治療用造血幹細胞/前駆細胞を回収するためのin vivoオステオオルガノイドアプローチ

私たちは、ウイルス開発中の物質生物学者、活性骨修復材料、成長因子、調製、活性化の技術者という先駆的な概念を導入できるバイオマテリアルの研究に長年取り組んできました。私たちは、生理活性材料を用いたIn Vivo Osteo-Organoid法を開発し、疾患治療のための自動結節、組織、細胞のオンデマンド生産を実現しました。従来の幹細胞の個別増殖技術は、幹細胞の生理機能の維持に限界がありました。

私たちのプロトコールは、個々の培養物の微小環境を構築して、刺激を維持しながら幹細胞を豊富に確保します。まず、組換えヒトストック溶液と未開封のゼラチンスポンジを滅菌クリーンベンチに置きます。滅菌したハサミを使用して、ゼラチンスポンジを均一なサイズの48個にカットし、48ウェルプレートに移します。

組換えヒトストック溶液を数回ピペットで動かし、十分に混合します。溶液の30マイクロリットルを吸引し、ゼラチンスポンジに滴下します。次に、48ウェルプレートをパラフィルムの層でシールします。

プレートをクリーンベンチから取り出し、マイナス20°Cの温度に置きます。まず、麻酔をかけたマウスを手術領域に移し、生理活性足場を左脚に簡単に移植できるように、右横臥位に配置します。シェービングマシンを使用して、左脚の髪を剃り、クロルヘキシジンとアルコールを交互に3回ずつ使用して、剃った部分を消毒します。

切開を行った後、脛骨の方向にポーチの筋肉に眼科用ハサミを挿入して、その後の材料移植のためのスペースを確保します。次に、組換えヒトを装填し、眼科用鉗子を使用して準備した生理活性足場を取り、円筒形につまみます。先ほど作成したスリットに沿って筋肉ポケットに足場を埋め込みます。

移植の12週間後、マウスに麻酔をかけ、後肢を体幹から慎重に分離します。ミニチュアハサミを使用して、骨オルガノイドから筋肉組織を細心の注意を払って取り除きます。ガーゼを使用して付着した軟組織を取り除き、きれいな骨オルガノイドサンプルを確保します。

組織学的分析のために、骨オルガノイドの一部を4%パラホルムアルデヒド溶液に室温で24時間固定します。まず、組換えヒトを含む足場を移植したマウスから骨オルガノイドを採取し、骨オルガノイドを乳鉢に配置し、カルシウムイオンとマグネシウムイオンを含まないHBSSを1ミリリットル加えます。外科用ハサミを使用してサンプルを切り刻み、乳鉢と乳棒でそっと粉砕します。

結果を細胞懸濁液に含ませ、40μmのセルストレーナーに通します。次に、300 Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。その後、上清を捨てます。

細胞ペレットを300マイクロリットルのHBSSに再懸濁し、よく混合して均一な細胞懸濁液を得る。麻酔をかけた致死放射線を照射したマウスを、摂氏37度に設定された加熱パッドに置きます。完全な麻酔を確認した後、マウスを頭を右に向けてマウスを左側に横たわるように配置します。

25ゲージの針が付いた1ミリリットルの注射器を使用して、調製した細胞懸濁液の200マイクロリットルを吸引します。施術のために目を露出させるには、頭のてっぺんと顎のラインに沿って指を置き、皮膚をそっと前後に引っ張ります。斜角を下に向けて針を目の内側眼瞼に約30度の角度で慎重に挿入します。

眼球の輪郭を針でそっとたどり、目の付け根に達するまでたどります。細胞懸濁液を指定された領域にスムーズかつゆっくりと注入します。注入が完了したら、マウスをケージに戻して回復させます。