この出版物で報告された研究は、国立老化研究所、高齢者の齧歯動物のコロニー (ナンシー ネイドン) から 14 ヶ月歳雌 CBA マウスの気前のいい贈り物とユタ州立大学獣医学校、動物、酪農サポートされています。・獣医科学。

ここで説明したすべてのメソッドは、国家研究評議会ガイドは、ケアと実験動物の使用のためのガイドラインとユタ州立大学機関動物のケアおよび使用委員会によって承認されているの下で開発されました。
注: 卵巣移植の手順は、生後 18 カ月に 21 日齢からマウス (CBA/J ひずみ) を伴うことがあります。CBA/J 系統のマウスの生殖年齢の 45 から 60 日の間有能ななり、生殖年齢の 10 と 12 ヶ月の間老化。
1. 老齢マウスにそのまま卵巣の移植
メモ: この最初のプロトコルでは、転送中に卵巣の若いマウス (60 日齢) から女性の postreproductive に (年齢 12 ヶ月) 同じ交の使用手順について説明します。同じ手順は、任意の 2 つのメスのマウスの卵巣移植に用いられます。
<ol><li>重量を量るし、腹腔内 (i. p.、27 ga 針) によるドナー動物を麻酔注射、たとえばケタミン ・ キシラジン アセプロマジンのカクテルを使用して (65 mg/kg ケタミン、13 mg/kg キシラジン 2.0 mg/kg, アセプロマジン; カクテル線量 - 6.5 ml/kg)。麻酔が効いたまで温水ホーム ケージに動物を返します。</li>
	<li>麻酔、一度ホーム ケージと温水ペーパー タオル上の場所から動物を削除します。バリカン (#40 刃優先)、削除正中線側、肋骨のすぐ下を開始し遠位に移動、準備、切り取られた髪に数 mm 外側を 'パッチ' 髪のストリップを残して傾向があるマウスの両側に約 2-3 cm 角を使用約 1-2 cm 正中線をカバーします。</li>
	<li>軽く 70% エタノールでクリップされた領域を拭くし、betadine ソリューションを綿棒でクリップされたサイトに適用されます。</li>
	<li>目の保護のため抗生物質のジェルし、メロキシカム (2.0 mg/kg) を皮下管理 (サウスカロライナ州 27 ga 針) 術後鎮痛のための動物の首の外側の面に。</li>
	<li>加熱滅菌手術野腹臥位で動物を置き、70% エタノールに浸した 2 cm × 2 cm の綿ガーゼでクリップされた領域を拭いてください。</li>
	<li>1.0 〜 1.5 cm paralumbar 切開そしてぶっきらぼう基本的な筋膜から皮膚を解剖します。もう一つ、筋膜切開を確認します。ぶっきらぼう解剖横方向にこの筋膜の下で可能な限り表面的腹腔内に到達するまで</li>
	<li>場所切開 (2 cm × 2 cm ガーゼから切り取り) とウェット ドレープ滅菌生理食塩水と小さな手術ドレープ。</li>
	<li>小鉗子を使用して、腹腔内に卵巣を取り囲む脂肪組織優しく脂肪パッドと卵巣を抽出し、接液ガーゼのドレープの上に置きます。卵巣の脂肪パッドは周囲の脂肪組織よりも「白」で表示されます。</li>
	<li>(卵巣の嚢を妨げない世話) 脂肪パッドに 1.5 インチ ブルドッグ クランプを置くプロシージャの間に場所で、管を保持します。</li>
	<li>所定の位置に解剖顕微鏡を移動し、卵巣の嚢を明確に識別します。2 つの時計鉗子で滑液包をつかみ、卵巣を公開する卵巣門部反対側卵巣嚢を切開します。滑液包の目的のアクセス領域は血管高度場合は、断裂の時に出血を減らすためにファブリキウス嚢の表面に注射器でエピネフリン (1: 100, 000) のドロップを適用します。</li>
	<li>優しく卵巣嚢から卵巣を削除し、卵巣門部での出血を防ぐために時計鉗子でクランプで卵巣を切除します。</li>
	<li>ドナー卵巣が、4 ° C 滅菌生理食塩水で満たされた時計ガラス、緩くカバー、移植の準備ができるまで置いておきます。理想的には、卵巣は、移植の時に外科医が簡単に把握できるように追加の解剖顕微鏡の下で見るガラスを配置します。</li>
	<li>この時点でか、安楽死させるまたは後時点でプレース ホルダー ガラス ビーズ細胞や組織移植卵巣を受信する (する必要があります継続的に監視する) ドナー マウスをおきます。</li>
	<li>清潔な手術野と楽器、上記として受信者の動物を ovariectomize します。古いマウス脂肪組織の増加量を持っている傾向があるし、増加の麻酔薬投与量 (最大 20%) を必要とする場合があります。</li>
	<li>受信者から卵巣の切除、出血制御と凝固を支援し生理食塩水に浸したガーゼの小片を置きます露出サイト空の滑液包内止血泡パッドの小片を置きます。</li>
	<li>ドナー卵巣 (または組織、細胞、プレース ホルダー ガラス ビーズ) 1 つの鉗子手し、顕微鏡の視野に移動時計とを検索します。反対側の手で別の鉗子、ガーゼを削除し、同時に滑液包から滑液包内新しい卵巣を配置しながら止血泡パッドを取り外します。</li>
	<li>受信者の滑液包内に収まらない新しい卵巣半分または 1/3 (1/4) のドナー卵巣を切り取っての部分の滑液包に配置。滑液包は全体の卵巣を完全に覆っていない場合配置嚢、卵巣および場所で卵巣を保持する滑液包を通って縫合 (ディスカッション セクションを参照)。 注: ガラスビーズ プレース ホルダーを時計師の鉗子で処理することは困難にすることができます。</li>
	<li>滑液包の中のガラス玉を置くとき大きい鉗子でビーズを拾うし、卵巣嚢の横の脂肪パッドの上にドロップします。滑液包にビーズをロールバックします。</li>
	<li>テーパー針と 9-0 または 10-0 のモノフィラメント縫合糸で既に読み込まれてカストロヴィーホー針ホルダーをピックアップ、滑液包の引き裂かれたエッジを検索し、1 つまたは 2 つのホルステッド縫合糸を使用してブルサを閉じます。 注: 縫合は、時計職人やその他の小さな鉗子で代わりに実行できます。</li>
	<li>滅菌生理食塩水で軽くサイトを灌漑、脂肪パッド クランプを削除し、卵巣/脂肪パッドを腹部に戻します。</li>
	<li>ドレープを削除し、6-0 クロム腸または vicryl に腹壁を閉じます。顕微鏡の有無、この手順を実行することができます。</li>
	<li>脇 (前の手順で移動していない) 場合に、顕微鏡を移動して傷 9 ミリメートル クリップで皮膚を閉じます。</li>
	<li>光から遮断された温水回復ケージに動物を配置し、麻酔から回復まで継続的に動物を監視します。その他メロキシカムは示される場合は手術後 24 時間使用できます。手術後約 9 日間傷クリップを削除します。 注: 免疫抑制技術は採用ないと移植後または死で移植片対宿主病の証拠を検出できません。</li>
</ol>2. 胚細胞の移植は、そのままマウス卵巣を消耗されています。
注: このプロトコルには、若い、生殖細胞枯渇マウスから卵巣の postreproductive 女性への転送が含まれます。このプロトコルでは卵巣の受信者と卵巣摘出と移植の手順は、上記のように例外に原始、プライマリ卵胞/生殖細胞の劣化移植卵巣が化学的にされていること。残りのセカンダリと幽門卵胞募集/閉鎖生殖細胞に欠けている卵巣を残してが行われます。4-ビニルシクロヘキセン diepoxide (VCD) と生殖細胞の枯渇はよく説明16です。VCD は毒素であります。VCD 治療卵巣非投与マウスに移植されている、ためこの手順 VCD の毒性にさらされていないマウスで VCD 治療卵巣から寄与します。このプロトコルでは、若い卵巣移植モデルにおける生殖細胞枯渇のための手順について説明します。
<ol><li>使用するまで注入と 4 ° C でストアのごま油で VCD (64 mg/mL) を希釈します。</li>
	<li>卵巣ドナー一日一回 VCD i. p. (160 mg/kg) での注入 28 日齢から 15 日間。ごま油の同じスケジュールを以下にコントロール マウスを注入します。</li>
	<li>50 日齢、上記 10 日間 VCD 処理し、オイルだけで扱われるマウス生殖周期の停止を確認します。60 日齢、VCD 処理マウスない生殖腺入力の細胞学的証拠が表示されます。</li>
	<li>60 日齢マウスから卵巣を回復し、上記のように移植します。</li>
	<li>生殖サイクルの欠如、アンドロステンジオンの循環の増加されたレベルの検出による卵巣の生殖細胞枯渇の巧妙な移植を決定します。VCD17生殖細胞枯渇後、アンドロゲン: エストロゲンの比率が大幅に増加します。</li>
	<li>10-14 日術後膣細胞診を開始し、少なくとも 10 日間周期の正確な測定を確保するためのデータを収集します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>National Institutes of Health, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, Fertility and Infertility Branch. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Fertility+Status+as+a+Marker+of+Overall+Health'.+"Support+studies+that+investigate+fertility+status+as+a+marker+of+overall+health+for+both+men+and+women".">'Fertility Status as a Marker of Overall Health'. "Support studies that investigate fertility status as a marker of overall health for both men and women".</a> New Research Priorities. , (2016).</li><li>Eisenberg, M. L., Li, S. F., Behr, B., Cullen, M. R., Galusha, D., Lamb, D. J., Lipshultz, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semen+quality,+infertility+and+mortality+in+the+USA.">Semen quality, infertility and mortality in the USA.</a> Hum. Reprod. 29 (7), 1567-1574 (2014).</li><li>Thom, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Heart+Association+Statistics+Committee+and+Stroke+Statistics+Subcommittee.+Heart+disease+and+stroke+statistics+-+2006+update+-+A+report+from+the+American+Heart+Association+Statistics+Committee+and+Stroke+Statistics+Subcommittee.">American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Heart disease and stroke statistics - 2006 update - A report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee.</a> Circulation. 113 (6), E85-E151 (2006).</li><li>Shuster, L. T., Rhodes, D. J., Gostout, B. S., Grossardt, B. R., Rocca, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+menopause+or+early+menopause:+Long-term+health+consequences.">Premature menopause or early menopause: Long-term health consequences.</a> Maturitas. 65 (2), 161-166 (2010).</li><li>Jacobsen, B. K., Knutsen, S. F., Fraser, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+at+natural+menopause+and+total+mortality+and+mortality+from+ischemic+heart+disease:+The+Adventist+health+study.">Age at natural menopause and total mortality and mortality from ischemic heart disease: The Adventist health study.</a> J Clin Epidemiol. 52 (4), 303-307 (1999).</li><li>Kulaksizoglu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+Factors+for+Diabetes+Mellitus+in+Women+with+Primary+Ovarian+Insufficiency.">Risk Factors for Diabetes Mellitus in Women with Primary Ovarian Insufficiency.</a> Biol Trace Elem Res. 154 (3), 313-320 (2013).</li><li>Johnell, O., Kanis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+estimate+of+the+worldwide+prevalence+and+disability+associated+with+osteoporotic+fractures.">An estimate of the worldwide prevalence and disability associated with osteoporotic fractures.</a> Osteoporos Int. 17 (12), 1726-1733 (2006).</li><li>Rosario, E. R., Chang, L., Head, E. H., Stanczyk, F. Z., Pike, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+levels+of+sex+steroid+hormones+in+men+and+women+during+normal+aging+and+in+Alzheimer's+disease.">Brain levels of sex steroid hormones in men and women during normal aging and in Alzheimer's disease.</a> Neurobiol Aging. 32 (4), 604-613 (2011).</li><li>Cargill, S. L., Medrano, J. F., Anderson, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infertility+in+a+line+of+mice+with+the+high+growth+mutation+is+due+to+luteal+insufficiency+resulting+from+disruption+at+the+hypothalamic-pituitary+axis.">Infertility in a line of mice with the high growth mutation is due to luteal insufficiency resulting from disruption at the hypothalamic-pituitary axis.</a> Biol Reproduction. 61 (1), 283-287 (1999).</li><li>Mason, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+young+ovaries+restored+cardioprotective+influence+in+postreproductive-aged+mice.">Transplantation of young ovaries restored cardioprotective influence in postreproductive-aged mice.</a> Aging Cell. 10 (3), 448-456 (2011).</li><li>Mason, J. B., Terry, B. C., Merchant, S. S., Mason, H. M., Nazokkarmaher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+Ovarian+Function+Significantly+Influenced+Trabecular+and+Cortical+Bone+Volume,+Architecture+and+Density+in+Mice+at+Death.">Manipulation of Ovarian Function Significantly Influenced Trabecular and Cortical Bone Volume, Architecture and Density in Mice at Death.</a> Plos One. 10 (12), 15 (2015).</li><li>Peterson, R. L., Parkinson, K. C., Mason, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+Ovarian+Function+Significantly+Influenced+Sarcopenia+in+Postreproductive-Age+Mice.">Manipulation of Ovarian Function Significantly Influenced Sarcopenia in Postreproductive-Age Mice.</a> J. Transplant. , (2016).</li><li>Peterson, R. L., Parkinson, K. C., Mason, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+immune+and+renal+function+in+aged+females+by+re-establishment+of+active+ovarian+function.">Restoration of immune and renal function in aged females by re-establishment of active ovarian function.</a> Reprod. Fertil. Dev. , (2017).</li><li>Parkinson, K. C., Peterson, R. L., Mason, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+behavior+and+sensory+function+were+significantly+influenced+by+restoration+of+active+ovarian+function+in+postreproductive+mice.">Cognitive behavior and sensory function were significantly influenced by restoration of active ovarian function in postreproductive mice.</a> Exp. Geront. 92, 28-33 (2017).</li><li>Cargill, S. L., Carey, J. R., Muller, H. G., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+of+ovary+determines+remaining+life+expectancy+in+old+ovariectomized+mice.">Age of ovary determines remaining life expectancy in old ovariectomized mice.</a> Aging Cell. 2 (3), 185-190 (2003).</li><li>Brooks, H. L., Pollow, D. P., Hoyer, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+VCD+Mouse+Model+of+Menopause+and+Perimenopause+for+the+Study+of+Sex+Differences+in+Cardiovascular+Disease+and+the+Metabolic+Syndrome.">The VCD Mouse Model of Menopause and Perimenopause for the Study of Sex Differences in Cardiovascular Disease and the Metabolic Syndrome.</a> Physiology. 31 (4), 250-257 (2016).</li><li>Rivera, Z., Christian, P. J., Marion, S. L., Brooks, H. L., Hoyer, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroidogenic+Capacity+of+Residual+Ovarian+Tissue+in+4-Vinylcyclohexene+Diepoxide-Treated+Mice.">Steroidogenic Capacity of Residual Ovarian Tissue in 4-Vinylcyclohexene Diepoxide-Treated Mice.</a> Biol. Reprod. 80 (2), 328-336 (2009).</li><li>Yuan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+in+inbred+strains+of+mice:+study+design+and+interim+report+on+median+lifespans+and+circulating+IGF1+levels.">Aging in inbred strains of mice: study design and interim report on median lifespans and circulating IGF1 levels.</a> Aging Cell. 8 (3), 277-287 (2009).</li><li>Mason, J. B., Cargill, S. L., Anderson, G. B., Carey, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Young+Ovaries+to+Old+Mice+Increased+Life+Span+in+Transplant+Recipients.">Transplantation of Young Ovaries to Old Mice Increased Life Span in Transplant Recipients.</a> J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 64 (12), 1207-1211 (2009).</li><li>Harrison, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acarbose,+17-alpha-estradiol,+and+nordihydroguaiaretic+acid+extend+mouse+lifespan+preferentially+in+males.">Acarbose, 17-alpha-estradiol, and nordihydroguaiaretic acid extend mouse lifespan preferentially in males.</a> Aging Cell. 13 (2), 273-282 (2013).</li><li>Manay, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17&#945;-Estradiol+Attenuates+Neuron+Loss+in+Ovariectomized+Dtg+A&#946;PP/PS1+Mice.">17&#945;-Estradiol Attenuates Neuron Loss in Ovariectomized Dtg A&#946;PP/PS1 Mice.</a> J. Alzheimers Dis. 23 (4), 629-639 (2011).</li><li>Parker, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+conservation+at+the+time+of+hysterectomy+and+long-term+health+outcomes+in+the+nurses'+health+study.">Ovarian conservation at the time of hysterectomy and long-term health outcomes in the nurses' health study.</a> Obstet Gynecol. 113, 1027-1037 (2009).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

卵巣摘出とそのままで、生殖細胞枯渇卵巣の移植は、21 日から生後 18 カ月までマウスで行われています。実行すると、卵巣摘出卵巣の嚢をそのまま維持することが望ましいが、ファブリキウス嚢の組織を切開するときに注意する必要があります。マウスは生後 6 か月よりも古い、滑液包の多くなる脂肪のパッドは、アクセスに使用できる領域を制限がかぶせてありました。これらのケースでそれはしばしば滑液包を脂肪パッドの国境近くに開いて涙に有利です。このメソッドは、しばしば 'タック' 新しい卵巣滑液包内にファブリキウス嚢組織のより簡単にアクセスできる 'ポケット' を残します。このアプローチはまたファブリキウス嚢の組織を閉じるに少ない縫合を要求できます。滑液包の開口部を横に回転はまた縫合中に場所に新しい卵巣を保つを助けることができます。
時折、ファブリキウス嚢の組織には、過度の脂肪パッドの範囲、管の異常な方向のため広く開かれるまたは取得困難な卵巣組織片を回復する必要があります。これらのケースで新しい卵巣隠れてことができない効果的にあります '' 滑液包に。開いている滑液包の上に卵巣と卵巣の半分より多くは残りのファブリキウス嚢の組織で覆われている、巾着縫合は滑液包や卵巣の周囲の引き裂かれたエッジを離れてよく配置されます。財布のひもを締めるゆっくりと卵巣が残りの滑液包にまで押し込まれて、滑液包がインプレースでは、卵巣を保つために十分にずっと閉鎖が完全に閉じないことがあります。卵巣が開いている滑液包の上に設定されていて、卵巣の半分以下が残りのファブリキウス嚢の組織で覆われている縫合糸が反対側の滑液包を卵巣を片側にブルサの引き裂かれたエッジを離れてよく置かれて、上に結び目卵巣。このメソッドは、複数の縫合が必要な場合があり、ファブリキウス嚢の組織によって卵巣の完全なカバレッジで起因しません。ただし、このメソッドは代わりに卵巣を保持し、効率的な血行再建術と卵巣活動の最終的な再開を許可します。
実行すると、卵巣が卵巣嚢をそのまま維持することが望ましい、また注意が必要内因性卵巣組織のすべてが削除されることを確認します。これは、大規模な内因性卵巣で難しいこと。できるだけ多くファブリキウス嚢の組織として維持するためには、個の大きな卵巣を削除できます。ただし、このメソッドを使用するとき余分な警戒を使用すべて内因性卵巣組織が削除されたことを確認する必要があります。卵巣の一部が削除され、滑液包が血液で満たされ、これは難しいことです。止血泡パッドの小片は、血を転置し、滑液包内凝固で助けるオープン ブルサに配置できます。30-60 秒後止血泡パッドが削除され、滑液包の検査 (滑液包がありますも軽くで洗浄生理食塩水) 残った卵巣フラグメントが存在します。
卵巣移植移植卵巣が確立された血液供給から分離する必要があり、その新しい家に卵巣の血行再建術が即時ではないです。このため、移植卵巣が壊死していくつか、主に卵胞の成熟および/または採用を含みます。移植卵巣の大半は移植後まもなく周期的活動を表示し、いくつかの移植は死に至るまでに循環し続けます。したがって、強く移植卵巣の新しいホスト統合の確立に影響を与える、移植の壊死のため卵胞の損失が表示されません。
哺乳類の老化に勝つ眺めは、エストロゲンが唯一の重要な生殖健康影響を表すことです。劇的な変化は昔の健康観察新しい卵巣を受けたマウスが循環のエストロゲンのレベルの単純な復元として簡単に却下します。しかし、3 つの研究所20、個別にレプリケートされる、最近の研究でエストラジ オール 17-α なかった 10 ヵ月齢から給紙すると女性の寿命に及ぼす影響。これは確かによりよく知られている 17 β エストラジとして同じホルモンではありませんが、エストラジ オール 17-α シグナリング21に生得的にされて多くのエストロゲンの効果を医療関連。エストロゲン療法は閉経後の女性に多くの年齢関連の病理学の正と負の両方の影響があることが示されているし、明らかには所有していない閉経後の女性で同じ影響は若い女性。卵巣の胚細胞枯渇はまださらに postreproductive の卵巣の除去、死亡率が増加健康促進の属性を持っている生殖細胞刺激のエストロゲン産生が更年期障害での再生の重要なを含む加齢に伴う疾患22。卵巣摘出マウス シャム手術マウス (728 日、それぞれ19対 715 日) より若干短い寿命のスパンがあります。長寿に影響を与えるメカニズムが保存された、健康にまたがる哺乳類の拡張のため、モデル生物からの証拠はエストロゲンのみの説明に対して論争します。
卵巣とアクティブな生殖細胞の移植は、ホルモン療法単独では達成するために苦労しているレベルに健康上の利点を改装します。女性の加齢の影響を受ける悪影響、健康の多くの側面は、高齢マウスにおけるアクティブな卵巣機能の再建に積極的に影響があります。ただし、最近の試験研究は、卵巣胚細胞ホルモンに依存しない程度に、これらの効果ことができますをお勧めします。

生殖の健康と寿命に及ぼす影響はしばしば誤ってとして生殖能力を取囲む期間だけに限定されると考えます。一方、ライフ スタイルや寿命の生殖能力の段階に関連付けられている表現型は前後 postreproductive の段階から簡単に区別、生殖状態寿命のすべてのフェーズを通じて健康に影響します。生殖能力の期間は、時系列の寿命と違い生殖の寿命としても呼ばれます。この用語は、現実に 2 つの寿命指定の人工分離にそれ自身を貸す、両方がイベントで互いに密接に結ばれた影響を与える 1 つは、多くの場合、他にも影響を与えます。
過去 10 年間の証拠では、個々 の生殖の状態が慢性の健康条件1を開発のリスクの増加に関連付けられていることを示します。1 つの研究では、男性2のコホートの短い寿命のスパンと繁殖障害間の関連付けを記載されています。協会は、女性にももっと印象的です。心血管疾患は閉経前の女性3、まれであるが、卵巣障害更年期障害4で鋭く、早発閉経5若年成人女性の心血管疾患が増加します。インスリン抵抗6骨損失更年期障害7増加、ほぼ 3 分の 2 のアメリカ人のアルツハイマー病の女性8。卵巣シグナル伝達の明確な変化は、閉経前、耐病性の状態から閉経後、疾病負担の状態への移行をマークします。この安定した移行では、老化で病気リスクを加速するメカニズムを識別するために機会を示します。
最近では、凍結保存した卵巣組織の移植は、生殖細胞、化学療法などを危険にさらす可能性があります医療を受ける女性の出生率を復元する使用されています。卵巣のティッシュの移植は、トランスジェニック マウス9を含む非卵巣のベース不妊症動物の実行可能な子孫を生成する使用できます。卵巣移植、生殖機能や日付順エージング自体から生殖加齢の影響を分離する効率的な方法です。
女性の健康の多くの面で卵巣ホルモンの支持の役割を確立は、積極的に更年期障害で増加病リスクの主要な原因として生殖細胞を自転車からのホルモンの生産の損失を関係づけます。女性健康で卵巣ホルモンの値は疑わしいが、更年期と閉経後の女性でこれらのホルモンの交換されている若い卵巣で若い女性によって楽しんだ健康上の利点の復元で信頼性の高い。これらの健康上の利点は、heterochronic postreproductive の雌マウス10、11,12,13,14に若い卵巣移植による確実に復元されます。
ドナーとレシピエントの両方のマウスの生殖の状態前に、移植や卵巣摘出手術の手順の後決定してください。看板を生後 12 ヶ月で手術前に性腺の入力の推定の postreproductive マウスは、これらの実験から除外されます。生殖腺の入力は、膣細胞診によって決定されます。膣細胞診上のデータは、少なくとも 10 日間連続受信者マウスで postreproductive 状態とドナー マウスの卵巣を積極的にサイクリングできるように手術前の収集されます。日から期間が上皮細胞を核として、発情のサイクルが定義されている 1 つが最初に表示されます (すなわちproestrus) 漢方薬の期間があること、前日核上皮細胞は膣塗抹標本の次の外観に間で (すなわち発情) の存在。発情は、大規模な扁平上皮細胞、核の有無の存在によって決定されます。マウスを表示しない周期的活動前に 10 日間の期間または期間の生殖腺の入力がないように手術が決定された後。マウスは前に 10 日間でおよび/または生殖腺入力する当該期間の手術が決定された後、少なくとも 1 つの完全発情周期を表示します。雌マウスは雄マウスの存在下で収容またはサイクルを誘発する刺激に一貫性のある露出を確保するため男性のケージから汚れた寝具にさらされる必要があります。
移植手順は、二つの外科医が同時にドナーと受信者のマウス作業で最も効率的に行われます。ただし、手順は簡単に、受信者のマウスの卵巣摘出手術の手順を開始する前にほとんどの場合回復ドナー卵巣 1 つの外科医によって実行されます。このプロトコルでは、単一の外科医のための手順について説明します。通常、取り外しと卵巣の交換は顕微鏡下で行われるに対し、生殖管の露出とサイトの閉鎖を顕微鏡なし行われます。あらゆる手術の方法を学習、切開サイトが大きい場合があり、手術が最初にプロシージャを学びながら長い時間がかかるし、一般的に経験と低下します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Any dissecting scope with an adjustable working distance.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm Water Recirculator and appropriate pad for your size surgical/recovery field.</td>
			<td>Stryker/Gaymar</td>
			<td>TP700</td>
			<td>Circulating water pads produce even and consistent temperature operating and recovery fields.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instruments-dissection instruments for access to the reproductive tract</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Choice of specific surgical instruments is highly surgeon-specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instruments-fine instruments for the transplantation procedure.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Choice of specific surgical instruments is highly surgeon-specific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture material for abdominal wall</td>
			<td>eSutures</td>
			<td>G3756K: 6-0 MILD CHROMIC GUT 18&#34; HE-7 CUTTING, DOUBLE ARMED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture material for ovarian bursa</td>
			<td>eSutures</td>
			<td>2809G: 9-0 or 2810G: 10-0 ETHILON BLACK 5&#34; BV130-5 TAPER</td>
			<td>10-0 suture can be difficult to locate if dropped on the surgery field.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable gelatin sponge</td>
			<td>PFIZER.</td>
			<td>Gelfoam- PFIZER 09-0315-08.</td>
			<td>cut into small (~2mm) pieces under sterile conditions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staples for skin closure</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>MikRon Autoclip 9mm (BD 427631)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment.</td>
			<td>MWI Veterinary Supply Co.</td>
			<td>Puralube sterile opthalmic ointment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes for anesthesia, analgesia and epinephrine</td>
			<td>MWI Veterinary Supply Co.</td>
			<td>BD 305536</td>
			<td>27g x 3/8in,Intradermal Bevel 1/2ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes for saline.</td>
			<td>MWI Veterinary Supply Co.</td>
			<td>BD 309657.</td>
			<td>3ml syringe, luer-lok tip, 27g needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers/blade</td>
			<td>Andis</td>
			<td>Super AGR+&#8482; Cordless Detachable Blade Clipper and a CeramicEdge&#174; #40 blade.</td>
			<td>Any clippers with a fine blade.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>University chemical supply</td>
			<td></td>
			<td>dilute to 70% for use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution</td>
			<td>MWI Veterinary Supply Co.</td>
			<td>003233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x2 gauze pads</td>
			<td>MWI Veterinary Supply Co.</td>
			<td>003073</td>
			<td>autoclaved with surgery packs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>Z273619</td>
			<td>Autoclave in sintilation vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-vinylcyclohexene diepoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>94956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sesame oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>S3547</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

orthotopic ovarian transplantation procedures to investigate the life- and health-span influence of ovarian senescence in female mice

卵巣移植は 1963 年にユタ州立大学に初めて実施されました。最近の作品で哺乳類卵巣の heterochronic 移植を若い女性で若い卵巣の健康保護効果を調査するため使用されています。現在のプロシージャでは、卵巣嚢の元の位置に戻って同種卵巣を移植するところ、同所性同種移植法を採用しています。これは、皮下や腎被膜下卵巣・卵巣組織のより一般的に使用される異所性移植とは対照的です。すべての 3 つの場所は、移植された組織の効率的な血行再建術を提供します。しかし、同所性同種移植は、最も自然な信号環境に卵巣を提供し、術後自然を再現する動物のための機会を提供する唯一の手順です。1 つは卵巣摘出のプロシージャの間にすべての内因性卵巣組織を除去する世話をしなければなりません。内因性の任意の組織が残っている場合、または 1 つの卵巣が削除された場合にのみ、既存の組織には老齢になるまで移植された組織は休眠残ります。臓器移植レシピエントがかなりの政権が、移植に関連するシグナル伝達、新しい視床下部/下垂体・性腺・副腎 (HPG/A) 軸に適応する時間を取ることができる移植卵巣の血行再建術は非常に迅速に行われている間組織。通常マウスに約 100 日かかります。したがって、移植実験はこの適応期間に合わせて設計する必要があります。典型的な卵巣移植により受信者の暦年齢ではなく移植卵巣の年齢を反映する受信者の健康の変更が含まれます。

21 日齢で卵巣が思春期の発症時の生殖器系の主要な発現を回避し、女性の生殖腺は生殖腺ホルモンの直接的な影響するさらに必要がありますその他の影響を除去します。CBA/J マウスの生殖減少は通常 8-10 ヶ月の不規則な周期で始まります。歳 11 ヶ月でマウスのこのラインのほとんどの女性が 12 カ月齢で応答卵母細胞の完全な損失と繁殖障害15ポイントに到達します。これらの年齢は、マウスの系統によって異なります。両側卵巣摘出・卵巣移植は、通常、数日以内移植卵巣の活性化の結果します。移植前に受信者の内因性卵巣 (片側卵巣摘出) の両方を削除する失敗は、内因性は残存卵巣が削除されるまで残りの休眠移植卵巣になります。手術はほとんど行われる (exteriorizing 道)、オープン フィールドで、解剖顕微鏡 (卵巣摘出と移植のプロシージャ)。
寿命の延長 CBA/J 雌マウスの平均寿命のスパンは 644 日18です。手術 (シャム [卵巣除去と即時交換] または移植) マウスは、少なくとも手術の時にライブに選ばれました。実験によって、これは年齢の 11 と 18 ヶ月の間でした。最初の実験19、生後 11 ヶ月で手術を行った偽マウス住んで 728 日 (手術後 393 日) の平均、新しい卵巣を受け取るそのままマウス住んで 811 日 (476 日過去の手術、GC-テキサス州-1、図 1)。最近の実験では、生後 17 ヶ月で手術を行った、新しい卵巣を受け取るマウス住んで 798 日 (281 日過去の手術、GC-テキサス州-2)。卵巣の胚細胞枯渇を受けたマウスは 880 日の平均寿命にこれを拡張 (363 日間手術後)。
健康の範囲の拡張 受信した新しい、生殖細胞を含む卵巣が大幅減少心血管疾患10と整形外科疾患11を表示し、いくつかの健康の重要な改善を示したマウスにまたがるパラメーター。生後 12 ヶ月で新しい卵巣を受信し、年齢の 16 ヶ月で測定した postreproductive マウスを示して減少サルコペニア12, 免疫系と腎機能の改善13, と改良された認知行動と感覚機能14.
生殖細胞の枯渇の検証 VCD で 15 日間の 28 日齢雌 CBA/J マウスの治療は、原始、プライマリ卵胞の (生殖細胞を含む) の枯渇の結果します。CBA/J マウスの生殖周期 (永続的な膣に角化) の VCD 既に表示されて治療停止の開始後わずか 37 日で分析減少卵巣重量 (1.7 mg 0.9 mg VCD 処理の対オイル専用) 原初の枯渇とコントロール (図 2) と比較して、主な卵巣の卵胞。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56638/56638fig1.jpg"> 図 1:Postreproductive 受信者で寿命に及ぼす若い卵巣。11% 寿命を延長 11 ヶ月齢マウスに移植した若い卵巣 (GC-テキサス州-1 n = 14, 60 日齢を受けた生後 11 ヶ月で生殖細胞を含む新しい卵巣)。生後 17 ヶ月で若い卵巣の移植に寿命延長の変化生成されません (GC-テキサス州-2 n = 5, 60 日齢を受けた生後 17 ヶ月で新しい卵巣の生殖細胞を含む)。21% の寿命の延長を倍増した若い卵巣移植前から生殖細胞を破壊 (GD テキサス州 n = 5, 60 日齢を受けた生後 17 ヶ月で新しい卵巣の生殖細胞枯渇)。没年: AAD。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56638/56638fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56638/56638fig2.jpg"> 図 2: CBA/J マウスの小さな卵胞の VCD 枯渇します。H & E 染色のセクション (25 X) 油処理 (A) 豊富な小龍包を示す (n = 6) マウス、(B) VCD 処理で小卵胞数は減少 (n = 4) マウス、(C) と原初とプライマリの両方に有意差卵胞数。矢印は、原始、プライマリ卵胞を示します。エラー バーを表す SE.<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56638/56638fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

Watch this Scientific Journal Video about Orthotopic Ovarian Transplantation Procedures to Investigate the Life- and Health-span Influence of Ovarian Senescence in Female Mice at JoVE.com

Orthotopic Ovarian Transplantation Procedures to Investigate the Life- and Health-span Influence of Ovarian Senescence in Female Mice

ここで説明した、受信者のマウスの生理学的卵巣の影響を修正するための卵巣移植プロトコルです同所性同種。この手術は、メスのマウス卵巣の影響の様々 なタイプの公開に使用し、heterochronic 移植と様々 な前のヴィヴォトリートメントを受けた卵巣の移植があります。

卵巣の老化雌マウスで寿命と健康影響を調査するため同所性卵巣移植手順

Ovarian transplantation was first conducted at Utah State University in 1963. In more recent work, heterochronic transplantation of mammalian ovaries is ...

orthotopic-ovarian-transplantation-procedures-to-investigate-life

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K ビュー.  Utah State University. ここで説明した、受信者のマウスの生理学的卵巣の影響を修正するための卵巣移植プロトコルです同所性同種。この手術は、メスのマウス卵巣の影響の様々 なタイプの公開に使用し、heterochronic 移植と様々 な前のヴィヴォトリートメントを受けた卵巣の移植があります。

ビデオ: Orthotopic Ovarian Transplantation Procedures to Investigate the Life- and Health-span Influence of Ovarian Senescence in Female Mice

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

文化と共培養マウスの卵巣と卵胞

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

発生生物学

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

の共焦点分析を用いました<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt; WntおよびShhのモルフォゲン勾配の調節を調査するために、

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. This morphological alteration is also recognized as epithelial to mesenchymal transition (EMT). Dysregulation of EMT is associated with fibrosis and cancer metastasis. There is emerging evidence that EMT is controlled by a number of molecular mechanisms. As such, many key genes that control apical constriction are also known to be important factors in the EMT observed in cancer metastasis. Like EMT during Drosophila gastrulation, epithelial cells can be induced to change their shape and be reprogrammed to redirect cell fate towards various other cell types. Here we provide a robust imaging method of Drosophila gastrulation to assay the initiation of morphogenetic cellular movements and cell fate identification during this stage of embryonic development. Using this method, we identify cell rearrangement at the time of gastrulation and demonstrate the importance of apical constriction during gastrulation using GFP labeled DE-cadherin.

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Herein we describe a procedure to capture live images of Drosophila gastrulation. This has enabled us to better understand the apical constriction involved in early development and further analyze mechanisms governing cellular movements during tissue structure modification.

セル形状変化のイメージングと細胞運動で<em&gt;ショウジョウバエ</emDEカドヘリンレポータートランスジェニックハエを使用&gt;原腸陥入

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

血管内皮幹細胞の血管形成を視覚化するための新規乳腺脂肪移植技術

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

傷害による老化と生体内での骨格筋におけるリプログラミングの評価

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

ライブショウジョウバエ卵巣組織の卵胞幹細胞系列のイメージング細胞内 pH の方法

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called liquefaction. In this study, we show how to collect the post-ejaculated semen from the female reproductive tract in a mouse model. First, adult female mice in the estrus stage were housed in a male&#39;s cage overnight. The next morning, copulation was confirmed by the presence of copulatory plug at the vaginal opening. Female mice with copulatory plugs were euthanized, and each reproductive tract was collected as a whole (vagina, uterus, oviducts, ovaries), ensuring a closed system to contain the semen. The reproductive tract was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube, and the vagina was cut off to release the semen into the tube. To ensure maximum semen volume for analysis, toothless forceps were used to squeeze the uterine horns from ovarian end to vaginal end expelling remaining semen. The whole reproductive tract was then discarded. The semen-containing tube was briefly spun down. A 25 &#956;L capillary pipette was placed into the tube at a 180&#176; angle (parallel to the tube wall). The amount of time used to fill the capillary tube to the 25 &#956;L line was recorded. Semen from a proven male breeder usually takes approximately 60-180 s to fill a 25 &#956;L capillary tube. This semen collection technique can also be used in other downstream applications such as sperm imaging and motility analysis.

Semen liquefaction is required for sperm to be liberated from the seminal gel. This study provides the procedures for collecting semen from the female reproductive tract post-coitus, and measuring semen liquefaction time.

ポスト交配精液女性の生殖器官とマウスの精液の液状化測定からのコレクション

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a hallmark of various pathophysiological conditions including tumor suppression, tissue remodeling and aging. The inducers of cellular senescence in vivo are still poorly characterized. However, a number of stimuli can be used to promote cellular senescence ex vivo. Among them, most common senescence-inducers are replicative exhaustion, ionizing and non-ionizing radiation, genotoxic drugs, oxidative stress, and demethylating and acetylating agents. Here, we will provide detailed instructions on how to use these stimuli to induce fibroblasts into senescence. This protocol can easily be adapted for different types of primary cells and cell lines, including cancer cells. We also describe different methods for the validation of senescence induction. In particular, we focus on measuring the activity of the lysosomal enzyme Senescence-Associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the rate of DNA synthesis using 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay, the levels of expression of the cell cycle inhibitors p16 and p21, and the expression and secretion of members of the Senescence-Associated Secretory Phenotype (SASP). Finally, we provide example results and discuss further applications of these protocols.

Here, we discuss a series of protocols for induction and validation of cellular senescence in cultured cells. We focus on different senescence-inducing stimuli and describe the quantification of common senescence-associated markers. We provide technical details using fibroblasts as a model, but the protocols can be adapted to various cellular models.

ひと初代細胞における細胞老化の誘導性

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

「マウス卵巣における現象を可視化する卵巣の組織培養

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. Recent studies have extended the role of cellular senescence to various physiological processes, including development, wound healing, immune surveillance, and age-related tissue dysfunction. Although cell cycle arrest is a critical hallmark of cellular senescence, an increased intracellular reactive oxygen species (ROS) production has also been demonstrated to play an important role in the induction of cellular senescence. In addition, recent studies revealed that senescent cells exhibit potent paracrine activities on neighboring cells and tissues through a senescence-associated secretory phenotype (SASP). The sharp increase in interest regarding therapeutic strategies against cellular senescence emphasizes the need for a precise understanding of senescence mechanisms, including intracellular ROS and the SASP. Here, we describe protocols for quantitatively assessing intracellular ROS levels during H-Ras-induced cellular senescence using ROS-sensitive fluorescent dye and flow cytometry. In addition, we introduce sensitive techniques for the analysis of the induction of mRNA expression and secretion of SASP factors. These protocols can be applied to various cellular senescence models.

Intracellular ROS has been shown to play an important role in the induction of cellular senescence. Here, we describe a sensitive assay for quantifying ROS levels during cellular senescence. We also provide protocols for assessing the senescence-associated secretory phenotype, which reportedly contributes to various age-related dysfunctions.

癌遺伝子が誘導する老化の中に活性酸素種および分泌老化関連の表現型正常ひと線維芽細胞の定量測定

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...