我々 は、バイオ フィルムの試金の役に立つ議論のノビレ ラボのすべてのメンバーを感謝します。この調査は、健康 (NIH) のグラント R21 AI125801 (C.J.N.) に国立衛生研究所によってサポートされました。地下鉄は、メキシコとアメリカ合衆国 (UC mexus フライ) と国立ナシオナル デ サイエンス y Technologia (CONACYT) カリフォルニア大学の大学から博士課程フェローシップによって支えられました。

<ol>
	<li>Nobile, C. J., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+Biofilms+and+Human+Disease.">Candida albicans Biofilms and Human Disease.</a> Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).</li><li>Kojic, E. M., Darouiche, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+infections+of+medical+devices.">Candida infections of medical devices.</a> Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).</li><li>Fox, E. P., Nobile, C. J., Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options. , 1-24 (2013).</li><li>Gulati, M., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms:+development,+regulation,+and+molecular+mechanisms.">Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms.</a> Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).</li><li>Uppuluri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersion+as+an+important+step+in+the+Candida+albicans+biofilm+developmental+cycle.">Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle.</a> PLoS Pathog. 6 (3), e1000828 (2010).</li><li>Andes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+in+vivo+central+venous+catheter+Candida+albicans+biofilm+model.">Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model.</a> Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).</li><li>Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+an+in+vivo+Candida+albicans+biofilm+denture+model.">Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model.</a> Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).</li><li>Nett, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+indwelling+urinary+catheter+model+of+Candida+albicans+biofilm+infection.">Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection.</a> Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).</li><li>Krom, B. P., Willems, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Models+for+Candida+Biofilm+Development.">In Vitro Models for Candida Biofilm Development.</a> Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).</li><li>Hawser, S. P., Douglas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+by+Candida+species+on+the+surface+of+catheter+materials+in+vitro.">Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro.</a> Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).</li><li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms.">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).</li><li>Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+a+Candida+biofilm+microtiter+plate+model+for+measurement+of+antifungal+susceptibility+by+tetrazolium+salt+assay.">Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay.</a> J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).</li><li>Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+candidal+biofilm+microtiter+assay.">Optimized candidal biofilm microtiter assay.</a> J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).</li><li>Lohse, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+and+Optimizations+of+Candida+albicans+In+Vitro+Biofilm+Assays.">Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).</li><li>Winter, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Identification+of+Biofilm-Specific+Proteolysis+in+Candida+albicans.">Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans.</a> mBio. 7 (5), (2016).</li><li>Nobile, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recently+evolved+transcriptional+network+controls+biofilm+development+in+Candida+albicans.">A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans.</a> Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).</li><li>Fox, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+regulatory+network+temporally+controls+Candida+albicans+biofilm+formation.">An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation.</a> Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).</li><li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation+by+the+C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p.">Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p.</a> Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).</li><li>Baker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> At the bench: A laboratory navigator. 27, (2005).</li></ol>

クラリッサ ・ j ・ ノビレは阻害剤とC. albicansのバイオ フィルムの診断の開発会社 BioSynesis 社の創始者です。

ここで説明したカスタマイズ可能なマイクロ流体バイオ フィルム アッセイでのバイオ フィルム形成の可視化は、固定レート層流および一定した温度に露出されたときに単一セルのレベルでリアルタイム。野生型および変異株のバイオ フィルムの研究開発に強力な手段を提供しています, 生理学的条件を模倣条件下でバイオ フィルムに対する抗菌剤治療の効果臨床設定で.異なり、ほとんどの in vitroバイオ フィルム アッセイ、このメソッドは、リアルタイムの開発バイオ フィルムの検討を形成。
このメソッドは、24 サンプルまでことができるバイオ フィルム形成を評価するために同時に実行高スループット方法で使用することができます。メソッドは、通常バイオ フィルム開発のために必要な遺伝子を識別するために突然変異体のライブラリの遺伝子スクリーニングを実施するも使用でき、化合物ライブラリー画面に関心の抗菌物質のバイオ フィルムに対する有効性を評価するために使用することができます。このマイクロ流体デバイスの将来のアプリケーションは、このような画面を含めることを期待しています。我々 は、しかし、特定の薬物治療の検査が形成されるバイオ フィルムの成長としてこのマイクロ流体デバイスを用いたバイオ フィルムの厚さによって制限されます、注意 &#62; 16 h 表示チャネルを詰まらせる傾向にあります。したがって、薬物検査の実験が実行する必要があります &#60; 16 h。
全体的にみて、このデバイスは、高いカスタマイズや、汎用性の高い、王国、流量、温度、培養時間、メディア間で微生物種を評価するために調整することができます。記載されているメソッドは、バイオ フィルムの形成、初期細胞接着性、成熟バイオ フィルム細胞分散などのさまざまな側面の番号についての情報を提供します。単一種のバイオ フィルム形成ここで結果を報告するだけ、このプロトコルはデュアルと混合種バイオ フィルムの形成を研究に適応できます。
2 つの手順は、このプロトコルを正常に実行するために重要です。まず、実験的な温度では、メディアを予熱でシステム内の気泡は避けなければなりません。1 つの一般的な誤りがない予熱されたメディア内のセルの希釈です。細胞は、入口の井戸に使用されている同じメディアで希釈する必要があります。第二に、井戸を注意深く監視する必要があります; 入口出口からの細胞の流れセル流れすぎる場合入口メディアが汚染になるし、実験は解釈結果を得られません。その一方で、セル表示されませんチャネルで実験中にそのセルが表示チャネルにすべての道を移動する許可されていない場合は白紙イメージに 。心に留めてその他重要なポイントとしてボリュームとマイクロ プレートのウェル間の動きは、列ごとに一緒にリンクされて、可能な限りメディアの一貫性を維持することが重要だ、(同じような粘度で細胞の密度と組成) と同様に、別のメディアと異なるセルのサイズ列の流量が異なるがある、各セルのサイズを (可能であれば)。顕微鏡; を使用してセルの逆流を監視、実験中にただし、(対物レンズ 10 倍を使用して) 1 つの時にだけ 2 つのチャネルを表示できます。したがって、細胞を使用して入口の井戸にコンセントからの流れに必要な時間を測定するための模擬実験を行うにお勧めは、メディアは、実際の実験で使用される予定します。
一般に、生体内で動物実験する前に利用するための in vitroアッセイとしてこのマイクロ流体バイオ フィルムの試金を使用お勧めします。アッセイは、まだの in vitroアッセイと結果は、適切な動物モデルで検証する必要があります。私たちの経験でこのマイクロ流体バイオ フィルム アッセイの結果は、最適予測値を持って他の in vitroアッセイと比較してバイオ フィルム体内の試金のため我々 は14を評価しています。

しかし、それはまた、日和見主義の病原体、表面的な重症真菌感染症1,2を引き起こすことができる、カンジダは人間の微生物叢の共生メンバーです。C. albicansの主な病原性の特徴は弾力性のあるフォームにその能力と薬剤耐性のバイオ フィルム細胞のコミュニティ、表面に付着、細胞外マトリックス材料1,3で囲まれます。C. albicansのバイオ フィルムの構造高度、種類の細胞のいくつかの層を含む (ラウンド出芽酵母フォームのセル、オーバル偽セル、および尿細管の菌糸細胞)4。C. albicansのバイオ フィルムの開発で始まる画面で、これらの細胞の増殖が続く (シーディングにバイオ フィルム)、表面に丸い酵母型細胞の付着と未熟なバイオ フィルムの成熟に構造化し、完全に形成されたバイオ フィルム細胞外マトリックス材料4によって囲まれます。成熟したバイオ フィルムは主に、バイオ4に安定したアーキテクチャを提供する密な相互接続ネットワークを形成する細長い菌糸細胞で構成されます。バイオ フィルムのライフ サイクルでは、出芽酵母細胞成熟したバイオ フィルムから分散ぐるぐる播種性感染症を引き起こすまたは他サイト4,5で新しいバイオ フィルムをシードに体の他の地域への旅行があります。C. アルビカンスは生物の表面、粘膜面など、ホスト組織全体とカテーテル、ペース メーカー、入れ歯、人工関節などの非生物的表面にバイオ フィルムを形成できます。バイオ フィルムの反抗的な性質上、根絶することは困難、唯一の効果的な治療戦略は、多くの場合感染したデバイス4の除去。つまり、臨床現場で観察されたと同様の条件下でのバイオ フィルム形成を調査することが重要。
いくつか重要な生体内で動物のモデルC. albicansバイオ フィルム形成6,7,8; を研究するために使用しかし、これらの研究は高価、時間のかかることができます、系統と同時にテストすることができます抗菌剤の数によって制限されます。培養バイオ フィルムの試金、その一方で、抗真菌化合物および突然変異系統の高速、高スループットの評価を可能にする、はるかに費用対効果と運ばれるバイオ フィルム アッセイより倫理的な動物のモデル9、 10、11,12,13,14。ここで我々 が開発し、カスタマイズ可能なマイクロ流体デバイス14,15を使用して層流の下で一時的にバイオ フィルム形成を観察するように最適化の in vitroアッセイについて述べる。アッセイは、初期接着性のステップ、細胞の増殖、成熟バイオ フィルム細胞分散などのバイオ フィルム形成の各段階の可視化が可能です。試金はまたバイオ フィルムの開発中の細胞形態変化を視覚化するのに役立ちます。
マイクロタイター プレート、バイオ フィルム アッセイ培養、高スループット中は、制御フローの条件を許可しないため通常利用されています。伝統的な層流セル系バイオ フィルム形成の制御の流れの条件の継続的な評価を可能にするが、設定し、ダイナミック レンジ コントロールおよびスループットが制限する傾向があるに時間がかかることが多い。活用するマイクロ流体デバイス組み込み流室高スループット プレート (48 井戸を含む) を組み合わせることによりこれら制限を克服、高再現性、汎用性とカスタマイズ可能です。
ここでは、野生型C. albicansのバイオ フィルム形成を評価するために市販の自動マイクロ流体デバイスを使用するためのプロトコルについて述べるひずみ、バイオ フィルム、およびバイオ フィルムの発育に及ぼす知られている抗真菌剤バイオ フィルムを持っている以前報告された変異株 (bcr1Δ/Δ ・ Δ/Δ efg1 ) が 2 つの層の欠陥の in vitroとin vivoの16,17,18。記述のプロトコルは、バイオ フィルムのバイオ フィルム形成を阻害することで抗菌薬の有効性をテストするのには、ライブラリの突然変異体をスクリーニングによって通常バイオ フィルム開発に必要な遺伝子を識別するために使用できます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BioFlux 1000z</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td></td>
			<td>Automated microfluidic device for live cell analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate 0-20 dyne</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td>910-0047</td>
			<td>Microfluidic plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Montage Software</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td>Version 7.8.4.0</td>
			<td>Visualization analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C7341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-Glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient Broth</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C6471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco D-Mannitol</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>217020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-003-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Inoculating Loops</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30002-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52846-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate and Cuvette Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M12820004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of biofilm formation in candida albicans using an automated microfluidic device

カンジダは、院内敗血症症例の約 15% を引き起こす人間の最も一般的な真菌病原体です。C. albicansの主な病原性属性は、そのバイオ フィルム フォームする能力、生物と非生物の表面に細胞の構造化されたコミュニティです。C. albicansのバイオ フィルムは、粘膜層などのホスト組織とカテーテル、ペース メーカー、入れ歯、人工関節などの医療機器を形成できます。物理と化学の摂動に強く、種子に貯水池播種性感染症として機能することができますので、バイオ フィルムは重要な臨床的課題を提起します。各種の in vitroアッセイは、 C. albicansのバイオ フィルム形成、マイクロタイター プレート アッセイ、乾燥重量測定、セル実行可能性の試金、共焦点走査型レーザー顕微鏡などの研究に利用されています。これらの試金のすべては、特定の時点でのバイオ フィルム形成の評価、単一エンドポイント アッセイです。ここでは、層流条件下で自動マイクロ流体デバイスを用いた実時間でのバイオ フィルムの形成を研究するためのプロトコルについて述べる。このメソッドは、血管カテーテルにおいて直面する問題など、ホストのそれらを模倣するカスタマイズ可能な条件を使用して、時間をかけて開発するバイオ、バイオ フィルム形成の観測できます。このプロトコルは、遺伝的変異のバイオ フィルムの欠陥だけでなく、バイオ フィルムにおけるリアルタイム抗菌剤の抑制効果を評価するために使用できます。

ここで野生型を使用して記述されているマイクロ流体バイオ フィルム アッセイを行った 2 つのメディア条件 (RPMI 1640 とクモ メディア) C. albicans歪み、知られている抗真菌剤アムホテリシン B (16 μ G/ml) RPMI の存在下で野生型株バイオ フィルム形成 ( efg1 Δ/Δbcr1Δ/Δ ・ スパイダー メディアの欠陥を持っている 2 つの突然変異体系統が以前報告しました。
ビデオ 1 では、RPMI 1640 中規模およびバイオ フィルム形成に及ぼす抗真菌薬、アムホテリシン B、野生型バイオ フィルムの開発を示しています。野生型の条件の下でいくつかのセルは、チャネルに強く付着、セル形成時間の経過として菌糸と厚いバイオ フィルム間菌糸をインターカ レートで観察することができます酵母細胞。マイクロ流体実験の終わりには、野生型バイオ フィルムは完全に表示チャンネルを塗りつぶします。アムホテリシン B の存在しかし、バイオ フィルムを減らすことに大きく影響しています。具体的には、細胞の付着を低下し、アムホテリシン B の存在下で、状況を放置とは異なりいくつかのセルに画いてあるメディアのせん断流れと共に流れ去っていく。時間の進行、フォーム菌糸にセル失敗するとバイオ フィルム形成されていません。これらの違いは図 3、0 h、2 h、6 h、12 h で試金から 4 時間ポイントを描いたにも表示されます。
ビデオ 2 は野生型のバイオ フィルムの開発を示し、以前クモ メディアでバイオ フィルム欠損株 (bcr1 Δ/Δ ・ Δ/Δ efg1 ) で報告された 2。Bcr1 Δ/Δ とefg1 Δ/Δ の両方の系統を示す同質遺伝子の野生型株と比較して大幅に低下のバイオ フィルム形成。Efg1 Δ/Δ 株の付着細胞が菌糸を形成しない、結果として得られるバイオ フィルムは深刻な欠陥を見ました。Bcr1 Δ/Δ 株の事だけではバイオ フィルム形成はあるbcr1 Δ/Δ 株も明確な付着の欠陥は、細胞を見ることができる表示を見ました彼らに付着する失敗としてせん断流れの方向に漂流、チャンネルの表示。これらの違いは、図 4、0 h、2 h、6 h、12 h で試金から 4 時間ポイントを描いたにも表示されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56743/56743fig1.jpg"> 
図 1: この実験に用いられるマイクロ流体装置。パネルを示しますマイクロ器械使用、パネルBはインターフェイス板パネルCは単一の表示チャンネル (ステージ) と、実験中に、カメラで撮影された 3 つのサブ段階の概略を示して、パネルDは、出口と入口の井戸および表示ウィンドウの概略図と使用 48 ウェル マイクロ プレートの概略を示しています。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56743/56743fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56743/56743fig2.jpg"> 
図 2: 制御システムのイメージング modulesoftware とマイクロ プレートの選択スクリーン ショットします。パネルAマイクロ プレート用のコントロールを含むコントロール モジュール、パネルBイメージング モジュール ウィンドウ、移動舞台」絶対位置まで 'を示しています (地図表示) モジュール、' 多次元買収' (MDA) モジュール「サンプル リロード調整」(SRA) モジュール。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56743/56743fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56743/56743fig3.jpg"> 
図 3: アムホテリシン B に暴露ではバイオ フィルム形成欠陥。RPMI 1640 メディア (列 1) とマイクロ流体システムの 12 h 後の遵守のための 37 ° C で 16 μ g/mL アムホテリシン B (列 2) 動的フロー (0.5 ダイン/cm2) の下で補った RPMI 1640 メディアにおけるバイオ フィルム形成の時間表を依存します。同質遺伝子野生型株 SN250 の代表的な 0 h (後の付着および初期洗浄)、2 h、6 h、12 h 画像 (上下から) が表示されます (列 1 および 2)。スケール バーは、各パネルで 20 μ m です。対応するバイオ フィルム形成のタイムラプス ビデオは、ビデオ 1で提供されます。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56743/56743fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56743/56743fig4.jpg"> 
図 4: BCR1またはEFG1の削除はバイオ フィルム形成の欠陥で結果します。マイクロ流体システムの 12 h 後遵守のためクモ メディア (列 1-3) 動的フロー (0.5 ダイン/cm2) 37 ° c の下でバイオ フィルム形成の依存の可視化の時間します。同質遺伝子野生型株 SN250 の代表的な 0 h (後の付着および初期洗浄)、2 h、6 h、12 h 画像 (上下から) が表示されます (列 1) bcr1の Δ/Δ efg1とひずみ (列 2)、Δ/Δ のひずみ (列 3)。スケール バーは、各パネルで 20 μ m です。対応するバイオ フィルム形成のタイムラプス ビデオは、ビデオ 2で提供されます。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56743/56743fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
ビデオ 1:<a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56743/Video-1-WT_and_WT_plus_AmpB.mp4">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
ビデオ 2:<a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56743/Video-2-WT_bcr1_efg1_Mutants.mp4">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device at JoVE.com

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオ フィルム形成の可視化

このプロトコルでは、ホストの生理学的な条件の下でカンジダ菌のバイオ フィルム形成を視覚化するカスタマイズ可能な自動化されたマイクロ流体デバイスの使用について説明します。

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

visualization-biofilm-formation-candida-albicans-using-an-automated

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

10.5K ビュー.  University of California, Merced. このプロトコルでは、ホストの生理学的な条件の下でカンジダ菌のバイオ フィルム形成を視覚化するカスタマイズ可能な自動化されたマイクロ流体デバイスの使用について説明します。

ビデオ: Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

監視形成との抗真菌薬感受性試験のための96ウェルマイクロタイタープレートベースの方法カンジダアルビカンスバイオフィルム

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

免疫・感染学

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

マイクロタイター皿のバイオフィルム形成アッセイ

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

8ウェルチャンバースライドを用いたin vitro のバイオフィルム形成における

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

微生物群集を学びます<em&gt;インビボ</em&gt;：ホスト間の媒介の相互作用のモデル<em&gt;カンジダ</em&gt;と<em&gt;緑膿菌</em&gt;航空で

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, a significant stress response is induced during gastrointestinal transit and upon bile exposure, a normal component of human digestion. To overcome the bactericidal effects of bile, many enteric pathogens form a biofilm hypothesized to permit survival when transiting through the small intestine. Here we present methodologies to define biofilm formation through solid-phase adherence assays as well as extracellular polymeric substance (EPS) matrix detection and visualization. Furthermore, biofilm dispersion assessment is presented to mimic the analysis of events triggering release of bacteria during the infection process. Crystal violet staining is used to detect adherent bacteria in a high-throughput 96-well plate adherence assay. EPS production assessment is determined by two assays, namely microscopy staining of the EPS matrix and semi-quantitative analysis with a fluorescently-conjugated polysaccharide binding lectin. Finally, biofilm dispersion is measured through colony counts and plating. Positive data from multiple assays support the characterization of biofilms and can be utilized to identify bile salt-induced biofilm formation in other bacterial strains.

This protocol enables the reader to analyze bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens using a multifaceted approach to capture the dynamic nature of bacterial biofilms by assessing adherence, extracellular polymeric substance matrix formation, and dispersion.

腸管病原体の胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成: 同定及び定量化の手法

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily lead to infections in the dermis which can, in turn, result in the dissemination of pathogens into the bloodstream. Understanding how the immune system fights infections at the very early stage and how the host can eliminate the pathogens is an important step to set the base for future therapeutic interventions. Here we describe a model of Candida albicans infection that can visualize the processes that occur early during an infection, including when the pathogen has passed the epithelial barrier, as well as the immune response elicited by the C. albicans invasion. We used this infection model to perform histological analyses that show the immune cells that infiltrate the skin as well as the presence and localization of the pathogen. Samples collected after the infection can be processed for RNA extraction.

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Here we describe a protocol that allows histological and molecular analysis of skin samples after Candida albicans intradermal injection. This protocol maintains the structural integrity of the skin and allows for the localization of tissue-resident or newly recruited immune cells as well as the pathogen distribution.

深い皮膚注入として、モデルカンジダ皮膚感染症病理組織学的解析のための

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic growth of C. albicans SN425, the inoculums grew on Yeast Nitrogen Base media. For biofilm formation, RPMI 1640 media, which have high concentrations of amino acids, were applied to help biofilm growth. Biofilms of 48 h were treated twice a day for a period of 1 min with a non-coherent light device (red light; wavelength = 635 nm; energy density = 87.6 J&#183;cm-2). As a positive control (PC), 0.12% chlorhexidine (CHX) was applied, and as a negative control (NC), 0.89% NaCl was applied to the biofilms. Colony forming units (CFU), dry-weight, soluble and insoluble exopolysaccharides were quantified after treatments. Briefly, the protocol presented here is simple, reproducible and provides answers regarding viability, dry-weight and extracellular polysaccharide amounts after red light treatment.

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcome of red light application on the growth of Candida albicans biofilm. A non-coherent red light device with the wavelength of 635 nm and energy density of 87.6 J&#183;cm-2 was applied throughout the growth of Candida albicans biofilms for 48 h.

規制カンジダバイオ フィルムの成長する赤い光で毎日光線

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

上皮内蛍光を用いたマウス消化管におけるカンダアルビカンスの可視化

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch from yeast-form growth to hyphal growth. Cells initiating this process become adherent to surfaces as well as to each other, with the resulting development of a biofilm colony. This commonly occurs not only on mucosal tissue surfaces in yeast infections, but also on medical implants such as catheters. It is well known that biofilm cells are resistant to antifungal drugs, and that cells that shed from the biofilm can lead to dangerous systemic infections. Biofilms range from heavily translucent to opaque due to refractive heterogeneity. Therefore, fungal biofilms are difficult to study by optical microscopy. To visualize internal structural, cellular, and subcellular features, we clarify fixed intact biofilms by stepwise solvent exchange to a point of optimal refractive index matching. For C. albicans biofilms, sufficient clarification is attained with methyl salicylate (n = 1.537) to enable confocal microscopy from apex to base in 600 &#181;m biofilms with little attenuation. In this visualization protocol we outline phase contrast refractometry, the growth of laboratory biofilms, fixation, staining, solvent exchange, the setup for confocal fluorescence microscopy, and representative results.

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

To view and quantify the internal features of Candida albicans biofilms, we prepare fixed intact specimens that are clarified by refractive index matching. Then, optical sectioning microscopy can be used to obtain three-dimensional image data though the full thickness of the biofilm.

カンディダ・アルビカンスバイオフィルムの明確化とイメージング

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオ フィルム形成の可視化

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオフィルム形成の可視化