著者はバイオ マーカーと免疫アッセイの貢献を認識したいアッセイの開発製品開発チーム。さらに、データ分析ソフトウェア パッケージの設計の彼らの共同の努力の Vigene テクノロジー株式会社に感謝したいと思います。

<ol>
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著者は、本稿に記載されている試薬を製造する BioLegend によって用いられます。株式会社 Vigene 技術は、本稿に記載されている分析から生成されたデータを分析するために使用 LEGENDplex データ解析ソフトウェアを開発しました。

このプロトコルで記述されているアッセイ フォーマットは、実験者を提供された生体試料中の可溶性調停プロファイルの堅牢な定量化は良い研究室技術と推奨されるプロトコルに準拠して提供できます。
信頼性の高い結果を保証するために従う必要がありますいくつかの主要な手順があります。まず、ポリプロピレン チューブにのみ希釈後、アッセイバッファー推奨、フルタイムを再構成する組換え基準を許可しなければなりません。ポリスチレンのチューブは、蛋白質の標準曲線を生成するときに低信号につながることができるチューブの壁への付着を促進することが。第二に、適切な培養手順中に揺れが重要です。適切な撹拌せず試金ビーズの結合特性を著しく妨げられること。さらに、インキュベーションのステップの間の適切な洗浄も必要です。実験者は過剰試薬がプロトコルの次のステップを開始する前に井戸から削除されることを確認してください。使用して試金ビーズ フローサイトの機器設定は、同様に最適化されなければなりません。特に、PMT の設定を調整して、適切なビードの分離と標準的なカーブの広いダイナミック レンジを確保する必要があります。最後に、cytometer で分析される直前にビーズに vortexed 適切なサスペンションを保証するために、集計結果を曲げるの形成を回避する必要があります。
このプロトコルは、研究者はプレート全体の大規模な分析を実行する前に、換散のプロトコルを最適化するために喜んで提供される組織乳剤として本稿で説明したサンプルの種類を分析する可能性のある変更ことができます。実際の手法は、組織の種類によってもちろん異なりますただし、一般的にプロトコルがイオンの塩の生理学的濃度、変性無農薬、好ましくない洗剤を含む中性 pH バッファーを使用する必要があります。洗剤を使用する必要がある場合非イオン性洗剤濃度は最小値 (例えばは 1% 以上) に保つ必要があります。バッファーは、標的タンパク質の分解を防ぐために十分なプロテアーゼ阻害剤を含める必要があります。換散のプロトコルが使用されるに関係なく微粒子分析の前に削除する最終準備を遠心する必要があります。
試金の制限に関する生物学的サンプルの型内の試料ターゲットの濃度が異なります。適切濃度を定量化するために、標準的なカーブのための上位および下位の値に収まる必要があります。カーブの値の外挿は、必ずしも信頼性がないと、お勧めしません。したがって調査官は、完全版の試金を実行する前にパイロット実験でそれらの特定のサンプルの希釈液を最適化する必要があります。さらに、試金するのに生物学的サンプルの入念な準備は、このアッセイの形式の成功に重要です。Lipemic、溶血されました、または蛋白質の破片を含むサンプルはこの免疫測定法の基本原則を定義する抗原抗体の相互作用に影響を与える、解釈である結果をレンダリングします。
この試金はいくつかの理由のための既存の定量化方法に関して重要です。正しく実行されると、アッセイの形式することができます量的に表わす伝統的な ELISA アッセイを使用してサンプルを分析する必要があるよりもはるかに小さいボリュームを使用してサンプルから最大 13 検体。このアッセイ フォーマットも必要ありません専用計測を実行するために。これは、アッセイは、一般的に使用される流れの cytometers の任意の数を使用して実行できる、他の市販のビーズを用いたイムノアッセイと比較利点です。
健康ネットワーク分泌因子とサイトカイン演じる役割への科学的な調査と病が拡大しています。本稿で説明している分析書式は、これらの多面的で複雑な現象を理解しようとする研究者にとって貴重なツールを使用できます。アクティブな生物医学研究プログラムは、だけでなくエリアなど、一般化された炎症6、におけるサイトカイン ネットワークの役割だけでなく、アテローム性動脈硬化、癌、neuroinflammationなど特定の病気の状態のコンテキストを探検し始めています。15,16,17。間違いなく、調査は、これら慢性疾患治療の検索が拡張されるとこれらの分野で成長を続けるでしょう。これらの疾患に関連付けられている溶性メディエーターの正確性と信頼性の定量化のための必要性は、重要な研究の優先順位になります。

水溶性のシグナル伝達分子としての役割、サイトカインは宿主免疫反応を支配する因子と高い調整能力のプロセスを仲介します。彼らは解像度に開始からの炎症性プロセスのすべての段階の間に表現し、独自の合成とその細胞の受容体1を含む複雑な相互作用ネットワークを調整します。この通信ネットワークは個々 のコンポーネント間があります相乗的あるいは敵対関係を超えた複雑さと階層化します。確かに、冗長または少なくとも部分的に重なり合う機能2,3を共有する多くのサイトカインが知られています。
同時に複数のサイトカイン analytes を定量化する統合システムバイオロジーは現在複数疾患の基になる免疫反応を調整するユニークな cytokinomes のますます包括的な理解を提供します。4、5 を状態します。これら疾患状態まで炎症から癌、神経変性疾患、および心血管疾患6,7,8,9です。
LEGENDplex ビーズを用いたイムノアッセイを効果的に使用してこのようなサイトカイン ネットワークを尋問することができます。これらの試金はサンドイッチ酵素免疫測定法 (ELISA) と同じ原理に基づいています、エンコードされた蛍光マイクロスフィアを使用し表面に共有結合接続キャプチャ抗体。これらの抗体は ELISA の従来のフォーマットに必要なそれらより小さい表面領域に固定します。これにより、このような試金をはるかに少ないサンプル量と同時に非固有のバインドおよび提供を減らすいくつかの検体の分析を多重実行します。
このプロトコルで説明アッセイは、同時に最大 13 ターゲット量的にこの技術を利用しています。この試金のデータはさまざまな一般的な流れの cytometers を使用して取得することができますとは異なり、他の利用可能なアッセイを必要としない専用の試金固有のインストルメンテーションを使用。検証済み試料パネルの拡大カタログ、いくつか継続的な生物医学研究プロジェクト10、11,12,13これらのアッセイを使用されています。
使いやすさとマウスの T ヘルパー サイトカイン パネルを使用して、量的にこの実験で、アッセイ フォーマットの有用性を実証するには、13 別の複数の下で培養したマウス脾細胞から得られた培養上清からのサイトカイン濃度刺激の条件。組織培養上清、に加えてこのアッセイも実行できます血清または血漿サンプルを使用しています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366816</td>
			<td>For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>740005</td>
			<td>Multiplex Immunoassay (13-plex)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD3&#949; antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100314</td>
			<td>Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD28 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102112</td>
			<td>Clone 37.51, low endotoxin, azide free format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>WP6111560</td>
			<td>For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Manifold</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>MSVMHTS00</td>
			<td>For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Reagent Reservoirs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-130</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene MicroFACS Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-842-90</td>
			<td>For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-388-100</td>
			<td>Four pipette sizes (0.2-2&#181;L, 2-20&#181;L, 20-200&#181;L, 100-1000&#181;L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Channel Pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FA10011G</td>
			<td>capable of dispensing 5 &#956;L to 200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88880023</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75002410</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9885747</td>
			<td>12 x 75 mm round bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-8274</td>
			<td>Escherichia coli O26:B6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson B200 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z305359</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z666505</td>
			<td>1.5 mL polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polypropylene Plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-662</td>
			<td>For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplex cytokine profiling of stimulated mouse splenocytes using a cytometric bead-based immunoassay platform

ビーズを用いたイムノアッセイ サンドイッチ免疫測定と同じ基本的な原理を採用しています。ビーズのサイズと内部アロフィコシアニン (APC) 蛍光強度によって区別することができます、特定の試料に特異抗体に共役をキャプチャします。次に、定義されているキャプチャ ビーズ セットの選択したパネルは、キャプチャー抗体に固有のターゲット analytes を含む生物学的サンプルと培養です。ビオチン標識検出抗体のカクテルが追加されます、キャプチャ ビーズ検体検出抗体サンドイッチの形成に 。
最後に、バインドされた試料の量に比例した蛍光信号強度を提供するビオチン検出抗体に結合するストレプトアビジン-フィコエ リスリン (SA PE) が追加されます。PE は蛍光ビーズ検体特異的領域の信号が、フローサイトメトリーを用いた定量化し、特定検体の濃度は、データ分析ソフトウェアとアッセイで生成される標準の曲線を使用して決定されます。
この実験では、マウス T ヘルパー サイトカイン パネルを使用して、同時に様々 な刺激条件下で培養マウス脾細胞から収集した組織培養上清中に 13 の独立したサイトカイン ターゲットの濃度を定量化します。

このプロトコルは、ビーズを用いたイムノアッセイ プラットフォームを使用して同時に流れの cytometer を用いる生体試料からのサイトカインを量的に方法を示します。この例で使用されている生物学的サンプルいた以前様々 な作動条件の下で培養されていたマウス脾細胞から細胞培養上清アッセイ フォーマットは、血清または血漿サンプルで使用する検証されています。
アッセイから生成されるデータを使用して、多重パネルですべての検体の標準曲線を構築します。データ解析ソフトウェアは、ユニークなビーズのサイズと APC 強度に基づいて各特定の試料を分類し、PE レポーターを使用してそれらを定量化します。図 2 aの対数-対数スケールでプロットすると、アッセイの感度と同様に動的な範囲が示されています。ソフトウェアを使用して、分析データ、すべて標準曲線 (テーブル 1 のハイエンドとローエンドの生体試料も検出限界を提供だけでなくユーザーの検体の濃度を正確に計算する 5 パラメーター曲線近似アルゴリズム).このプロトコルで説明する形式はまた、非常に堅牢な測定精度を提供します。図 2 bおよび2 Cの各試料の測定内変動を描いたデータを掲載されています。2 つの別々 の標準蛋白質濃度 (高低) を各サンプル 16 複製し、1 つの分析で行った。図 2と2 Dは、3 つの独立した試金からターゲット検体の測定間変動を表します。測定内の精密実験と高低標準濃度を行った 3 とそれぞれ独立した実験の複製します。ターゲット蛋白質の計算される濃度の最小変動がはっきりと見えるです。
マウス脾細胞サイトカイン発現プロファイルを尋問でビーズを用いたフローサイトメトリーによるアッセイの有用性を実証するために様々 な作動条件の下で培養。些細のコントロールでは、セルも LP、抗 CD3/抗 CD28 抗体またはホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート イオノマイシンと培養。細胞培養上清は、48 時間後、マウスの T ヘルパー サイトカイン パネルを使用して試金を収集しました。この実験から定量化の結果は図 3で表され、サイトカイン濃度に及ぼす刺激条件を明確に線引き。
上記結果は実験者がありよい実験室技術提供の試金のプロトコルに続く限り、典型的であります。この試金の形式でエラーのソースは、サンプルの分析に使用される流れの cytometer でインキュベーション時間、洗浄、試薬ボリュームの偏差や不適切な PMT 設定からを発生します。図 4 a散布図では、成功した試金からプロットは、明確に定義された 2 の異なるビーズ人口を示しています。これは、図 4 b、どこに洗濯とプロトコルのコンプライアンスの低下が 2 つの集団をぼかしビーズ凝集体に導いたに対比ことができます。さらに、左下腹部の残骸によって証明されるようゲート イベントのみの優先のフォーマットではなく、分析の合計 cytometer イベントが輸出されました。設定適切な cytometer は、このアッセイで信頼性の高いデータを生成するのに不可欠です。図 4適切な pmt 関数の設定は APC 分類チャネル 6 検体のそれぞれの解像度のこと。不適切な光電子増倍管の設定は図 4 APC チャネルが重複分類強度を持つビーズ集団で提示したようなデータになります。試金ビーズの明確に定義された集団なし濃度を計算することが可能になりますので、試金は無効になります。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig2.jpg"> 
図 2: 標準曲線の範囲と測定精度。(A)マウスの T ヘルパー サイトカイン パネルを使用して生成された代表的な標準的なカーブです。標準的な曲線は、各アッセイで実行されなければなりません。(B ・ C)測定内の有効桁数です。ターゲット蛋白質 (高低) の濃度の異なる 2 つのサンプルを各サンプル 16 複製し、1 つの分析で行った。データは、平均 + 標準偏差として表されます。(D ・ E)測定間の精度。ターゲット蛋白質 (高低) の濃度の異なる 2 つのサンプルは、各サンプルに対して 3 の複製を 3 つの独立したアッセイで行った。データは、平均 + 標準偏差として表されます。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56440/56440fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig3.jpg"> 
図 3: 代表結果の定量化します。37 ° C + 5% CO2様々 な条件下で培養したマウス脾細胞 (1 x 10 の6セル): 些細、LPS (100 ng/mL)、αCD3 (1 μ G/ml プレート コーティング) + αCD28 (1 μ g/mL 水溶性)、PMA (20 ng/mL) + イオノマイシン (500 ng/mL)。培養上清は 48 時間後に収集されたし、マウス T ヘルパー サイトカイン パネルを使用して量を示されます。刺激条件に応じて各種サイトカイン発現プロファイルが明確に表示されます。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56440/56440fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig4.jpg"> 
図 4: 失敗した試金と成功の結果します。(A)成功した試金微粒子集団の異なるビーズ人口しているが。(B)失敗したアッセイでお越しの貧しい人口分離、ビーズの集計、および収集されたイベントが多すぎます。(C)正常な試金がゲートし、定量化しやすい分類蛍光チャネルの強度が明確に定義します。(D)失敗した試金が不十分な分離と分類強度定量化を難しく、複数のビーズ集団を重複します。注意付着試金のプロトコルを介してこれらのエラーの多くを回避できます。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56440/56440fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">標準曲線</td>
			<td colspan="2">感度 (pg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>検体</td>
			<td>フィット式</td>
			<td>CV</td>
			<td>R2</td>
			<td>分。</td>
			<td>Max。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-Γ</td>
			<td>5 P.log(4.43, 14.40, 0.54, 9.11, 0.01)</td>
			<td>1.77%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.1</td>
			<td>18105.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-5</td>
			<td>5 P.log(4.36, 12.68, 0.64, 5.73, 0.36)</td>
			<td>1.32%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>14514.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF Α</td>
			<td>5 P.log(4.36, 11.63, 0.79, 5.45, 0.37)</td>
			<td>1.48%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>1.9</td>
			<td>20109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>5 P.log(4.46, 12.62, 0.78, 5.07, 0.34)</td>
			<td>1.34%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>25109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6</td>
			<td>5 P.log(4.58, 11.66, 0.64, 5.77, 0.37)</td>
			</tr></tbody></table>td>1.70%
			<td>0.99</td>
			<td>2.0</td>
			<td>7022.0</td>
		
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>5 P.log(4.27, 12.23, 0.62, 5.72, 0.36)</td>
			<td>1.36%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>13273.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10</td>
			<td>5 P.log(4.67, 11.65, 1.20, 6.28, 0.61)</td>
			<td>1.81%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.2</td>
			<td>5190.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL 9</td>
			<td>5 P.log(4.32, 13.86, 0.86, 5.90, 0.45)</td>
			<td>1.82%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>12602.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL 17A</td>
			<td>5 P.log(4.06, 14.03, 0.47, 6.52, 0.32)</td>
			<td>0.99%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>12285.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL 17F</td>
			<td>5 P.log(4.52, 12.15, 0.61, 5.52, 0.34)</td>
			<td>0.92%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>14841.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>イリノイ 21</td>
			<td>5 P.log(4.90, 8.03, 1.77, 4.74, 1.11)</td>
			<td>0.79%</td>
			<td>1</td>
			<td>9.0</td>
			<td>12943.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL 22</td>
			<td>5 P.log(4.57, 12.56, 0.63, 6.06, 0.39)</td>
			<td>1.16%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>6408.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL 13</td>
			<td>5 P.log(4.40, 11.44, 0.22, 3.19, 1.45)</td>
			<td>1.11%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
			<td>16728.0</td>
		</tr>
	

表 1: 標準的なカーブ フィットとアッセイ感度。データ解析ソフトウェアは、マルチプレックス アッセイに含まれているすべての分析の標準的な曲線の生成に使用されました。この全自動分析アッセイからアルゴリズムを希釈シリーズ規格にふさわしい堅牢な 5 パラメーター曲線を適用し、検出の理論的な限界を使用してアッセイ感度の定義にも使用されました。

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Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

このプロトコルでは、数量的なマルチプレックス ビーズ ベース イムノアッセイ ・ システムと流れの cytometer を使用して刺激マウス脾細胞から収集した組織培養上清中に同時に複数のサイトカイン目標について説明します。

フローサイトメトリーによる免疫プラットフォームを使用して刺激マウス脾細胞のサイトカインがプロファイリングを多重化します。

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal ...

multiplex-cytokine-profiling-stimulated-mouse-splenocytes-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

44.7K ビュー.  BioLegend. このプロトコルでは、数量的なマルチプレックス ビーズ ベース イムノアッセイ ・ システムと流れの cytometer を使用して刺激マウス脾細胞から収集した組織培養上清中に同時に複数のサイトカイン目標について説明します。

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Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

サイトカインキャプチャシステムを用いた臨床応用のためのサイトメガロウイルス特異的T細胞の自動化された細胞濃縮

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

免疫・感染学

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene transcripts from infected tissues. Pathogen RNA constitutes a tiny portion of the total RNA isolated from infected tissue samples. Both microarray and RNAseq technologies have difficulties in generating reliable reads for weakly expressed pathogen genes. Mutant pathogen strains with reduced in vivo proliferation pose an even bigger challenge. Here we describe an in vivo gene expression profiling protocol that is very fast, extremely sensitive and highly reproducible. We developed this protocol during our investigation of the fungal pathogen Candida albicans in a murine model of hematogenously disseminated candidiasis. Using this protocol, we have documented time courses of dynamically regulated C. albicans gene expression during kidney infection, and discovered unexpected features of gene expression responses to antifungal drug treatment in vivo.

We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

デジタルバーコードプラットフォームを使用して感染する微生物の遺伝子発現プロファイリング

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and infections using cost effective, high-throughput approaches would be indispensable. This manuscript describes the development and analysis of a bead-based multiplex immunoassay capable of measuring the presence of antibodies in human saliva to multiple pathogens simultaneously. Saliva is particularly attractive in this application because it is noninvasive, cheaper and easier to collect than serum. Antigens from environmental pathogens were coupled to carboxylated microspheres (beads) and used to measure antibodies in very small volumes of human saliva samples using a bead-based, solution-phase assay. Beads were coupled with antigens from Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 and G II.4) and hepatitis A virus. To ensure that the antigens were sufficiently coupled to the beads, coupling was confirmed using species-specific, animal-derived primary capture antibodies, followed by incubation with biotinylated anti-species secondary detection antibodies and streptavidin-R-phycoerythrin reporter (SAPE). As a control to measure non-specific binding, one bead set was treated identically to the others except it was not coupled to any antigen. The antigen-coupled and control beads were then incubated with prospectively-collected human saliva samples, measured on a high throughput analyzer based on the principles of flow cytometry, and the presence of antibodies to each antigen was measured in Median Fluorescence Intensity units (MFI). This multiplex immunoassay has a number of advantages, including more data with less sample; reduced costs and labor; and the ability to customize the assay to many targets of interest. Results indicate that the salivary multiplex immunoassay may be capable of identifying previous exposures and infections, which can be especially useful in surveillance studies involving large human populations.

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

環境病原体に対するヒトの暴露を測定するために唾液抗体マルチプレックスイムノアッセイの開発

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and protection to the underlying cells. Analysis of tears is an emerging area for the identification of biomarkers for the prediction, diagnosis, and prognosis of various ocular diseases. Tears are easily accessible and their collection is non-invasive. Therefore, advancing technologies are gaining prominence for identification of multiple analytes in tears to study changes in protein or metabolite composition and its association with pathological conditions. Tear cytokines are ideal biomarkers for studying the health of the ocular surface and also help in understanding the mechanisms of different ocular surface disorders like dry eye disease and vernal conjunctivitis. Bead based multiplex assays have the capability of detecting multiple analytes in a small amount of sample with a higher sensitivity. Here we describe a standardized protocol of tear sample collection, extraction and analysis of cytokine profiling using a bead based multiplex assay.

Analysis of tear film cytokines helps in studying various ocular diseases. Bead based multiplex assays are simple and sensitive and enable the testing of multiple targets in samples with small volumes. Here we describe a protocol for tear film cytokine profiling a using bead based multiplex assay.

ビーズ ベースの涙サイトカイン解析マルチプレックス アッセイ

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

リンパ管内皮細胞のフローサイトのマウス肝臓の消化

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

自動行動分析の大規模なc. の elegans集団による視野が広い追跡プラットフォーム

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this challenge, dereplication, which is the process of identifying known compounds, is performed on samples of interest. Methods for dereplication such as analytical separation followed by mass spectrometry are time-consuming and resource-intensive. To improve the dereplication process, we have developed the antibiotic resistance platform (ARP). The ARP is a library of approximately 100 antibiotic resistance genes that have been individually cloned into Escherichia coli. This strain collection has many applications, including a cost-effective and facile method for antibiotic dereplication. The process involves the fermentation of antibiotic-producing microbes on the surface of rectangular Petri dishes containing solid medium, thereby allowing for the secretion and diffusion of secondary metabolites through the medium. After a 6 day fermentation period, the microbial biomass is removed, and a thin agar-overlay is added to the Petri dish to create a smooth surface and enable the growth of the E. coli indicator strains. Our collection of ARP strains is then pinned onto the surface of the antibiotic-containing Petri dish. The plate is next incubated overnight to allow for E. coli growth on the surface of the overlay. Only strains containing resistance to a specific antibiotic (or class) grow on this surface enabling rapid identification of the produced compound. This method has been successfully used for the identification of producers of known antibiotics and as a means to identify those producing novel compounds.

We describe a platform that utilizes a library of isogenic antibiotic resistant Escherichia coli for the dereplication of antibiotics. The identity of an antibiotic produced by bacteria or fungi can be deduced by the growth of E. coli expressing its respective resistance gene. This platform is economically effective and time-efficient.

抗生物質耐性プラットフォームを用いた抗生物質脱複製

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. Innate immune cells, specifically mononuclear phagocytes, express overlapping cell surface markers, which makes identifying these populations a challenge. Multi-parameter flow cytometry allows for the simultaneous, quantitative analysis of multiple cell surface markers in order to differentiate monocytes, macrophages, microglia, and dendritic cells in mouse eyes. This protocol describes the enucleation of whole mouse eyes, ocular dissection, digestion into a single cell suspension, and staining of the single cell suspension for myeloid cell markers. Additionally, we explain the proper methods for determining voltages using single color controls and for delineating positive gates using fluorescence minus one controls. The major limitation of multi-parameter flow cytometry is the absence of tissue architecture. This limitation can be overcome by multi-parameter flow cytometry of individual ocular compartments or complimentary immunofluorescence staining. However, immunofluorescence is limited by its lack of quantitative analysis and reduced number of fluorophores on most microscopes. We describe the use of multi-parametric flow cytometry to provide highly quantitative analysis of mononuclear phagocytes in laser-induced choroidal neovascularization. Additionally, multi-parameter flow cytometry can be used for the identification of macrophage subsets, fate mapping, and cell sorting for transcriptomic or proteomic studies.

This protocol provides a method to digest whole eyes into a single cell suspension for the purpose of multi-parameter flow cytometric analysis in order to identify specific ocular mononuclear phagocytic populations, including monocytes, microglia, macrophages, and dendritic cells.

単核食細胞の多パラメータフローサイトメトリック解析のためのマウス全体の眼の消化

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

フローサイトメトリーによる免疫プラットフォームを使用して刺激マウス脾細胞のサイトカインがプロファイリングを多重化します。

要約

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サイトカインキャプチャシステムを用いた臨床応用のためのサイトメガロウイルス特異的T細胞の自動化された細胞濃縮

デジタルバーコードプラットフォームを使用して感染する微生物の遺伝子発現プロファイリング

虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

環境病原体に対するヒトの暴露を測定するために唾液抗体マルチプレックスイムノアッセイの開発

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

ビーズベースの涙サイトカイン解析マルチプレックスアッセイ

リンパ管内皮細胞のフローサイトのマウス肝臓の消化

自動行動分析の大規模なc. の elegans集団による視野が広い追跡プラットフォーム

抗生物質耐性プラットフォームを用いた抗生物質脱複製

単核食細胞の多パラメータフローサイトメトリック解析のためのマウス全体の眼の消化

フローサイトメトリーによる免疫プラットフォームを使用して刺激マウス脾細胞のサイトカインがプロファイリングを多重化します。

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デジタルバーコードプラットフォームを使用して感染する微生物の遺伝子発現プロファイリング

虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

環境病原体に対するヒトの暴露を測定するために唾液抗体マルチプレックスイムノアッセイの開発

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

ビーズ ベースの涙サイトカイン解析マルチプレックス アッセイ

リンパ管内皮細胞のフローサイトのマウス肝臓の消化

自動行動分析の大規模なc. の elegans集団による視野が広い追跡プラットフォーム

抗生物質耐性プラットフォームを用いた抗生物質脱複製

単核食細胞の多パラメータフローサイトメトリック解析のためのマウス全体の眼の消化

ビーズベースの涙サイトカイン解析マルチプレックスアッセイ