著者は、グレン ・ サンガー ・ ホジソン、ビデオ制作、編集、音声のすべての彼の仕事のため旧ソ連医科大学、メディアの専門家に感謝したいと思います。
この作品は、国立衛生研究所 (R01GM100474 および R01GM072611) によって支えられました。

メソッドここで説明のセクション 2 では、フロリダ州立大学機関動物のケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されているし、ケアと 8th版実験動物の使用のためのガイドに定めるガイドラインに従います.このプロトコルでは、これのすべての動物は、使用まで専用の実験室の動物実験施設で家をしています。生体内で実験を犠牲にする前に実行がありませんでした。動物の数字は、使用量を最小限に抑えるためにガイドとして平均セルとミエリンのコレクションを使用して実験の必要性に基づいていた。
注:このプロトコルを記述する骨髄由来マクロファージ (BMDMs) (セクション 1) 蛍光に分類された脳由来の髄鞘の残骸 (セクション 2)、髄鞘の残骸貪食 (セクション 3) を分析するための一般的な手順の準備の世代と髄鞘の残骸の脂肪蓄積 (セクション 4) の分析のための一般的な手順です。試薬調製、セルを収穫し操作、ミエリン コレクション、ラベル付け、およびアッセイ パフォーマンスは層流気流バイオ セーフティ キャビネットで完了する必要があります。
1. プライマリ骨髄由来マクロファージの生成
<ol>
	<li>完全なマクロファージ培養培地 (CMCM) の準備 注:から骨髄マクロファージ世代大食細胞のコロニー刺激因子 (M-CSF) の使用が必要です。この準備は、M-CSF のソースとして L929 マウス線維芽細胞エアコン メディアを利用しています。<ol>
		<li>50 mL の高グルコース (4500 mg/L L ブドウ糖) ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 5% 新しい生まれた子牛血清 (NCS) とペニシリン/ストレプトマイシンを 7 日間で 145 mm 皿で培養細胞による L929 マウス線維芽細胞エアコン メディアを生成します。</li>
		<li>3500 × g、4 ° C で 30 分間、50 mL コニカル遠沈管および遠心分離機に文化からメディアを収集します。</li>
		<li>0.2 μ m のシリンジ フィルターを通して培養上清を新しい 50 mL の円錐形遠心管にフィルターします。エアコン メディアは、最大 6 ヶ月間-80 ° C で保存できます。</li>
		<li>高グルコース DMEM、5% 巻/巻 NCS を追加、15% 巻/巻 L929 マウス線維芽細胞エアコン DMEM、および 1% ペニシリン/ストレプトマイシン。メディアは、2-3 か月の 4 ° C で保存できます。使用する前に 37 ° C に暖かい。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>主な骨髄細胞とマクロファージ誘導のコレクション 
	注:このプロトコルの 1 つのマウスを使用して、約 2000 万骨髄由来マクロファージ (BMDMs) が生成されます。<ol>
		<li>8-10 週間の標準的な CO2窒息ガイドラインを使用して古いマウスは続いて頚部転位の桁数を安楽死させます。</li>
		<li>70% (巻/巻) エタノール: H2O を使用し、毛皮を飽和動物をサニタイズします。</li>
		<li>腹部に小さな開口部をカットし、基になる組織を明らかにするため皮膚を慎重に引いてください。腹腔穿刺に注意してください。</li>
		<li>両方の後ろ足の股関節から始まると足首で終わるを削除します。場所 5-10 mL 滅菌リン酸を含む 100 mm のペトリ皿に収集した組織緩衝生理食塩水 (PBS) 1% を添加したペニシリン/ストレプトマイシン。 
		注:組織の劣化を制限する氷の上の皿を維持するとき確認いくつかの動物を処理します。</li>
		<li>メスを使用して骨から筋肉や結合組織を削除します。大腿骨と脛骨のみ使用されますセルのコレクションの腓骨を破棄できます。</li>
		<li>メスの各端からの小さなセクションをトリミングすることによって収集された骨の髄腔を公開します。</li>
		<li>25 g の針を使用して、50 mL の円錐形遠心チューブに CMCM と骨髄腔をフラッシュします。骨は、一度十分にフラッシュされている白表示されます。</li>
		<li>コレクションが完了すると、単一細胞懸濁液を生成する 30-90 s のための 18 g 針で吸引を振りま します。 
		注:この時点で、オプションの赤い血球 (RBC) 換散のステップが行われます。最近、細胞内の鉄分がマクロファージ偏波16髄鞘の残骸の影響に影響を及ぼすことが示唆されています。赤血球の包含について散のステップは、Trouplinらを参照してください。17。</li>
		<li>新しい 50 mL の円錐形遠心管に 70 μ m 無菌細胞ストレーナー懸濁液をフィルタ リングします。</li>
		<li>種子は、15 〜 20 mL CMCM を含む 145 mm 細胞培養皿に均等に細胞を収集しました。マウスを犠牲にしたあたりの約 3 つの培養皿を使用します。37 ° c、5% CO2文化を孵化させなさい。</li>
		<li>72 時間は、非付着性のセルを削除する滅菌 PBS で 1 回プレートを洗って後、15 ~ 20 mL を追加新鮮な CMCM。37 ° C、5% CO2でさらに 4 日間文化を孵化させなさい。総文化の日の 7 日後、最初に分離した造血骨髄細胞は成熟した BMDMs (図 1) になります。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 脳由来の蛍光に分類された髄鞘の残骸の世代
注:すべての試薬は、1 ヶ月の 4 ° C で保存できます。
<ol>
	<li>髄鞘の残骸のコレクション試薬の調製
	<ol>
		<li>Tris· を準備します。Cl 緩衝液。<ol>
			<li>800 mL 蒸留脱イオン H2O (ddiH2O) 追加 1 M Tris· 20 mLCl、ナ2EDTA (最終濃度が 2 mM) 100 mM の pH 7.45 (最終濃度が 20 の mM) および 20 mL。</li>
			<li>7.45 に pH を調整します。DdiH20.2 μ m ろ過ユニットを介して o. フィルター ソリューションと 1000 の mL にボリュームを調整します。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>1 M ショ糖液を準備します。<ol>
			<li>Tris· 100 mlCl バッファー溶液、ショ糖の 68.46 g を追加。Tris· と 200 mL にボリュームを調整します。Cl 緩衝液。0.2 μ m のろ過装置を通してソリューションをフィルター処理します。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Tris· で 1 M 溶液を希釈することによって 0.32 M ショ糖溶液 200 mL を準備します。Cl バッファー ソリューション 0.83:0.16 (巻/巻)。</li>
		<li>Tris· で 1 M 溶液を希釈することによって 0.83 M ショ糖溶液 150 mL を準備します。Cl バッファー ソリューション 0.83:0.16 (巻/巻)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脳由来の原油髄鞘の残骸のコレクション 
	注:ここで説明するコレクション メソッドは、原油髄鞘の残骸の隔離のためです。<ol>
		<li>10-12 マウス頚部転位続いて CO2窒息の標準のガイドラインを使用して年齢の 8-10 週を安楽死させます。</li>
		<li>脳を解剖し、0.32 M ショ糖溶液の 10 mL を含む 100 mm ディッシュに配置します。</li></ol></li></ol>氷の上の皿を保ちます。
		<li>約 5 mm3の大きさの部分に脳をカット滅菌手術用はさみを使ってします。</li>
		<li>50 mL の円錐形遠心管に組織を転送し、約 0.32 M ショ糖液 30 mL を追加します。</li>
		<li>スムーズな解決が達成されるまで滅菌手持ち回転式ホモジナイザーをホモジナイズしてください。</li>
		<li>0.32 M ショ糖液 90 mL の最終巻に均質化された脳を希釈します。</li>
		<li>6 38.5 mL 薄肉ポリプロピレン遠心チューブ、0.83 M ショ糖溶液の 20 mL を追加します。</li>
		<li>優しくホモ脳ソリューションを 2 つの層をミックスしないように世話 0.83 M ショ糖液の最上部に追加します。</li>
		<li>0.32 M ショ糖液各管のバランスをとる。</li>
		<li>100,000 × g で遠心する適切なを使用して 4 ° C の 45 分の事前超遠心機のローターを冷却しました。ロータ加速と減速を髄鞘の残骸の損失を低減する最小値に設定します。</li>
		<li>ショ糖密度の 2 つのインタ フェースから髄鞘の残骸を収集します。 
		注: 破片は管の中心に向かって白いバンドとして表示されます。</li>
		<li>50 mL の円錐形遠心チューブに原油ミエリンの破片を組み合わせるし、約 35 ml Tris· を使用して音量を調整します。Cl 緩衝液。</li>
		<li>30-60 秒の滅菌手持ち回転式ホモジナイザーを用いた原油の髄鞘の残骸を均質化します。</li>
		<li>6 きれいな遠心チューブと Tris· の適切な量とバランスの懸濁液を均等に分割します。Cl 緩衝液。</li>
		<li>100,000 × g で遠心する適切なを使用して 4 ° C の 45 分の事前超遠心機のローターを冷却しました。ローターの加速と減速を最大値に設定します。</li>
		<li>固体白いペレットが表示されます、上澄みを廃棄、再 Tris· の 10-15 mL にペレットを中断Cl 緩衝液。</li>
		<li>2 きれいな遠心チューブと Tris· の適切な量とバランスの懸濁液を均等に分割します。Cl 緩衝液。</li>
		<li>遠心分離機再び 4 ° C、適切なを使用しての 45 分の 100,000 × g で事前冷却遠心ローター。ローターの加速と減速を最大値に設定します。</li>
		<li>上澄みを廃棄し、5-6 mL の滅菌 PBS でペレットを再懸濁します前体重 1.5 mL マイクロ遠心チューブの適切な数の間の懸濁液を分割します。</li>
		<li>22,000 x g で 4 ° C で 10 分間遠心</li>
		<li>上澄みを廃棄し、髄鞘の残骸のペレットの重量を決定します。</li>
		<li>100 mg/mL の最終的な集中に PBS でペレットを再中断します。 
		注: 10 から 12 の脳は 100 mg/mL の髄鞘の残骸の 10-15 mL を生成するのに十分です。髄鞘の残骸は、6 ヶ月間-80 ° c ストアをすることができます。</li>
	
	
	<li>髄鞘の残骸の蛍光標識
	<ol>
		<li>使用直前に 50 μ M carboxyfluorescein 染色エステル (CFSE) ソリューションを準備します。<ol>
			<li>CFSE 100% ジメチルスルホキシド (DMSO) を 50 μ M の最終作業濃度と準備の 5 mM の原液を希釈滅菌 PBS を使用すると。</li>
			<li>0.2 μ m のシリンジ フィルターを通してソリューションをフィルターします。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>100 mg/mL の髄鞘の残骸の必要な量を解凍し、再滅菌の 29 g 針を停止できます。 
		注: 髄鞘の残骸を凍結に使用する前に再懸濁が必要な解決から落ちる原因となります。</li>
		<li>あらかじめ重量を量られた 1.5 mL マイクロ遠心チューブに髄鞘の残骸を転送します。</li>
		<li>14,800 x g で 4 ° C で 10 分間遠心上清を捨てます。</li>
		<li>ペレット 100 μ L ミエリン破片ごと CFSE ソリューションの 200 μ L に髄鞘の残骸を再懸濁します。</li>
		<li>光から保護部屋の温度 (RT) で 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>14,800 x g で 4 ° C で 10 分間遠心上清を捨てます。</li>
		<li>洗浄バッファーの 600-800 μ L でペレットを再懸濁します (0.2 μ m フィルター滅菌 PBS で 100 mM グリシン)。</li>
		<li>14,800 x g で 4 ° C で 10 分間遠心上清を捨てます。</li>
		<li>手順 2.3.8-2.3.9 倍を繰り返します。</li>
		<li>最終的な洗浄後髄鞘の残骸のペレットの重量を決定して再滅菌 PBS と 100 mg/mL に中断します。 注: ラベル付けされた髄鞘の残骸は最大 6 ヶ月間-80 ° c ストアをすることができます。</li>
	</ol>
	</li>

3. 髄鞘の残骸貪食アッセイ
注:以下は、蛍光に分類された髄鞘の残骸の貪食能を観察する基本的な方法です。他のトリートメントや実験条件の付加は調査官によって最適化する必要があります。
<ol>
	<li>治療プレートの準備
	<ol>
		<li>各 145 mm プレート 10 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 5-6 mL を使用して 15 mL コニカル遠心管にダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (dPBS) (pH 7.4) の成熟した BMDMs を収集します。 
		注:18細胞のアクティブ化の状態を変えるかもしれないので、トリプシンを使用しないでください。</li>
		<li>集められたセルの各チューブに予め温めておいた CMCM の等しい量を追加します。</li>
		<li>180 x g で 20 ° C で 8 分間遠心上清を捨てます。</li>
		<li>再細胞 CMCM とカウントを中断します。</li>
		<li>24 ウェル細胞培養プレートのウェルに CMCM の 1 mL で 1 x 10 の5セルを追加します。</li>
		<li>37 ° c、5% CO2 24 時間孵化させなさい。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>髄鞘の残骸処理と解析
	<ol>
		<li>100 mg/mL CFSE の 10 μ L (最終濃度が 1 mg/mL) 各ウェルに髄鞘の残骸のラベルを追加します。</li>
		<li>37 ° C、5% CO21 3 時間孵化させなさい。</li>
		<li>包まれている非髄鞘の残骸を削除する滅菌 PBS で 3 回プレートを洗います。</li>
		<li>4% のパラホルムアルデヒドの 400 μ L を各ウェルに追加します。室温 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>滅菌 PBS で 2 回プレートを洗います。</li>
		<li>ヘキスト 33258 ソリューションの 400 μ L を各ウェルに追加します。光から保護された RT で 5 分間インキュベートします。</li>
		<li>滅菌 PBS で 2 回プレートを洗います。</li>
		<li>退色を抑える各ウェルに Tris バッファー フッ素ゲルの 200 μ L を追加します。</li>
		<li>倒立のエピ蛍光ことができる顕微鏡を用いたイメージ セルです。 
		注:CFSE の励起・発光波長が 494 nm と 521 nm、それぞれ。</li>
		<li>相対的な髄鞘の残骸取り込みを決定する核の数によって CFSE 陽性細胞の数で割ります。</li>
		<li>画像、前に光から保護 4 ° C で 7 日前までのプレートを維持します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. オイル赤 O 染色による細胞内脂質の定量化
注:髄由来の破片の細胞内の脂質を観察する基本的な方法は以下です。CFSE 髄鞘の残骸のラベルの使用はスペクトルの重なりによる染色オロの蛍光定量化のため推奨されません。他のトリートメントや実験条件の付加は調査官によって最適化する必要があります。
<ol>
	<li>汚損の解決の準備
	<ol>
		<li>0.5% オイル赤い O (オロ) の染色液を準備します。<ol>
			<li>ゆっくりとオロ (攪拌しながら 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) 0.5 g に 100 mL 100% プロピレング リコール (1, 2-プロパンジ オール) を追加します。</li>
			<li>95 ° c 15 分またはすべての大きな粒子が溶解するまでソリューションを加熱します。 
			注: 100 ° C 以上に加熱しないでください</li>
			<li>新しいコンテナーにまだ暖かい間、フィルター紙を通じてソリューションをフィルターします。</li>
			<li>室温は、1 年間し、RT。 ソリューションで一晩冷却ソリューションを格納できる許可します。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>85% プロピレング リコール溶液を準備します。<ol>
			<li>DdiH2o ・攪拌混合されるまでの 15 mL に 100% プロピレング リコールの 85 mL を追加します。室温は、1 年間にソリューションを保存できます。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>治療プレートの準備
	<ol>
		<li>次のセクション 3 で説明する方法 24 ウェル プレートを準備します。</li>
		<li>37 ° c、5% CO2 24 時間孵化させなさい。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>髄鞘の残骸の治療
	<ol>
		<li>(最終濃度が 1 mg/mL) 各ウェルに 100 mg/mL の髄鞘の残骸の 10 μ L を追加します。</li>
		<li>37 ° C、5% CO21-3 時間孵化させなさい。</li>
		<li>非消化髄鞘の残骸を削除する滅菌 PBS で 3 回プレートを洗います。 この時点で、プレートは、即時固定を受けることができるかまたは新鮮な CMCM を追加でき、メモ: 追加の時間ポイントのインキュベーションに返されるセル。</li>
		<li>4% のパラホルムアルデヒドの 400 μ L を各ウェルに追加します。室温 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>2 回で滅菌 PBS、染色からプレートを洗います。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>オロの染色と分析
	<ol>
		<li>DdiH2o. で 3 回固定プレートを洗う</li>
		<li>各ウェルに 100% プロピレング リコールの 400 μ L を追加し、室温 5 分間インキュベート 
		注: これは ddiH2o. のキャリー オーバーを削減</li>
		<li>プロピレング リコールを吸引し、オロ ソリューションの 400 μ L を各ウェルに追加します。</li>
		<li>60 ° C で 8 分間インキュベートします。</li>
		<li>オロ ソリューションを吸い出しなさい。各ウェルに 85% プロピレング リコールの 400 μ L を追加し、室温 5 minumintes インキュベート</li>
		<li>DdiH2o. で 3 回洗浄プレート</li>
		<li>ヘキスト 33258 ソリューションの 400 μ L を各ウェルに追加します。光から保護、常温 5 分間インキュベートします。</li>
		<li>滅菌 PBS で 2 回プレートを洗います。</li>
		<li>各ウェルに Tris バッファー フッ素ゲルの 200 μ L を追加します。</li>
		<li>倒立のエピ蛍光ことができる顕微鏡を用いたイメージ セルです。オロは、標準テキサス赤や下流のフィルター セットを使ってイメージ化されることができます。</li>
		<li>各イメージ フィールドにオロ肯定的な領域を決定する核の数で割って算出して相対的な脂質保持を定量化します。</li>
		<li>4 ° C で 7 日間のプレートは、光から保護を維持します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li><li>Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-presenting+function+of+the+macrophage.">Antigen-presenting function of the macrophage.</a> Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).</li><li>Cavaillon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+and+macrophages.">Cytokines and macrophages.</a> Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).</li><li>Ren, Y., Savill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+the+importance+of+being+eaten.">Apoptosis: the importance of being eaten.</a> Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+spinal+cord+injury:+phenotypic+and+functional+change+from+exposure+to+myelin+debris.">Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris.</a> Glia. 63 (4), 635-651 (2015).</li><li>Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+myelin+lipids+during+degeneration+and+regeneration+of+peripheral+nerve:+an+autoradiographic+study.">Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study.</a> J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).</li><li>Greenhalgh, A. D., David, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+Phagocytic+Response+of+Microglia+and+Peripheral+Macrophages+after+Spinal+Cord+Injury+and+Its+Effects+on+Cell+Death.">Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death.</a> J Neurosci. 34 (18), 6316 (2014).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+activates+FAK/Akt/NF-kappaB+pathways+and+provokes+CR3-dependent+inflammatory+response+in+murine+system.">Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system.</a> PLoS One. 5 (2), e9380 (2010).</li><li>Gensel, J. C., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+its+role+in+repair+and+pathology+after+spinal+cord+injury.">Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury.</a> Brain Res. , 1-11 (2015).</li><li>Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+consists+of+a+continuum+of+particles+of+different+density+with+varying+lipid+composition:+major+differences+are+found+between+normal+mice+and+quaking+mutants.">Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants.</a> Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).</li><li>Larocca, J. N., Norton, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Norton, W. T., Poduslo, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+in+rat+brain:+method+of+myelin+isolation.">Myelination in rat brain: method of myelin isolation.</a> J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).</li><li>Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester+fluorescent+dye+for+cell+labeling.">Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).</li><li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+and+proliferation+studies.">Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.</a> Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).</li><li>Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+image+analysis+approach+for+lipid+droplet+size+quantitation+of+Oil+Red+O-stained+cultured+cells.">Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells.</a> Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).</li><li>Kroner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF+and+increased+intracellular+iron+alter+macrophage+polarization+to+a+detrimental+M1+phenotype+in+the+injured+spinal+cord.">TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord.</a> Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).</li><li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow-derived+Macrophage+Production.">Marrow-derived Macrophage Production.</a> J Vis Exp. (81), e50966 (2013).</li><li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function.">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).</li><li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescuing+macrophage+normal+function+in+spinal+cord+injury+with+embryonic+stem+cell+conditioned+media.">Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media.</a> Mol Brain. 9 (1), 48 (2016).</li><li>Bosco, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+synthetic+matrix+metalloproteinase+inhibitor+reduces+human+mesenchymal+stem+cell+adipogenesis.">A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis.</a> PLOS ONE. 12 (2), e0172925 (2017).</li><li>Ram&#237;rez-Zacar&#237;as, J. L., Castro-Mu&#241;ozledo, F., Kuri-Harcuch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+adipose+conversion+and+triglycerides+by+staining+intracytoplasmic+lipids+with+oil+red+O.">Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O.</a> Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).</li><li>Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+oil+red+staining+permits+combination+with+immunofluorescence+and+automated+quantification+of+lipids.">Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids.</a> Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).</li><li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-Induced+Macrophage+Inflammatory+Response+Is+Regulated+by+SHIP.">Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP.</a> J Immunol. 173 (1), (2004).</li><li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, (2008).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li></ol>

著者の開示があります。

ここで説明する手順は、新鮮単離粗中枢神経系ミエリン破片とプライマリ骨髄由来マクロファージを利用します。動物の支出を減らすためには、両方の脳をお勧めします、犠牲の時に各マウスの骨髄細胞を収穫します。一緒に働く 2 つの研究者は、同時に両方の材料を準備できます。また、脳は髄鞘の残骸の分離前に抗生物質を添加した PBS で-80 ° C で保存できます。脳の私たちの経験は、髄鞘の残骸ポテンシャルのないかなりの損失とは、1 ヶ月のこれらの条件で維持できるとしています。
CFSE は、その使いやすさと蛍光強度のための髄鞘の残骸のラベルに使用されます。染料のまま細胞エステラーゼ分子14酢酸グループを切断する焼入れ。解放された染色エステル グループ、細胞蛋白質14キャラクタリゼーションの結果一次アミドと反応できます。CFSE は興奮標準緑蛍光チャネルを使用して、異なるスペクトル特性を持つ市販いくつかの誘導体があります。したがって、複数の蛍光色素を用いた似たような貪食能アッセイを設計することが可能です。また、染料は容易に細胞膜を通過するためそれとしても使えますラベル アポトーシス細胞を同様の方法で髄鞘の残骸の19に注意する必要があります。さらに、本手法が標準画像解析、最適化、ユーザーに依存する一方定量化実行できますフローサイトメトリーまたはイメージング システム スループットの高い板を使用します。
オイル赤 O (溶剤赤 27 またはスーダン赤 5 b とも呼ばれます) は、中性脂質は組織標本の染色に広く使用されている脂溶性の色素です。その深い赤色の色素沈着は、明視野と蛍光顕微鏡5,20の両方を介して細胞内脂質の可視化が可能です。蛍光顕微鏡を用いたオロ脂質液滴をステンド グラスの単一チャネル イメージングと堅牢な定量化のためことができます。染色法は簡単で再現性が高いが、試料中に注意が必要があります。染色の大幅な削減につながる細胞内の脂質を溶解することができます、アルコールや酸ベースの定着剤を使用しないことが重要です。さらに、任意の定量的画像解析と標準化されたイメージ キャプチャ設定と十分な公平なサンプリングの重要性を軽視することはできません。任意のサンプルの自己蛍光を考慮してコントロールを染色の使用勧めします。このような染色のコントロールは同じように扱う必要がありますが、自動蛍光バック グラウンドのレベルを測定するオロと左無染色します。そうであっても、私たちの画像解析法他脂質定量技術より以下の最適化が必要オロ抽出法21、標準曲線の準備を必要とする実験的変動を受けやすいが必要とサンプルの破壊。イメージ ベース解析の使用は、いくつかのそれは非破壊でするオロ抽出方法を伝統的に利点し、染色21,22と互換性のあります。
最後に、記載されている手順は、比較的まっすぐ進む、それは適切な無菌テクニックが使用する、マクロファージが病原体関連分子パターン (PAMPS) エンドトキシンなどを認識する複数の受容器を表現するので重要ですリポ多糖 (LPS)23。細菌との相互作用の汚染はマクロファージ活性化の結果し、その関数24,25劇的な変化をすることができます。に関して収集された髄鞘の残骸、汚染のためにテストしてください。カブトガニ含まライセート (ラル) アッセイなどのエンドトキシン検出法は感度が高いとこのアプリケーション5,19以前使用されています。
マクロファージ健康と病気の両方で重要な役割を果たしますが中枢神経損傷のコンテキストにおける BMDMs の役割は現在の調査の重要なトピック。ここで説明する方法を使用して、研究者は BMDMs によって髄鞘の残骸の貪食の機構を理解する開始できます。

骨髄由来マクロファージ (BMDMs) は、自然免疫と適応免疫システム間の重要なリンクです。抗原提示細胞 (APCs)、彼らは両方の抗原提示によるリンパ球と通信できるし、サイトカインのリリース1,2,3。しかし、プロの食、主な機能は病原体、高齢者の細胞および細胞残骸1,4をクリアします。脊髄損傷 (SCI)、次は、中枢神経系の軸索の髄鞘化5担当細胞型死ぬオリゴデンドロ サイトから髄鞘の残骸の相当な量が生成されますように。私たちと他の人は髄鞘の残骸のクリアランスが主に浸潤 BMDMs5,6、7の責任であることを示しています。しかし、脊髄損傷で炎症状態5,8,9に向けてこれらの通常抗炎症のセルをシフトさせるサイト髄鞘の残骸の貪食を示唆されています。脊髄損傷における神経炎症の主要メディエーターとして BMDMs、重要な臨床目標です。
脊髄損傷の BMDMs の影響を調査するため、直接 BMDMs と髄鞘の残骸の対応を研究する生体外モデルを開発しました。生物学的関連性を高めるためには、プライマリ マウス BMDMs と新鮮単離髄鞘の残骸の両方はこれらの調査で使用されます。プライマリ マウス BMDMs の分離文化紹介方法についても詳しく説明し、マウス中枢神経系を分離するために使用変更されたショ糖勾配法は髄鞘の残骸10、11,12派生します。髄鞘の残骸は、蛍光染料、carboxyfluorescein サクシニミジルエステル (CFSE)、BMDMs。 CFSE によってその内面は非細胞傷害性だからこのアプリケーションに適してトラックとその狭い蛍光スペクトル許可で容易にラベル付けできます。その他の蛍光多重13,14をプローブします。次の貪食、髄鞘の残骸の脂質は、リソソームを経由、細胞内脂質液滴5に中性脂質としてパッケージします。この細胞内の脂質の蓄積を定量化するには、オイル赤い O (オロ) 染色法の定量的画像解析の最適化を提案する.この単純な染色法は、堅牢な再現性のある結果と定量化15を生成します。これらのメソッドは、限られた特殊な設備とミエリンの破片貧食能および脂質保持の研究を促進します。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td>High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>100X Solution</td></tr><tr><td>New Born Calf Serum (NCS)</td><td>Rocky Mountain Biologics</td><td>NBS-BBT-5XM</td><td>United States Origin</td></tr><tr><td>NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td>L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation</td></tr><tr><td>24-well Cell Culture Plates</td><td>VWR</td><td>10062-896&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Dish</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639960</td><td>Polystyrine, 145/20mm</td></tr><tr><td>CFSE Cell Proliferation Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>C34570</td><td>DMSO for Reconsitution Provided</td></tr><tr><td>Fluoro-gel with Tris Buffer&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17985-11</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td>Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm</td></tr><tr><td>SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td>SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium</td></tr><tr><td>Hand Held Rotary Homogenizer</td><td>Fisher Science</td><td>08-451-71</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro phagocytosis of myelin debris by bone marrow-derived macrophages

骨髄由来マクロファージ (BMDMs) は、さまざまな粒子をクリアできるプロの食として重要な生理的役割を果たす成熟した白血球です。通常、中枢神経系 (CNS)、BMDMs が制限されているが、外傷後に容易に侵入することができます。一度負傷した中枢神経組織内 BMDMs、外傷由来の細胞の残骸を含む脂質豊富な髄鞘の残骸の大量のクリアランスに対して責任がある一次電池タイプです。中枢神経系内 BMDM 浸潤と髄鞘の残骸貪食能の神経病理学的影響が複雑でも理解していません。ここで、説明プロトコルは、BMDMs の直接の in vitro研究中枢神経損傷のコンテキストで許可します。BMDM 髄鞘の残骸の貪食能を評価するためにマウスの BMDM 分離と文化、髄鞘の残骸の準備とアッセイを取り上げます。これらの技術は重要な特殊な機器や材料を必要とせず堅牢な定量化可能な結果を生むまだ研究者のニーズに合わせて簡単にカスタマイズすることができます。

CFSE は髄鞘の残骸のラベルと BMDMs の治療は、明確な内部 (図 2) を得られるはず。3 時間作用時間は下流の検出が確実に十分な追加された髄鞘の残骸の貪食に BMDMs のための十分なが、相互作用の 1 時間ほどの細胞内蓄積を観察できます。ただし、いくつかの髄鞘の残骸まだあるかもしれない細胞表面に洗浄後。これは不十分な洗浄またはない貪食の初期の段階で完全に内面化粒子が原因かもしれません。
BMDMs することができます急速に髄鞘の残骸を内面化、ライソゾーム処理オロ染色脂質液滴を形成する前に必要です。BMDMs は示すために、髄鞘の残骸で 90 分間インキュベートし、洗浄し、固定および汚損 (図 3) 前に時間の追加量の培養されました。図 4は、および中性脂質外観と治療開始の遅れがあるを示します。また、文化の中には脂質の保持が不安定をする必要があります。BMDMs は、液滴形成後すぐに蓄積された脂質を代謝する開始されます。など、もはや洗濯離れて非包まれて髄鞘の残骸と固定の間 24 時間以上待機をお勧めします。
オロすすけるエリアの定量化は、BMDMs (図 5) のミエリン脂質代謝の割合を示しています。90 分間相互作用期間に続いて細胞が新鮮な CMCM のインキュベーションに戻されました。新鮮な培地で初期の追跡期間中に、BMDMs は中性オロ染色脂質に貪食髄鞘の残骸脂質を代謝します。オロ肯定的な領域での着実な増加は次の相互作用時間で一般的です。24 時間後ただし、BMDMs effluxed を持っている、または代謝細胞内脂質の重要な部分。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56322/56322fig1.jpg"> 
図 1: 代表 BMDM 文化。いくつかの付着性のセルは最初観察します。3 日目、任意の非付着性のセルが削除されます。7 日で成熟した骨髄由来マクロファージが観察されます。スケール = 50 μ m.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56322/56322fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56322/56322fig2.jpg"> 
図 2: BMDM 髄鞘の残骸の貪食の代表画像アッセイします。セルが 1 mg/ml の髄鞘の残骸の洗濯および 4% で固定の前に 1 時間ラベル CFSE 扱われた PFA。内面化された髄鞘の残骸は、エピ蛍光ことができる顕微鏡の標準 GFP フィルタ セットを使用して視覚化できます。スケール = 50 μ m.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56322/56322fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56322/56322fig3.jpg"> 
図 3: オイル赤い O (オロ) 実験的なデザインの図。BMDM は、続いて洗濯と固定する前に新鮮な培地で培養、90 分間、1 mg/mL の髄鞘の残骸 (1: 100 希釈) と扱われます。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56322/56322fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56322/56322fig4.jpg"> 
図 4: オロ染色 BMDM 次の髄鞘の残骸の貪食します。指定した時間点、BMDMs で PFA オロとヘキスト 33258 染色 4% 以下固定。各時点の代表的な画像が表示されます。スケール = 100 μ m.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56322/56322fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56322/56322fig5.jpg"> 
図 5: オロ染色の定量的画像解析します。染色オロの定量化, 3 井戸は 5 枚もの 20 X でイメージしました。すべてのイメージの取得設定は同一であった。誤差 = SEM. (n = 3)。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56322/56322fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages at JoVE.com

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

蛍光に分類された髄鞘の残骸と細胞内脂質液滴染色を使用してプライマリ マウス骨髄由来マクロファージの貪食能を評価する手法を提案します。

体外骨髄由来マクロファージによって髄鞘の残骸の貪食

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

in-vitro-phagocytosis-myelin-debris-bone-marrow-derived

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

12.6K ビュー.  Florida State University. 蛍光に分類された髄鞘の残骸と細胞内脂質液滴染色を使用してプライマリ マウス骨髄由来マクロファージの貪食能を評価する手法を提案します。

ビデオ: In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

マウスのマクロファージの枯渇と再構成

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

免疫・感染学

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

骨髄由来マクロファージの生産

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

ライブマクロファージにおけるファゴリソソーム生合成の研究

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and subsequently digests this material, commonly through lysosomal degradation. Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) whose phagocytic function has been described in a broad range of conditions from neurodegenerative disease (e.g., beta-amyloid clearance in Alzheimer&#8217;s disease) to development of the healthy brain (e.g., synaptic pruning)1-6. The following protocol is an engulfment assay developed to visualize and quantify microglia-mediated engulfment of presynaptic inputs in the developing mouse retinogeniculate system7. While this assay was used to assess microglia function in this particular context, a similar approach may be used to assess other phagocytes throughout the brain (e.g., astrocytes) and the rest of the body (e.g., peripheral macrophages) as well as other contexts in which synaptic remodeling occurs (e.g. ,brain injury/disease).

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) with a high capacity to phagocytose or engulf material in their extracellular environment. Here, a broadly applicable, reliable, and highly quantitative assay for visualizing and measuring microglia-mediated engulfment of synaptic components is described.

貪食アッセイ：CNS食細胞と神経細胞間の相互作用を評価するためのプロトコル

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

神経科学

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

リアルタイム細胞外フラックス分析を用いた偏光M1、M2の骨髄由来マクロファージの代謝特性評価

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics have been at the forefront. They interact with and regulate immune cell activity. The focus of this study is the MSC regulation of macrophage phagocytic activity. Macrophage (M&#934;) phagocytosis is an important part of the innate immune system response to infection, and the mechanisms through which MSC modulate this response are under active investigation. Presented here is a method to study M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan particles conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule while in co-culture with MSC. As phagocytic activity increases and the labeled zymosan particles are enclosed within the acidic environment of the phagolysosome, the fluorescence intensity of the pH-sensitive molecule increases. With the appropriate excitation and emission wavelengths, phagocytic activity is measured using a fluorescent spectrophotometer and kinetic data is presented as changes in relative fluorescent units over a 70 min period. To support this quantitative data, the change in the phagocytic activity is visualized using dynamic imaging. Results using this method demonstrate that when in co-culture, MSC enhance M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan of both naive and IFN-&#947; treated M&#934;. These data add to the current knowledge of MSC regulation of the innate immune system. This method can be applied in future investigations to fully delineate the underlying cellular and molecular mechanisms.

Presented here is a protocol to quantify and produce dynamic images of mesenchymal stem cell (MSC) mediated regulation of macrophage (M&#934;) phagocytosis of non-opsonized yeast (zymosan) particles that are conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule.

間葉系幹細胞のマクロファージ食前細胞の調節;定量とイメージング

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in neurological diseases including neurodegeneration and stroke. CNS-MPs are involved in phagocytic clearance of pathological proteins, debris and neuronal synapses, each with distinct underlying molecular pathways. Characterizing these phagocytic properties can provide a functional readout that compliments molecular profiling of microglia using traditional flow cytometry, transcriptomics and proteomics approaches. Phagocytic profiling of microglia has relied on microscopic visualization and in vitro cultures of mouse neonatal microglia. The former approach suffers from limited sampling while the latter approach is inherently poorly reflective of the true in vivo state of adult CNS-MPs. This paper describes optimized protocols to phenotype phagocytic properties of acutely-isolated mouse CNS-MPs by flow cytometry. CNS-MPs are acutely isolated from adult mouse brain using mechanical dissociation followed by density gradient centrifugation, incubated with fluorescent microspheres or fluorescent A&#946; fibrils, washed, and then labeled with panels of antibodies against surface markers (CD11b, CD45). Using this approach, it is possible to compare phagocytic properties of brain-resident microglia with CNS-infiltrating macrophages and then assess the effect of aging and disease pathology on these phagocytic phenotypes. This rapid method also holds potential to functionally phenotype acutely-isolated human CNS-MPs from post-mortem or surgical brain specimens. Additionally, specific mechanisms of phagocytosis by CNS-MP subsets can be investigated by inhibiting select phagocytic pathways.

Assessment of phagocytic properties of microglia and brain macrophages can provide a valuable functional dimension to molecular profiling studies. We describe a validated protocol that uses flow cytometry to rapidly and reliably quantify phagocytosis of fluorescent microspheres and amyloid beta fibrils by acutely-isolated microglia and brain macrophages from mouse models.

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

マウス由来骨髄由来マクロファージの単離と培養

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

iPSCマクロファージによる死んだ神経芽細胞の食細胞に対するインビトロ定量イメージングアッセイ

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

新生児骨髄由来マクロファージの食作用アッセイ評価 

Neonatal Mouse Bone Marrow Isolation and Preparation of Bone Marrow-Derived Macrophages

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging and time-consuming, yet for some models, it is translationally relevant and necessary. This protocol describes an efficient and straightforward method for preparing bone marrow cells from 7-9-day-old pups. These cells can then be further isolated or differentiated into specific cell types of interest. Macrophages are crucial immune cells that play a major role in inflammation and infection. During development, neonatal macrophages contribute significantly to tissue remodeling. Moreover, the phenotype and functions of neonatal macrophages differ from those of their adult counterparts. This protocol also outlines the differentiation of neonatal macrophages from the isolated bone marrow cells in the presence of L929-conditioned medium. Surface markers for differentiated neonatal macrophages were assessed using flow cytometric analysis. To demonstrate functionality, the phagocytic efficiency was also tested using pH-sensitive dye-conjugated Escherichia coli.

著者スポットライト:新生児マウスから骨髄由来マクロファージを分離するための再現性のある方法の開発により、早期の免疫応答を促進

This protocol describes a non-enzymatic and straightforward method for isolating 7-9-day-old neonatal mouse bone marrow cells and generating differentiated macrophages using a supernatant of L929 cells as a source of granulocyte colony-stimulating factor (M-CSF). The bone marrow-derived macrophages were further analyzed for surface antigens F4/80, CD206, CD11b, and functional competency.

新生児マウス骨髄単離と骨髄由来マクロファージの調製

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging ...