プロジェクトは、ドイツのホセ ・ カレーラス白血病財団 (DJCLS 14 R/2017) によって支えられました。

ここで説明したすべてのメソッドは、ハイデルベルク大学医療学部マンハイムの倫理委員会 II によって承認されています。インフォームド コンセントを得たすべての個人から書き込まれます。
 1。 材料準備 <ol><li>抗凝固剤原液: 0.9% 塩化ナトリウムの mL あたり 200 i. u. ヘパリンの抗凝固薬の原液を準備。コレクション チューブのそれぞれを入力 (ボリュームを描く 9 mL) 血液または骨髄のサンプルの撤退前に抗凝固剤の原液 2 mL と</li>。
	<li>赤い細胞の換散ソリューション: 準備、10 x 82.91 g 塩化アンモニウム、重炭酸アンモニウム 7.91 g、8.0 でエージェントを溶解して pH を 0.5 M エチレンジアミン四酢酸溶液 2 mL と赤血球の溶解液1 の容量の二重蒸留水・ l ・</li>
	<li>固定の解決: マイクロタイター チューブで 360 mg パラホルムアルデヒド (PFA) に 1 M 水酸化カリウム溶液を追加 8.3 μ L。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) チューブと熱 36 %pfa 溶液の 1 mL を取得する 95 ° C で加熱ブロック管内の 1 mL マークで管を埋めます。容量は 15 mL チューブに 1 mL 36 %pfa ソリューションを転送します。8 mL の PBS を 4 %pfa ストック液 9 mL を得るために 1 mL 36 %pfa のソリューションに追加します。細胞の固定用 4 %pfa 原液と-18 ° c までストア因数 。
	注意: 1) 水酸化カリウム水溶液腐食性です。目と皮膚の保護の注意してください。2) PFA は、発がん性があります。皮膚への接触や吸入を避けます。フードの下の固定の解決の準備します</li>。
	<li>透過ソリューション: およそ 0.1% のソリューションを取得する追加 50 μ L Octoxinol 50 に 9 mL PBS Octoxinol 9.</li>
	<li>ソリューションをブロック: 5% と 2 %6 で PBS とストアを持つ蛋白質のブロッキング剤を混合することによって解決を妨げる準備 &#8211; 8 ° C</li>
</ol> 2。サンプルの準備 <ol><li>細胞培養線維芽細胞: の加湿 5% の細胞株培養線維芽細胞を養う CO 2 雰囲気 4 mM 10% 牛胎児血清添加 RPMI 1640 培地で 37 ° C でグルタミン、および 1% ペニシリン/ストレプトマイシン。
	<ol><li>付着と顕微鏡のスライドの準備線維芽細胞 <ol><li>は、フラスコ (75 cm 2 成長分野) 指数関数的に成長の培養線維芽細胞からメディアを削除します。フラスコに 10 mL の PBS を追加します。手動で 1 分のフラスコを振ることによって付着線維芽細胞を優しく洗って</li>
			<li>は、PBS を削除し、フラスコに 1 mL のトリプシンを追加します。すべての付着性細胞がトリプシンによって覆われているように優しくフラスコを振る。フラスコからトリプシンを削除します。37 で 5 分のためのインキュベーターにフラスコを入れ ° C</li>
			<li>は、インキュベーター外フラスコを取るし、フラスコに 10 mL RPMI 1640 媒体を追加します。ピペットの繊維芽細胞を分散させるために数回上下中です</li>。
			<li>は、顕微鏡スライドの 2 つのフィールドのそれぞれに分散した線維芽細胞の 0.3 mL のピペットし、24 h のためのインキュベーター内にスライドを置き、繊維芽細胞がスライドに従います。ΓH2AX と線維芽細胞の核 53BP1 の是非、ステップ 3.1 に移動します</li>。
		</ol></li></ol></li> <li>患者サンプル <ol><li>血液サンプル: 抗凝固剤原液 2 mL で満ちていたコレクション チューブを使用し、チューブに 7 mL の血液を追加。一晩室温 (すなわち 18-20 ° C) で試料を保存します。次の日、密度勾配遠心法 (ステップ 2.2.3) による単核細胞を休んで G0/G1 相を分離します</li>。
		<li>骨髄サンプル: 抗凝固剤の原液 (ステップ 1.1) の 2 mL で満ちていたコレクション チューブを使用して、チューブに 7 mL の骨髄を追加。一晩室温 (すなわち 18-20 ° C) で試料を保存します。次の日は、密度勾配遠心法 (ステップ 2.2.3) による単核細胞を休んで G0/G1 相を分離します。CD34 のマイクロ ビーズを使用し、CD34 陽性細胞を分離するための分離カラムのセルします</li>。
		<li>密度勾配遠心法による単核細胞の分離 
		メモ: 単核細胞は密度勾配遠心法 17 , 18 , 19 血液、骨髄サンプルから分離されます。
		<ol><li>Dilute PBS で 1:1 の比率でヘパリン加血液サンプルおよび PBS で 1:3 の比率でヘパリン骨髄サンプル。ピペットのうち 2 回、それらを描画することによって、細胞を優しく中断します</li>。
			<li>は、新鮮なチューブに密度勾配媒体のボリュームを追加します。優しくレイヤーの希釈血液または骨髄密度勾配媒体の上に。2 つのレイヤーを混在させるように注意してください</li>。
			<li>は、室温で 30 分間チューブを遠心分離機し、400 x g. ピペットの上部のプラズマ層を引き。密度勾配媒体上の層の単核細胞を慎重に収穫後は。新鮮なチューブに単核細胞を転送します</li>。
			<li>は、チューブの単核の細胞に PBS の少なくとも 3 つのボリュームを追加します。ピペットのうち 2 回、それらを描画することによって細胞を優しく中断します。部屋の温度と 400 x g で 10 分間のチューブを遠心</li>
			<li>スピン後上澄みを除去し、4 ° C、1 x 赤い細胞の溶解液 10 mL を加えます。優しくピペットのうち 2 回、それらを描画することによって、細胞を再懸濁します、5 分間氷の上管を配置します。4 ° C で 30 mL の PBS を追加し、室温と 400 x g で 10 分間のチューブを遠心</li>
		</ol></li> <li>、Cytospins の準備 <ol><li>患者サンプル (すなわち、1 つ cytospin γH2AX 蛍光染色、γH2AX、53BP1 の 1 つ cytospin の単核の細胞との 2 つの cytospins の準備免疫蛍光染色の組み合わせ) を (300 × g, 10 分) 遠心 ( 図 3 および 4) のそれぞれの準備のための 10 の 5 セル × 1.0</li>。
		</ol></li></ol></li></ol> 3。 γH2AX 53BP1 免疫蛍光染色と <ol><li>固定・透過: 4% の 200 μ l でセルを修復する PFA 10 分。固定後、3 回ラボ シェーカーで各 5 分の 30 mL の PBS のセルを優しく洗います。その後、セルを permeabilize 0.1% の 200 μ L で 10 分間 Octoxinol 9 セルを洗浄して優しくラボ シェーカーで各 5 分 5% ブロッキング溶液 30 mL を 3 回。30 mL の新鮮な 5 %1 h. の解決を妨げるに細胞をブロック</li>
	<li>抗体の孵化 <ol><li>インキュベート マウス モノクローナル抗 γH2AX 抗体 (1: 500) の細胞の 1 つ準備およびマウス モノクローナル抗 γH2AX 抗体 (1: 500) と細胞の他の準備とアンチ 53BP1 ポリクローナルウサギ (1: 500) 一晩で 4 ° C</li>
		<li>インキュベーション洗浄セル軽くラボ シェーカー各 5 分の 2% ブロッキング溶液 30 mL に 3 回後</li>。
		<li>ブロックのソリューションを削除し、Alexa488 共役ヤギ抗マウス二次抗体 (1: 500) とセルの最初の準備と、Alexa488 共役ヤギ抗マウス抗体 (セルの 2 番目の準備を孵化させなさい1: 500)、常温で 1 h の Alexa555 共役ロバ抗家兎二次抗体 (1: 500).</li>
	</ol></li> <li>メディアをマウント: 細胞とスライドをボウルに入れ、セルを洗浄して優しくラボ シェーカー各 5 分の 30 ml の PBS の 3 回。PBS を削除し、セルを 4, 6-diamidino-2-phenylindole を含むメディアをマウントをマウントします。気泡がないように慎重にメディアをマウントの上に coverslip を置く埋め込まれています。蛍光顕微鏡による細胞を分析する前にメディアをマウントの強化のため、少なくとも 3 時間待機します</li>。
</ol> 4。ΓH2AX、53BP1 の解析巣 <ol><li>蛍光顕微鏡: 100 X 目的で画像の中に、DAPI、アレクサ 488 Cy3 フィルターを搭載した蛍光顕微鏡で細胞核内 γH2AX、53BP1 の巣を分析倍率。カメラで画像を記録し、適切な画像処理ソフトウェアで画像を処理します</li>。
</ol>

<ol>
	<li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+maintenance+mechanisms+for+preventing+cancer.">Genome maintenance mechanisms for preventing cancer.</a> Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).</li><li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instability+and+decay+of+the+primary+structure+of+DNA.">Instability and decay of the primary structure of DNA.</a> Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).</li><li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+replication+stress.">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li><li>. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture Available from: <a target="_blank" href="https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf">https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf</a> (1994)</li><li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+DNA+double-strand+breaks:+production,+fidelity+of+repair,+and+induction+of+cancer.">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).</li><li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation.">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).</li><li>Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+NHEJ-derived+reciprocal+chromosomal+translocations+does+not+require+Ku70.">Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70.</a> Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Scully, R., Xie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+strand+break+repair+functions+of+histone+H2AX.">Double strand break repair functions of histone H2AX.</a> Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).</li><li>Walters, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+ongoing+DNA+damage+in+multiple+myeloma+cells+as+revealed+by+constitutive+phosphorylation+of+H2AX.">Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX.</a> Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).</li><li>Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+expression+of+phosphorylated+histone+H2AX+in+tumors+in+relation+to+DNA+double-strand+breaks+and+genomic+instability.">Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability.</a> DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).</li><li>Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GammaH2AX+in+cancer+cells:+a+potential+biomarker+for+cancer+diagnostics,+prediction+and+recurrence.">GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence.</a> Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).</li><li>Chen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK2V617F+promotes+replication+fork+stalling+with+disease-restricted+impairment+of+the+intra-S+checkpoint+response.">JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).</li><li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+of+DNA+damage+and+alteration+of+the+DNA+damage+response+in+myelodysplastic+syndromes+and+acute+myeloid+leukemias.">Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias.</a> Leuk Res. 57, 112-118 (2017).</li><li>Panier, S., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+repair:+53BP1+comes+into+focus.">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).</li><li>Escribano-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+cycle-dependent+regulatory+circuit+composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+controls+DNA+repair+pathway+choice.">A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice.</a> Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+White+Blood+Cells.">Separation of White Blood Cells.</a> Nature. 204, 793-794 (1964).</li><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.+Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation,+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1+g.">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g.</a> Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).</li><li>Bain, B., Pshyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+reactivity+in+mixed+leukocyte+cultures+after+separation+of+mononuclear+cells+on+Ficoll-Hypaque.">Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque.</a> Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).</li><li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+DNA+damage+after+reduced+and+conventional+absorbed+radiation+doses+using+3rd+generation+dual-source+CT+technology.">Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology.</a> Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).</li><li>Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+DNA+damage+after+multi-detector+row+CT:+a+quantitative+biomarker+of+low-level+radiation+exposure.">Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure.</a> Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).</li><li>Lobrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks+after+computed+tomography+examinations.">In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fixatives+for+immunostaining.">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+cell+membranes.">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).</li><li>Rothkamm, K., Lobrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+lack+of+DNA+double-strand+break+repair+in+human+cells+exposed+to+very+low+x-ray+doses.">Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

ΓH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡は、形成と幅広い分野で DSB の修復の分析に有用な方法です。実験の結果に影響を与える重要なパラメーターは、細胞周期、固定と透過の細胞、抗体、およびハードウェアの選択、蛍光顕微鏡のソフトウェアに使用されるエージェントの段階です。
正常線維芽細胞細胞株培養を指数関数的に成長することにより細胞周期の γH2AX の巣パターンに及ぼす影響を示した。G0/G1 の異なる蛍光ドットとして登場した γH2AX 巣と S 期 (図 5) で分散したパン核 γH2AX 斑点と比べて G2 段階。G0/G1 の異なる γH2AX 巣相し、G2 段階一過性および/または構成で指定された DNA の損傷セル繰り返し通路中に取得しました。逆に、S 相に分散した斑点のみ一過性が発生し、レプリケーション ・ プロセスとおそらく関連していた。パン核 γH2AX 斑点を妨げる可能性があります分析から S 期細胞の排除、本物 γH2AX 病巣の解析を推奨します、S 相の特定 γH2AX パターンによって容易に行われています。また、DAPI 信号の強度を測定することによって相の特定のマーカーの S (例えばサイクリン A) のアプリケーションは、S 期細胞を除外できます。また、G0/G1 期の細胞の同期と増殖停止の誘導は一晩室温 (すなわち18-20 ° C) でサンプルを保存することにより、cytospins を準備する前に役に立つかもしれません。
固定と透過のプロシージャは、γH2AX、53BP1 の染色で重要な手順です。固定は形態および細胞23の抗原性を維持するために必要です。透過は、細胞内および核抗原24にアクセスをできます。PFA は固定のため比較的穏やかなエージェントをフォーム メチレン架橋する塩基性アミノ酸との反応によるタンパク質の構造を維持しながら細胞を安定化します。PFA と固定後、数日から数週間後の処理までの cytospins を格納できます。ΓH2AX、53BP1 の検出、セルはグリセリンがする必要があります。Octoxinol 9 は、ポリオキシ エチレン鎖から成る中性の親水性のヘッド グループを含む非イオン性洗剤として使用されました。Octoxinol 9 は、優しく細胞核を分割し、非常にはっきりと γH2AX の巣が維持されます。また、あまりにも固定のセルの透過メタノール使用できます。メタノールは、タンパク質を沈殿させるし、抗体を透過し、細胞膜の脂質を分解します。しかし、メタノールによる治療はおそらくより積極的な γH2AX 巣がありますとしてはっきりと 4 %pfa と 0.1% 治療によって得られる γH2AX の巣と比較されたとき Octoxinol 9。にもかかわらず、効率的な抗体は、γH2AX、53BP1 の免疫の重要な役割を再生します。したがって、実績のある抗体の使用をお勧めします (テーブルの材料/機器を参照してください)。抗体のシリアル希釈は、最適な抗体濃度測定における役に立つかもしれません。
ΓH2AX 巣は低用量放射線 biodosimetry 内のマーカーとして使用される &#62; 1 mGy25。ΓH2AX 巣を 100 mGyの in vitro (図 6) の線量は照射後 5 分でリンパ球で行った。H2AX を照射後 DSB のサイトで急速にリン酸化されると γH2AX の巣の数がすでに照射20,22後 5 分で最大に達する。ただし、照射後すぐに修復処理を開始、γH2AX 巣が明瞭な減衰率で削除されます。したがって、時系列で γH2AX 巣の数を監視するため、照射後の時間で指定された時点で氷のサンプルを置くことによって修復プロセスを中断することをお勧めします。
ΓH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡は、癌細胞における遺伝子不安定性の分析に有用な方法です。CD34 陽性細胞は、CD34 のマイクロ ビーズを用いた急性骨髄性白血病患者の骨髄から濃縮しました。ΓH2AX 巣と巣 53BP1 のイメージは、特定の蛍光フィルターを使用して得られました。Cytospin の明るい照明は、γH2AX、53BP1 の巣の適切な蛍光を誘導するために重要です。画像を記録した後、巣とバック グラウンド信号の強度の適応は、イメージング ソフトウェアを使用して必要です。ΓH2AX、53BP1 の巣の共局在を解析するため、画像がマージされます (図 7)。基本的な落射蛍光顕微鏡カメラ システムとの組み合わせで、DAPI、アレクサ 488 Cy3 のフィルターを装備し、イメージング ソフトウェアは γH2AX の分析のために十分、53BP1 巣 DAPI で細胞核を染色します。ただし、特定のアプリケーション (例えば、単一の粒子トラックに沿って DNA 損傷の解析) が (共焦点レーザ走査型顕微鏡など提供) として、高い解像度と背景の蛍光性の低減を必要があります。さらに、顕微鏡を用いた技術は急速に発展中の領域、200 以下の解像度 nm は新式の顕微鏡で実現可能。
要約すると、この原稿は DSB 形成と修復の重要な問題を明らかに γH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡による DSB の詳細な分析手順のプロトコルを提供しています。DSB の研究は顕微鏡技術の発展から明確にお越し。

DNA が継続的に内因性によって破損している (例えば、複製ストレス、活性酸素種、DNA の固有不安定性) と外因性 (例えば、化学ラジカル、照射) ソース (図 1)1,2 ,3,4。DNA 損傷の間で DNA 二重鎖切断 (DSB) は特に深刻な病変、細胞死やがんを引き起こす可能性があります。細胞と細胞周期5あたり約 50 DSB が生じることがあります。哺乳類細胞における相同組換え (HR) と非相同性末端結合 (NHEJ) は、DSB (図 2) の修理のための主要な経路として開発。HR 遅い S/G2 段階で発生し、そのまま妹を使用する可能性のあるエラー無料修理のためのテンプレートとして染色分け体。比較では、NHEJ は細胞周期の中でアクティブおよび潜在的変異原性塩基対を追加または壊れた端部の手術時に切除したことがあります。さらに、代替末端結合 NHEJ 欠乏6、7の場合遅い変異原性バックアップ修理メカニズムとして従事するかもしれない。
DSB は、各 DSB の周りいくつかの megabase ペアの領域でセリン 139 でヒストン H2AX のリン酸化を誘導します。形成の核の巣 γH2AX 巣の名前は、蛍光顕微鏡8で検出。ΓH2AX はさらに DSB 応答性タンパク質の採用を促進し、クロマチン DNA 修復、信号伝達9に関与しています。各 γH2AX フォーカスは、単一の DSB を表すと考えられている、蛍光顕微鏡による DSB の定量化が可能であれば、癌細胞および患者検体10、11,が示されています12,13,14. 53BP1 (p53 結合タンパク質 1) DSB 修復を媒介に別の主要蛋白質であります。DSB 応答性タンパク質、チェックポイントシグナ リング、DSB 端15のシナプスの募集に取り組んでいます。さらに、53BP1 は DSB 修復経路選択に重要な役割を果たしています。HR は防がれた16NHEJ に向かって DSB の修復がトリガーされます。ΓH2AX と DSB 修復 53BP1 の本物の機能を考慮した γH2AX と蛍光顕微鏡により 53BP1 の同時分析形成と DSB の修復の正確な分析のための有用な方法があります。
この原稿は、細胞核の γH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡を実行するためのステップバイ ステップ プロトコルを提供します。具体的には、細胞株培養、CD34 陽性急性骨髄性白血病の患者の細胞、健康な人の x 線照射によるリンパ球の正常線維芽細胞に応用されました。方法の詳細は、発表された結果のコンテキストで指摘されます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="630">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">RPMI medium</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">R0883</td>
			<td style="width:200px;">Medium for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:119px;">ratiopharm</td>
			<td style="width:104px;">PZN 3029843</td>
			<td style="width:200px;">&#160;Heparin 5,000 I.U. / mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sodium chloride solution 0.9%</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td style="width:104px;">PZN 1957154</td>
			<td style="width:200px;">Component of the anticoagulant stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Ficoll-Paque Premium</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:104px;">17-5442-02</td>
			<td style="width:200px;">Medium for isolation of mononuclear cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Trypsin solution 10X</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">59427C</td>
			<td style="width:200px;">Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">CD34 MicroBead Kit</td>
			<td style="width:119px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:104px;">130-046-702</td>
			<td style="width:200px;">Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Diagnostic microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER-203B-CE24</td>
			<td style="width:200px;">Microscope slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Megafuge 1.0 R</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td style="width:104px;">75003060</td>
			<td style="width:200px;">&#160;Tabletop centrifuge&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cytospin device</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Lid</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td>76003422</td>
			<td style="width:200px;">Lid for working without micro-tubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Cyto container</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td style="width:104px;">75003416</td>
			<td style="width:200px;">Cyto container with 2 conical bores</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Clip carrier</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td style="width:104px;">75003414</td>
			<td style="width:200px;">Carrier for holding a cyto container and a slide</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Support insert</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td style="width:104px;">75003417</td>
			<td style="width:200px;">Support insert for holding a clip carrier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Triton X-100 (Octoxinol 9)</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">85112</td>
			<td style="width:200px;">Detergent for permeabilization of cell membranes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Potassium hydroxide solution 1M</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:104px;">109107</td>
			<td style="width:200px;">Necessary for preparing the paraformaldehyde solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">P6148</td>
			<td style="width:200px;">Fixation agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">D8537</td>
			<td style="width:200px;">Balanced salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Chemiblocker</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:104px;">2170</td>
			<td style="width:200px;">Blocking agent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Mouse monoclonal anti-&#947;H2AX antibody (JBW301)</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:104px;">05-636</td>
			<td style="width:200px;">Primary antibody for detection of &#947;H2AX</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304)</td>
			<td style="width:119px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:104px;">NB100-304</td>
			<td style="width:200px;">Primary antibody for detection of 53BP1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:119px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">A-11001</td>
			<td style="width:200px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Alexa Fluor 555-conjugated goat anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:119px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">A-21428</td>
			<td style="width:200px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Vectashield mounting medium</td>
			<td style="width:119px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">H-1200</td>
			<td style="width:200px;">Contains DAPI for staining of DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Axio Scope.A1</td>
			<td style="width:119px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;">490035</td>
			<td style="width:200px;">Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Cool Cube 1 CCD camera</td>
			<td style="width:119px;">Metasystems</td>
			<td style="width:104px;">H-0310-010-MS</td>
			<td style="width:200px;">Camera system for digital recording</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Isis software</td>
			<td style="width:119px;">Metasystems</td>
			<td style="width:104px;">Not applicable</td>
			<td style="width:200px;">Microscope software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence microscopy of &#947;h2ax and 53bp1 for analyzing the formation and repair of dna double-strand breaks

DNA 二重鎖切断 (DSB) は、深刻な DNA 損傷です。DSB の修復形成の分析、ゲノム、遺伝毒性試験、放射線生物学、老化、癌、および医薬品開発を含む研究分野の広範なスペクトルに関連しています。DSB に応答して、ヒストン H2AX は蛍光顕微鏡によるセリン 139 離散核病巣検出を形成するいくつかの megabase ペアの領域内でリン酸化されます。また、53BP1 (p53 結合タンパク質 1) は別重要な DSB 応答性タンパク質相同組換えを防止しながら非相同性末端結合による DSB の修復を促進します。ΓH2AX、53BP1 の特定の機能によると γH2AX と蛍光顕微鏡により 53BP1 の複合解析 DSB の詳細な分析のための合理的なアプローチがあります。本稿では、技術を実行するための組織的なノートを添加したステップバイ ステップ プロトコルを提供します。具体的には、細胞周期の γH2AX の巣パターンに及ぼす影響は、通常細胞株培養線維芽細胞で示されます。さらに、健康な人の x 線照射によるリンパ球のマーカーとしての γH2AX の巣の値が描かれています。最後に、γH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡による、急性骨髄性白血病患者の CD34 陽性細胞の遺伝的不安定性を調べた。

G0/G1 期と G2 段階の場合 γH2AX 巣が (図 5 a) 異なる蛍光ドットとして表示されますセルの γH2AX 巣の分析は最も正確です。対照的に、レプリケーション プロセス (図 5 b) によって引き起こされる分散パン核 γH2AX 斑点、S 期細胞で γH2AX 巣の分析は複雑します。
細胞の固定を行った 4 %pfa (10 分) と 0.1% で透過 Octoxinol 9 (10 分)。メタノールを固定と透過にも使用できます。ただし、メタノールが非常に深刻な細胞核を分割し、4 %pfa と 0.1% 治療によって得られる γH2AX の巣と比較して明確な表示されない γH2AX 巣 γH2AX 巣を汚す Octoxinol 9。
効率的な抗体の選択は効果的な蛍光顕微鏡にとって重要です。プライマリ マウス モノクローナル抗 γH2AX 抗体と γH2AX と、53BP1 の免疫蛍光染色のプライマリ ウサギ ポリクローナル抗 53BP1 抗体実験を行なったそれぞれ。
各 γH2AX フォーカスは、単一の DSB を表すと考えられているに、DSB の照射組織定量化のため γH2AX の免疫蛍光染色に使用できます。照射リンパ球 (図 6) の γH2AX 巣のレベル、照射線量20,21に比例します。ΓH2AX の巣は、最大照射20,22の既に 5 分を達成するかもしれない。時間の後の時点で γH2AX の巣の崩壊は、監視することができます、DSB20,21,22の修理を反映します。
ΓH2AX と細胞と腫瘍検体10、11,12,13,1453BP1 の結合された蛍光染色による遺伝的不安定性を分析できます。急性骨髄性白血病 (図 7) 患者の CD34 陽性細胞における模範的な分析を行った。ΓH2AX、53BP1 の共局在に DSB のサイトで 53BP1 介した NHEJ 修理メカニズムの推進が示されたは、HR は禁止されました。しかし、ローカライズ共同 γH2AX と急性骨髄性白血病の芽球で 53BP1 巣の割合は変数です。追加 53BP1 信号なし γH2AX 巣が後期 S/G2 の DSB の修復のための HR を従事しています。特異 53BP1 巣の役割、未解明のままです。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56617/56617fig1v3.jpg"> 
図 1:ソースと内因性と外因性 DNA の結果は、1,2,3,4を損傷します。DSB、DNA 二重鎖切断;NHEJ、非相同性末端結合。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56617/56617fig2v2.jpg"> 
図 2:主要な DNA 二重鎖切断 (DSB) の模式図は、哺乳類細胞のメカニズムを修復します。相同組換えは、そのまま妹を使用して DSB の潜在的エラー無料修理のため後半の S/G2 段階で染色分け体。非相同性末端結合 (NHEJ)、細胞周期の中でアクティブな潜在的エラーが発生しやすいいくつかの塩基対を追加または DSB 端部の結紮術前に切除したことがあります。代替末端結合、NHEJ 欠乏場合従事かもしれない遅い変異原性バックアップ修理メカニズムです。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56617/56617fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56617/56617fig3v2.jpg"> 
図 3:デバイスは、cytospins を準備するため。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56617/56617fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56617/56617fig4v2.jpg"> 
図 4:Cytospins の準備。各サンプルの 2 つの cytospins は、10 分の 300 x g で 10 の5セル × 1.0 の遠心分離によって準備されます。1 つ cytospin γH2AX 蛍光染色用し、別 cytospin が結合された γH2AX、53BP1 免疫蛍光染色に利用されます。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56617/56617fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56617/56617fig5v2.jpg"> 
図 5:ΓH2AX 巣の細胞株培養正常線維芽細胞の細胞周期依存パターン。培養線維芽細胞の核 (ブルー、DAPI) (A) γH2AX 巣 (緑、アレクサ 488) は G0/G1 あるいは G2 段階で異なるドットとして表示されます。(B) γH2AX 巣 S 期で線維芽細胞の核のような分散したパン核スペックル (スケールバー = 5 μ m)。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56617/56617fig5v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56617/56617fig6v3.jpg"> 
図 6: ΓH2AX 巣 x 線では、健康な人のリンパ球を照射しました。ΓH2AX の巣 (緑、アレクサ 488) リンパ球の核 (ブルー、DAPI) のイメージは 100 mGy を照射後 5 分で記録 (スケールバー = 5 μ m)。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56617/56617fig6v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56617/56617fig7.jpg"> 
図 7: 急性骨髄性白血病患者の CD34 陽性細胞における γH2AX、53BP1 の巣の共局在。ΓH2AX の巣 (緑、アレクサ 488)、53BP1 巣 (赤、Cy3) の共局在を示す 53BP1 による非相同性末端結合修復機構 DNA 二重鎖切断部位での推進 (スケールバー = 5 μ m)。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56617/56617fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Microscopy of ÃŽÂ³H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks at JoVE.com

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

この原稿は、γH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡による DNA 二重鎖切断の分析のためのプロトコルを提供します。

ΓH2AX、53BP1 形成と DNA 二重鎖切断の修復を分析するための蛍光顕微鏡観察

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

immunofluorescence-microscopy-h2ax-53bp1-for-analyzing-formation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

16.1K ビュー.  Medical Faculty Mannheim of the Heidelberg University. この原稿は、γH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡による DNA 二重鎖切断の分析のためのプロトコルを提供します。

ビデオ: Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular biology techniques have clarified structure, enzymatic functions, and kinetics of repair proteins, there is still a need to understand how repair is coordinated within the nucleus. Laser micro-irradiation offers a powerful tool for inducing DNA damage and monitoring the recruitment of repair proteins. Induction of DNA damage by laser micro-irradiation can occur with a range of wavelengths, and users can reliably induce single strand breaks, base lesions and double strand breaks with a range of doses. Here, laser micro-irradiation is used to examine repair of single and double strand breaks induced by two common confocal laser wavelengths, 355 nm and 405 nm. Further, proper characterization of the applied laser dose for inducing specific damage mixtures is described, so users can reproducibly perform laser micro-irradiation data acquisition and analysis.

Confocal fluorescence microscopy and laser micro-irradiation offer tools for inducing DNA damage and monitoring the response of DNA repair proteins in selected sub-nuclear areas. This technique has significantly advanced our knowledge of damage detection, signaling, and recruitment. This manuscript demonstrates these technologies to examine single and double strand break repair.

マイクロ レーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

がん研究

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a better understanding of tumor heterogeneity and thus facilitate the selection of patients for personalized treatment. However, this is hampered because of the rarity of CTCs. We present an innovative approach for sampling a high volume of the patient blood and obtaining information about presence, phenotype, and gene translocation of CTCs. The method combines immunofluorescence staining and DNA fluorescent-in-situ-hybridization (DNA FISH) and is based on a functionalized medical wire. This wire is an innovative device that permits the in vivo isolation of CTCs from a large volume of peripheral blood. The blood volume screened by a 30-min administration of the wire is approximately 1.5-3 L. To demonstrate the feasibility of this approach, epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) expression and the chromosomal translocation of the ALK gene were determined in non-small-cell lung cancer (NSCLC) cell lines captured by the functionalized wire and stained with an immuno-DNA FISH approach. Our main challenge was to perform the assay on a 3D structure, the functionalized wire, and to determine immuno-phenotype and FISH signals on this support using a conventional fluorescence microscope. The results obtained indicate that catching CTCs and analyzing their phenotype and chromosomal rearrangement could potentially represent a new companion diagnostic approach and provide an innovative strategy for improving personalized cancer treatments.

We present a new approach to characterize tumor cells. We combined immunofluorescence with DNA fluorescent-in-situ-hybridization to evaluate cells captured by a functionalized medical wire capable of in vivo enriching CTCs directly from patient blood.

循環腫瘍細胞を取り込むため医療用ワイヤー線を用いた腫瘍細胞の特性解析: 蛍光抗体法や DNA 魚に基づく 3 D アプローチ

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair complexes. This process is regulated by a myriad of proteins that promote the association and disassociation of proteins to these lesions. Thanks in large part to the ability to perform functional screens of a vast library of proteins, there is a greater appreciation of the genes necessary for the double-strand DNA break repair. Often knockout or chemical inhibitor screens identify proteins involved in repair processes by using increased toxicity as a marker for a protein that is required for DSB repair. Although useful for identifying novel cellular proteins involved in maintaining genome fidelity, functional analysis requires the determination of whether the protein of interest promotes localization, formation, or resolution of repair complexes. 
The accumulation of repair proteins can be readily detected as distinct nuclear foci by immunofluorescence microscopy. Thus, association and disassociation of these proteins at sites of DNA damage can be accessed by observing these nuclear foci at representative intervals after the induction of double-strand DNA breaks. This approach can also identify mis-localized repair factor proteins, if repair defects do not simultaneously occur with incomplete delays in repair. In this scenario, long-lasting double-strand DNA breaks can be engineered by expressing a rare cutting endonuclease (e.g., I-SceI) in cells where the recognition site for the said enzyme has been integrated into the cellular genome. The resulting lesion is particularly hard to resolve as faithful repair will reintroduce the enzyme's recognition site, prompting another round of cleavage. As a result, differences in the kinetics of repair are eliminated. If repair complexes are not formed, localization has been impeded. This protocol describes the methodology necessary to identify changes in repair kinetics as well as repair protein localization.

Repair of double-strand DNA breaks is a dynamic process, requiring not only formation of repair complexes at the breaks, but also their resolution after the lesion is addressed. Here, we use immunofluorescence microscopy for transient and long-lasting double-stranded breaks as a tool to dissect this genome maintenance mechanism.

蛍光顕微鏡を用いた過渡的長期的な二本鎖 DNA 切断の DNA 修復プロセスの特性

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in tumorigenesis, can be directed to cancer biomarkers enabling tumor detection and characterization, and can be used for cancer therapy as mAbs or antibody-drug conjugates to activate immune effector cells, to inhibit signaling pathways, or directly kill cells carrying the specific antigen. Despite clinical advancements in the development and production of novel and highly specific mAbs, diagnostic and therapeutic applications can be impaired by the complexity and heterogeneity of the tumor microenvironment. Thus, for the development of efficient antibody-based therapies and diagnostics, it is crucial to assess the biodistribution and interaction of the antibody-based conjugate with the living tumor microenvironment. Here, we describe In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL) as a new approach to study interactions of antibody-based therapeutics and diagnostics in the in vivo physiological and pathological conditions. In this technique, a therapeutic or diagnostic antigen-specific antibody is intravenously injected in&#160;vivo and localized ex vivo with a secondary antibody in isolated tumors. IVIL, therefore, reflects the in vivo biodistribution of antibody-based drugs and targeting agents. Two IVIL applications are described assessing the biodistribution and accessibility of antibody-based contrast agents for molecular imaging of breast cancer. This protocol will allow future users to adapt the IVIL method for their own antibody-based research applications.

The in vivo immunofluorescence localization (IVIL) method can be used to examine in vivo biodistribution of antibodies and antibody conjugates for oncological purposes in living organisms using a combination of in vivo tumor targeting and ex vivo immunostaining methods.

がん研究における治療・診断抗体生体分布の評価のための生体内免疫蛍光局所法

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few decades, the field of antibody-drug conjugates, bispecific antibodies, chimeric antigen receptors (CAR) and cancer immunotherapy has emerged as the most promising area of basic and therapeutic investigations. With numerous successful human trials targeting immune checkpoint receptors and CAR-T cells in leukemia and melanoma at a breakthrough pace, it is highly exciting times for oncologic therapeutics derived from variations of antibody engineering. Regrettably, a significantly large numbers of antibody and CAR based therapeutics have also proven disappointing in human trials of solid cancers because of the limited availability of immune effector cells in the tumor bed. Importantly, nonspecific distribution of therapeutic antibodies in tissues other than tumors also contribute to the lack of clinical efficacy, associated toxicity and clinical failure. As faithful translation of preclinical studies into human clinical trails are highly relied on mice tumor xenograft efficacy and safety studies, here we highlight a method to test the tumor and general tissue distribution of therapeutic antibodies. This is achieved by labeling the protein-A purified antibody with near Infrared fluorescent dye followed by live imaging of tumor bearing mice.

Here we present a protocol to study the in vivo localization of antibodies in mice tumor xenograft models.

標的抗原特異的治療抗体の腫瘍と組織分布の分析

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage response induced by neutron-gamma mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT). Specifically, the proposed methodology is applied for the detection of repair proteins activation which can be visualized as foci using antibodies specific to DNA double-strand breaks (DNA-DSBs). DNA repair foci were assessed by immunofluorescence in colon cancer cells (HCT-116) after irradiation with the neutron-mixed beam. DNA-DSBs are the most genotoxic lesions and are repaired in mammalian cells by two major pathways: non-homologous end-joining pathway (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR). The frequencies of foci, immunochemically stained, for commonly used markers in radiobiology like &#947;-H2AX, 53BP1 are associated with DNA-DSB number and are considered as efficient and sensitive markers for monitoring the induction and repair of DNA-DSBs. It was established that &#947;-H2AX foci attract repair proteins, leading to a higher concentration of repair factors near a DSB. To monitor DNA damage at the cellular level, immunofluorescence analysis for the presence of DNA-PKcs representative repair protein foci from the NHEJ pathway and Rad52 from the HRR pathway was planned. We have developed and introduced a reliable immunofluorescence staining protocol for the detection of radiation-induced DNA damage response with antibodies specific for repair factors from NHEJ and HRR pathways and observed radiation-induced foci (RIF). The proposed methodology can be used for investigating repair protein that is highly activated in the case of neutron-mixed beam radiation, thereby indicating the dominance of the repair pathway.

Radiation-induced DNA damage response activated by neutron mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT) has not been fully established. This protocol provides a step-by-step procedure to detect radiation-induced foci (RIF) of repair proteins by immunofluorescence staining in human colon cancer cell lines after irradiation with the neutron-mixed beam.

ヒト大腸癌細胞におけるDNA損傷および修復病巣の免疫蛍光イメージング

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis as well as for the treatment selection and its response in cancer patients. The current gold standard method for detecting tumor mutations involves a genetic test of tumor DNA by means of tumor biopsies. However, this invasive method is difficult to be performed repeatedly as a follow-up test of the tumor mutational repertoire. Liquid biopsy is a new and emerging technique for detecting tumor mutations as an easy-to-use and non-invasive biopsy approach.
Cancer cells multiply rapidly. In parallel, numerous cancer cells undergo apoptosis. Debris from these cells are released into a patient&#8217;s circulatory system, together with finely fragmented DNA pieces, called cell-free DNA (cfDNA) fragments, which carry tumor DNA mutations. Therefore, for identifying cfDNA based biomarkers using liquid biopsy technique, blood samples are collected from the cancer patients, followed by the separation of plasma and buffy coat. Next, plasma is processed for the isolation of cfDNA, and the respective buffy coat is processed for the isolation of a patient&#39;s genomic DNA. Both nucleic acid samples are then checked for their quantity and quality; and analyzed for mutations using next-generation sequencing (NGS) techniques.
In this manuscript, we present a detailed protocol for liquid biopsy, including blood collection, plasma, and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

In this paper we present a detailed protocol for non-invasive liquid biopsy technique, including blood collection, plasma and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

がん患者の血漿サンプルにおける無細胞DNAの検出

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several animal models have been generated, including the widely used orthotopic mouse models, where cancer cells are injected into the mammary fat pad. However, these models cannot help monitor tumor growth kinetics and metastatic colonization. Cutting-edge tools to monitor cancer cells in real time in mice will significantly advance the understanding of tumor biology. 
Here, breast cancer cell lines stably expressing luciferase and green fluorescent protein (GFP) were established. Specifically, this technique contains two sequential steps initiated by measuring the luciferase activity in vitro and followed by the implantation of the cancer cells into mammary fat pads of nonobese diabetic-severe combined immunodeficiency (NOD-SCID) mice. After the injection, both the tumor growth and metastatic colonization are monitored in real time by the noninvasive bioluminescence imaging system. Then, the quantification of GFP-expressing metastases in the lungs will be examined by fluorescence microscopy to validate the observed bioluminescence results. This sophisticated system combining luciferase and fluorescence-based detection tools evaluates cancer metastasis in vivo, which has great potential for use in breast cancer therapeutics and disease management.

Here, we describe a noninvasive monitoring method involving luciferase and green fluorescent protein expression in various breast cancer cell lines. This protocol provides a technique to monitor tumor formation and metastatic colonization in real time in mice.

生物発光を用いたマウスにおける乳がん増殖および転移性コロニー形成のモニタリング

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, transcription-replication conflicts, or amplified oncogenes, inevitably resulting in the generation of single-stranded DNA (ssDNA). Quantifying ssDNA, therefore, presents an opportunity to assess the level of replication stress in different cell types and under various DNA-damaging conditions or treatments. Emerging evidence also suggests that ssDNA can be a predictor of responses to chemotherapeutic drugs that target DNA repair. Here, we describe a detailed immunofluorescence-based methodology to quantify ssDNA. This methodology involves labeling the genome with a thymidine analog, followed by the antibody-based detection of the analog at the chromatin under non-denaturing conditions. Stretches of ssDNA can be visualized as foci under a fluorescence microscope. The number and intensity of the foci directly co-relate with the level of ssDNA present in the nucleus. We also describe an automated pipeline to quantify the ssDNA signal. The method is rapid and reproducible. Furthermore, the simplicity of this methodology makes it amenable to high-throughput applications such as drug and genetic screens.

Here, we describe an immunofluorescence-based method to quantify the levels of single-stranded DNA in cells. This efficient and reproducible method can be utilized to examine replication stress, a common feature in several ovarian cancers. Additionally, this assay is compatible with an automated analysis pipeline, which further increases its efficiency.