この研究は、国立衛生研究所の助成金 (R01 DE025985)、アメリカ癌協会の研究学者賞 (RSG-13-383-MPC) にサポートされていました。この作品もによって支えられた米国農務省の (2015-67015-23268 と 2014-67015-21787) とカリフォルニア大学から新しい研究イニシアティブ助成金からの助成金・ デイヴィス。

注意: この手順で使用される細胞感染ウイルスを含んでいる、注意、レベル 2 BSL 施設以上時だけ進みます。
1. セルの準備とメンテナンス
<ol><li>TREx K-RTA BCBL 1 細胞の培養 (または別 KSHV 感染 PEL セルライン) 15% ウシ胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリン ストレプトマイシン グルタミン溶液添加 RPMI1640 培地で。</li>
	<li>継続的に成長し、1:4 の比率は、2-4 日おきにセルを分割するように 5% 二酸化炭素 (CO2)、37 ° C で細胞を成長します。</li>
	<li>良い細胞増殖と形態は、それ以外の場合に細胞培養を再起動するか、または細胞培養条件を調整するは、勧めを確認する毎日光顕微鏡による培養細胞を監視します。</li>
</ol>2. チミジン同期と溶解誘導
<ol><li>10 cm シャーレで TREx K-Rta BCBL 1 細胞作りたてメディア (メディアの 1 x 106セル/2 mL)</li>
	<li>200 mM チミジンを追加 (最終濃度: 2 mM) 皿にミックスし、18 時間孵化させなさい。</li>
	<li>遠心分離機 500 x g に 5 分のセル洗浄と滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x セル、再び、遠心分離機、作りたてメディアで細胞を再懸濁します。3 洗浄の合計に対して繰り返します。作りたてのメディアで再懸濁します。</li>
	<li>8 h に S 段階を終了するセルを許可します。</li>
	<li>チミジンを追加 (最終濃度: 2 mM) をミックスして 16 時間孵化させなさい。</li>
	<li>遠心分離機 500 x g に 5 分のセル洗浄と滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x セル、再び、遠心分離機、作りたてメディアで細胞を再懸濁します。3 洗浄の合計に対して繰り返します。作りたてのメディアで再懸濁します。</li>
	<li>ウイルス再活性化を誘導するには、細胞培養に 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA、最終濃度 20 ng/mL) とドキシサイクリン (DOX、最終濃度 100 ng/mL) を追加、ミックス、4 時間インキュベートします。K Rta 誘導カセットなしセルライン、TPA (最終濃度 20 ng/mL およびナトリウム酪 (1 mM)) を使用して再活性化を刺激するため。</li>
	<li>遠心分離機 500 x g に 5 分セル洗浄と滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x セル、再び、遠心分離機および完全な培地で細胞を再懸濁します。3 洗浄の合計に対して繰り返します。完全な文化メディアで再懸濁します。</li>
	<li>24 h に成長する細胞を許可します。</li>
</ol>3. 固定・透過
メモ: 先に進む前に必ず固定ソリューション (DEPC 処理 PBS で 3.7% ホルムアルデヒド)、ジエチル pyrocarbonate 処理リン酸緩衝生理食塩水 (DEPC PBS)、グリシン DEPC PBS (グリシンの最終濃度: 100 mM) および permeabilizating 溶液 (50%アセトン、50% メタノール) を用意しています。通常、各スライドが少なくとも 50 万の細胞を必要とする、必要に応じて乗算し、細胞が健康ではない場合に特にを背面に余分なセルが含まれています。
<ol><li>1.5 mL 遠心チューブに細胞を収集します。</li>
	<li>3 回で 1 mL の滅菌の DEPC PBS セル 200 x g. 洗浄で 2 分間細胞を遠心分離機します。1.2 mL の DEPC PBS に再懸濁します。</li>
	<li>6 ウェル プレートの底に coverslips (実験のセットアップによって決まります) の適切な数を配置します。</li>
	<li>セルに各 coverslip DEPC PBS 混合物の 200 μ L をピペット、少なくとも 50 万の細胞が各スライド上にあることを確認します。2 分のために解決の細胞し、細胞の薄い層だけを残して余分な DEPC PBS を吸引します。このプロセスで、削除するセルは正常です。 注意: PFA は有毒である、適切な保護具を着用します。</li>
	<li>慎重に各カバー スリップするソリューション (DEPC PBS で 3.7% ホルムアルデヒド) の修正の 1 つの mL を追加します。10 分間を修正するセルを許可します。</li>
	<li>Coverslips DEPC PBS で 3 回洗います。</li>
	<li>慎重にグリシン DEPC PBS の 1 mL を追加 (グリシンの最終濃度: 100 mM) 各カバー スリップします。5 分急冷するセルを許可します。</li>
	<li>5 分のシェーカーで 1.5 mL の DEPC PBS のいずれかの場所を追加または 1 分吸引超過の DEPC PBS のためしっかりと、優しく手を振る。セルを破壊しないように注意します。3 洗浄の合計のためには、この手順を繰り返します。</li>
	<li>慎重に構造の各カバー スリップに (50% アセトン、50% メタノール) ソリューションの 1 つの mL を追加します。15 分間 permeabilize セルを許可します。 注: この時点で、coverslips はもはや一週間以上の-20 ° C のフリーザーで格納できます。凍結を避けるか、画像の品質が急激に低下、冷凍庫に費やされる時間を最小限に抑えます。確認するときにセルのまま冷凍庫ウェットとメタノールまたはアセトンと彼らは正しく冷凍庫から取り出した後 DEPC PBS で補給できるように屋根付き。</li>
	<li>5 分のシェーカーで 1.5 mL の DEPC PBS のいずれかの場所を追加またはしっかりと振るが手に優しく 1 分超過の DEPC PBS を吸引、セルを破壊しないように注意してください。3 洗浄の合計のためには、この手順を繰り返します。</li>
</ol>4. IFA と RNA 魚
注: 魚 RNA プローブのラベル付けと準備について: の K-Rta 959 塩基対、31 の異なるプローブであるイントロンが生成され、20 塩基対、各 GC を含む約 50% の満足していました。プローブの作業、在庫ソリューションであった 100 μ M 及び 2.5 μ M の濃度に避けよう。
<ol><li>実験に必要な情報または区別のラベルのいくつかの並べ替えを持つ顕微鏡スライド ラベルを付けます。</li>
	<li>湿ったペーパー タオルでヒートシール可能なプラスチック製の容器の底を並べ。</li>
	<li>
一次抗体溶液を調製 (1.5 μ L ラナ抗体、0.75 μ L の RNA Pol II 抗体、ベーカーの 3 μ L の酵母まで 30 μ L の DEPC PBS、tRNA) とそれぞれの coverslip の存在のためのレシピを乗算します。各ラベル付き顕微鏡スライド上に一次抗体ソリューションの場所 30 μ L。
	<ol>
<li>まず興味の一次抗体を滴定し、最適な量を使用します。必ず使用して精製された IgG 血清 (腹水) が RNase の大量を含んでいる可能性があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ラベル付き顕微鏡スライド上に coverslip (ソリューションを直面しているセル) を置き、湿ったペーパー タオルでコンテナーにスライドを移動します。気泡を導入することに注意してください。プラスチック製のラップとコンテナーの外装をカバーします。1 h の 37 ° C に設定インキュベーターにコンテナーを移動します。</li>
	<li>(2 x 生理食塩水のナトリウム クエン酸バッファー (SSC) (最終)、10% ホルムアミド、90% DEPC dH2O) 魚洗浄バッファーを準備します。</li>
	<li>交配バッファー x 2 を準備 (4 x SSC、20% デキストラン硫酸)。</li>
	<li>二次抗体と魚イントロン プローブ バッファーを準備 (交配バッファー (Hyb バッファー x 最終 1) x 2 の 20 μ L、パン酵母の 4 μ L tRNA (最後の 10%)、ホルムアミド (最後の 10%)、イントロン K Rta プローブの 4 μ L (最終的な 125 nM)、0.8 の二次抗体、DEPC dH2 μ g40 μ L まで O)。必要なすべてのスライドのためのレシピを乗算します。</li>
	<li>インキュベーション後、3 回 5 分 6 ウェル プレートで DEPC PBS のセルを洗浄します。</li>
	<li>3 回各 5 分の魚洗浄バッファーで洗浄します。第二に抗体とイントロンのプローブ (ステップ 4.7) の混合物の準備完了するまで魚洗浄バッファーの coverslip を維持します。</li>
	<li>きれいなガラスのスライドは、一次抗体の孵化の交配のために使用されます。</li>
	<li>二次抗体とスライド グラスの上にソリューションを含む魚イントロン プローブの場所 40 μ L。</li>
	<li>泡を導入するしないように注意をする、バッファー上に下向きセル側でスライド上に細胞を coverslips を配置します。</li>
	<li>底に湿ったペーパー タオルでプラスチックの容器にスライドを配置します。最初のラップとし、アルミ箔とプラスチックの容器をラップします。</li>
	<li>16-24 h 37 ° C でスライドを持つコンテナーを孵化させなさい。</li>
	<li>インキュベーション後、慎重にスライド、coverslip スライド ガラスの端から 6 ウェル プレート、上向きに戻す、3 回 5 分 6 ウェル プレートで魚洗浄バッファーを持つセルを洗浄します。</li>
	<li>2 回で 2 セルを洗浄して x SSC。</li>
	<li>2 に DAPI (1:1, 000) を追加 x SSC し、室温で 5 分間座ることができます。</li>
	<li>2 回で 2 セルを洗浄して x SSC。</li>
	<li>交配用スライド ガラスをきれいにしガラス スライド上にソリューションを装着の 10 μ L を追加します。</li>
	<li>Coverslips フェイス ダウンをマウント ソリューションを配置します。気泡を導入することに注意してください。</li>
	<li>研究所の組織と細胞をスカッシュに触らない、余分なマウント ソリューションを注意深く取り外します。</li>
	<li>マニキュアを使用して、coverslips の端のまわりの十分な層を適用して乾燥することができます。</li>
	<li>蛍光顕微鏡を実行に進みます。</li>
</ol>5. 3 D 蛍光顕微鏡
注: プロトコル使用蛍光顕微鏡システムの種類で異なりますが、次の手順、定量分析のための最適な画像データの取得を保障を助けます。
<ol><li>固定サンプルを前処理し、イメージング中に蛍光退色を遅延する耐フェード メディアでマウントします。</li>
	<li>全体のセル (またはセルの核) をキャプチャすることができます (60 X 1.42 N.A 油浸型レンズなど)、高品質の目的を使用して、ビューのフィールドで。</li>
	<li>正と負のコントロールのサンプルを使用して、それぞれの蛍光カラー チャンネルの露出パラメーター (例えば、励振電力、露光時間) を設定します。蛍光画像を取得します。 注: のみ 1 つの蛍光ラベルを含む肯定的な制御サンプルは、「クロストーク」カラー チャンネル間のレベルを決定するのにも使用ください。画像固定細胞標本の退色を最小限に抑えるため、(わずかにより長い露光時間) と蛍光励起電力を削減できます。</li>
	<li>イメージングのプロトコルを確立すると、維持同じ露光パラメーター研究のすべてのサンプルに対する一貫性のある-ので、画像データを正確に分析および比較が可能します。</li>
	<li>買収後の画像処理と 3次元復元を実行します。特定 RNA 魚信号 (赤) で K Rta 成績証明書、ラナ分子蛍光抗体法 (緑) と核クロマチン (該当する場合) 染色 DAPI (青)。 注: K Rta とラナが共同クラスターである細胞核の領域従ってウイルス転写工場および複雑なレプリケーションに関連する考えられています。</li>
</ol>

<ol>
	<li>de Laat, W., Grosveld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grosveld+Spatial+organization+of+gene+expression:+the+active+chromatin+hub.">Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub.</a> Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).</li><li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+dynamics:+implications+for+nuclear+architecture+and+gene+expression.">Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression.</a> Science. 291 (5505), 843-847 (2001).</li><li>Bernardi, R., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+dynamics+and+functions+of+promyelocytic+leukaemia+nuclear+bodies.">Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).</li><li>Cioce, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies:+a+long+history+of+discovery.">Cajal bodies: a long history of discovery.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).</li><li>Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifunctional+nucleolus.">The multifunctional nucleolus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).</li><li>Sutherland, H., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factories:+gene+expression+in+unions.">Transcription factories: gene expression in unions.</a> Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).</li><li>Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+virus+replication+compartments.">DNA virus replication compartments.</a> J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).</li><li>Chen, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+Hijacks+RNA+Polymerase+II+To+Create+a+Viral+Transcriptional+Factory.">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory.</a> J Virol. 91 (11), (2017).</li><li>Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KSHV+and+the+pathogenesis+of+Kaposi+sarcoma:+listening+to+human+biology+and+medicine.">KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine.</a> J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).</li><li>Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+sarcoma+and+its+associated+herpesvirus.">Kaposi's sarcoma and its associated herpesvirus.</a> Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).</li><li>Campbell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methyltransferase+1-directed+methylation+of+Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus+latency-associated+nuclear+antigen.">Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen.</a> J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).</li><li>Guito, J., Lukac, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KSHV+Rta+Promoter+Specification+and+Viral+Reactivation.">KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation.</a> Front Microbiol. 3, 30 (2012).</li><li>Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+diversity+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus.">Epigenetic diversity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).</li><li>Osborne, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myc+dynamically+and+preferentially+relocates+to+a+transcription+factory+occupied+by+Igh.">Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh.</a> PLoS Biol. 5 (8), 192 (2007).</li><li>Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+contact+permits+transcription+between+coregulated+genes.">Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes.</a> Cell. 155 (3), 606-620 (2013).</li><li>Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+nuclear+noncoding+RNA+binds+re-localized+poly(A)+binding+protein+and+is+required+for+late+KSHV+gene+expression.">A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression.</a> PLoS Pathog. 7 (10), 1002300 (2011).</li><li>Chang, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylase+JMJD2A+regulates+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+replication+and+is+targeted+by+a+viral+transcriptional+factor.">Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor.</a> J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).</li><li>McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+efficiency+of+phorbol+ester-induced+lytic+reactivation+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+during+S+phase.">Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus during S phase.</a> J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).</li><li>Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lytic+cycle+switches+of+oncogenic+human+gammaherpesviruses.">Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses.</a> Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).</li><li>Guito, J., Lukac, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KSHV+Rta+Promoter+Specification+and+Viral+Reactivation.">KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation.</a> Front Microbiol. 3, 30 (2012).</li></ol>

この論文の著者には、金融関係や競合する利害の衝突があります。

異常な状況に合わせて変更することができますプロトコルのいくつかの側面があります。固定・透過バッファーの選択を変更することも。固定バッファーのパラホルムアルデヒドも効果的で、透過性のエタノールを使用ことができます。
ホルムアルデヒドがウシ血清アルブミン (BSA) の不在で抗体を無効にするを防ぎますが、グリシンの PBS のステップをスキップできま?...

それは核の時空間の組織が真核生物で細かく調整された遺伝子の発現を調節する際に重要な役割を果たしていることがますます明らかになっています。ほとんどのティッシュ特定の遺伝子は多くの染色体に分散されているし、調整方法1特定の刺激に応答するために同期的に規制する必要があります。細胞は、核の特定の空間1遺伝子とそのシスのコンポーネントをまとめるための方法としてアクティブなクロマチン ハブ (ACH) を構築します。
それも実証されている様々 な研究によって核思われます非常に密な粘性が、生理活性分子を経由できること核より迅速に拡散2を経由。この一時的なプロパティは、結果としてほとんどの DNA 結合タンパク質 'ジャンプ' 結合により、高い適応性と汎用性の高い核2原子力の分野の周り自分の道を感じるサイトへサイトのバインドから。
核内の分子の動的挙動がこの、にもかかわらず核体膜なしなど (ただしこれらに限定されない) 核小体、カハール体および前骨髄球性白血病核体 (PML の-NB) がまだ存在します。それはタンデム DNA 繰り返し (仁)、rRNA (仁) と coilin (カハール体) など PML タンパク質などの様々 な蛋白質 (PML の-NB) これら構成要素一緒に3,4,5 を保持します。.これらの構造と転写工場など他の集会だけでなく必要なコンポーネントのローカル集中を高めるが、またタンパク質や核酸最終的に作成するそれらの内の組成を調節する足場として、効率的な細胞機能6中央のサイト。
核構造のフォームは、エピジェネティクス研究に豊富な情報を提供しますいつ、どこの可視化。ウイルス学の観点から KSHV などの潜伏感染したウイルスの再活性化大幅核の風景とウイルス遺伝子を細胞の遺伝子から主に転写を最終的にシフトする核酵素の分布を変更するには完全に機能ウイルス子孫7、8を生成します。KSHV はどのようにウイルスの遺伝子発現を促進する細胞遺伝子式機械を操作できますか。そのような情報は、細胞特異的な遺伝子発現制御機構に光を当てることができるも。
他のヘルペス ウイルスは、同様 KSHV 複製と遅延と呼ばれる 2 つのライフ サイクルがあります。KSHV は遅延関連遺伝子9,10を除いて、式の沈黙で、ほとんどのウイルスの遺伝子の潜伏段階で主に存在します。生成 KSHV 待ち時間中に待ち時間は恒常とウイルスのゲノムを縛り、人間の染色体11ウイルス クロマチンをテザー核抗原 (ラナ) を関連付けられています。ラナのウイルスのゲノムとの親密な関係のため、IFA および DAPI を使用して染色し、ウイルス エピソームがホスト クロマチンに関連していた検索することが可能です。
単一 episome レベルおよび感染細胞内の他のウイルスのエピソーム関連付けで KSHV を再活性化を勉強するには、手段を使って、積極的にその場でウイルス クロマチン転写を設置します。したがって、ラナとイントロン RNA 魚と RNAPII を対仏投資庁に結合されたは KSHV K Rta のキーのウイルス蛋白質のイントロン領域 (泉谷ラボの最新出版物8シーケンスを見つけることができます正確なプローブ) にバインド魚 RNA プローブを生成することによって不可欠と KSHV 再活性化-それは識別すること十分な転写が取っていた実際にどこの場所8,11,12,13,14,15.このイントロン RNA 魚の技術すぐに融着接続、細胞質16,17にエクスポートする前に、mRNA が転写されている視覚化することも可能。 にします。
KSHV ホルボールエステル 12-O-Tetradeconoyl-ホルボールエステル-13acetate (TPA) などを含む様々 な化学的刺激によって再びアクティブにできます、酪、さらに KSHV などヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が誘導され、過剰発現による再アクティブ化ウイルスの転写因子、K Rta19。研究者は再活性化18を誘導する前にセルのサイクルを同期することによって正常に KSHV 再活性化の効率を増加しています。したがって、これらの特定の研究は、細胞は二重チミジン ブロック (下記のプロトコル) を使用して、短時間 TPA とドキシサイクリン (Dox) インキュベートに同期されました。これらの実験に利用されている細胞株はドキシサイクリン誘導された K Rta カセットは、cDNA から複製された、K Rta のイントロン領域は含まれませんので、ドキシサイクリンが使用されました。再アクティブ化することが可能だが K Rta 式を誘導 KSHV を使用してのみ、それは、さまざまな異なる生化学的要因により K Rta 式だけがかすかな再活性化刺激20と証明する他の研究者によって証明されています。これらのすべてを組み合わせることで、薬物孵化に時間の短い期間を制限することにより、イメージングの堅牢な過度に人工的ではない KSHV 再活性化が達成されました。
ラナ、RNAPII、ラベリング後 K Rta イントロンととしての DNA は、このペーパーで説明、広視野デコンボリューション顕微鏡を用いた 3 D 蛍光イメージングを行った。イメージング ソフトウェアとの処理の後は、アクティブなウイルス エピソームの空間分布を正しく評価できます。この手法を使用すると、アクティブなクロマチン ハブやその他の核構造の形成の基本的な性質に関する中央の質問を学ぶことができます。同じ規制要素を処理する単一のセルに同じウイルス エピソームを持つ時空間の遺伝子発現制御機構の理解を深めるためのユニークな研究ツールがあります。
異なる時点で固定する複数の細胞標本が、本質的に動的分子プロセスを特徴付けるためのイメージングの制限事項は蛍光分布の微妙なあるいは小規模の変化が検出されているまたは取るに足りないと判断します。これはまれなインスタンスの観察のすべてのセルが同じの微妙な変化を表示されない場合です。したがって、アクティブなウイルスの転写およびその他の核構造の全時空間関係批判的に評価できません固定のイメージングを使用します。これらの技術的な課題に対応するには、最善の方法は、ウイルス エピソームをマークしている生きた細胞をイメージし、時間の経過とともに細胞の主要な酵素の場所に従うことです。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">RPMI medium 1650 GlutaMAX</td>
			<td style="width:71px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">61870-036</td>
			<td style="width:167px;">Needs to be warmed to 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Omega Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">FB-11</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Pen Strep Glutamine (100x)</td>
			<td style="width:71px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10378-016</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Thymidine&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9250</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Solution</td>
			<td style="width:71px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">TPA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1585</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sodium Butyrate&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B5887</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Formaldehyde Solution&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">252549</td>
			<td style="width:167px;">Corrosive, toxic, health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Diethyl Pyrocarbonate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D-5758</td>
			<td style="width:167px;">Acute toxicity&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">410225</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Acetone</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">179124</td>
			<td style="width:167px;">Flammable, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Chemical&#160;</td>
			<td style="width:119px;">67-56-1</td>
			<td style="width:167px;">Flammable, toxic, health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73</td>
			<td style="width:71px;">Advanced Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">13-210-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8</td>
			<td style="width:71px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">05-623</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Ribonucleic acid, transfer from baker&#8217;s yeast (S. cerevisiae)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">9014-25-9</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Saline sodium citrate buffer 20x (SSC)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15557044</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Formamide&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">295876</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution</td>
			<td style="width:71px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">1916C093</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">DAPI (4&#8217;,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">slowFade Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S36936</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Micro cover glass 22x22</td>
			<td style="width:71px;">Matsunami</td>
			<td style="width:119px;">C022221</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">VoloCITY</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;">3D imaging software</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DeltaVision microscope</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Superfrost/Plus microscope slides</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional imaging of viral transcription factories using 3d fluorescence microscopy

遺伝子の空間的で、一時的な規制が適切な遺伝子発現を支配するの不可欠な部分であることが知られています。その結果、核空間内で転写が行われて、いつどこを理解し、エピソーム同じ細胞の核内に感染との関係を視覚化するが有益です。ここでは、蛍光抗体法 (IFA) と RNA の魚をされているに転写してカポジ肉腫関連ヘルペス ウイルス (KSHV) エピソーム総収入を識別します。KSHV 潜時に関連核抗原 (ラナ) を染色によってウイルス エピソームが核内に存在する検索することが可能です。さらに、生産的な伝染の間にだけ表現されるウイルス遺伝子のイントロン領域を対象とする魚 RNA プローブを設計することによって初期の RNA 転写産物に配置できます。この分子プローブの組み合わせを使用して、大規模なウイルスの転写工場の組立を視覚化および分析 KSHV 再活性化中にウイルスの遺伝子発現の空間情報の制御することが可能です。抗 RNA ポリメラーゼ II 抗体の汚損などによる RNA ポリメラーゼ II (RNAPII) の集約と再アクティブ化の間に KSHV 転写関係を視覚化することも 1 つ。

やや弱めのプロトコルを行った BCBL 1 セルを用い、ラナと K Rta RNA のみ染色 (図 1)。この実験では、積極的に転写のウイルス エピソームがあると細胞の人口に KSHV 再活性化刺激への反応の不均一性を調べることが出来ます。図 1の矢印で示されたセル、密接にウイルス エピソーム (ラナでマーク) の分布に一致する領域で異?...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

ウイルスの転写工場は、濃縮されている細胞の RNA ポリメラーゼ II は再活性化の中にウイルスの遺伝子の転写を増加する離散構造です。ここでは、積極的に蛍光染色し、その場でRNA の交配の組み合わせによってウイルス クロマチン核の 3 D 空間での議事録作成のサイトを検索する方法を説明します。

3 D 蛍光顕微鏡を用いたウイルス転写工場の機能イメージング

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

functional-imaging-viral-transcription-factories-using-3d

Research

JoVE Journal

Biology

7.0K ビュー.  University of California, Davis. ウイルスの転写工場は、濃縮されている細胞の RNA ポリメラーゼ II は再活性化の中にウイルスの遺伝子の転写を増加する離散構造です。ここでは、積極的に蛍光染色し、その場でRNA の交配の組み合わせによってウイルス クロマチン核の 3 D 空間での議事録作成のサイトを検索する方法を説明します。

ビデオ: Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

生物学

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

蛍光によるウイルスRNAの検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

高度な3D蛍光顕微鏡を用いたオートファジーの定量分析

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

迅速な分析および蛍光顕微鏡画像の探索

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

高速3D-構造化照明顕微鏡（F3D-SIM）を使用したライブ細菌における細胞質分裂のZリングの超解像イメージング

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal fluid accumulation and extracellular matrix formation. Activity of ion channels and intracellular calcium signaling are key physiologic parameters which determine functions of tubular epithelium. We developed a method suitable for real-time observation of ion channels activity with patch-clamp technique and registration of intracellular Ca2+ level in epithelial monolayers freshly isolated from renal cysts. PCK rats, a genetic model of autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD), were used here for ex vivo analysis of ion channels and calcium flux. Described here is a detailed step-by-step procedure designed to isolate cystic monolayers and non-dilated tubules from PCK or normal Sprague Dawley (SD) rats, and monitor single channel activity and intracellular Ca2+ dynamics. This method does not require enzymatic processing and allows analysis in a native setting of freshly isolated epithelial monolayer. Moreover, this technique is very sensitive to intracellular calcium changes and generates high resolution images for precise measurements. Finally, isolated cystic epithelium can be further used for staining with antibodies or dyes, preparation of primary cultures and purification for various biochemical assays.

Ion channels expressed in renal tubular epithelium play a significant role in the pathology of polycystic kidney disease. Here we describe experimental protocols used to perform patch-clamp analysis and intracellular calcium level measurements in cystic epithelium freshly isolated from rodent kidneys.

新たに単離したPKD上皮の機能的特性を監視するためにパッチクランプし、ライブ蛍光顕微鏡を実装

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

蛍光顕微鏡を用いたキネシン1貨物の同定

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

自動化された蛍光寿命イメージング顕微鏡を利用してオープンソースのハイコンテンツな解析

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...