We thank Cora H&#252;bner and Andrea Gall for help in acquiring some of the representative results. This work was supported by the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) at the University of Tuebingen, an Excellence Initiative funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the framework of the Excellence Initiative (EXC 307), and by funds from the Charitable Hertie Foundation.

倫理文は：すべての実験手順は、研究における動物の使用に関するEU指令に従ったと地元の動物実験委員会によって承認された（Regierungspräsidiumチュービンゲン、バーデン・ヴュルテンベルク州、ドイツの状態）テュービンゲン大学の責任。 1.定位注入手順<ol><li>滅菌器を使用して滅菌ツール（はさみ、メス、クランプ、ドリル、針、縫合糸材料）を準備します。例えば滅菌外科用ドレープ上の滅菌綿スワップ、消毒、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4）で、およびH 2 O 2のような滅菌ツールや他の必要なソリューションや手術用品を配置します。 </li><li>製造元の指示に従って水平微小電極プラー上に幅3mmのボックスのフィラメントを使用して、注射剤（ 図1A、挿入図）用ガラスマイクロピペットを引き出します。 注：深い注射のために、電極のテーパーが十分でなければなりません腹最も座標に到達するのに長い（約5ミリメートル;座標のため、1.10を参照してください）​​。 </li><li>プレミックスウイルス溶液1μl及び滅菌PBS中の0.1％ファーストグリーン液0.2μlの（ガラスピペット内の溶液の優れた視認性のため）。先端の細い（ 図1A、挿入図）とマイクロリットルピペットを使用してウイルス液と高速グリーンの混合物とガラスピペットを埋めます。 注：組換えアデノ随伴ウイルスベクター（rAAVの）と協力はバイオセーフティーレベル1（BSL 1）仕事と考えられ、BSL 1実験室で実施する必要があります。この研究（ 図1C）で使用rAAVsは以下の通りであった：1）のmPFC：のrAAV-HSYN-のChR2（H134R）-eYFP（血清型2/9）16。 2）MGM / PIN：のrAAV-CAGh-のChR2（H134R）-mCherry（血清型2/9）23。 3）mpITC / BLA：のrAAV-EF1A-DIOhChR2（H134R）-YFP（血清型2/1）23 </li><li>小動物麻酔機（：誘導のための酸素中3％イソフルラン）を使用して、マウスを麻酔。 注：この研究で使用したマウスは4でした -7週齢と以下の株と遺伝子型の：のC57Bl6 / J野生型（ 図2Aと3A-Dでの実験）。 GAD67-GFP 24（ 図2Bおよび3E-Hでの実験）。 TAC2-Creを25（ 図2Cおよび3I-Jでの実験）。 </li><li>耳と目の間に頭を剃ります。綿棒を使って剃った頭に消毒剤（ベース - イオジン）を適用します。 </li><li>麻酔中に目の乾燥を防ぐために、眼軟膏を適用します。皮下鎮痛剤（メロキシカムベースの5mg / mlの溶液0.1 ml）でマウスを注入します。 </li><li> （：保守のための酸素中2％イソフルラン）定位フレーム（ 図1A）でマウスを置き、ガス麻酔のマスクを介して麻酔を維持します。続行する前に肢引っ込め反射を使用して麻酔深度を確認してください。 注：全体の外科手術中に無菌状態並びに可能を維持します。使い捨てフェイスマスクを着用し、手術用外出WN、および手袋。 </li><li>はさみを使って頭の上に皮膚切開を行います。優しく、鈍鉗子を使用して、側に皮膚を引っ張って頭蓋骨の表面を露出するようにクランプで固定し、そしてH 2 O 2とクリーン頭蓋骨。 </li><li> （ 図1B）両半球のための先端の細い油性マーカーとドリル穴を使用して頭蓋骨上のマーク注射部位。 （ブレグマ（ミリメートル）から）この研究での注射のためにされている座標：のmPFC：0.3±横前方1.9、腹2.1。 MGM / PIN：1.8±横、3.0事後、腹側3.8。 mpITC / BLA：3.35、および4.75腹±横、1.45後部。 </li><li>圧力噴射装置に接続された定位フレーム上に充填されたガラスピペットをマウントし、ブレグマの位置にピペットをもたらします。 </li><li>ファインストレートチップピンセットを用いてガラスピペットの先端を折り。ウイルス溶液のエアロゾル発生を防止するために静かにこれを行います。いくつかの圧力パルスを印加し、ヴィルの液滴の押し出しを観察することにより、ピペットチップが開いていることを確認しますsのソリューション。 </li><li>目標噴射座標に移動し、圧力噴射装置で次の設定を使用してピペットコンテンツ（〜0.5マイクロリットル）の半分を注入：圧力：20 psiで、平均パルス長さ：30ミリ秒、パルスの平均数：50。 </li><li>それを後退ゆっくり（1ミリメートル/分）の前〜1分間の場所にピペットを残します。 注：必ずピペットは、他の半球で同じピペットで手順を繰り返す前にブロックされていないことを確認します。ブロックされたチップの場合には、クリーンまたは再びブレグマで先端とゼロピペット位置を断ちます。 </li><li> PBS（pH7.4）でクリーン頭蓋骨、一緒に皮膚を引っ張って、個々のボタンの縫合糸で切開部を縫合優しく、クランプを取り外します（3から4ノット）。傷の周りに消毒剤（ベース - イオジン）を適用します。 </li><li>麻酔を停止し、それが完全に目を覚ましになるまで無人マウスを放置しないでください。単一収容さを維持するか、完全に回復するだけで他の動物の会社に戻ります。術後、健康状態を監視し続ける、とadminisター鎮痛剤必要に応じて。地元の動物実験委員会が提案したルールに従って手順に従ってください。 </li></ol>急性スライスの調製<ol><li> ACSF、切削液、ツール（はさみ、メス、鉗子、へら、パスツールピペット）、および寒天ブロックを準備します。 注：人工脳脊髄液（ACSF）の1 Lは、実験ごとに必要であり、以前に公表16,23のように二重蒸留H 2 O中の化学物質を溶解することにより調製されます。切断溶液を2 M 硫酸マグネシウムストック溶液0.87 mlをACSF 200mlのを補充することによって調製されます。 </li><li>含酸素ACSFおよび95％O 2および5％CO 2を用いて実験を通して溶液を切断します。 </li><li>深くイソフルラン（酸素中3％）を使用して、小動物麻酔機を用いてマウスを麻酔。続行する前に肢引っ込め反射を使用して麻酔深度を確認してください。 </li><li>大きなハサミを用いてマウスを刎ねると、すぐに冷やします氷のように冷たい切削液中のヘッド。 </li><li>吻側に尾からの単一の正中切開によるオープン頭蓋骨と優しく鉗子を使用して、側面に頭蓋骨の部分を押してください。急速にそっと小さな丸いスパチュラを用いて頭蓋骨からそれを持ち上げることにより、脳を削除します。メスで小脳をカット。氷のように冷たい切削液に脳を置きます。 </li><li> mPFCの注射部位の場合：（のmPFC含む）メスを用いて脳の前部を切断し、スライスまで氷冷切断溶液に入れました。 </li><li>濾紙で余分な切削液を削除し、ビブラトームステージに脳の後部を接着。 </li><li>傾斜扁桃体スライスについては、35°の角度（ 図1D、中央）で切断寒天ブロック（4％）に脳を接着。冠状扁桃体スライス、MGM / PINの注射部位とのmPFCの注射部位については、ステージ上で直接脳を接着（ 図1D、左、右）。スライスしながら、安定性のための脳の後ろに追加寒天ブロックを配置します。 </li><li> Plac冷却ユニットを用いて4℃に維持する氷冷酸素切削液でチャンバー切削Eステージ。サファイアブレードを用いて扁桃体（320ミクロン）の急性スライスを準備します。室温で酸素ACSFに付属のインターフェースチャンバー内のスライスを配置します。 </li><li> 45分 - 急性扁桃体スライスの調製後、35スライスを回復するために、36℃の水浴中でインターフェースチャンバーを配置。その後、RTにインターフェースチャンバーを返します。これらのスライスから記録するために、ステップ3.2に進みます。 </li><li>急性扁桃体スライス（ - 2.9 2.8ステップ）のために、前述したようにステップ2.10の開始時には、注射部位のスライスをカット。水浴内のスライスの回復は、ここで必要とされていません。オプション：すぐに蛍光灯や適切なフィルターセットを搭載したステレオスコープ上のスライスを観察し、注射部位の位置を推定するために。 </li><li> 2濾紙とsubmer間を挟んで事後分析のための注射部位を含むスライスを修正しました。PBS溶液をO / Nで4％パラホルムアルデヒド（PFA）でそれらを銀杏。注射部位の分析のためのステップ4.1に進みます。 </li></ol>シナプス前繊維の3可視化と刺激<ol><li>繊維と細胞の光遺伝学活性化のためのパッチ顕微鏡を準備します。 <ol><li>光伝送路に取り付けられた発光ダイオード（LED）を中心。 </li><li>後焦点面でのLEDの光強度を測定し、470nmでの適切な波長を選択するパワーメータとの各目的の出力で。 </li><li>ミリワット/ mm 2での光強度を計算し、470 nmの波長の測定値のための各目的のための（光出力（ミリワット/ mm 2）と対LEDの輝度（％））の検量線を作成します。 </li></ol></li><li>蛍光ランプを備えた正立顕微鏡に装着スライスチャンバー内のインターフェース室と場所から急性扁桃体スライスを取得します。このようなSLICそのスライスを配置するように注意してくださいインターフェースチャンバーに上向きE面は、記録チャンバー内に上向きに向いています。 〜31℃の温度で2 ml /分 - 1の割合で新鮮な、酸素ASCFでスライスを灌流。 </li><li>発現される特異的蛍光タンパク質のための適切なフィルターセットとの組み合わせで蛍光灯を使用して、スライス内のシナプス前線維を観察します。概要（ 図1E）を得るために5倍対物レンズを使用し、対象領域内の繊維密度の評価のために60倍対物レンズ。 注：GFPとYFPの場合、使用フィルターセット「グリーン」（励起20分の472、ビームスプリッタ495、放射490 LP）mCherryをするために指定されているフィルタセット「赤」（励起40分の560、ビームスプリッタ585、放射70分の630）を使用します材料/機器テーブルインチ</li><li>開くか実験（ 図2D）のために所望のように顕微鏡光路の開口を制限します。 </li><li>パッチ記録を入手するには、内部溶液でパッチピペットを記入し、私はマウントn電極ホルダー。パッチピペットに正の圧力を適用し、ゆっくりとマイクロマニピュレーターを用いて、スライスに視覚的な制御の下で最初に浴溶液にした後、それを下げます。 <ol><li>サイドとトップからパッチピペットを用いて、関心のニューロンに近づきます。ピペットは、細胞の表面上にあるときに正の圧力を解放し（細胞表面上に目に見えるディンプル）と、負圧を適用することによって、「ギガシール」を得ます。 </li><li>全細胞記録を得るために、膜パッチを破壊するために、さらに吸引を適用します。続いて、細胞からの電気的応答を記録しながらCHR（470 nm）を活性化するための適切な波長を使用して接続したLEDとラベルされた繊維を刺激します。 </li><li>シナプス刺激のために、低いLED強度で開始し、所望のシナプス電流振幅に達するまで増加します。 図中の（タイミングやパルス長さを制御するためのデータ取得ソフトウェアでデジタル出力を設定することで、LEDの例をトリガー3）。 注：他のソフトウェア及び/又はTTL発生装置は、LEDをトリガするために使用することができます。 </li></ol></li><li>次に記録セルのためおよび/または特定の薬物の存在下で所望のように顕微鏡光経路におけるオープンまたは制限された開口部（ステップ3.4）で繰り返し刺激。 </li><li>記録した後、2枚の濾紙の間でそれらを挟んで、4％PFA O / Nでそれらを沈めることによって事後分析のためのスライスを修正します。 </li><li>電気生理学的データを分析します。 注意：使用して、適切なソフトウェアは、個々の刺激をオフライン用に記録されたスイープデータを視覚化します。薬物の効果を分析する場合、すべての個々のスイープのためのシナプス電流振幅に対する薬物効果の時間経過を得るために、ピーク検出ルーチンを使用します。薬剤効果が定常状態に達したときに決定します。実験条件ごとの平均≥10個々のスイープにソフトウェアを使用し、数値のための代表的な平均応答を準備する（CF 図3B-D、FH、J右パネル）。 注：いくつかの代替のソフトウェアパッケージは、データ分析のために使用することができます。 </li></ol> 4.注射部位の事後分析<ol><li> （再イメージングは​​、ステップ3.7から、所望される場合）PBS中で3回の部位を記録する（ステップ2.12から）注射部位のスライスを洗ってください。これは、繰り返し10分間回転シェーカー上に新鮮なPBSで3回溶液を交換することによって行われます。 </li><li> PBS中の2％寒天溶液を調製し、そしてそれは〜65℃に冷却しましょう​​。小さな直径30mmのペトリ皿の底に平らな場所スライスは、寒天内のスライスを埋め込み、それが固体になるまで冷却しましょう​​。 </li><li>ビブラトームのステージに埋め込まれたスライスまたはスライスと寒天ブロックを接着し、PBSでチャンバーを切断内のステージを配置します。 </li><li>切除70μmの厚さにスライスを埋め込まれました。オプション：切除した後、切片を細胞構築（ 図3A、C）、および/ ​​またはBを明らかにするNeurotraceと、 すなわち 、染色することができますYFPまたはmCherryをするためのyの免疫蛍光染色は、CHR融合タンパク質からの信号をブーストします。 </li><li>取り付けメディアとスライドとカバースリップ上のマウントスライス。画像注射部位と、所望であれば、蛍光顕微鏡または共焦点レーザー走査顕微鏡（ 図2A-C）を用いて、投影領域内の繊維を含む、画像スライス。 </li></ol>

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	<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li><li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Huang, Z. J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+approaches+to+neural+circuits+in+the+mouse.">Genetic approaches to neural circuits in the mouse.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 183-215 (2013).</li><li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emotion+circuits+in+the+brain.">Emotion circuits in the brain.</a> Annu Rev Neurosci. 23, 155-184 (2000).</li><li>Pape, H. C., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastic+synaptic+networks+of+the+amygdala+for+the+acquisition,+expression,+and+extinction+of+conditioned+fear.">Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear.</a> Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).</li><li>Myers, K. M., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+fear+extinction.">Mechanisms of fear extinction.</a> Mol Psychiatry. 12 (2), 120-150 (2007).</li><li>Quirk, G. J., Mueller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+mechanisms+of+extinction+learning+and+retrieval.">Neural mechanisms of extinction learning and retrieval.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (1), 56-72 (2008).</li><li>Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstimulation+reveals+opposing+influences+of+prelimbic+and+infralimbic+cortex+on+the+expression+of+conditioned+fear.">Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear.</a> Learn Mem. 13 (6), 728-733 (2006).</li><li>Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., Quirk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociable+roles+of+prelimbic+and+infralimbic+cortices,+ventral+hippocampus,+and+basolateral+amygdala+in+the+expression+and+extinction+of+conditioned+fear.">Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (2), 529-538 (2011).</li><li>Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+encoding+of+fear+extinction+in+mPFC-amygdala+circuits.">Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits.</a> Neuron. 80 (6), 1491-1507 (2013).</li><li>Arruda-Carvalho, M., Clem, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-Selective+Adjustment+of+Prefrontal-Amygdala+Transmission+during+Fear+Encoding.">Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding.</a> J Neurosci. 34 (47), 15601-15609 (2014).</li><li>Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+dissection+of+optogenetically+activated+mPFC+and+hippocampal+inputs+to+neurons+in+the+basolateral+amygdala:+implications+for+fear+and+emotional+memory.">Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory.</a> Front Behav Neurosci. 8, 64 (2014).</li><li>Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., Sah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+and+Auditory+Input+to+Intercalated+Neurons+of+the+Amygdala.">Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala.</a> Cell Rep. 10 (9), 1435-1442 (2015).</li><li>Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+potentiation+in+the+amygdala:+a+cellular+mechanism+of+fear+learning.">Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning.</a> Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).</li><li>Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., Luthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amygdala+inhibitory+circuits+and+the+control+of+fear+memory.">Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory.</a> Neuron. 62 (6), 757-771 (2009).</li><li>Millhouse, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intercalated+cells+of+the+amygdala.">The intercalated cells of the amygdala.</a> J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).</li><li>Busti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+fear+states+engage+distinct+networks+within+the+intercalated+cell+clusters+of+the+amygdala.">Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala.</a> J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).</li><li>Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., Perez de la Mora, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intercalated+paracapsular+islands+as+a+module+for+integration+of+signals+regulating+anxiety+in+the+amygdala.">The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala.</a> Brain Res. 1476, 211-234 (2012).</li><li>Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+inputs+to+intercalated+cells+provide+fear-learning+modulated+inhibition+to+the+basolateral+amygdala.">Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala.</a> Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).</li><li>Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+expression+and+colocalization+with+calretinin,+parvalbumin,+and+somatostatin+in+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse.">Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse.</a> J Comp Neurol. 467 (1), 60-79 (2003).</li><li>Mar, L., Yang, F. C., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+marking+and+characterization+of+Tac2-expressing+neurons+in+the+central+and+peripheral+nervous+system.">Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system.</a> Mol Brain. 5, (2012).</li><li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission.">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> J Neurosci. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li><li>Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+modification+of+a+central+amygdala+fear+circuit.">Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit.</a> Nat Neurosci. 16 (3), 332-339 (2013).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).</li><li>Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLA+to+vHPC+inputs+modulate+anxiety-related+behaviors.">BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors.</a> Neuron. 79 (4), 658-664 (2013).</li><li>Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-specific+suppression+of+GABA+release+from+parvalbumin+interneurons+in+the+basolateral+amygdala+by+dopamine.">Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine.</a> J Neurosci. 32 (42), 14815-14820 (2012).</li><li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel.">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li><li>Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+and+behavioral+profile+of+multiple+glutamatergic+inputs+to+the+nucleus+accumbens.">Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens.</a> Neuron. 76 (4), 790-803 (2012).</li><li>Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity.">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).</li><li>Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+suppression+of+plasticity+in+amygdala+inputs+from+temporal+association+cortex+by+the+external+capsule.">Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule.</a> J Neurosci. 31 (1), 339-345 (2011).</li><li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nat Rev Neurosci. 4 (5), 353-364 (2003).</li><li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transduction+efficiency,+tropism+and+axonal+transport+of+AAV+serotypes+1,+2,+5,+6,+8,+and+9+in+the+mouse+brain.">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain.</a> PLoS One. 8 (9), (2013).</li><li>Salegio, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+adeno-associated+viral+vectors+is+serotype-dependent.">Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent.</a> Gene Ther. 20 (3), 348-352 (2013).</li><li>Holehonnur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+serotypes+produce+differing+titers+and+differentially+transduce+neurons+within+the+rat+basal+and+lateral+amygdala.">Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala.</a> BMC Neurosci. 15, (2014).</li><li>McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+transduction+efficiency+of+recombinant+AAV+serotypes+1,+2,+5,+and+8+in+the+rat+nigrostriatal+system.">Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system.</a> J Neurochem. 109 (3), 838-845 (2009).</li><li>Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+channelrhodopsin-2+(ChR2)+expression+can+induce+abnormal+axonal+morphology+and+targeting+in+cerebral+cortex.">Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex.</a> Front Neural Circuits. 7, (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

このプロトコルは、すべてではない簡単に、最も上に実装することができ、神経回路やローカル接続のex vivo光遺伝学調査のための方法を説明し、落射蛍光光ポートのLED〜470 nmのとそれらを装備することにより、直立スライスパッチクランプ記録のセットアップ。スライスにおける軸索突起の光遺伝学刺激の主な利点は、対応する線維路が明確に定義されていない、またはに保存されない、知られていなかったので、それは、特定の活性化と、従来の電気刺激とアクセスできませんでした接続の特性の調査を可能にすることです単一の脳切片。恐怖回路に関連する重要な一例として、扁桃体へのmPFC入力の特性を分析するために適用することができる方法を例示します。 電気的な線維トラクト刺激が広く、過去の研究に使用されている場合であっても、これらの管は、多くの場合、起源の異なる領域からの繊維を運びます。例えば、学習を恐れるように関連する回路には、視床核や皮質領域の異なる感覚からの突起がそれぞれ、内部および外部のカプセルを通じて混在して実行します。光遺伝学刺激の利点は、それが定義された領域からの繊維のサブセットの選択的活性化を可能にすることです。これは、インターカレートされた細胞と横扁桃体の主要な細胞へのPINとMGMからの特定の視床入力のために示されています。また、電気刺激、 すなわち 、標的領域内のローカル接続を行うことができる刺激電極の近傍内の通路またはセルの他の繊維の活性化に起因する問題を克服することができます。光遺伝学刺激は、電気刺激と同等に迅速であるが、確実に適用することができる刺激周波数に関する制限があってもよいです。これは、不活性化およびdeinactivation動力学にと使用されているCHRの変形に依存4と同様にexpression個のレベルや方法、および光刺激法26。 光刺激用の蛍光ポートに取り付けられたLEDを使用する場合、典型的には、与えられた対物レンズの視野全体は、フィールドおよび特定の深さ内のすべての繊維または細胞の活性化をもたらす、照明されます。これは、部分的にのみ小さな領域に限定または標識された細胞を設定することができる（この例では、mpITC）蛍光路23,27の開口を使用して。ハイパワー青色LEDは、現在、多くの製造業者から入手可能であるようにLEDを、光パワーは、問題ではありません。しかしながら、発光スペクトルは、数十ナノメートルの全幅半最大値を有します。接続および/または単色刺激の細胞内マッピングのための空間的に正確な刺激のいずれかが必要なときにそのため、LEDは、制限を課します。両方は、典型的には、タールを有効に、より洗練されたセットアップと組み合わせて、光源として青色レーザを使用することによって改善することができますgetingおよび/ ​​または小領域におけるビームの走査と定義された組織の深さ（ 例えば 、28を参照してください）。 エクスビボ光遺伝学アプローチは、ここで説明すると、シナプス伝達のいくつかの特性を研究することができます。初期のシナプス応答成分、待ち時間の徹底的な分析とそのジッタのmonosynapticityだけでなく、応答振幅の分散を評価するために記録したニューロン（ 例えば 、16,17,23を参照のこと ）の代表的なサンプルで使用する必要があります。ネットワーク活動の活性化が役割を果たし得る場合には、選択の方法は、（K +チャネルブロッカー4-アミノピリジンと組み合わせて活動電位を遮断するためのテトロドトキシン（TTX）の組み合わせを適用することによって直接単シナプスの成分を分離するために4- AP）は、再分極14,28,29を防止します。入力のモノとdisynapticコンポーネントを媒介する受容体は、薬理学的遮断薬を用いて同定することができます。 FurthermorEは、扁桃体23,30にoptogenetically活性化入力のシナプス前調節の側面を研究することが可能です。潜在的な注意点はにChR2は、いくつかのカルシウム透過性1,4を有しており、シナプス前繊維と端末におけるその活性化は、様々な機構26,31によって放出確率を変更することが提案されていることです。それにもかかわらず、実施例を含め、いくつかの研究では、就業のChR2発現インプット識別し、扁桃体や他の脳領域16,23,26,32における対になったパルス比で細胞特異的な違いをターゲットに成功し、ここで示されており、さらに活性化によって放出確率の変調を実証しましたCHR活性化23,30によって排除されなかったシナプス前終末における特定のシグナル伝達経路の。さらにサポートが適切なCHRの表現方法と光刺激法でいることを示す海馬および小脳内のデータ、リリースの有効性と忠実度oを含む生理的な側面から来ていますFシナプス伝達は確実に26を研究することができます。最後に、光遺伝学繊維の活性化は、正常なシナプス可塑性31,33,34を誘導する刺激プロトコルを適用するために使用されています。 いくつかの態様は、この方法の成功のために重要です。一つは、ウイルスベクターの定位ターゲティングの精度です。したがって、迅速に記録を取得する前に注射部位の位置を評価し、次に、より詳細な事後分析を実行するために有用です。空間的な精度に加えて、注射部位でのニューロンの生存性は、成功した実験の主要な決定因子であり、注入法に依存します。長くて細いテーパ状のガラス電極を使用して提示オプションは、表在性とより深い脳領域の両方のためにも、この目的を果たしますが、テーパーが非常に柔軟であるという欠点を有していてもよいです。代替案は、特に神経科学（神経s内の定位送達のために開発されたマイクロリットルの注射器を使用することですyringes）小さな体積を分配することができ、より剛性の針を持ちます。扁桃体インターカレー細胞について示されているように定義された細胞型と地域にCHR発現を標的とする特異性をさらにCreをシステムで、例えば、条件式7を使用して向上させることができます。これはまた、Cre依存ウイルスベクターでの強力なプロモーターを使用することができます。 もう一つの重要な側面は、ウイルスベクターの選択です。 CHRを発現させるために、組換えアデノ随伴ウイルス（rAAVs）は、他の人気のあるウイルス系に比べてバイオセーフティーレベル1のベクトルであることの利点を持っているものを用いました。 rAAVsはいくつかの時間のために使用されており、良好な神経向性とほとんど、あるいは全く免疫原性と安全性と信頼性ベクターは、一般的であるが、それらの包装ボリュームが（約4〜5 KB）35制限されています。これらの特定の実験では、血清型2/9及び2/1は、それぞれ、ユビキタスかつ条件式に使用しました。文献によれば、SEの血清型は、標的領域内の細胞を形質導入するが、血清型2/5及び2/6 36,37とは異なり、標識細胞を逆行する軸索によって取り込まれないように見えます。しかし、最初の実験では、このようなのmPFCや扁桃体などの相互に接続された脳の領域を研究する際に特に重要である注射部位に突出した領域におけるCHR標識細胞体が存在することを除外してください。いくつかの最近の研究は、ラットおよびマウス36,38,39中の異なる脳領域でのrAAV血清型の有効性を比較しました。新興テーマは新しい血清型（ 例えば 、2/1、2/8と2/9）は、一般的に、元の2/2の血清型よりも効率的であるということです。またノートの、CHRののrAAV媒介発現は、他の方法とは対照的に、細胞または標識軸索40を表現するに有害な影響を引き起こしませんでした。 ex vivoで有効繊維の活性化を達成するために必要な発現時間を研究突起の距離に依存するように思われます。こことライトと一致してマウス（のmPFCと感覚入力）での長距離接続の標識及び活性化のためrature、4の発現時間 - 8週間が必要とされ、扁桃体でのローカル接続性を研究するために、2の短い発現時間に対し - 3週間がされています14-17,23,30,34十分。 対象地域のoptogenetically誘発応答の記録のために、2つの要因が重要である：1）急性脳スライスは良い品質と2）実行可能なラベルされた繊維のかなりの量を保存する必要があることが必要です。スライスの品質をスライスするためのサファイアブレードを使用することによって改善することができます。光反応の軸索の維持、従って、大きさ及び安定性のmPFC-扁桃体突起（ 図1Dおよび図2A）16,34のために示されているように一定の角度でスライスを切断することによって改善することができます。しかし、これは、強く、標的領域内の求心性神経の方向に依存し、投影領域およびTAの各組み合わせについて決定されなければなりません目標確認地域。この点において、標的領域における凸部の事後分析が有用であることができます。繊維の検出を強化し、スライス刺激中に発生した漂白を回避するために、CHR融合タンパク質に蛍光タグに対する免疫染色を用いることができます。 全体的に、光遺伝学回路マッピングのこの方法は、最近だけで脳内の回路が、他の多くのシステムを恐れるように適用されていません。将来的には、遺伝的に改変されたマウス系統および条件付きウイルスベクターの増加配列を組み合わせることによりsubnuclei、特定の細胞型の標的化は、特定のローカル及び長距離回路の機能的シナプスの性質の多様性のより一層詳細な理解を提供するであろう。また、調査し、機能の接続における蛍光タグ付きCHRの事後免疫標識は、超微細構造解析と組み合わせることができる（ すなわち 、電子顕微鏡法を使用して）正確なMORへの洞察を提供するために、以前に有効にシナプスのphological特性。

可視化および脳領域および神経細胞の特定のタイプとの間の特定の接続の同時活性化のための正確なツールは、健康な脳機能及び疾患状態の根底にある機能的接続性を理解する上でより重要になってきています。理想的には、これは、ニューロンが通信識別される正確なシナプス特性の生理学的な調査を必要とします。これは、単一の急性脳スライスに保存することができない脳の領域間の接続に特に当てはまります。過去において、これは、主に別の実験で達成されました。一方、 生体内で注入された神経トレーサーは、後続の光や前およびシナプス後パートナーの電子顕微鏡分析と組み合わせて使用されてきました。原点の領域からの線維トラクトがスライス標本に保存し、アクセスされたとき一方、電気刺激は、標的領域内の細胞とシナプス通信メカニズムを評価するために使用されています。 彼らの可視化を可能にし、事後解剖学的分析の1-ながら、光遺伝学の出現により、蛍光タンパク質に融合したようなChannelrhodopsins（CHRS）などの光依存性陽イオンチャネルの標的発現は、今ニューロンとその軸索軌道の活性化を可能にします4。線維路が分離または特定の軌道ではないので、1）従来の電気刺激によるアクセスできませんでした脳領域からの入力を評価：親細胞体5から切断場合でもCHRを発現する軸索は刺激することができるので、それはに脳スライスで可能です不明です。 2）明確に想定するが完全には理解された特定の入力の出身地域を特定します。そして、3）の両方のローカルおよび長距離の突起で、定義された細胞型の間の機能の接続性を調べます。そのため、多くの利点を、脳スライス内の回路のこの光遺伝学マッピングは、ワイドになっていますlyが最後の年で使用され、蛍光タグ付きCHRSの発現のための種々のウイルスベクターは、商業的な供給業者から容易に入手可能です。電気刺激はまた、通路または他の近くの細胞、および均等に迅速かつ時間的に正確な刺激の繊維を募集する可能性があるため、従来の電気刺激を超える光遺伝学活性化のいくつかの重要な利点は、刺激電極の配置、繊維の刺激の特異性に起因する組織への損傷はありません。さらに、ウイルスベクターの定位注射を容易Cre依存の発現および/ ​​または特異的プロモーター7を用いて達成することができる特定の脳領域6及び条件または細胞型特異的発現を標的とすることができます。ここでは、この技術は、恐怖システムにおける長距離のマッピングとローカル回路に印加されます。 扁桃体は恐怖と感情的な思い出8,9の取得と恐怖の表情、およびストレージのための重要な領域です。別にあちこち扁桃体、内側前頭前皮質（のmPFC）および海馬（HC）のmは、相互に扁桃体に接続されている構造は、恐怖や絶滅思い出10,11の買収、統合と検索の側面に関与しています。 mPFCの細分化における活性は12,13を述べてハイとローの両方の恐怖を制御する際に二重の役割を果たしていると思われます。これは、一部には扁桃体の活動と出力を制御することになる扁桃体へのmPFCからの直接接続によって媒介される可能性があります。そのため、最後の年に、いくつかの研究では、扁桃体14-17でのmPFCの求心性および特定の標的細胞間のシナプスの相互作用を調査するためにex vivoでスライス実験で始まりました。 恐怖学習中は、エアコンと無条件刺激についての感覚情報は、特定の視床と皮質領域からの突起を介して、扁桃体に到達します。 basolの側部（LA）内のニューロンへのこれらの入力の可塑性ateral扁桃体（BLA）が恐怖条件9,18の基礎となる重要なメカニズムです。増加する証拠は、扁桃体における並列プラスチックプロセスが恐怖記憶19を制御するための阻害要素を伴うことを示唆しています。クラスタ化された抑制性ニューロンのグループは、GABA作動性内側paracapsularインターカレーション細胞（mpITCs）であるが、その正確な接続性と機能が不完全20-22を理解されています。ここでは、光遺伝学の回路マッピングはmpITCsは視床と皮質中継局23からの直接の感覚入力を受け取ることを実証し、求心性および遠心性これらの細胞の接続と扁桃体における標的ニューロンへの影響を評価するために使用されます。 mpITCsまたはBLAニューロンにおけるCHRの特異的な発現を効果的BLAの活性を制御新規フィードフォワードとフィードバック抑制回路に置く、mpITCsを阻害することを明らかにし、局所的相互作用のマッピングを可能にするだけでなく、相互にBLA校長ニューロン、によって活性化されます23。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic frame</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>51670</td>
			<td rowspan="2">can be replaced by other stereotactic frame for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steretoxic frame mouse adaptor</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>51625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia mask for mice</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>50264</td>
			<td>no longer available, replaced by item no. 51609M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure injection device, Toohey Spritzer</td>
			<td>Toohey Company, USA</td>
			<td>T25-2-900</td>
			<td>other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik Fill glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments, Germany</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine, IsoFlo</td>
			<td>Eickemeyer, Germany</td>
			<td>213261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controler and heating pad</td>
			<td>FHC, USA</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal Micropipette Puller Model P-1000</td>
			<td>Sutter Instruments, USA</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75</td>
			<td>Melag, Germany</td>
			<td>08754200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)</td>
			<td>Penn Vector Core, USA</td>
			<td>AV-9-26973P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)&#160;</td>
			<td>Penn Vector Core, USA</td>
			<td>AV-9-20938M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)&#160;</td>
			<td>Penn Vector Core, USA</td>
			<td>AV-1-20298P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fast green</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>0301.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml)</td>
			<td>CP Pharma, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiseptic, Betadine (providone-iodine)</td>
			<td>Purdure Products, USA</td>
			<td>BSOL32</td>
			<td>can be replaced by other disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td>can be replaced by other analgesics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthen eye ointment</td>
			<td>Bayer, Germany</td>
			<td>0191</td>
			<td>can be replaced by other eye ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)</td>
			<td>Nouvag, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutranox Suture Needle</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>12050-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided Silk Suture</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>18020-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Recordings, light stimulation, and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>artificial cerebrospinal fluid (ACSF)</td>
			<td>for composition see references #16 and #23</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>internal patch solutions</td>
			<td>for composition see references #16 and #23</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagnesiumSulfate Heptahydrate</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>P027.1</td>
			<td>prepare 2M stock solution in purified water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicer, Microm HM650V</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>920120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling unit for tissue slicer, CU65</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>770180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire blade</td>
			<td>Delaware Diamond Knives</td>
			<td></td>
			<td>custom order, inquire with company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope, SZX2-RFA16</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492)</td>
			<td>Lumen Dynamics Group, Canada</td>
			<td>2012-12699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch microscope, BX51WI</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiclamp 700B patch amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitdata 1440A</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PClamp software, Version 10</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to control data acquisition and stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath temperature controler, TC05</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann, Germany</td>
			<td>200-100 500 0145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three axis micromanipulator Mini 25</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann, Germany</td>
			<td>210-100 000 0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator controller SM7</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann, Germany</td>
			<td>200-100 900 7311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass capillaries for patch pipettes</td>
			<td>World Precision Instruments, Germany</td>
			<td>GB150F-8P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber&#160;</td>
			<td>Satorius Stedim Biotech, Germany</td>
			<td>13006--50----ACN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED unit, CoolLED pE</td>
			<td>CoolLED, UK</td>
			<td>244-1400</td>
			<td rowspan="4">CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolLED 100 Dual Adapt</td>
			<td>CoolLED, UK</td>
			<td>pE-ADAPTOR-50E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED unit, USL 70/470</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td>L70-000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual port adapter</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td>inquire with company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set red (excitation)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F49-560</td>
			<td rowspan="3">Filters can be bought as set F46-008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (beamsplitter)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F48-585</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (emission)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F47-630</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set green (excitation)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F39-472</td>
			<td rowspan="3">Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (beamsplitter)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F43-495W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (emission)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F76-490</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaserCheck, handheld power meter</td>
			<td>Coherent, USA</td>
			<td><a>1098293</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgorPro Software, Version 6</td>
			<td>Wavemetrics, USA</td>
			<td></td>
			<td rowspan="2">for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuromatic suite of macros for IgorPro</td>
			<td><a href="http://www.neuromatic.thinkrandom.com/">http://www.neuromatic.thinkrandom.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Post hoc analysis of injections and projections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde powder (PFA)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>0335.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N-21479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar-agar for embedding and resectioning</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>5210.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 x 10 mm petri dishes for embedding</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>alternatives can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides, Super Frost</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>61303802</td>
			<td>alternatives can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover slips</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>3000302</td>
			<td>alternatives can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vecta Shield mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories, USA</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>alternative mounting media can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation</td>
			<td>Satorius Stedim Biotech, Germany</td>
			<td>11406--25------N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices

光遺伝学のアプローチは、現在広く光によって光活性化タンパク質と神経活動のその後の操作の標的発現を組み合わせることにより、神経集団や回路の機能を研究するために使用されています。 Channelrhodopsins（CHRS）は、光依存性カチオンチャネルであり、蛍光タンパク質に融合させたときに、それらの発現は、視覚化し、特定の細胞型の同時活性化と脳の定義された領域での軸索投射を可能にします。ウイルスベクターの定位注射によって、CHR融合タンパク質は、構成的にまたは条件規定された脳領域の特定の細胞で発現することができ、それらの軸索突起は、その後、脳切片におけるエクスビボ光遺伝学の活性化を介して、解剖学的及び機能的に研究することができます。従来の電気刺激の方法で対処することができなかった接続のシナプスの性質を理解することを目的とする場合に、または新規affeを識別する際に特に重要です以前に十分に理解された家賃と遠心性接続。ここでは、いくつかの例は、この技術が扁桃体に恐怖関連の回路の解明にこれらの質問を調査するために適用することができる方法を示しています。扁桃体は恐怖と感情的な思い出の取得と恐怖の表情、およびストレージのための重要な領域です。証拠の多くの行は、内側前頭前皮質（のmPFC）は恐怖の取得と絶滅のさまざまな側面に関与するが、扁桃体との正確な接続がちょうど理解され始めていることを示唆しています。まず、光遺伝学活性化は基底扁桃体（BLA）中のmPFCの求心性と標的細胞との間のシナプス伝達の側面を研究するために使用することができる方法をex vivoで示されています。また、このエクスビボ光遺伝学アプローチは、扁桃体においてGABA作動性ニューロンのグループを使用して新規の接続パターンを評価するために適用することができる方法を説明するが、一例としてparacapsularインターカレー細胞塊（mpITC）。

このセクションでは、ex vivo光遺伝学アプローチと感覚と調節長距離BLAとmpITCニューロンへの突出部だけでなく、mpITCとBLA間のローカル接続のプロパティの生理学的特性を調査するために、異なる実験戦略の代表的な結果のワークフローを示しています。 マウス脳への所望の座標に選択されるウイルスベクターの定位注射した後（ 図1A-C、ウイルス発現時間は2から6週間は、実験に応じて）、扁桃体における注射部位と投影領域の急性脳スライスが用意されていますパッチクランプ実験のために適切な角度で、注入部位（ 図1D）の事後分析のために注入された脳領域から。録音や光遺伝学の刺激を開始する前に、蛍光標識された細胞または軸索のプロターゲット領域（扁桃体）でjectionsが結合した蛍光ランプ（ 図1E）を使用して、パッチクランプ記録のための正立顕微鏡で確認する必要があります。時点、間隔、パルス長は、発光ダイオード（LED）をトリガパッチソフトウェアを介して制御しながらスライスの投影領域内の推定上の標的細胞からの記録パッチクランプを得ると、光刺激が開始されます。実験戦略に応じて（ 図2A-Cは 、右）蛍光灯路の開口部を全開または（ 図2D）に制限されますか。一定できるだけ短いパルス長（理想的に≤1ミリ秒）を維持しながら、LEDの出力強度は徐々に特定の実験（ 図2E）におけるシナプス応答の所望の振幅を達成するために必要とされる強度を評価するために増加されます。記録した後、扁桃体スライスは後固定されています。切除およびオプションの時に染色、注射および記録部位は、注入位置を確認し、見当違いの注射からデータを除外するために共焦点顕微鏡上に結像されています。注射部位の画像と3つの実験戦略のための扁桃体の関連する軸索突起部（BLAへのmPFC入力、mpITCsに視床入力、およびローカルmpITC活性化）は、 図 2A-Cに示されています。 図3（ 図3A、E、I）を使用し、異なる実験戦略のための光誘発反応の特性を示すBLA主要なニューロン、地元のBLAの介在ニューロンとmpITCニューロンから得られた代表的な記録結果を示しています。記録のためのGABA作動性ニューロン（ローカル介在ニューロンとmpITCs）を標的にするには、GAD67-GFPレポーターマウスは、24を使用しました。 mPFC感覚視床突起は、シナプス伝達のいくつかの側面を研究することができます。交流の時間精度tivati​​onと本研究で用いたCHRSの力学的特性は、50ミリ秒の間刺激間隔でパルス対を持つ信頼性の高い刺激を可能にします。これは、容易に又は押圧突起に応じて、細胞のタイプを標的とすることができるいずれかのシナプス後電流（のPSC）の対のパルス比（PPR）の分析を可能にし、シナプス前放出確率（ 図3B、F、H）の指標として機能します。さらに、シナプス待ち時間の分析は、異なるシナプス後応答コンポーネントの解剖を可能にします。 この例では、興奮PSC（EPSC）コンポーネントに対する阻害PSC（IPSC）の長い待ち時間は（ 図3C）は、それぞれ、disynapticと単シナプス入力を示しています。他の例では、このような応答のジッタまたは応答の大きさの変動係数などの追加EPSC特性のより完全な分析は、モノ - またはdisynaに関する結論を引き出すために必要とされてもよいですPTIC自然17,23。また、特定の受容体のための薬理学的遮断薬のアプリケーションはのPSCの性質を識別することができる（ すなわち 、グルタミン酸作動性EPSCとGABA作動性IPSC、 図3C-D）。予想されたように後半成分はGABA作動性であったのに対し、のmPFC入力の初期成分は、グルタミン酸作動しました。さらにグルタミン酸受容体遮断薬CNQXとEPSC及びIPSCの両方の完全なブロックがIPSCがdisynapticであることをサポートしています。 optogenetically活性化した繊維でシナプス伝達の変調を調査するために、振幅およびPPR上の代謝調節型受容体（ここではGABA B受容体）に対するアゴニストおよびアンタゴニストの効果は、前と後シナプス部位への影響を評価するために評価することができます。この例では、PPRの増加と振幅の同時減少は、光活性化繊維（3G、H）のシナプス前調節の指標です。最後に、扁桃体中の細胞の局所的相互作用を評価することができ、例えば、TAC2プロモーター25の制御下のCreを発現するマウスは、ウイルスベクターを発現ダブルフロックスCHR（ 図1C）を注射されたとき。 TAC2したがって、CHRはmpITCと中央扁桃体（ 図2C）で表現されているので、光活性化は、蛍光灯路開口（ 図2D）を閉じることによってmpITCに制限されていました。これらの条件下で、光誘発活動電位は、感染mpITCsにおいて誘発することができます。 BLAで短い待ち時間の抑制性シナプス応答がmpITCとBLA主要なニューロン間の機能の阻害の接続の存在を示します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53628/53628fig1.jpg" /> 図1.定位注射、急性脳スライスの作製、およびシナプス前繊維の可視化。（A、B）定位ウイルス注入。頭蓋骨と定位フレームに配置された、麻酔したマウスのA）画像が露出し、注入ピペット。挿入図：高速グリーンと混合ウイルス液で満たされた注入ピペットの絵でズーム。スケールバー：3ミリメートル。異なる注入領域のためのドリル穴のマーク付けされた位置でマウスの頭蓋骨の（B）の回路図。 （C）スキームは、本研究で使用した異なるウイルス構築物を示します。ダークグレー：プロモーター配列;青：Channelrhodopsin2（にChR2（H134R））;赤/緑：蛍光タンパク質。 mPFCとMGM / PINからの投影のための6週間 - 発現時間は、ローカルの扁桃体の凸部および4の2週間でした。 （D）急性脳切片の調製：スキーム異なる注入と投影領域からスライスを得るためのスライサーステージにマウス脳の配置を示します。 （E）MGM / PINでのChR2-mCherryをウイルスを注射したGAD67-GFPマウスから急性脳スライス中の繊維の可視化。写真は、異なるフィルタセットで直立パッチ顕微鏡で撮影されていますGAD67-GFP発現、ミドル。 MCに標識されたMGM / PIN繊維herry、右。スケールバー：200μmです。 mPFC、内側前頭前皮質; mpITC、内側paracapsularインターカレート細胞; BLA、基底外側扁桃体。 MGM、内側膝状核、内側部; PIN、視床核髄板内後部; LA、横扁桃体。 BA、基底扁桃体。 CEA、扁桃体の中心核が。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53628/53628fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53628/53628fig2.jpg" /> 図2. 注射部位、投影領域、および軸索投射の光遺伝学刺激。（AC）BLAにおける代表的な注射部位と投影領域の共焦点画像、及び実験戦略のスキーム。左（A）：Neurotraceで染色されたC57BL / 6マウスでのmPFCの注射部位。スケールバー：500ミクロン。ミドル：傾斜扁桃体スライスにBLAで突起部を対応します。スケールバー：200μmです。右：のmPFC突起とBLAにおけるニューロンの記録の全視野照明の模式図。左（B）：GAD67-GFPマウスのMGM / PINの注射部位。スケールバー：500μmで。ミドル：mpITCと冠状扁桃体スライスのLAでの対応の投影。スケールバー：200μmです。右：mpITCニューロンのMGM / PINの突起及び記録の全視野照明の模式図。 （C）左：TAC2-のCreマウスのNeurotrace染色扁桃体スライス内のChR2-YFPのローカル式。スケールバー：200μmです。挿入図：ズームにChR2-YFPを発現しているmpITCsのインチスケールバー：20μmです。右：BLAニューロンのmpITCクラスタと記録の制限された照明光の概略図。オープンで制限APERとGAD67-GFPマウスにおける急性脳スライスにおけるニューロンの光伝送および画像（mpITCクラスタ）中にチャンバを記録する（D）の写真チャー。スケールバー：30μmです。異なるLED強度（上）とMGM / PINからの繊維の光遺伝学活性化の際に代表mpITCニューロンから誘発EPSC振幅（下）対光パワーのプロットにより誘発される（E）興奮性シナプス後電流（EPSCs）。スケールバー：100 PA / 10ミリ秒。 図2Aは、参照番号23からの基準＃16および図2Cから変更されます注意してください。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53628/53628fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53628/53628fig3.jpg" /> 光遺伝学ロングレンジの活性化と地域突起から図3.代表的な結果。（BD）のための実験戦略の（A）スキーム。 （B）BLA主要なニューロンから記録された代表EPSCsとそれぞれ、対のパルスの円滑化と対になっパルスうつ病を誘発するのmPFCからの繊維の光遺伝学ペアのパルス刺激（50ミリ秒刺激間間隔）時のBLA介在ニューロン。スケールバー：100 PA / 25ミリ秒。 （C）のmPFCからの繊維の光遺伝学活性化は、フィードフォワード抑制を誘発します。左：代表（-70 mVの時）EPSCとBLAプリンシパルニューロンにおける抑制性シナプス後電流（0 mVのでIPSCを、）。 IPSCは、EPSCに比べ長いシナプス待ち時間を有します。スケールバー：200 PA / 10ミリ秒と200 PA / 2ミリ秒。右：光はさらにIPSCのdisynaptic性質をサポートする、AMPA /カイニン酸拮抗薬CNQX（10ミクロン）によってブロックされている（-50 mVの時）二相性EPSC / IPSCシーケンスを誘発しました。スケールバー：50 PA / 5ミリ秒。 （D）CLにより（-50 mVの時）EPSC / IPSCシーケンスの次のブロックの影響-チャネルブロッカーピクロトキシン（PTX、100μM）及びPTX + CNQX。 IPSCはPTXとCNQXによって残りのEPSCによってブロックされています。スケールバー：50 PA / 5ミリ秒。 （以下のための実験戦略のE）スキーム（FH）。 F）mpITCおよびMGM / PINからの繊維の光遺伝学ペアのパルス刺激によるBLA主要なニューロンから記録された代表的EPSCs。スケールバー：50 PA / 20ミリ秒。別のmpITCニューロンにおける（G）EPSCsは、それらがナトリウムチャネルの活性に依存していることを示す、ナトリウムチャネル遮断薬テトロドトキシン（TTX、0.5μM）によってブロックされます。スケールバー：50 PA / 20ミリ秒。 （H）mpITCニューロンへの視床入力はシナプス前の GABA B受容体によって調節されています。制御条件の下でEPSCs、GABA Bアゴニストバクロフェン（2μM）の適用時にペアリングパルス比のEPSC振幅と同時増加の減少、および両方の振幅の回復とのGABA Bアンタゴニスト CGP55845の同時適用時にペアリングパルス比を初期（10μM）。これらの変化は、GABA B受容体によるシナプス前調節の指標です。スケールバー：50 PA / 20ミリ秒。 （J）の実験戦略（I）スキーム。 ChR2-YFPを発現mpITCニューロンから記録（J）光誘発活動電位。異なる保持電位でBLAの主要なニューロンから記録された光誘発性IPSC（-90、-70、-50、-20、および0 mVの）のClのための計算された平衡電位の周りに逆- 。スケールバー：20 mVの/ 100ミリ秒と10 PA / 10ミリ秒。図3B-Dが基準＃23からリファレンス＃16、および図3H及びJから変更されます注意してください。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53628/53628fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

脳スライスにおける恐怖回路のex vivo光遺伝学解剖

光遺伝学アプローチは広く神経活動を操作し、脳機能の影響を評価するために使用されます。ここでは、この技術は、光活性化剤チャネルロドプシンのインビボでの発現の際に、恐怖に関連する回路内の特定の長距離およびローカル神経接続のシナプス特性のex vivo分析を可能にすることが概説されています。

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

ex-vivo-optogenetic-dissection-of-fear-circuits-in-brain-slices

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

15.8K ビュー.  University of Tuebingen. 光遺伝学アプローチは広く神経活動を操作し、脳機能の影響を評価するために使用されます。ここでは、この技術は、光活性化剤チャネルロドプシンのインビボでの発現の際に、恐怖に関連する回路内の特定の長距離およびローカル神経接続のシナプス特性のex vivo分析を可能にすることが概説されています。 

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Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

神経形態形成の研究のための方法：<em&gt;エキソビボ</em胎児マウス大脳皮質&gt; RNAiのエレクトロポレーション

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

神経科学

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

超音波血液脳関門の破壊とマンガン増強MRIを用いた脳機能イメージングの試み

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

脳スライスビオチン：<em&gt;生体外</emアダルトニューロンにおいて地域固有の細胞膜のタンパク質輸送を測定するために&gt;の取り組み

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

無傷の鋤鼻器官と副嗅球のex vivoでの準備

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

同時<em&gt; ex vivoで</emによる二つの網膜の&gt;機能テスト<em&gt; in vivoで</em&gt;電図システム

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding diseases, and future therapies hinge on fundamental understandings about how different retinal cells function normally. Gaining such information with biochemical methods has proven difficult because contributions of particular cell types are diminished in the retinal cell milieu. Live retinal imaging can provide a view of numerous biological processes on a subcellular level, thanks to a growing number of genetically encoded fluorescent biosensors. However, this technique has thus far been limited to tadpoles and zebrafish larvae, the outermost retinal layers of isolated retinas, or lower resolution imaging of retinas in live animals. Here we present a method for generating live ex vivo retinal slices from adult zebrafish for live imaging via confocal microscopy. This preparation yields transverse slices with all retinal layers and most cell types visible for performing confocal imaging experiments using perfusion. Transgenic zebrafish expressing fluorescent proteins or biosensors in specific retinal cell types or organelles are used to extract single-cell information from an intact retina. Additionally, retinal slices can be loaded with fluorescent indicator dyes, adding to the method&#39;s versatility. This protocol was developed for imaging Ca2+ within zebrafish cone photoreceptors, but with proper markers it could be adapted to measure Ca2+ or metabolites in M&#252;ller cells, bipolar and horizontal cells, microglia, amacrine cells, or retinal ganglion cells. The retinal pigment epithelium is removed from slices so this method is not suitable for studying that cell type. With practice, it is possible to generate serial slices from one animal for multiple experiments. This adaptable technique provides a powerful tool for answering many questions about retinal cell biology, Ca2+, and energy homeostasis.

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Imaging retinal tissue can provide single-cell information that cannot be gathered from traditional biochemical methods. This protocol describes preparation of retinal slices from zebrafish for confocal imaging. Fluorescent genetically encoded sensors or indicator dyes allow visualization of numerous biological processes in distinct retinal cell types.

Ex Vivoイメージング実験アダルト ゼブラフィッシュから準備新鮮な網膜スライス

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

行動するマウスにおける海馬シータ振動の光同調

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Ex Vivoラット脳切片を用いた神経変性疾患の主要なイベントを勉強する方法

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 (ChR2), is expressed by a virus vector in a particular type of neuronal cells in various Cre-driver mice. Activation of these opsins is triggered by application of light pulses which are delivered by laser or LED through optic cables, and the effect of activation is observed with very high time resolution. Experimenters are able to acutely stimulate neurons while monitoring behavior or another physiological outcome in mice. Optogenetics can enable useful strategies to evaluate function of neuronal circuits in the regulation of sleep/wakefulness states in mice. Here we describe a technique for examining the effect of optogenetic manipulation of neurons with a specific chemical identity during electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) monitoring to evaluate the sleep stage of mice. As an example, we describe manipulation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis (BNST). Acute optogenetic excitation of these neurons triggers a rapid transition to wakefulness when applied during NREM sleep. Optogenetic manipulation along with EEG/EMG recording can be applied to decipher the neuronal circuits that regulate sleep/wakefulness states.

Here, we describe methods of optogenetic manipulation of particular types of neurons during monitoring of sleep/wakefulness states in mice, presenting our recent work on the bed nucleus of the stria terminalis as an example.

マウスにおける睡眠/覚醒状態のモニタリング中の神経回路の光遺伝学的操作

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...