Name: application of aorta-gonad-mesonephros explant culture system in developmental hematopoiesis
Uploaded: 2017-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
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Suwei Gao は、図の準備のヘルプを感謝いたします。この作品は、国家自然科学基金、中国の (81530004、31425016) および科学省と中国の技術 (2016YFA0100500) からの助成金によって支えられました。J. l. が、実験を行い; 原稿を起草F. l. は、原稿を編集します。著者は両方とも読み、最終原稿を承認します。

動物科目を含むすべてのプロシージャは、中国科学院動物研究所の北京、中国の倫理審査委員会によって承認されている。
 1 材料準備 <ol><li>定置滅菌、0.65 μ m フィルター紫外線光線の紫外線の下で生産 4 h 用クリーン ベンチ内でランプをレイと 2 h マークの後にフィルターを裏返して。 。
	注: UV ライトを使用して、適切な保護を着用します</li>。
	<li>滅菌オートクレーブ殺菌剤 30 分のための 121 ° c でステンレス メッシュします 。
	注: 気液界面でフィルターをサポートするステンレス メッシュのある特定の高さが必要し、スチール メッシュ ( 図 1 A) にワイヤーとそれを実現すます</li>。
	<li>長期的な M5300 に 10 μ M の最終濃度に希釈フルオキセチン文化メディアとミックスに均等にします 。
	注: 6 ウェル プレート 2 mL M5300 長期培養培地は各ウェルに適したです。10 -6 M でヒドロコルチゾンを媒体に選択的に希釈できる</li>。
	<li>6 ウェル プレートや料理に 10 μ M でフルオキセチンを添加した培地を転送し、媒体に滅菌のステンレス メッシュを入れて</li>。
	<li>は、殺菌のためガラス細胞培養皿のたびに 2 回 3 分の沸騰水で 0.65 μ m フィルターを洗ってください。[スケマティック 図 1 A のように、それぞれの洗浄、入れフィルター リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2 分とウェット フィルター ステンレスの上に場所をメッシュ気液界面に立ってを後センター] にします 。
	注: 無菌状態を達成するためにオートクレーブ滅菌器で生成水を沸騰と温度低下を避けるために機器をタイムリーにオートクレーブ滅菌器から取り除いてください</li>。
</ol> 2。AGM 外植体文化 <ol><li>は慎重に鉗子で E10.5 または E11 で胚から AGM の領域を分離します。
	<ol><li>解剖はさみで妊娠マウスから子宮を除去し、子宮の胚の区別します</li>。
		<li>卵黄嚢、臍帯、胎児の体から内臓をふき取りなさい</li>。
		<li>背側神経組織や周囲の筋肉組織を慎重に削除します</li>。
		<li>カットは、前部と後部の肢のサイトで鉗子で組織をオフ、胚体から AGM 地域を区切ります。 図 1B C を示す模式図と解剖 AGM の形態</li>。
	</ol></li> <li>2 〜 3 日の 37 ° C で 5% CO 2 液体空気インターフェイス ( 図 1 A) 文化でフィルターに別々 に切り裂かれた議事録を外植体します 。
	注: はないスチール メッシュのワイヤーに切り裂かれた AGM を配置し、フィルターは、気液界面培養中かどうかを確認します。AGM、以外にも卵黄嚢と胎仔肝することができますはまた培養するこのシステム 7 と</li>。
</ol> 3。発現解析 <ol><li>mRNA レベル <ol><li>1 mL の PBS に培養された議事録を収集し 4 ° C、6 分 310 × g で遠心分離</li>
		<li>上清を除去した後フェノールの単相性ソリューションで収集した定時から総 RNA を抽出、メーカーによると &#39; の指示</li>。
		<li>総 RNA (2 μ g) は、逆 M MLV 逆転写酵素を使用して、テンプレートとして cDNA を取得するを転写。定量的リアルタイム PCR の試金は SYBR グリーンで実行され、Gapdh は内部統制として使用されます</li>。
	</ol></li> <li>蛋白質のレベル <ol><li>3.1.1 の手順で上記のように培養 AGM を収集します</li>。
		<li>セル換散バッファーと培養の AGM から蛋白質の準備 (10 mM トリス塩酸、10 mM の NaCl、および 0.5% NP 40) 13 プロテアーゼ阻害剤と前述の蛋白質のレベルを検出する西部のしみのための使用を含む説明</li>。
	</ol></li></ol> 4。文化 (CFU-C) アッセイでのコロニー形成単位 <ol><li>2-3 日培養後 1 mL リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と 4 ° C、6 分 310 × g で遠心分離機に AGM 地域を収集し、37 で 200 μ L コラゲナーゼ (PBS で 0.1%) との関連付けを解除° C 
	注: コラゲナーゼ単一細胞懸濁液を生成するために必要な時間は約 20 分です。AGM を格納筒を振るごとに 5 分は消化プロセスを加速できます。200 μ L 0.1% コラゲナーゼは各 AGM 用、200 μ L 10% 血清反応を停止するために使用します</li>。
	<li>文化 M3434 超低添付ファイル 24 ウェル プレート中の単一細胞を懸濁液します 。
	注: 汚染を避けるためには、ペニシリン ・ ストレプトマイシン液選択追加できます媒体に。M3434 媒体は粘性、ため針なし 1.0 cc 注射器が細胞と培地を混合する使用されます</li>。
	<li>後 7 - 10 日間培養 5% CO 2 の 37 ° C でコロニー形成単位の赤芽球 (BFU E)、CFU granulo, 単球 (CFU-GM) と CFU-顆粒球、バーストを含む赤血球、巨核球 (CFU ジェム) マクロファージの種類ごとの数識別形態に基づいて、倒立顕微鏡 ( 図 2 C) を獲得します</li>。
</ol> 5。生体内で移植アッセイ 植を培養、<ol><li>コロニー形成単位脾臓 (CFU-S) 試金 <ol><li>後 2 - 3 日議事録を収集し、200 μ L コラゲナーゼ (PBS で 0.1%) 20 のと孵化によって単一細胞を懸濁液の準備分</li>
		<li>男性 8 に 10 週齢の c57bl/6 マウスの致死照射 (x 線の 9 Gy) を行う細胞の注入の前に 4-5 h</li>。
		<li>照射マウスを入れてその活動を制限する落</li>。
		<li>静脈の血管拡張を促進するために 75% アルコールで綿棒を使って尾を拭く</li>。
		<li>0.5 の胚と同等 (ee) または 1 ee 単一セル中断 AGM の静脈内に注入照射マウスの尾静脈 1.0 cc 注射器です 。
		注: セル PBS を中断している、受信者ごとの 0.5 mL PBS、適切な音量。25 ゲージまたはサイズ 26 ゲージの針は、1.0 cc 注射器で注入に使用されます。注射器に空気を導入することができます。出血を止めるため防腐剤綿棒と注射部位を押します</li>。
		<li>11 日ポスト移植を収集、ブアンで受信者のマウスの脾臓を修正 &#39; s ソリューション (1.22% ピクリン酸飽和溶液 15 mL、2 mL 40% メタノールと酢酸 1 mL) 1-2 日の別の 1 〜 2 日の 80% のアルコールで洗浄。肉眼的脾臓における目に見えるコロニーをカウントし、ee あたりのコロニーの数を決定します 。
		&#8203; 注: ブアン &#39; s 定着剤、摩耗の適切な保護します</li>。
	</ol></li> <li>長期的な移植アッセイ <ol><li>後 2-3 日培養外植体議事録を収集し、200 μ L コラゲナーゼ (PBS で 0.1%) 20 分と孵化によって単一細胞を懸濁液の準備</li>
		<li>致命的な照射 (x 線の 9 Gy) 男性 8 に 10 週齢の c57bl/6 マウスの細胞の注入の前に 4-5 時間を実行します</li>。
		<li>照射マウスを入れてその活動を制限する落</li>。
		<li>静脈の血管拡張を促進するために 75% アルコールで綿棒を使って尾を拭く</li>。
		< l私 > 0.5 胚と同等 (ee) を挿入または 1 ee 1.0 cc 注射器で照射マウスの尾静脈に静脈内 AGM のセル中断のシングルします。AGM は 2 × 10 5 骨髄細胞 (CD45.1 背景) と受信者ごと 1 ee の用量で注入される 。
		注: 空気を導入していない注射器に。出血を止めるため防腐剤綿棒と注射部位を押します</li>。
		<li>4 ヶ月間は、移植後、受信者の骨髄を収集し、FACS による再構成の試金のためにそれを使用します。持つ受信者のみ &#8805; 10% ドナー由来のキメリズムが成功した再構成を展示すると見なされます</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development.">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464, 108-111 (2010).</li><li>Boisset, J. 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著者は金融利害の対立があります。

骨髄で成熟した造血が照射受信者の血システムを再作成することができますが知られています。異なり、これらの機能の HSCs マウス胚の AGM で新興の HSCs は熟女ではありません。直接移植結果このような私 (VE cad+ CD45- CD41+) と II 型 (VE cad+ CD45+) 前 HSCs が再構成能力20を所有していません。AGM 植文化システム、AGM 地域における初期の HSCs の利点を取って移植アッセイ4,20の受信者を再構築できます。さらに、マウス胚の子宮内開発により KO マウスの造血の障害者を救出する生体内で実験が実行する便利です。AGM 植文化は代替システム、中13,15に (成長因子とサイトカイン) の化学物質を加えることによって単にレスキュー実験に適しています。AGM、に加えてまた卵黄嚢と胎仔肝をこのシステム7で培養することができます。
この実験の先頭には、ステンレス メッシュ フィルターの厳密な滅菌は汚染を避けるためにとても重要です。もっと重要なは、文化の重要なステップは気液界面でフィルターに切り裂かれた AGM の培養をすることです。あまりにも多くの媒体の液体培養する AGM 原因となります、少なすぎる媒体は、AGM の乾燥を作る一方、虫歯かもしれない。培養中に細胞インキュベータの適切な湿度の維持も重要です培地の蒸発を防ぐために。
これの更なる向上は HSCs の体内における文化技術21の最近の進歩と開発を本当に模倣する培養系を外植体から造血研究への応用も大きく拡充HSC の自己複製、複数系統の分化と病のモデリングおよび薬剤の発見に HSC ニッチな相互作用。

造血幹細胞 (造血)、組織固有成体幹細胞多能性赤芽球、骨髄性を含むリンパ球様細胞と自己更新する能力を持っています。最近の研究は、初期の HSCs が背側大動脈1,2 の腹側の壁で造血転移 (EHT) 血管内皮を介して hemogenic 内皮 (彼) と呼ばれる特殊な血管内皮人口に生じた示されています。 ,3,4。マウス胚における E12.5 に胚 (E) 10.5 から大動脈生殖巣中の (AGM) 地域に結成され、一度 HSCs が拡張のため胎児の肝臓に移行、最終的に個人の生活の中で成人の造血を維持するために骨髄を植民地化5,6。 これは、長年にわたって研究されている、HSC の出現と発展の基になるメカニズムの不完全な理解まま。
体外受精やゼブラフィッシュ胚の開発と違ってマウス胚の子宮内開発研究を行う決定的な造血の胚形成の間にはるかに不便。ノックアウト (KO) マウスを用いた遺伝子実験が一般に利用が特定の KO マウスの不足はまた造血研究分野での使用を制限します。さらに、レスキューを実験する生体内では、KO マウスで簡単には実行されません。1996 年以来、AGM 培養は、フィールド7の開拓者によって造血研究開発されています。この文化システムの助けを借りて、AGM 部腹側の組織は、背側の組織は、反対の効果8,9を発揮しながら、HSC の活動を促進するために識別されています。AGM 植文化システムは、セロトニン、Mpl、SCF、BMP、および HSC 開発10、11,12,13,におけるヘッジホッグのロールを判断に適用されています。14します。 重要なことは、また変異胚13,15造血欠陥を救助するために使用人気のある方法です。

<table><tbody><tr><td>durapore 0.65 &amp;micro;m filters</td><td>Millipore</td><td>R5BA63787</td><td>AGM explant culture</td></tr><tr><td>M5300 long-term culture medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5300</td><td>AGM explant culture</td></tr><tr><td>Trizol&amp;nbsp;</td><td>Tiangen</td><td>5829</td><td>RNA extration</td></tr><tr><td>M-MLV reverse transcriptase</td><td>Promega</td><td>90694</td><td>reverse transcription</td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Qiagen</td><td>A6002</td><td>quantatitive real-time PCR</td></tr><tr><td>protease inhibitor</td><td>Roche</td><td>55622</td><td>Protein extration</td></tr><tr><td>collagenase</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>digestion of AGM tissues</td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434 medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>3434</td><td>CFU-C assay</td></tr><tr><td>ultra-low attachment 24-well plates</td><td>Costar</td><td>3473</td><td>CFU-C assay</td></tr><tr><td>C57BL/6 CD45.2 mice</td><td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td><td>CFU-S assay</td></tr><tr><td>C57BL/6 CD45.1 mice</td><td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td><td>Long-term transplantation</td></tr><tr><td>phosphate buffered saline</td><td>Life Technologines</td><td>8115284</td><td>AGM Collection</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>AGM explant culture</td></tr><tr><td>anti-CD45.2-PE-CY7</td><td>eBioscience</td><td>25-0454-80</td><td>Long-term transplantation</td></tr><tr><td>anti-CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td>Long-term transplantation</td></tr><tr><td>UV lamp</td><td>Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD</td><td>039-14402</td><td>power: 30W</td></tr><tr><td>stainless steel mesh</td><td>AS ONE SHANGHAI Corporation</td><td>2-9817-10&amp;nbsp;</td><td>aperture diameter: 2.5 mm</td></tr><tr><td>hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td>selectively diluted into M5300 medium</td></tr></tbody></table>

application of aorta-gonad-mesonephros explant culture system in developmental hematopoiesis

マウス胚を用いた造血研究の制限は、主に胚の子宮内開発のための操作で追加の不便です。ノックアウト (KO) マウスの遺伝データが説得力のある、すべて遺伝子 KO マウスを必要に応じて生成するは現実的ではありません。さらに、生体内で実行する KO マウスから得られたデータを統合するレスキュー実験不便です。これらの制限を克服するために、大動脈性腺発生 (AGM) 培養は、造血幹細胞 (HSC) の開発を検討する適切なシステムとして開発されました。特にレスキュー実験の KO マウスの造血の障害を回復に使えます。適切な化学物質をメディアに追加すると、障害信号を再開することができます。 または調整された細道を禁じることができます。このメソッドの使用は、多くの実験は HSC の開発の重要な調整装置を識別するために実行することができます、HSC など関連する遺伝子の発現 mRNA および蛋白質レベル、コロニー形成能力および再構成能力。この一連の実験は哺乳類における HSC 開発に欠かせない根本的なメカニズムを定義するのに役立つでしょう。

最近の出版物は、血管内皮細胞由来セロトニン AGM13pro のアポトーシスを阻害することによって造血の生存を促進する報告しました。HSC におけるセロトニンの促進効果を確認、フルオキセチンが含まれていた。選択的セロトニン再取り込み阻害剤 (SSRI)、としてフルオキセチンは、末梢組織16,17,18にセロトニンの再吸収を阻害する実証されています。文化システムの変化、AGM を使用して、上に示した手順に従って、フルオキセチンの HSC の開発に及ぼす影響を調べた。式解析それぞれ HSC 開発19、フルオキセチン治療 AGMs mRNA および蛋白質レベルでの極めて重要な遺伝子として定義されている Runx1 の発現増加を示した (図 2Aおよび2 b)。フルオキセチンも大幅 HSCs AGM では、BFU E、CFU-GM、CFU ジェム (図 2Cと図 2D) などでのコロニー形成能力を増やすことができます。さらに、生体内移植結果、フルオキセチン治療 AGM の HSCs が照射成人レシピエント (図 2E) における脾臓コロニーの数を増やすことができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56557/56557fig1.jpg"> 
図 1.AGM 構造と植の模式図は文化システムです。 
(A) AGM 植文化システムを使用するためのフローチャートは HSCs 開発化学物質の影響を確認します。簡単に言えば、AGMs 胚から切除し、M5300 長期的な培地の希釈の化学物質とフィルターの気液界面培養します。2-3 日後、培養定時収集および造血関連遺伝子、コロニー形成能および再作成能力発現を調べるために使用します。AGM では、大動脈-生殖腺の発生;カルチャーの CFU C, コロニー形成単位CFU-S は、コロニー形成単位脾臓。(B) AGM の構造はこの図で示されています。背側大動脈;私は、間充織;G, 生殖腺;M、中。(C) AGM の形態。AGM は、E10.5 で周囲の間葉系細胞と胚体の尾側半分から分離されています。スケール バー = 1 mm.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56557/56557fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56557/56557fig2.jpg"> 
図 2.AGM のアプリケーションは、フルオキセチンの HSC の開発に及ぼす影響を検出する培養系を外植体します。(A)投与 10 μ M はフルオキセチンと定時でRunx1の mRNA レベルが量的なリアルタイム PCR で検出されました。スチューデントのt検定: * *、P &#60; 0.01。結果は、平均 ± SEM. (B)ウエスタンブロット分析をさらに確認 Runx1 議事録のタンパク質レベルでの発現の増加がフルオキセチンで治療として掲載されています。(C)代表的なイメージは、BFU E、CFU-GM、CFU ジェムの形態を示します。スケールバー = 100 μ m (D) CFU C 試験では, フルオキセチン治療がコロニーの種類ごとの数を増やすことができます。1 つの胚と同等 (ee) が使用されました。スチューデントのt検定: *、P &#60; 0.05;* *、P &#60; 0.01.The 結果 AGMs フルオキセチンが脾臓照射成人レシピエントにおけるコロニーの数を増やすことができます, フルオキセチン治療として平均 ± SEM. (E) CFU-S の試金が表示されます。スケール バー = 1.5 mm. 1 ee が使用されました。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56557/56557fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

このプロトコルを記述する発現解析、文化と脾臓、および長期的な再構成のコロニー形成単位の培養大動脈生殖巣中腎を使用して造血幹に及ぼす制御因子、シグナル伝達経路を決定するには細胞の開発。これは、造血幹細胞生物学、機能を研究するための効果的なシステムとして実証されています。

造血の発達における大動脈生殖巣中植文化システムのアプリケーション

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

application-aorta-gonad-mesonephros-explant-culture-system

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.4K ビュー.  Chinese Academy of Sciences. このプロトコルを記述する発現解析、文化と脾臓、および長期的な再構成のコロニー形成単位の培養大動脈生殖巣中腎を使用して造血幹に及ぼす制御因子、シグナル伝達経路を決定するには細胞の開発。これは、造血幹細胞生物学、機能を研究するための効果的なシステムとして実証されています。

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Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop within the uterus. A newly developed ex vivo upright droplet culture method provides an attractive alternative to studies performed in utero. The ex vivo droplet culture provides the ability to examine and manipulate cellular interactions and diverse signaling pathways through use of various blocking and activating compounds; additionally, the effects of various pharmacological reagents on the development of specific organs can be studied without unwanted side effects of systemic drug delivery in utero. As compared to other in vitro systems, the droplet culture not only allows for the ability to study three-dimensional morphogenesis and cell-cell interactions, which cannot be reproduced in mammalian cell lines, but also requires significantly less reagents than other ex vivo and in vitro protocols. This paper demonstrates proper mouse fetal organ dissection and upright droplet culture techniques, followed by whole organ immunofluorescence to demonstrate the effectiveness of the method. The ex vivo droplet culture method allows the formation of organ architecture comparable to what is observed in vivo and can be utilized to study otherwise difficult-to-study processes due to embryonic lethality in in vivo models. As a model application system, a small-molecule inhibitor will be utilized to probe the role of vascularization in testicular morphogenesis. This ex vivo droplet culture method is expandable to other fetal organ systems, such as lung and potentially others, although each organ must be extensively studied to determine any organ-specific modifications to the protocol. This organ culture system provides flexibility in experimentation with fetal organs, and results obtained using this technique will help researchers gain insights into fetal development.

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

使い方<em&gt;エクスビボ</em&gt;全体の胎児器官の直立飛沫培養物をマウス器官中に発生過程を研究します

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

発生生物学

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional (3D) tissue wherein hematopoiesis is regulated by spatially organized cellular microenvironments termed niches2-4. The organization of the BM niches is critical for the function or dysfunction of normal or malignant BM5. Therefore a better understanding of the in vivo microenvironment using an ex vivo mimicry would help us elucidate the molecular, cellular and microenvironmental determinants of leukemogenesis6.
Currently, hematopoietic cells are cultured in vitro in two-dimensional (2D) tissue culture flasks/well-plates7 requiring either co-culture with allogenic or xenogenic stromal cells or addition of exogenous cytokines8. These conditions are artificial and differ from the in vivo microenvironment in that they lack the 3D cellular niches and expose the cells to abnormally high cytokine concentrations which can result in differentiation and loss of pluripotency9,10.
Herein, we present a novel 3D bone marrow culture system that simulates the in vivo 3D growth environment and supports multilineage hematopoiesis in the absence of exogenous growth factors. The highly porous scaffold used in this system made of polyurethane (PU), facilitates high-density cell growth across a higher specific surface area than the conventional monolayer culture in 2D11. Our work has indicated that this model supported the growth of human cord blood (CB) mononuclear cells (MNC)12 and primary leukemic cells in the absence of exogenous cytokines. This novel 3D mimicry provides a viable platform for the development of a human experimental model to study hematopoiesis and to explore novel treatments for leukemia.

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

A 3D culture system for hematopoiesis is described using human cord blood and leukemic bone marrow cells. The method is based on the use of a porous synthetic polyurethane scaffold coated with extracellular matrix proteins. This scaffold is adaptable to accommodate a wide range of cells.

正常と異常ヒト造血のex vivoでの擬態

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional ...

生物工学

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

マウス胎児腎臓の解剖および培養

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic lamellae and smooth muscle cells (SMCs), and an outer layer of fibroblasts and extracellular matrix. In contrast to the widespread study of pathological models (e.g., atherosclerosis) in the adult aorta, much less is known about the embryonic and perinatal aorta. Here, we focus on SMCs and provide protocols for the analysis of the morphogenesis and pathogenesis of embryonic and perinatal aortic SMCs in normal development and disease. Specifically, the four protocols included are: i) in vivo embryonic fate mapping and clonal analysis; ii) explant embryonic aorta culture; iii) SMC isolation from the perinatal aorta; and iv) subcutaneous osmotic mini-pump placement in pregnant (or non-pregnant) mice. Thus, these approaches facilitate the investigation of the origin(s), fate, and clonal architecture of SMCs in the aorta in vivo. They allow for modulating embryonic aorta morphogenesis in utero by continuous exposure to pharmacological agents. In addition, isolated aortic tissue explants or aortic SMCs can be used to gain insights into the role of specific gene targets during fundamental processes such as muscularization, proliferation, and migration. These hypothesis-generating experiments on isolated SMCs and the explanted aorta can then be assessed in the in vivo context through pharmacological and genetic approaches.

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Protocols for studying the embryonic and perinatal murine aorta using in vivo clonal analysis and fate mapping, aortic explants, and isolated smooth muscle cells are detailed here. These diverse approaches facilitate the investigation of the morphogenesis of the embryonic and perinatal aorta in normal development and the pathogenesis in disease.

体内と組織や細胞植アプローチを使用して形態形成と胚および周産期の大動脈の病因を研究するには

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセル インデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Optimization of Renal Organoid and Organotypic Culture for Vascularization, Extended Development, and Improved Microscopy Imaging

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental processes and modelling kidney disease. However, the models are limited by a lack of vascularization and functionality. To address this, an improved protocol for the method of xenografting cells and tissues to the chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo to gain vascularization and restoration of blood flow was developed. The grafts are overlaid with custom-made minireservoirs that fix the samples to the CAM and supply them with culture medium that protects the grafts from drying. The improved culture method allows xenografts to grow for up to 9 days. The manuscript also describes how to provide optimal conditions for long-term confocal imaging of renal organoids and organotypic cultures using the previously published Fixed Z-Direction (FiZD) method. This method gently compresses an embryonic organ or organoid between a glass coverslip and membrane in a large amount of medium and provides excellent conditions for imaging for up to 12 days. Together, these methods allow vascularization and blood flow to renal organoids and organotypic kidney cultures with improved confocal imaging. The methods described here are highly beneficial for studying fundamental and applied functions of kidneys ex vivo. Both methods are applicable to various types of tissues and organoids.

This work describes two methods for studying organ development, an improved xenotransplantation setup on chorioallantoic membrane (CAM) from avian embryos that allows for vascularization of cultured embryonic organs and organoids and a novel fixed z-direction organ culture method with modified experimental conditions that allows for high-resolution time-lapse confocal imaging.

血管化、拡張開発、および顕微鏡イメージングの改善のための腎オルガノイドおよびオルガノイド培養の最適化

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental ...

Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo and for characterizing the earliest genes involved in hematopoiesis, without having to deal with embryonic lethalities. The ES/OP9 co-culture system was originally designed to produce hematopoietic progeny, without the over production of macrophages, as the OP9 stromal cell line is derived from the calvaria of osteopetrosis mutant mice that lack functional M-CSF. The in vitro ES/OP9 co-culture system can be used in order to recapitulate early hematopoietic development. When cultured on OP9 stromal cells, ES cells differentiate into Flk-1+ hemangioblasts, hematopoietic progenitors, and finally mature, terminally differentiated lineages. The standard ES/OP9 co-culture protocol entails the placement of ES cells onto a confluent layer of OP9 cells; as well as, periodic replating steps in order to remove old, contaminating OP9 cells. Furthermore, current protocols involve evaluating only the hematopoietic cells found in suspension and are not optimized for evaluation of ES-derived progeny at each day of differentiation. However, with replating steps and the harvesting of only suspension cells one potentially misses a large portion of ES-derived progeny and developing hematopoietic cells. This issue becomes important to address when trying to characterize hematopoietic defects associated with knockout ES lines. Here we describe a modified ES/mStrawberry OP9 co-culture, which allows for the elimination of contaminating OP9 cells from downstream assays. This method allows for the complete evaluation of all ES-derived progeny at all days of co-culture, resulting in a hematopoietic differentiation pattern, which more directly corresponds to the hematopoietic differentiation pattern observed within the embryo.

mStrawberry OP9 cells allow for complete evaluation of all ES-derived progeny from co-culture.

修正されたES / OP9共培養のプロトコルは、造血後代の強化された特性を提供します。

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo ...

生物学

<meta charset="utf8"></head><body>放射線照射マウスにおける効果的な造血幹細胞移植のための骨オルガノイド由来細胞

In Vivo Osteo-organoid Approach for Harvesting Therapeutic Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) requires a sufficient number of therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). To identify an adequate source of HSPCs, we developed an in vivo osteo-organoid by implanting scaffolds loaded with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) into an internal muscle pouch near the femur in mice. After 12 weeks of implantation, we retrieved the in vivo osteo-organoids and conducted flow cytometry analysis on HPSCs, revealing a significant presence of HSPC subsets within the in vivo osteo-organoids.
We then established a sublethal model of hematopoietic/immune system injury in mice through radiation and performed hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) by injecting the extracted osteo-organoid-derived cells into the peripheral blood of radiated mice. The effect of hematopoietic recovery was evaluated through hematological, peripheral blood chimerism, and solid organ chimerism analyses. The results confirmed that in vivo osteo-organoid-derived cells can rapidly and efficiently reconstruct damaged peripheral and solid immune organs in irradiated mice. This approach holds potential as an alternative source of HSPCs for HSCT, offering benefits to a larger number of patients.

<meta charset="utf8"></head><body>治療用造血幹細胞/前駆細胞を回収するためのin vivoオステオオルガノイドアプローチ

Here, we established in vivo osteo-organoids triggered by bone morphogenetic protein-2-loaded gelatin scaffolds to harvest therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells for the reconstruction of a damaged hematopoietic and immune system. Overall, this approach can provide a promising cell source for cell therapies.

治療用造血幹細胞/前駆細胞を回収するためのin vivoオステオオルガノイドアプローチ

Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) requires a sufficient number of therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). To identify an ...

造血の発達における大動脈生殖巣中植文化システムのアプリケーション

要約

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使い方

正常と異常ヒト造血のex vivoでの擬態

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

マウス胎児腎臓の解剖および培養

体内と組織や細胞植アプローチを使用して形態形成と胚および周産期の大動脈の病因を研究するには

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセルインデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析

血管化、拡張開発、および顕微鏡イメージングの改善のための腎オルガノイドおよびオルガノイド培養の最適化

修正されたES / OP9共培養のプロトコルは、造血後代の強化された特性を提供します。

治療用造血幹細胞/前駆細胞を回収するためのin vivoオステオオルガノイドアプローチ

治療用造血幹細胞/前駆細胞を回収するためのin vivoオステオオルガノイドアプローチ

造血の発達における大動脈生殖巣中植文化システムのアプリケーション

要約

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使い方

正常と異常ヒト造血のex vivoでの擬態

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

マウス胎児腎臓の解剖および培養

体内と組織や細胞植アプローチを使用して形態形成と胚および周産期の大動脈の病因を研究するには

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセル インデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析

血管化、拡張開発、および顕微鏡イメージングの改善のための腎オルガノイドおよびオルガノイド培養の最適化

修正されたES / OP9共培養のプロトコルは、造血後代の強化された特性を提供します。

治療用造血幹細胞/前駆細胞を回収するためのin vivoオステオオルガノイドアプローチ

治療用造血幹細胞/前駆細胞を回収するためのin vivoオステオオルガノイドアプローチ

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセルインデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析