Das Projekt wurde von der deutschen José Carreras Leukämie Stiftung (DJCLS 14 R/2017) unterstützt.

alle hier beschriebene Methoden wurden von der Ethik Komitee II in die medizinische Fakultät Mannheim der Universität Heidelberg zugelassen. Schriftliche Einwilligung von allen Personen eingeholt wurde.
 1. Vorbereitung der Materialien <ol><li>Antikoagulans-Stammlösung: bereiten ein Antikoagulans Stammlösung 200 IE Heparin pro mL in 0,9 % Natriumchlorid. Füllen Sie jeweils die Röhrchen (zeichnen Sie Volume 9 mL) mit 2 mL der gerinnungshemmenden Vorratslösung vor Entnahme der Proben Blut oder Knochenmark.</li>
	<li>Lyse-Lösung für die Erythrozyten: bereiten die 10 x Lyse-Lösung für die Erythrozyten mit 82,91 g Ammoniumchlorid, 7,91 g Ammonium Bicarbonat und 2 mL 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic sauren Lösung einen pH-Wert von 8,0 durch Auflösen der Wirkstoffe in bidestilliertem Wasser für ein Gesamtvolumen von 1 L.</li>
	<li>Fixierung Lösung: hinzufügen 8.3 µL einer 1 M Kalilauge zu 360 mg Paraformaldehyd (PFA) in einem Mikrotiter-Rohr. Füllen Sie das Rohr mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bis 1 mL-Markierung des Rohres und Wärme der Röhre in einem Heizblock bei 95 ° C, 1 mL einer 36 % PFA Lösung zu bekommen. Ein Rohr mit einer Kapazität von 15 mL übermitteln Sie 1 mL 36 % PFA Lösung. Die Lösung 1 mL 36 % PFA, 9 mL einer 4 % PFA Vorratslösung zu fügen Sie 8 mL PBS hinzu. Aliquoten 4 % PFA-Stammlösung und Speicher bei-18 ° C bis zur Fixierung der Zellen nutzen. 
	Achtung: (1) Kalilauge ist ätzend. Beachten Sie Augen-und Haut. (2) PFA ist krebserregend. Vermeiden Sie Hautkontakt und Inhalation. Bereiten Sie die Fixierung-Lösung unter einer Haube.</li>
	<li>Permeabilisierung Lösung: hinzufügen 50 µL Octoxinol 9 bis 50 mL PBS zu einer Lösung von ca. 0,1 % Octoxinol 9.</li>
	<li>Blockiert Lösung: bereiten Sie 5 % und 2 % blockieren von Lösungen durch Mischen der Protein Blockierungsmittel mit PBS und Store bei 6 &#8211; 8 ° C.</li>
</ol> 2. Vorbereitung der Proben <ol><li>Fibroblasten in der Zellkultur: pflegen menschliche Fibroblasten der Zelllinie NHDF in einer befeuchteten 5 % CO 2 Atmosphäre bei 37 ° C in RPMI 1640 Medium ergänzt mit 10 % fetalen Kälberserum, 4 mM Glutamin, und 1 % Penicillin/Streptomycin.
	<ol><li>Vorbereitung der einen Objektträger mit Anhänger Fibroblasten <ol><li>Entfernen Sie das Medium aus der Flasche (75 cm 2 Wachstumsbereich) mit exponentiell wachsenden NHDF Fibroblasten. Fügen Sie 10 mL PBS in den Kolben. Vorsichtig waschen anhaftenden Fibroblasten durch manuell Schütteln der Flasche für 1 min.</li>
			<li>Die PBS zu entfernen und fügen Sie 1 mL Trypsin in den Kolben. Schütteln Sie die Flasche vorsichtig, um sicherzustellen, dass alle adhärente Zellen von Trypsin abgedeckt werden. Die Trypsin aus der Flasche zu entfernen. Legen Sie die Flasche in den Brutkasten für 5 min bei 37 ° c</li>
			<li>Nehmen die Flasche aus dem Inkubator und 10 mL RPMI 1640 Medium in den Kolben. Pipette das Medium nach oben und unten mehrmals die Fibroblasten zu zerstreuen.</li>
			<li>Der dispergierten Fibroblasten auf jeweils zwei Felder der Objektträger 0,3 mL pipette und setzen Sie die Folie in den Brutkasten für 24 h, so dass die Fibroblasten zur Folie haften. Für Immunostaining von γH2AX und 53BP1 in Kernen von Fibroblasten, fahren Sie mit Schritt 3.1.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Patientenproben <ol><li>Blutproben: verwenden Sie die Röhrchen, die angefüllt waren mit 2 mL der gerinnungshemmenden Vorratslösung und fügen 7 mL Blut in die Rohre. Speichern Sie die Proben über Nacht bei Raumtemperatur (d.h., 18-20 ° C). Am nächsten Tag isolieren die G0/G1-Phase ruhen Mononukleäre Zellen durch Dichte Gradienten Zentrifugieren (Schritt 2.2.3).</li>
		<li>Knochenmarkproben: verwenden Sie die Röhrchen, die angefüllt waren mit 2 mL der gerinnungshemmenden Vorratslösung (Schritt 1.1) und fügen Sie 7 mL Knochenmark in den Rohren. Speichern Sie die Proben über Nacht bei Raumtemperatur (d.h., 18-20 ° C). Am nächsten Tag isolieren der G0/G1-Phase ruhen Mononukleäre Zellen durch Dichte Gradienten Zentrifugieren (Schritt 2.2.3). Verwenden Sie CD34 Microbeads und Zell-Trennsäulen für die Isolierung von CD34 + Zellen.</li>
		<li>Isolierung von mononukleären Zellen durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung 
		Hinweis: Mononukleäre Zellen sind von Blut und Knochenmarkproben durch Dichte Gradienten Zentrifugation 17 , 18 , 19 isoliert.
		<ol><li>Verdünnt den heparinisierten Blutprobe in einem Verhältnis von 1:1 mit PBS und der heparinisierten Knochenmarkprobe in einem Verhältnis von 1:3 mit PBS. Aussetzen der Zellen sanft durch Zeichnen sie in die und aus der Pipette zweimal.</li>
			<li>Volumen Dichte Gradienten Medium zu einem neuen Schlauch. Sanft Schicht verdünnten Blut oder Knochenmark auf das Dichte-Gradienten-Medium. Achten Sie darauf, nicht die beiden Schichten mischen.</li>
			<li>Zentrifugieren der Röhre für 30 min bei Raumtemperatur und 400 X g. Abziehen der oberen Plasmaschicht mit der Pipette. Dann ernten Sie sorgfältig die mononukleären Zellen in der Schicht über das Dichte-Gradienten-Medium. Übertragen der mononukleären Zellen in ein frisches Gefäß.</li>
			<li>Mindestens drei Bände von PBS hinzufügen der mononukleären Zellen in der Röhre. Aussetzen Sie die Zellen sanft durch Zeichnen sie in die und aus der Pipette zwei Mal. Zentrifugieren Sie das Rohr für 10 min bei Raumtemperatur und 400 X g.</li>
			<li>Nach dem Spin den Überstand zu entfernen und 10 mL 4 ° C, 1 x Lyse-Lösung für die Erythrozyten. Aufschwemmen der Zellen sanft durch Zeichnen sie in die und aus der Pipette zwei Mal, und das Rohr für 5 min auf Eis legen. Dann fügen Sie 30 mL PBS bei 4 ° C und Zentrifugieren Sie das Rohr für 10 min bei Raumtemperatur und 400 X g.</li>
		</ol></li> <li>Vorbereitung der Cytospins <ol><li>bereiten Sie zwei Cytospins mit mononukleären Zellen von Patientenproben (d. h., ein Cytospin für γH2AX Immunfluoreszenz Färbung und eine Cytospin für γH2AX und 53BP1 kombiniert Immunfluoreszenz-Färbung) durch Zentrifugieren (300 X g, 10 min) von 1,0 x 10 5 Zellen für jede Zubereitung ( Abbildung 3 und 4).</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 3. γH2AX und 53BP1 Immunfluoreszenz Färbung <ol><li>Fixierung und Permeabilisierung: befestigen Sie die Zellen mit 200 µL 4 % PFA 10 min. lang. Waschen Sie nach der Fixierung die Zellen vorsichtig dreimal mit 30 mL PBS für 5 min auf einem Labor-Shaker. Dann permeabilize die Zellen mit 200 µL von 0,1 % Octoxinol 9 für 10 min. die Zellen sanft dreimal waschen mit 30 mL 5 % blockieren Lösung für 5 min auf einem Labor-Shaker. Blockieren Sie die Zellen in 30 mL frische 5 % blockiert Lösung für 1 h</li>
	<li>Inkubation mit Antikörpern <ol><li>inkubieren, eine Vorbereitung der Zellen mit einer Maus monoklonalen Anti-γH2AX Antikörper (1: 500) und die weitere Vorbereitung der Zellen mit einer Maus monoklonalen Anti-γH2AX Antikörper (1: 500) und eine polyklonale Kaninchen Anti-53BP1 Antikörper (1: 500) über Nacht bei 4 ° c</li>
		<li>Nach Inkubation der Zellen vorsichtig waschen 3 Mal mit 30 mL 2 % blockieren Lösung für jede 5 min auf einem Labor-Shaker.</li>
		<li>Entfernen Sie die blockierende Lösung und inkubieren Sie die erste Vorbereitung der Zellen mit einer Ziege Alexa488-konjugierten Anti-Maus Sekundärantikörper (1: 500) und die zweite Vorbereitung der Zellen mit einer Ziege Alexa488 konjugierten Anti-Maus Sekundärantikörper ( 1: 500) und ein Esel Alexa555-konjugierten Anti-Kaninchen Sekundärantikörper (1: 500) für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	</ol></li> <li>Eindeckmittel: setzen Sie die Folie mit den Zellen in eine Schüssel geben und die Zellen vorsichtig dreimal für jeweils 5 min auf einem Labor-Shaker mit 30 mL PBS waschen. Entfernen Sie die PBS und montieren Sie die Zellen mit Eindeckmittel mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole. Vorsichtig ein Deckglas auf das Eindeckmittel gelegt, so dass keine Luftblasen sind eingebettet. Warten Sie mindestens 3 h zum Härten des Mediums Montage vor der Analyse der Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie.</li>
</ol> 4. Analyse von γH2AX und 53BP1 Schwerpunkte <ol><li>Fluoreszenz-Mikroskopie: γH2AX und 53BP1 Brennpunkte in den Zellkernen mit einem Fluoreszenzmikroskop, ausgestattet mit Filter für DAPI, Alexa 488 und Cy3 während der Bildgebung auf ein 100 X Objektiv zu analysieren Vergrößerung. Bilder mit einer Kamera aufnehmen und verarbeiten der Bilder mit entsprechenden Imagingsoftware.</li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 ist eine nützliche Methode für die Analyse der Bildung und Reparatur des DSB in einem breiten Spektrum von Forschungsgebieten. Wichtige Parameter, die Einfluss auf das Ergebnis der Experimente sind die Phase des Zellzyklus, die Agenten für die Fixierung und Permeabilisierung der Zellen, die die Antikörper und die Hardware und Software von dem Fluoreszenzmikroskop verwendet.
Die Beeinflussung des Zellzyklus γH2AX Brennpunkte Muster zeigte sich von normalen Fibroblasten der Zelllinie NHDF wächst exponentiell. Die γH2AX-Herde erschien als verschiedene fluoreszierende Punkte in der G0/G1 und G2-Phasen im Vergleich zu verteilten Pan-nuklearen γH2AX Flecken im S-Phase (Abbildung 5). Die unterschiedlichen γH2AX-Herde in der G0/G1 phase und in G2 phase angegebenen Transienten und/oder konstitutive DNA-Schäden, die bei sich wiederholenden Zellzyklus Passagen erworben worden sein könnte; umgekehrt die verstreuten Flecken in S-Phase nur vorübergehend aufgetreten und wurden vermutlich von den Replikationsprozess zugeordnet. Als Pan-nuklearen γH2AX, die Flecken stören können empfiehlt sich die Analyse der echten γH2AX Herde, der Ausschluss von S Phase Zellen aus Analyse leicht erledigt die S Phase spezifische γH2AX Muster. Alternativ können die Zellen in der S-Phase durch Messung der Intensität des Signals DAPI oder Anwendung S Phase spezifischer Marker (z.B.Cyclin A) ausgeschlossen werden. Darüber hinaus kann die Induktion von Wachstum Verhaftung mit Synchronisation von Zellen in der G0/G1-Phase hilfreich sein, vor der Herstellung der Cytospins durch Lagerung der Proben bei Raumtemperatur (d.h. 18-20 ° C) über Nacht.
Die Verfahren der Fixierung und Permeabilisierung sind wichtige Schritte in Immunostaining von γH2AX und 53BP1. Die Fixierung ist notwendig zur Erhaltung der Morphologie und Antigenität der Zellen23. Permeabilisierung ermöglicht den Zugriff auf die intrazelluläre und nukleare Antigene24. PFA ist ein relativ schonende Mittel zur Fixierung und Zellen unter Beibehaltung der Proteinstrukturen durch Reaktion mit basischen Aminosäuren in Form Methylen Querverbindungen stabilisiert. Nach der Fixierung mit PFA können Cytospins für Tage und Wochen bis Weiterverarbeitung gespeichert werden. Für die Erkennung von γH2AX und 53BP1 müssen die Zellen permeabilized werden. Octoxinol 9 diente als ein nicht-ionische Waschmittel mit ungeladenen hydrophilen Kopfgruppen bestehend aus Polyoxyethylen Moieties. Octoxinol 9 bricht die Zellkerne sanft und bewahrt γH2AX Herde ganz deutlich. Alternativ kann auch Methanol für die Fixierung und Permeabilisierung der Zellen verwendet werden. Methanol Ausscheidungen Proteine und Lipide aus der Zellmembran, so dass sie durchlässig für Antikörper löst. Aber Behandlung mit Methanol ist vermutlich aggressiver und γH2AX Schwerpunkte erscheinen nicht als deutlich im Vergleich zu der γH2AX Herde durch die Behandlung mit 4 % PFA und 0,1 % Octoxinol-9. Ungeachtet spielen effiziente Antikörper eine Schlüsselrolle für die Immunostaining von γH2AX und 53BP1. Daher empfiehlt sich die Verwendung der nachgewiesenen Antikörper (siehe Tabelle der Materialien/Geräte). Eine serielle Verdünnung der Antikörper möglicherweise nützlich für die Bestimmung der optimalen Antikörper-Konzentrationen.
ΓH2AX Schwerpunkte dienen als Marker in Strahlung Biodosimetry bei niedrigen Dosen &#62; 1 mGy25. ΓH2AX Schwerpunkte wurden in Lymphozyten bei 5 min nach Röntgenbestrahlung mit einer Dosis von 100 mGy in Vitro (Abbildung 6) analysiert. Wie H2AX rasch nach der Bestrahlung an den Standorten des DSB phosphoryliert wird, kann die Anzahl der γH2AX Herde bereits ein Maximum bei 5 min nach Bestrahlung20,22erreichen. Jedoch die Reparatur-Prozess beginnt sofort nach der Bestrahlung und γH2AX Schwerpunkte sind auf eine ausgeprägte Zerfallsrate entfernt. Daher für die Überwachung der Anzahl der γH2AX Schwerpunkte in einer chronologischen Reihenfolge, ist es ratsam, den Reparatur-Prozess zu unterbrechen, indem Sie die Probe auf Eis am angegebenen Punkt in der Zeit nach der Bestrahlung.
Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 ist eine nützliche Methode für die Analyse der genetischen Instabilität in Krebszellen. CD34 + Zellen wurden aus dem Knochenmark von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie mit CD34 Microbeads bereichert. Bilder von γH2AX Schwerpunkten und 53BP1 Schwerpunkte wurden spezifische Fluoreszenz-Filter verwenden. Eine helle Ausleuchtung der Cytospin ist wichtig, ausreichend Fluoreszenz der γH2AX und 53BP1 Brennpunkte zu induzieren. Nach der Aufnahme des Bilds, ist die Anpassung der Intensität der Brennpunkte und das Hintergrundsignal notwendig über die imaging-Software. Für die Analyse der Co Lokalisierung von γH2AX und 53BP1 Schwerpunkte, die Bilder werden zusammengeführt (Abbildung 7). Eine grundlegende Epifluoreszenz-Mikroskop mit Filtern für DAPI, Alexa 488 und Cy3 in Kombination mit einem Kamerasystem ausgestattet und imaging-Software ist ausreichend für die Analyse von γH2AX und 53BP1 Schwerpunkte in DAPI gefärbt Zellkerne. Jedoch erfordern bestimmte Anwendungen (z.B. Analyse von DNA-Schäden an einzelnen Partikels Gleisen) höhere Auflösung und Reduzierung der Hintergrundfluoreszenz (wie z. B. durch konfokale Laser-scanning-Mikroskopie). Mikroskop-Technologie ist ein sich rasant entwickelnden Gebiet und eine Auflösung unter 200 nm ist machbar mit State-of-the-Art-Mikroskopen.
Zusammenfassend lässt sich sagen diese Handschrift stellt kritische Fragen des DSB Bildung und Reparatur und enthält eine Schritt für Schritt Protokoll für eine detaillierte Analyse der DSB durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1. Die Forschung über DSB profitieren deutlich von den vergangenen und zukünftigen Entwicklungen in der Mikroskop-Technologie.

DNA wird kontinuierlich durch endogene beschädigt (z.B., Replikation Stress, reaktive Sauerstoffspezies, innere Instabilität von DNA) und exogene(z. B.chemische radikale, Bestrahlung) Quellen (Abbildung 1)1,2 ,3,4. Unter DNA-Schäden DNA-Doppel-Strangbrüchen (DSB) sind besonders schwere Läsionen und Zelltod oder Karzinogenese induzieren können. Etwa 50 DSB ergeben sich pro Zelle und Zellzyklus5. In Säugetierzellen entwickelte homologe Rekombination (HR) und nonhomologous Ende verbinden (NHEJ) als wichtigen Wege für die Reparatur des DSB (Abbildung 2). HR in späten S/G2-Phase tritt und nutzt eine intakte Schwester Chromatids als Vorlage für potenziell fehlerfreie Reparatur. Im Vergleich dazu ist NHEJ während des Zellzyklus aktiv und potenziell mutagene wie Basenpaare hinzugefügt oder vor der Ligatur der gebrochenen enden reseziert werden. Darüber hinaus kann Alternativen Ende-Verbindung als eine langsame mutagene Back-up Repair-Mechanismus bei NHEJ Mangel6,7betraut sein.
DSB induzieren die Phosphorylierung des Histon H2AX Serin 139 in einer Region von mehreren Megabase Paaren um jede DSB. Bildenden nuklearen Brennpunkte werden benannt γH2AX Brennpunkte und nachweisbar durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie-8. ΓH2AX fördert die Einstellung von weiteren DSB-responsive Proteine und Chromatin umgestalten, DNA-Reparatur und Signal Transduction9beteiligt ist. Da jeder γH2AX Schwerpunkt gilt, einen einzigen DSB zu vertreten, ist die Quantifizierung der DSB durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie möglich, die nachweislich in Krebszelllinien und Patientenproben10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 bindendes Protein 1) ist eine weitere wichtige Protein bei der Vermittlung von DSB-Reparatur. Es ist bei der Rekrutierung von DSB-responsive Proteine, Checkpoint Signalisierung und der Synapsis DSB endet15beteiligt. Darüber hinaus spielt die 53BP1 eine entscheidende Rolle bei der DSB Reparatur Weg Wahl. Es löst die Reparatur des DSB in Richtung NHEJ, während HR verhindert16ist. In Betracht der echte Funktionen γH2AX und 53BP1 in der DSB-Reparatur möglicherweise die simultane Analyse von γH2AX und 53BP1 durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie eine nützliche Methode für die genaue Analyse der Bildung und Reparatur des DSB.
Diese Handschrift enthält eine Schritt für Schritt Protokoll für Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 in Zellkernen durchführen. Insbesondere ist die Technik in normalen Fibroblasten der Zelllinie NHDF, in x-ray bestrahlt Lymphozyten eines gesunden Menschen und CD34 + Zellen eines Patienten mit akuter myeloischer Leukämie angewendet. Die Einzelheiten des Verfahrens sind im Zusammenhang mit den vorgestellten Ergebnissen hingewiesen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="630">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">RPMI medium</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">R0883</td>
			<td style="width:200px;">Medium for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:119px;">ratiopharm</td>
			<td style="width:104px;">PZN 3029843</td>
			<td style="width:200px;">&#160;Heparin 5,000 I.U. / mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sodium chloride solution 0.9%</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td style="width:104px;">PZN 1957154</td>
			<td style="width:200px;">Component of the anticoagulant stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Ficoll-Paque Premium</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:104px;">17-5442-02</td>
			<td style="width:200px;">Medium for isolation of mononuclear cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Trypsin solution 10X</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">59427C</td>
			<td style="width:200px;">Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">CD34 MicroBead Kit</td>
			<td style="width:119px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:104px;">130-046-702</td>
			<td style="width:200px;">Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Diagnostic microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER-203B-CE24</td>
			<td style="width:200px;">Microscope slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Megafuge 1.0 R</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td style="width:104px;">75003060</td>
			<td style="width:200px;">&#160;Tabletop centrifuge&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cytospin device</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:200px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Lid</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td>76003422</td>
			<td style="width:200px;">Lid for working without micro-tubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Cyto container</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td style="width:104px;">75003416</td>
			<td style="width:200px;">Cyto container with 2 conical bores</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Clip carrier</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td style="width:104px;">75003414</td>
			<td style="width:200px;">Carrier for holding a cyto container and a slide</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Support insert</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus</td>
			<td style="width:104px;">75003417</td>
			<td style="width:200px;">Support insert for holding a clip carrier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Triton X-100 (Octoxinol 9)</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">85112</td>
			<td style="width:200px;">Detergent for permeabilization of cell membranes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Potassium hydroxide solution 1M</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:104px;">109107</td>
			<td style="width:200px;">Necessary for preparing the paraformaldehyde solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">P6148</td>
			<td style="width:200px;">Fixation agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">D8537</td>
			<td style="width:200px;">Balanced salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Chemiblocker</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:104px;">2170</td>
			<td style="width:200px;">Blocking agent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Mouse monoclonal anti-&#947;H2AX antibody (JBW301)</td>
			<td style="width:119px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:104px;">05-636</td>
			<td style="width:200px;">Primary antibody for detection of &#947;H2AX</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304)</td>
			<td style="width:119px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:104px;">NB100-304</td>
			<td style="width:200px;">Primary antibody for detection of 53BP1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:119px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">A-11001</td>
			<td style="width:200px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Alexa Fluor 555-conjugated goat anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:119px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">A-21428</td>
			<td style="width:200px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Vectashield mounting medium</td>
			<td style="width:119px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">H-1200</td>
			<td style="width:200px;">Contains DAPI for staining of DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Axio Scope.A1</td>
			<td style="width:119px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;">490035</td>
			<td style="width:200px;">Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Cool Cube 1 CCD camera</td>
			<td style="width:119px;">Metasystems</td>
			<td style="width:104px;">H-0310-010-MS</td>
			<td style="width:200px;">Camera system for digital recording</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Isis software</td>
			<td style="width:119px;">Metasystems</td>
			<td style="width:104px;">Not applicable</td>
			<td style="width:200px;">Microscope software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence microscopy of &#947;h2ax and 53bp1 for analyzing the formation and repair of dna double-strand breaks

DNA-Doppel-Strangbrüchen (DSB) sind schwere DNA-Läsionen. Analyse der Bildung und Reparatur des DSB ist in einem breiten Spektrum von Forschungsgebieten einschließlich Genom Integrität, Genotoxizität, Strahlenbiologie, Altern, Krebs und Arzneimittelentwicklung. In Erwiderung auf DSB ist die Histon H2AX Serin 139 in einer Region mit mehreren Megabase Paare bilden diskrete nuklearen Herde nachweisbar durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie phosphoryliert. Darüber hinaus 53BP1 (p53 bindendes Protein 1) ist ein weiteres wichtiges DSB-responsive Protein Förderung der Reparatur des DSB bei nonhomologous Ende-homologe Rekombination zu verhindern. Entsprechend den spezifischen Funktionen der γH2AX und 53BP1 möglicherweise die kombinierte Analyse von γH2AX und 53BP1 durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie ein vernünftiger Ansatz für eine detaillierte Analyse des DSB. Diese Handschrift enthält eine Schritt für Schritt Protokoll ergänzt durch methodische Hinweise für die Durchführung der Technik. Insbesondere zeigt sich der Einfluss des Zellzyklus auf γH2AX Brennpunkte Muster in normalen Fibroblasten der Zelllinie NHDF. Darüber hinaus ist der Wert der γH2AX Brennpunkte als Biomarker in Röntgenstrahlung bestrahlt Lymphozyten eines gesunden Menschen dargestellt. Zu guter Letzt wird die genetischer Instabilität in CD34 + Zellen eines Patienten mit akuter myeloischer Leukämie durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 untersucht.

Analyse der γH2AX Herde in den Zellen ist in der G0/G1-Phase und G2-Phase als γH2AX Herde als verschiedene fluoreszierende Punkte (Abbildung 5A) erscheinen am genauesten. Im Gegensatz dazu wird durch verteilte Pan-nuklearen γH2AX Flecken verursacht durch den Replikationsprozess (Abb. 5 b) Analyse der γH2AX Brennpunkte in Zellen in der S-Phase erschwert.
Fixierung der Zellen erfolgte mit 4 % PFA (10 min) und Permeabilisierung mit 0,1 % Octoxinol 9 (10 min). Methanol kann auch für die Fixierung und Permeabilisierung, benutzt werden; jedoch Methanol kann die Zellkerne ganz schwer aufzubrechen und schmieren, γH2AX Brennpunkte γH2AX Brennpunkte nicht deutlich im Vergleich zu der γH2AX Herde durch die Behandlung mit 4 % PFA und 0,1 % angezeigt Octoxinol-9.
Die Wahl des effizienten Antikörper ist entscheidend für die effektive Immunfluoreszenz-Mikroskopie. Experimente wurden durchgeführt, mit einem primären Maus monoklonalen Anti-γH2AX-Antikörper und eine primäre Kaninchen polyklonale Anti-53BP1 Antikörper für die Immunfluoreszenz-Färbung des γH2AX und 53BP1, beziehungsweise.
Wie jeder γH2AX Schwerpunkt betrachtet wird, ein einzelnes DSB vertreten, kann die Immunfluoreszenz-Färbung des γH2AX für die Quantifizierung des DSB im bestrahlten Gewebe verwendet werden. ΓH2AX Brennpunkte in bestrahlter Lymphozyten (Abbildung 6) sind proportional zur Bestrahlung Dosis20,21. ΓH2AX Herde können maximal bereits 5 Minuten Bestrahlung20,22erreichen. Der Zerfall des γH2AX Brennpunkte zu späteren Zeitpunkten kann überwacht werden und spiegelt die Reparatur von DSB20,21,22.
Genetischer Instabilität kann durch kombinierte Immunfluoreszenz-Färbung des γH2AX und 53BP1 in Zell-Linien und Tumor Proben10,11,12,13,14analysiert werden. Eine exemplarische Analyse erfolgte in den CD34 + Zellen eines Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (Abbildung 7). Co Lokalisierung von γH2AX und 53BP1 angezeigt, Förderung der 53BP1-vermittelten NHEJ Reparaturmechanismen an Standorten der DSB während HR verhindert werden konnte. Allerdings war der Anteil an Co lokalisierenden γH2AX und 53BP1 Schwerpunkte in Blasten der akuten myeloischen Leukämie Variable. Die γH2AX Herde ohne eine zusätzliche 53BP1-Signal könnte HR für die Reparatur des DSB in S/G2 Spätphase engagiert haben. Die Rolle des singulären 53BP1 Herde blieb schwer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56617/56617fig1v3.jpg"> 
Abbildung 1: Quellen und folgen der endogene und exogene DNA schädigen1,2,3,4. DSB, DNA-Doppel-Strangbrüchen; NHEJ nonhomologous Ende-Beitritt.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56617/56617fig2v2.jpg"> 
Abbildung 2 : Schematische Darstellung der wichtigsten DNA-Doppel-Strang Pause (DSB) Reparaturmechanismen in Säugetierzellen. Homologe Rekombination verwendet eine intakte Schwester Chromatids in späten S/G2-Phase für potenziell fehlerfreie Reparatur des DSB. Nonhomologous Ende verbinden (NHEJ) ist aktiv in den Zellzyklus und potenziell fehleranfälliger paar Basenpaare können hinzugefügt oder vor der Ligatur der DSB enden reseziert. Alternatives Ende-Beitritt ist eine langsame mutagene Backup-Repair-Mechanismus die bei NHEJ-Mangel tätig werden könnte. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56617/56617fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56617/56617fig3v2.jpg"> 
Abbildung 3 : Gerät für die Zubereitung des Cytospins. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56617/56617fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56617/56617fig4v2.jpg"> 
Abbildung 4 : Vorbereitung der Cytospins. Zwei Cytospins jeder Probe werden durch Zentrifugation von 1,0 x 105 Zellen bei 300 X g für 10 min zubereitet. Ein Cytospin dient γH2AX Immunfluoreszenz Färbung und ein weiteres Cytospin ist für kombinierte γH2AX und 53BP1 Immunfluoreszenz Färbung genutzt. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56617/56617fig4v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56617/56617fig5v2.jpg"> 
Abbildung 5 : Zellzyklus abhängige Muster der γH2AX Brennpunkte in normalen Fibroblasten der Zelllinie NHDF. (A) γH2AX Herde (grün, Alexa 488) in Kernen (blau, DAPI) der NHDF Fibroblasten erscheinen als verschiedene Punkte in der G0/G1 oder G2-Phase. (B) γH2AX Herde in Kernen von Fibroblasten in S-Phase als verteilte Pan-nuklearen Flecken erscheinen (Maßstabsleiste = 5 µm). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56617/56617fig5v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56617/56617fig6v3.jpg"> 
Abbildung 6 : ΓH2AX Herde im Röntgenbild bestrahlt Lymphozyten eines gesunden Menschen. Die Bilder der γH2AX Herde (grün, Alexa 488) in Kernen (blau, DAPI) der Lymphozyten werden bei 5 min nach der Bestrahlung mit 100 mGy aufgezeichnet (Maßstabsleiste = 5 µm). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56617/56617fig6v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56617/56617fig7.jpg"> 
Abbildung 7 : Co Lokalisierung von γH2AX und 53BP1 Schwerpunkte in CD34 + Zellen eines Patienten mit akuter myeloischer Leukämie. Co-Lokalisierung der γH2AX Herde (grün, Alexa 488) und 53BP1 Herde (rot, Cy3) gibt an Förderung der 53BP1-vermittelten nonhomologous Ende-Beitritt Reparaturmechanismen an Standorten von DNA-Doppel-Strangbrüchen (Maßstabsleiste = 5 µm). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56617/56617fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Diese Handschrift enthält ein Protokoll für die Analyse von DNA-Doppel-Strangbrüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1.

Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 für die Analyse der Bildung und Reparatur der DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

immunofluorescence-microscopy-h2ax-53bp1-for-analyzing-formation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

16.1K Aufrufe.  Medical Faculty Mannheim of the Heidelberg University. Diese Handschrift enthält ein Protokoll für die Analyse von DNA-Doppel-Strangbrüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1.

Serie: Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular biology techniques have clarified structure, enzymatic functions, and kinetics of repair proteins, there is still a need to understand how repair is coordinated within the nucleus. Laser micro-irradiation offers a powerful tool for inducing DNA damage and monitoring the recruitment of repair proteins. Induction of DNA damage by laser micro-irradiation can occur with a range of wavelengths, and users can reliably induce single strand breaks, base lesions and double strand breaks with a range of doses. Here, laser micro-irradiation is used to examine repair of single and double strand breaks induced by two common confocal laser wavelengths, 355 nm and 405 nm. Further, proper characterization of the applied laser dose for inducing specific damage mixtures is described, so users can reproducibly perform laser micro-irradiation data acquisition and analysis.

Confocal fluorescence microscopy and laser micro-irradiation offer tools for inducing DNA damage and monitoring the response of DNA repair proteins in selected sub-nuclear areas. This technique has significantly advanced our knowledge of damage detection, signaling, and recruitment. This manuscript demonstrates these technologies to examine single and double strand break repair.

Anwendung von Mikro-Laserbestrahlung zur Prüfung von einzelnen und doppelt Strand Break Repair in Säugerzellen

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Forschung

Krebsforschung

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a better understanding of tumor heterogeneity and thus facilitate the selection of patients for personalized treatment. However, this is hampered because of the rarity of CTCs. We present an innovative approach for sampling a high volume of the patient blood and obtaining information about presence, phenotype, and gene translocation of CTCs. The method combines immunofluorescence staining and DNA fluorescent-in-situ-hybridization (DNA FISH) and is based on a functionalized medical wire. This wire is an innovative device that permits the in vivo isolation of CTCs from a large volume of peripheral blood. The blood volume screened by a 30-min administration of the wire is approximately 1.5-3 L. To demonstrate the feasibility of this approach, epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) expression and the chromosomal translocation of the ALK gene were determined in non-small-cell lung cancer (NSCLC) cell lines captured by the functionalized wire and stained with an immuno-DNA FISH approach. Our main challenge was to perform the assay on a 3D structure, the functionalized wire, and to determine immuno-phenotype and FISH signals on this support using a conventional fluorescence microscope. The results obtained indicate that catching CTCs and analyzing their phenotype and chromosomal rearrangement could potentially represent a new companion diagnostic approach and provide an innovative strategy for improving personalized cancer treatments.

We present a new approach to characterize tumor cells. We combined immunofluorescence with DNA fluorescent-in-situ-hybridization to evaluate cells captured by a functionalized medical wire capable of in vivo enriching CTCs directly from patient blood.

Charakterisierung von Tumorzellen mit einem medizinischen Draht zur Erfassung von zirkulierenden Tumorzellen: 3D Ansatz basierend auf Immunfluoreszenz und DNA-Fisch

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair complexes. This process is regulated by a myriad of proteins that promote the association and disassociation of proteins to these lesions. Thanks in large part to the ability to perform functional screens of a vast library of proteins, there is a greater appreciation of the genes necessary for the double-strand DNA break repair. Often knockout or chemical inhibitor screens identify proteins involved in repair processes by using increased toxicity as a marker for a protein that is required for DSB repair. Although useful for identifying novel cellular proteins involved in maintaining genome fidelity, functional analysis requires the determination of whether the protein of interest promotes localization, formation, or resolution of repair complexes. 
The accumulation of repair proteins can be readily detected as distinct nuclear foci by immunofluorescence microscopy. Thus, association and disassociation of these proteins at sites of DNA damage can be accessed by observing these nuclear foci at representative intervals after the induction of double-strand DNA breaks. This approach can also identify mis-localized repair factor proteins, if repair defects do not simultaneously occur with incomplete delays in repair. In this scenario, long-lasting double-strand DNA breaks can be engineered by expressing a rare cutting endonuclease (e.g., I-SceI) in cells where the recognition site for the said enzyme has been integrated into the cellular genome. The resulting lesion is particularly hard to resolve as faithful repair will reintroduce the enzyme's recognition site, prompting another round of cleavage. As a result, differences in the kinetics of repair are eliminated. If repair complexes are not formed, localization has been impeded. This protocol describes the methodology necessary to identify changes in repair kinetics as well as repair protein localization.

Repair of double-strand DNA breaks is a dynamic process, requiring not only formation of repair complexes at the breaks, but also their resolution after the lesion is addressed. Here, we use immunofluorescence microscopy for transient and long-lasting double-stranded breaks as a tool to dissect this genome maintenance mechanism.

Charakterisierung von DNA-Reparaturprozesse bei Transienten und langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in tumorigenesis, can be directed to cancer biomarkers enabling tumor detection and characterization, and can be used for cancer therapy as mAbs or antibody-drug conjugates to activate immune effector cells, to inhibit signaling pathways, or directly kill cells carrying the specific antigen. Despite clinical advancements in the development and production of novel and highly specific mAbs, diagnostic and therapeutic applications can be impaired by the complexity and heterogeneity of the tumor microenvironment. Thus, for the development of efficient antibody-based therapies and diagnostics, it is crucial to assess the biodistribution and interaction of the antibody-based conjugate with the living tumor microenvironment. Here, we describe In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL) as a new approach to study interactions of antibody-based therapeutics and diagnostics in the in vivo physiological and pathological conditions. In this technique, a therapeutic or diagnostic antigen-specific antibody is intravenously injected in&#160;vivo and localized ex vivo with a secondary antibody in isolated tumors. IVIL, therefore, reflects the in vivo biodistribution of antibody-based drugs and targeting agents. Two IVIL applications are described assessing the biodistribution and accessibility of antibody-based contrast agents for molecular imaging of breast cancer. This protocol will allow future users to adapt the IVIL method for their own antibody-based research applications.

The in vivo immunofluorescence localization (IVIL) method can be used to examine in vivo biodistribution of antibodies and antibody conjugates for oncological purposes in living organisms using a combination of in vivo tumor targeting and ex vivo immunostaining methods.

In Vivo Immunfluoreszenzlokalisation zur Bewertung der therapeutischen und diagnostischen Antikörperbiodistribution in der Krebsforschung

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few decades, the field of antibody-drug conjugates, bispecific antibodies, chimeric antigen receptors (CAR) and cancer immunotherapy has emerged as the most promising area of basic and therapeutic investigations. With numerous successful human trials targeting immune checkpoint receptors and CAR-T cells in leukemia and melanoma at a breakthrough pace, it is highly exciting times for oncologic therapeutics derived from variations of antibody engineering. Regrettably, a significantly large numbers of antibody and CAR based therapeutics have also proven disappointing in human trials of solid cancers because of the limited availability of immune effector cells in the tumor bed. Importantly, nonspecific distribution of therapeutic antibodies in tissues other than tumors also contribute to the lack of clinical efficacy, associated toxicity and clinical failure. As faithful translation of preclinical studies into human clinical trails are highly relied on mice tumor xenograft efficacy and safety studies, here we highlight a method to test the tumor and general tissue distribution of therapeutic antibodies. This is achieved by labeling the protein-A purified antibody with near Infrared fluorescent dye followed by live imaging of tumor bearing mice.

Here we present a protocol to study the in vivo localization of antibodies in mice tumor xenograft models.

Analyse der Tumor- und Gewebeverteilung von Zielantigen-spezifischen therapeutischen Antikörpern

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage response induced by neutron-gamma mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT). Specifically, the proposed methodology is applied for the detection of repair proteins activation which can be visualized as foci using antibodies specific to DNA double-strand breaks (DNA-DSBs). DNA repair foci were assessed by immunofluorescence in colon cancer cells (HCT-116) after irradiation with the neutron-mixed beam. DNA-DSBs are the most genotoxic lesions and are repaired in mammalian cells by two major pathways: non-homologous end-joining pathway (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR). The frequencies of foci, immunochemically stained, for commonly used markers in radiobiology like &#947;-H2AX, 53BP1 are associated with DNA-DSB number and are considered as efficient and sensitive markers for monitoring the induction and repair of DNA-DSBs. It was established that &#947;-H2AX foci attract repair proteins, leading to a higher concentration of repair factors near a DSB. To monitor DNA damage at the cellular level, immunofluorescence analysis for the presence of DNA-PKcs representative repair protein foci from the NHEJ pathway and Rad52 from the HRR pathway was planned. We have developed and introduced a reliable immunofluorescence staining protocol for the detection of radiation-induced DNA damage response with antibodies specific for repair factors from NHEJ and HRR pathways and observed radiation-induced foci (RIF). The proposed methodology can be used for investigating repair protein that is highly activated in the case of neutron-mixed beam radiation, thereby indicating the dominance of the repair pathway.

Radiation-induced DNA damage response activated by neutron mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT) has not been fully established. This protocol provides a step-by-step procedure to detect radiation-induced foci (RIF) of repair proteins by immunofluorescence staining in human colon cancer cell lines after irradiation with the neutron-mixed beam.

Immunfluoreszenz Bildgebung von DNA-Schäden und Reparatur-Fozien in menschlichen Darmkrebszellen

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis as well as for the treatment selection and its response in cancer patients. The current gold standard method for detecting tumor mutations involves a genetic test of tumor DNA by means of tumor biopsies. However, this invasive method is difficult to be performed repeatedly as a follow-up test of the tumor mutational repertoire. Liquid biopsy is a new and emerging technique for detecting tumor mutations as an easy-to-use and non-invasive biopsy approach.
Cancer cells multiply rapidly. In parallel, numerous cancer cells undergo apoptosis. Debris from these cells are released into a patient&#8217;s circulatory system, together with finely fragmented DNA pieces, called cell-free DNA (cfDNA) fragments, which carry tumor DNA mutations. Therefore, for identifying cfDNA based biomarkers using liquid biopsy technique, blood samples are collected from the cancer patients, followed by the separation of plasma and buffy coat. Next, plasma is processed for the isolation of cfDNA, and the respective buffy coat is processed for the isolation of a patient&#39;s genomic DNA. Both nucleic acid samples are then checked for their quantity and quality; and analyzed for mutations using next-generation sequencing (NGS) techniques.
In this manuscript, we present a detailed protocol for liquid biopsy, including blood collection, plasma, and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

In this paper we present a detailed protocol for non-invasive liquid biopsy technique, including blood collection, plasma and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

Nachweis zellfreier DNA in Blutplasmaproben von Krebspatienten

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several animal models have been generated, including the widely used orthotopic mouse models, where cancer cells are injected into the mammary fat pad. However, these models cannot help monitor tumor growth kinetics and metastatic colonization. Cutting-edge tools to monitor cancer cells in real time in mice will significantly advance the understanding of tumor biology. 
Here, breast cancer cell lines stably expressing luciferase and green fluorescent protein (GFP) were established. Specifically, this technique contains two sequential steps initiated by measuring the luciferase activity in vitro and followed by the implantation of the cancer cells into mammary fat pads of nonobese diabetic-severe combined immunodeficiency (NOD-SCID) mice. After the injection, both the tumor growth and metastatic colonization are monitored in real time by the noninvasive bioluminescence imaging system. Then, the quantification of GFP-expressing metastases in the lungs will be examined by fluorescence microscopy to validate the observed bioluminescence results. This sophisticated system combining luciferase and fluorescence-based detection tools evaluates cancer metastasis in vivo, which has great potential for use in breast cancer therapeutics and disease management.

Here, we describe a noninvasive monitoring method involving luciferase and green fluorescent protein expression in various breast cancer cell lines. This protocol provides a technique to monitor tumor formation and metastatic colonization in real time in mice.

Überwachung des Brustkrebswachstums und der metastasierenden Koloniebildung bei Mäusen mittels Biolumineszenz

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, transcription-replication conflicts, or amplified oncogenes, inevitably resulting in the generation of single-stranded DNA (ssDNA). Quantifying ssDNA, therefore, presents an opportunity to assess the level of replication stress in different cell types and under various DNA-damaging conditions or treatments. Emerging evidence also suggests that ssDNA can be a predictor of responses to chemotherapeutic drugs that target DNA repair. Here, we describe a detailed immunofluorescence-based methodology to quantify ssDNA. This methodology involves labeling the genome with a thymidine analog, followed by the antibody-based detection of the analog at the chromatin under non-denaturing conditions. Stretches of ssDNA can be visualized as foci under a fluorescence microscope. The number and intensity of the foci directly co-relate with the level of ssDNA present in the nucleus. We also describe an automated pipeline to quantify the ssDNA signal. The method is rapid and reproducible. Furthermore, the simplicity of this methodology makes it amenable to high-throughput applications such as drug and genetic screens.

Here, we describe an immunofluorescence-based method to quantify the levels of single-stranded DNA in cells. This efficient and reproducible method can be utilized to examine replication stress, a common feature in several ovarian cancers. Additionally, this assay is compatible with an automated analysis pipeline, which further increases its efficiency.