdTomato)19, トップ) 円錐形20,21 (緑、下) にグルコース取り込みを示す蛍光グルコース (NBDG) を与えられます。(この画像は図 2 bの Kanow、らから21) (D)ダブル トランスジェニックゼブラフィッシュを用いた 3 色画像の例。左、RFP の長波長の円錐形の光受容体 (Tg(trβ2:tdTomato)2) を対象とします。センター、カルシウム バイオ センサー GCaMP 円錐形の光受容体のミトコンドリア (Tg(gnat2:mito-GCaMP3)22) を対象とします。右、ヘキスト核対比染色 (青)、水戸 GCaMP (緑)、tdTomato (マゼンタ) の画像を重ねて表示されます。画像は 9 フレームの最大強度 Z 予測 7 μ m の組織の深さ;スケール バー表す 10 μ m 蛍光イメージング条件は表 4のとおりです。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56977/56977fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56977/56977fig4.jpg"> 図 4。Ca2 +イメージング GCaMP とコントロールの eGFP と。(A)蛍光 Ca2 +バイオ センサー GCaMP (gnat2:GCaMP32、トップ) を表現する新鮮な網膜スライスまたは錐体視細胞の eGFP (下) の代表的なイメージ。左、ベースラインでスライス右、Na+だった isotonically トラップ Ca2 +視細胞でトリス ベース リンガーの液の灌流を用いたイメージング室から枯渇後 2 分をスライスします。スケール バー = 10 μ m の範囲の蛍光イメージング条件は表 4で概説されます。(B)は、Na+枯渇のタイムラプス イメージング中に単一視細胞コンパートメント (外側セグメント、細胞体シナプス) の蛍光変化を意味します。スライスをイメージしましたすべての 10 s、スタックは、ImageJ を用いた処理され、GCaMP または eGFP の蛍光膜色素から信号を正常化しました。実線、GCaMP (外側セグメントの n = 15、細胞体シナプス 24 の = = 26);破線、eGFP (外側セグメントの n = 26、細胞体シナプス 20 = = 31)。誤差範囲は、平均値の標準誤差を表しています。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56977/56977fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

網膜組織を撮像すると、従来の生化学的方法から収集することはできません単一セル情報が提供できます。このプロトコルでは、共焦点レーザー顕微鏡のゼブラフィッシュの網膜スライスの準備について説明します。蛍光遺伝子センサーをエンコードまたはインジケーター染料網膜細胞の多数の生物学的過程の可視化を許可します。

Ex Vivoイメージング実験アダルト ゼブラフィッシュから準備新鮮な網膜スライス

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

preparing-fresh-retinal-slices-from-adult-zebrafish-for-ex-vivo

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

9.1K ビュー.  University of Washington. 網膜組織を撮像すると、従来の生化学的方法から収集することはできません単一セル情報が提供できます。このプロトコルでは、共焦点レーザー顕微鏡のゼブラフィッシュの網膜スライスの準備について説明します。蛍光遺伝子センサーをエンコードまたはインジケーター染料網膜細胞の多数の生物学的過程の可視化を許可します。

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Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

蛍光色素で大人のゼブラフィッシュの網膜神経節細胞の逆行性標識

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

神経科学

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, photoreceptor degeneration triggers M&#252;ller glial cells to re-enter the cell cycle and produce transient-amplifying progenitors. These progenitors continue to proliferate as they migrate to the damaged area, where they ultimately give rise to new photoreceptors. Currently, there are two widely-used LIRD paradigms, each of which results in varying degrees of photoreceptor loss and corresponding differences in the regeneration response. As more genetic and pharmacological tools are available to test the role of individual genes of interest during regeneration, there is a need to develop a robust LIRD paradigm. Here we describe a LIRD protocol that results in widespread and consistent loss of both rod and cone photoreceptors in which we have combined the use of two previously established LIRD techniques. Furthermore, this protocol can be extended for use in pigmented animals, which eliminates the need to maintain transgenic lines of interest on the albino background for LIRD studies.

Multiple light damage protocols have been described to damage photoreceptors and consequently induce a retinal regeneration response in adult zebrafish. This protocol describes an improved method that can be used in pigmented animals and that damages the vast majority of rod and cone photoreceptors across the entire retina.

大人のゼブラフィッシュにおける網膜再生研究で使用するための新規な光ダメージパラダイム

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

共焦点肉眼検査を使用した生後小脳顆粒細胞の移動のex vivoイメージング

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

脳スライスにおける恐怖回路のex vivo光遺伝学解剖

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

光干渉断層計: マウス網膜神経節細胞In Vivoイメージング

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

成人小脳スライスにおける長期うつ病誘導の評価

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon guidance, has not been fully elucidated. This is partly due to technical limitations of traditional axon guidance assays. To identify additional axon guidance cues influencing the oculomotor nerve, an ex vivo slice assay to image the oculomotor nerve in real-time as it grows towards the eye was developed. E10.5 IslMN-GFP embryos are used to generate ex vivo slices by embedding them in agarose, slicing on a vibratome, then growing them in a microscope stage-top incubator with time-lapse photomicroscopy for 24-72 h. Control slices recapitulate the in vivo timing of outgrowth of axons from the nucleus to the orbit. Small molecule inhibitors or recombinant proteins can be added to the culture media to assess the role of different axon guidance pathways. This method has the advantages of maintaining more of the local microenvironment through which axons traverse, not axotomizing the growing axons, and assessing the axons at multiple points along their trajectory. It can also identify effects on specific subsets of axons. For example, inhibition of CXCR4 causes axons still within the midbrain to grow dorsally rather than ventrally, but axons that have already exited ventrally are not affected.

An ex vivo slice assay allows oculomotor nerve outgrowth to be imaged in real time. Slices are generated by embedding E10.5 IslMN:GFP embryos in agarose, slicing on a vibratome, and growing in a stage-top incubator. The role of axon guidance pathways is assessed by adding inhibitors to the culture media.

オキュロ運動神経増殖のタイムラプスイメージングのための胚性GFP発現マウスからのEx Vivo Oculomotorスライス培養

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.

成虫マウスおよび老化マウスからの海馬スライスにおける低酸素症の最小化

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

行動と刺激反応の間に全脳イメージングのための成人ショ ウジョウバエメラノガスター を準備する

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular characterization. Fluorescence-activated nuclei sorting (FANS) can be used to successfully isolate and study human neuronal nuclei (NeuN+) populations from frozen archival tissue, thereby avoiding problems associated with handling&#160;fresh tissue. However, efforts to similarly isolate astroglia from the non-neuronal (NeuN-) element are lacking. A recently developed and validated immunotagging strategy uses three transcription factor antibodies to simultaneously isolate enriched neuronal (NeuN+), astrocyte (paired box protein 6 (PAX6)+NeuN-), and oligodendrocyte progenitor (OLIG2+NeuN-) nuclei populations from non-diseased, fresh (unfixed) snap-frozen&#160;postmortem human temporal neocortex tissue.
This technique was shown to be useful for the characterization of cell type-specific transcriptome alterations in primary pathological epilepsy neocortex. Transcriptomic analyses confirmed that PAX6+NeuN- sorted populations are robustly enriched for pan-astrocyte markers and capture astrocytes in both resting and reactive conditions. This paper describes the FANS methodology for the isolation of astrocyte-enriched nuclei populations from fresh-frozen human cortex, including tissue dissociation into single-nucleus (sn) suspension; immunotagging of nuclei with anti-NeuN and anti-PAX6 fluorescently conjugated antibodies; FANS gating strategies and quality control metrics for optimizing sensitivity and specificity during sorting and for confirming astrocyte enrichment; and recommended procurement for downstream transcriptome and chromatin accessibility sequencing at bulk or sn resolution. This protocol is applicable for non-necrotic, fresh-frozen, human cortical specimens with various pathologies and recommended postmortem tissue collection within 24 h.

We have developed a method that enriches for and isolates human astrocyte populations from fresh-frozen tissue for use in downstream molecular analyses.

Ex Vivoイメージング実験アダルト ゼブラフィッシュから準備新鮮な網膜スライス

Ex Vivoイメージング実験アダルトゼブラフィッシュから準備新鮮な網膜スライス