この研究は国立科学財団の中国 (21474057 および 21604076) によって支えられました。

警告: 使用前に関連するすべての材料安全データ用紙 (MSDS) を参照してください。ヒューム フードと保護具 (保護メガネ、保護手袋、白衣、等) の使用を含む化学実験を行う際は、適切な安全対策を使用してください。プロトコル標準セル処理テクニック (殺菌、細胞回復、細胞継、細胞凍結、細胞染色、等) が必要です。
 1 準備のヒドロゲル <ol><li><ol><li><ol><li>PEG の事前乾燥を ベンズアルデヒドの合成終了・ ディ ・修飾ポリエチレング リコール (PEG DF) のポリマー重量 4.00 g ペグ (4,000 MW、1.00 モル)。丸底フラスコ (250 mL) にそれを転送し、トルエン (100 mL) を追加します 。
			注: 異なる分子量とその他のペグ ハイドロゲル形成のために働くことができますが、異なる剛性につながる</li>。
			<li>熱熱銃 (またはホット プレート 40 ° C 付近) によって軽度すべてのポリマーを溶解するためにソリューションです。すべてのポリマーは、溶解後は、蒸発器を使用して、すべての溶剤を削除します。乾燥のペグを高分子にするこのディゾルブとドライ プロセスを 2 回繰り返します 。
			注意: これは発煙のフード細心の注意を実行する必要があります。トルエンは可燃性</li>。
		</ol></li> <li>PEG のベンズアルデヒド終了反応 <ol><li>フラスコに電磁攪拌機及びテトラヒドロ フラン (THF、100 mL) を追加し、攪拌を使用してペグを解散。すべての固体を完全に解消するソリューション (0.90 g, 6.0 mmol) 4-carboxybenzaldehyde、4-ジメチルアミノピリジン (0.07 g、0.6 モル) を順に追加します</li>。
			<li>追加 N, N &#39;-ヒドロキシサクシンイミド (DCC, 1.25 g, 6.0 mmol) ソリューションには満ちているフラスコに無水 CaCl 2 乾燥管を追加。室温で攪拌しながら、反応を維持 (~ 20 ° C) 約 12 h. の</li>
		</ol></li> <li>後反応プロセス <ol><li>反応が完了したら、真空による溶液生成白色固体をフィルターで除外します。冷たいジエチル エーテル (500 mL) に白色の固形物を沈殿させる攪拌下の溶液を注ぐ。フィルターによりすべての白色固体を収集し、ヒューム フード中の固形物を乾燥します</li>。
			<li>再び白色固体を THF に溶解する、任意の不溶性の白色固体を除外、白色固形物を沈殿させる新鮮な冷たいジエチル エーテルに溶液を注ぐ、それを乾燥します。2 ~ 3 回、この手順を繰り返し、真空乾燥オーブン (20 ° C、0.1 mbar) 完全にそれらを乾燥するために白色の固体。最終製品として白い粉を収集: ベンズアルデヒド終了 DF ペグ</li>。
		</ol></li></ol></li> <li>ハイドロゲルの調製 <ol><li>チューブ (10 mL) で DF ペグ (0.11 g、0.028 ミリ モル 0.22 g、0.055 モル; 0.44 g、0.110 mmol) のさまざまな量の重量を量る脱イオン水 (5.0 mL) を追加して、支援する渦や磁性攪拌器使用 ポリマーを溶解します</li>。
		<li>リコール キトサン (0.495 g, x 10 -3 m モル 6.18) 管内 (50 mL)、脱イオン水 (15.0 mL) を溶解し、キトサン溶液 (3 wt %) を均質化するため、数分間渦を使用します</li>。
		<li>は、チューブ (2.0 mL) で順次リコール キトサン溶液 (0.2 mL、3 wt %) と DF PEG 溶液 (0.2 mL) を追加します。数分で均一フォーム ヒドロゲルへの解決策を混合するのに渦を使用します。表 1 異なる機械的強度のヒドロゲルの比に従ってください 。
		注: は、すでにヒドロゲルを形成するかどうかを決定するため管反転方法を使用します</li>。
	</ol></li> <li>レオロジー解析 <ol><li>パラレル鋼板回転レオメータのレオロジー解析を実施 (径: 20 mm)。ゲル化テストの下のプレートにリコール キトサン溶液 (0.2 mL、3 wt %) を広がってください。キトサン溶液の表面に均等に滴下 DF PEG 水溶液 (0.2 mL、2 wt %) を追加し、ピペットで手早く混ぜます。低いアッパー プレートをしてテストを開始</li>
		<li>ハイドロゲルの &#39; s 剛性テスト カット ハイドロゲル円 (直径: 20 mm) 貯蔵弾性率を測定し、(G &#39;) 1% ひずみ時の周波数解析に対する値。典型的な G &#39; 6.3 rad s 値 &#8722; 1 表 1 に示す 。
		注: はヒドロゲルの動的結合の安定化を確保するためハイドロゲル形成後 0.5 h ゲルのレオロジー解析を実施します</li>。
		<li>ヒドロゲルの &#39; s の自己 healable 特性テスト、切りにするハイドロゲルおよび整数部分に自動修復する作品が集まります。輪を作ってヒドロゲル部分で切って (径: 20 mm) レオロジー解析を行うレオメータの上に置くと</li>。
	</ol></li></ol> 2 ゲルの 3 d 細胞培養 <ol><li>ゲル ゲル溶液の調製 <ol><li>の細胞培養媒体 (RPMI 1640 年 2.0 で追加の重量を量る DF ペグ (0.44 g、0.11 ミリ モル) (4.0 mL)、生殖不能の管に。mL) と高分子溶液 (20 wt %) を取得する高分子を溶解するために渦や撹拌機を使用します。注射器 (10.0 mL) でソリューションを読み込むし、ミクロンの細菌保フィルター (0.22 μ m) を通すことで消毒します</li>。
		<li>はリコール キトサン (0.165 g, x 10 -3 m モル 2.06) 生殖不能の管 (15.0 mL) で重量を量る、細胞培養媒体 (RPMI 1640、4.0 mL)、そしてリコール キトサン溶液 (4.0 wt %) を取得する高分子を溶解するために渦を追加します。注射器 (10.0 mL) でソリューションを読み込むし、0.22 μ m 保細菌フィルターとフィルターします</li>。
	</ol></li> <li>ゲルの細胞培養 注意: 実行すべてのセルのティッシュ文化フードに関連する手順。生殖不能の技術の基本的な知識が期待されます。
	10% <ol><li>細胞懸濁液 <ol><li>RPMI 1640 培養 L929 細胞の調製培 FBS、ペトリネットの 5% ペニシリン (10 mL) 皿 (直径 10 cm)、37 ° C、5% CO 2 で孵化させなさいと。媒体は使用する前に毎日変更します</li>。
			<li>は、トリプシン (0.025 w/v %) および EDTA を含む PBS で L929 細胞を収穫 (0.01 %w/v)、遠心分離 (70 x g、5 分) と再 RPMI 1640 培地 (1.0 mL) で細胞を中断します。血液カウント ボードの標準操作を使用してセルのカウントを実行します。細胞濃度を調整する細胞を再停止 〜 3.75 × 10 6 セル/mL</li>。
		</ol></li> <li>ヒドロゲルの電池を封止材 <ol><li>L929 細胞懸濁液 (0.4 mL、10 6 セル mL -1 x 3.75) を混ぜて渦による管内 (4.0 mL) リコール キトサン溶液 (0.4 mL)。ピペットの共焦点シャーレの中央に L929/リコール キトサン溶液 (0.8 mL) (直径 2.0 cm)。同じ皿にピペットの DF PEG 溶液 (0.2 mL)、ソリューションをミックス、ハイドロゲル形成を誘導してゆっくりピペットします 。
			注: は、ペトリ皿を傾けることによってハイドロゲル形成を評価します</li>。
			<li>直接細胞培養、ゲルの上に RPMI 1640 培養媒体 (1.0 mL) の追加額を追加。インキュベーター (37 ° C、5% CO 2) に埋め込まれた携帯ハイドロゲル (1.0 mL、1.5 wt % グリコール キトサン、4.0 wt %df ペグ 1.5 × 10 6 セル mL -1) を入れ、毎日媒体を変更します。セル封止後日 1、3、5、および 7 にセルイメージ投射のための準備します</li>。
		</ol></li> <li>注入後ゲルの後 3 D 細胞培養の準備ロード携帯ハイドロゲル (1.0 mL ステップ 2.2.2 を参照) (10.0 mL、48 G 針) の注射器。ハイドロゲル フォーム後共焦点イメージング用シャーレにヒドロゲルをゆっくりと注入します。ヒドロゲルの上に培地 (1.0 mL) の追加量を追加し、それは毎日変更します。インキュベーター (37 ° C、5% CO 2) にペトリ皿を置くし、その後にイメージングのための準備します 。
		注意: を確認し、注射器の安全操作プロトコルに従ってください</li>。
	</ol></li> <li>細胞生存率解析 <ol><li>共焦点観察 <ol>
<li>は、2 回の PBS (1.0 mL) でゲルをすすいでください。フルオレセイン ・ ジアセテート (FDA、0.5 mL, 0.05 mg/mL) と propidium (PI、0.5 mL、0.08 mg/mL) はヨウ化ソリューションの 15 分のゲルを染色します。染色後、すべての溶剤を削除します</li>。
			<li>観察励起波長 488 の下共焦点顕微鏡を用いたゲル nm のライブを視覚化する nm と死者の 543 細胞、それぞれ。中の細胞の均一な分布を検証するゲルの 2 μ m 深さごとを通して z スタックを取る 。
			注意: FDA の汚れの生きているセル PI 汚れ死んだ細胞中です</li>。
		</ol></li> <li>チューブ (4.0 mL) に酢酸 (拍、3 v %、1.0 mL) 5 分のピペットでハイドロゲル (1.0 mL) が低下します。遠心分離機 (70 x g、5 分) による細胞を収集し、再 RPMI 1640 培 (1.0 mL) で細胞を中断します。細胞カウント ボードを数える血を使用してを実行します</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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このプロトコル (図 1) で発表したハイドロゲルは 2 つの主要なコンポーネント: 天然高分子グリコール キトサンおよび合成ベンズアルデヒド終了高分子ゲル化剤 DF ペグ、両方の生体適合性材料であります。DF ペグの合成は、ワンステップ改質反応を使用して提示されます。分子量 4,000 のペグは、溶解度、変更効率、ハイドロゲルの剛性の問題でこのプロトコルに選ばれました。固形物が異なるとグリコール キトサンと DF PEG の比率を使用して一連の機械の強みを持ったゲルを調製しました。ゲル化速度が希薄溶液によって低下するも、分で、常温ゲル化ソリューションを混合することによって、均質なゲルによってすぐに形作られました。レオロジー試験は異なるヒドロゲルの機械的強度を評価するために採用されました。貯蔵弾性率 (G') それらのヒドロゲルの約 900 とは異なることがわかった Pa (ソフト) 2,100 4,700 (中) Pa Pa (硬い) (表 1と図 2 a)。これはより高い貯蔵弾性率 (高い剛性) のハイドロゲル ネットワークでより多くの高分子のゲル化剤を追加することによってより高い架橋密度に貢献しました。自己 healable プロパティはゲルの弾性率 (図 2 b) の回復によっても確認されました。グリコール キトサンと DF ペグ高分子ゲル化剤18の間の様々 な比率によって ECM 剛性と様々 な組織で異なります、したがってヒドロゲルを調整可能な機械的手がかりを提供でき、異なる研究の要件を満たすことをいわれます。
L929 細胞、体内環境組織剛性の典型的なマウス線維芽細胞のセルライン 〜 5,600 pa19ヒドロゲルに埋め込まれる細胞モデルとして使用されました。ヒドロゲルのセル封止後簡単に観測できる、ゲルの細胞が非常に高い生存率を示した (&#62; 99%) 培養液中キトサンによるハイドロゲルの優れた生体適合性を確認します。細胞密度、ハイドロゲルの顕著な増加暗示このハイドロゲルが余分な追加成長因子 (図 3 a) がなくて L929 細胞の増殖を支えることができます。ヒドロゲルの文化の日の 7 日後は、細胞の数は、300% (図 3 b) を増加しました。足場に細胞が機械的キュー20,21、この三次元ハイドロゲル培養法によるさらなる研究を意味する可能性があります、次を区別することを報告します。
注射ハイドロゲルと細胞を植え付けること配信の効率と14移植細胞の生存率を大幅強化する比類のない利点を得ています。動的なイミン架橋ネットワーク内ヒドロゲルは注射後治癒可能性があります。自己 healable プロパティにより、注射するハイドロゲル注射としてヒドロゲルの潜在的なアプリケーションに複数のキャリアを意味します。注射剤の担体としてこのハイドロゲルをさらに評価するには、注入真似をして後の培養実験を行った。埋め込まれた携帯ハイドロゲルは注射器で読み込まれ、続いて後研究細胞生存率や増殖率とプロセスを培養 7 日シャーレに 48 G の針を通して出て圧迫します。
図 4 aのように、踏み付けヒドロゲル部分は治癒、携帯配信で役立つ射出後統合ハイドロゲル約 1 h を改革する可能性があります。ヒドロゲルの細胞と比較するとイメージをカプセル化 (図 4 a、左挿入)、(図 4 a、中間挿入) 7 日後劇的に増加した細胞密度の直後に取った。拡大のビジョンの詳細のいくつかの細胞が 2 つに分かれて存在する細胞 fissional のプロセス (図 4 a、右の挿入)、直接、ハイドロゲルの 3 D の細胞増殖を確認します。図 4 bは、注射後の培養実験後住んでいる死んだ細胞の試金の共焦点画像を示しています。挿入されたセルの密度増加明らかに高いセル実行可能性 (&#62; 99%)、注射後 3 D ゲルで成功した細胞の増殖を示します。ゲル注入の有無で細胞増殖率の量的な統計分析の比較があった注射に細胞増殖率が影響を受けるかどうかを学ぶこと (図 4) を実行します。注入後、細胞増殖率わずかに減少したが後に残った高レベル (〜 75%) と細胞数の 145% 増加比較的射出時のせん断力が、観測可能なオブジェクトであることを示す、ハイドロゲル培養で 7 日間細胞増殖の否定的な影響力を限定。
このハイドロゲル アプリケーションの一般的な手順について説明しましたが、研究者は研究の特定の要件に合わせてプロトコルを変更できます。高分子ゲル化剤ヒドロゲルへの重要な影響があるし、簡単に変更することは。たとえば、グリコール キトサンと DF ペグ ゲル化剤の異なる比率でこのハイドロゲルの剛性を簡単に操作できます。一方、他の分子量の DF ペグ使用もこの目標を満たすことができます。我々 はこのプロトコルで 4 K ペグを使用、ペグ 2 に 10 K はまた働くかもしれない。他のペグを使用している場合、ゲル化時間と剛性を特に監視するため重要です。その他の機能性高分子ゲル化剤は、研究者は特定ベンズアルデヒド終了高分子17を準備する合成スキルを持っている場合また働くかもしれません。
このプロトコルには、いくつかの制限があります。まず、動的構造によりこのハイドロゲルの剛性は限られた共有結合架橋ハイドロゲルと比較です。ゲルの創製を準備する障害が発生ことがあります 1 つ弾性設計の高すぎます。第二に、このハイドロゲルがバイオ分解のヒドロゲル内長期細胞培養を抑えたりです。第三に、ヒドロゲル拡散懸念している 3次元架橋の栽培環境を提供しています。まで、バイオ解析の多くは、2 D の文化に基づいています。3 D 構造は、さらに細胞の生体に関連を妨げる可能性があります。
このプロトコルを使用するときにいくつかの重要な手順があります。まず、合成高分子ゲル化剤 DF ペグ、中に脱水は非常に重要です。第二に、セル関連のプロシージャを実行すると、無菌操作が重要です。第三に、素敵な共焦点画像を取得するゲルの染色時間をよく制御必要があります。
要約すると、プロトコルはキトサン ベース注射ゲル, 3 D 細胞培養のためのプラットフォームとして適用されますと各種研究用調節可能な力学的手がかりを提供できる安易な準備を導入しました。それはドラッグデリバリー、細胞療法、腫瘍化学療法だけでなく、その性能を証明するものがまた生体 ap の可能性が高まるなどの分野で適用されています。ド。

ヒドロゲルは大量の水と柔らかい物性を架橋高分子材料と彼らは多くの生物医学応用1,2で使用されています。ゲルは、生体内で細胞の生理学的環境に非常に類似している柔らかく、ぬれた環境を提供できます。したがって、ヒドロゲルは 3 D 細胞培養3,4の最も人気のある足場になっています。2D ペトリ皿培養に比べると、3 D 細胞培養細胞外マトリックス (ECM) 模倣し、増殖・分化のための5のための組み立てる細胞の微小環境を提供する迅速に進んでいます。さらに、天然高分子を含むゲルは、細胞が増殖し、3を区別するための生体適合性と促進環境を提供できます。由来の合成高分子ヒドロゲルは動物由来タンパク質またはウイルスのような複雑な影響を排除する、そのシンプルかつ明確なコンポーネントに適しています。3 D 細胞培養のためのすべてのハイドロゲル候補では、中でゲルが容易に作製し、一貫性のあるプロパティを持つが常に優先されます。異なる研究要件に合わせてハイドロゲルのプロパティを調整する施設は、よく6として重要です。
3 D 細胞培養7のための汎用性の高いハイドロゲル プラットフォームとなる動的なイミン化学を使用してリコール キトサンによるハイドロゲルの安易な準備をご紹介します。このメソッドでは、よく知られているバイオ セーフティー リコール キトサンを使用ヒドロゲルのネットワークのフレームを確立します。そのアミノ基は、ヒドロゲル8crosslinkages として動的なイミン結合を形成する高分子ゲル化剤として終了ベンズアルデヒド ポリエチレングと反応しました。動的なイミン結合を形成し、機械的に調節可能な架橋ネットワーク9,10,11ヒドロゲルを endowing 周囲に可逆的かつ responsively を分解します。高含水、生体適合材料と調節可能な機械的強度のため、ハイドロゲルが正常に 3 D 細胞培養12,13L929 細胞の足場として適用されます。ここのプロトコルは、高分子ゲル化剤合成、ハイドロゲルの準備、セルの埋め込み、3 D 細胞培養など、手順を詳しく説明します。
ヒドロゲルはまたその動的なイミンの crosslinkages、その多様々 なバイオ刺激(酸/pH、ビタミン B6 誘導体ピリドキサール、タンパク質パパイン等)への応答を含む、ヒドロゲルへことができることを示すための他のいくつかの機能を示しています8生理学的条件下で分解を誘導しました。ヒドロゲルはまた自己 healable と注射、ヒドロゲル最小限の侵襲的な注入法で投与できる薬剤と細胞の配達14,15では優位します。ヒドロゲルは磁気、温度、pH 応答性など16,17を満たすことができるような特定のプロパティを獲得する互換性のある機能性添加剤や特定のあらかじめデザインされた高分子ゲル化剤を追加することによって、幅広い研究要件。これらのプロパティでは、注射をするハイドロゲルの潜在的な能力薬の細胞in vitroとin vivoの生物医学研究とアプリケーションの両方で複数のキャリアを明らかにします。

<table><tbody><tr><td>Glycol chitosan</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>39280-86-9</td><td>90% degree of deacetylation</td></tr><tr><td>4-Carboxybenzaldehyde</td><td>Shanghai Aladdin&amp;nbsp;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td><td>619-66-9</td><td>99%</td></tr><tr><td>N, N&#039;-dicyclohexylcarbodiimide</td><td>Shanghai Aladdin&amp;nbsp;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td><td>538-75-0</td><td>99%</td></tr><tr><td>Calcium chloride anhydrous</td><td>Shanghai Aladdin&amp;nbsp;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td><td>10043-52-4</td><td>96%</td></tr><tr><td>4-dimethylamiopryidine</td><td>Shanghai Aladdin&amp;nbsp;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td><td>1122-58</td><td>99%</td></tr><tr><td>Polyethyleneglycol</td><td>Sino-pharm Chemical Reagent</td><td>5254-43-7</td><td>99%</td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sino-pharm Chemical Reagent</td><td>109-99-9</td><td>99%</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sino-pharm Chemical Reagent</td><td>108-88-3</td><td>99%</td></tr><tr><td>Ethyl ether</td><td>Sino-pharm Chemical Reagent</td><td>60-29-7</td><td>99%</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sino-pharm Chemical Reagent</td><td>64-19-7</td><td>99%</td></tr><tr><td>Anhydrous CaCl2</td><td>Sino-pharm Chemical Reagent</td><td>10043-52-4</td><td>99%</td></tr><tr><td>Fluorescein diacetate</td><td>Sigma</td><td>596-09-8</td><td>99%</td></tr><tr><td>Propidium iodide&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>25535-16-4</td><td>94%</td></tr><tr><td>RPMI-1640 culture media</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td></td><td>0.25%</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td></td><td>0.01 M</td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin solution</td><td>Hyclone</td><td></td><td>10,000 U/mL</td></tr><tr><td>Rheometer</td><td>TA Instrument</td><td></td><td>AR-G2</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>710-3channel</td></tr><tr><td>L929 Cells</td><td>ATCC</td><td></td><td>NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L</td></tr><tr><td>Evaporator</td><td>EYELA</td><td></td><td>N-1100</td></tr><tr><td>48 guage needle</td><td>ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD</td><td></td><td>48-guage</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td>DM3000 B</td></tr><tr><td>Microscope software</td><td>Imaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat gun</td><td>Confu</td><td></td><td>KF-5843&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>NEST</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of chitosan-based injectable hydrogels and its application in 3d cell culture

プロトコルは、動的イミン化学を用いたキトサン ベースのゲルを準備する安易な効率的、かつ汎用性の高い手法を提案します。終了合成ベンズアルデヒド高分子ゲル化剤とグリコール キトサンの溶液を混合することによって、ハイドロゲルを用意し、ヒドロゲルは室温で数分間で効率的に得られます。グリコール キトサン、高分子ゲル化剤、含水量の様々 な比率によって異なるゲル化時間と剛性の多彩なゲルが得られます。破損して、その外観と係数、crosslinkages として動的なイミン結合の可逆性ヒドロゲルを回復できます。この自己 healable プロパティにより、注入処理後整数一括ハイドロゲルに絞りの部分から自己治癒があるので注射するハイドロゲルです。ヒドロゲルも多動的イミン結合の別の平衡状態のため多くの生物活性の刺激に応答するものです。このハイドロゲルが生体適合性として確認された、L929 マウス線維芽細胞が埋め込まれた次の標準的な手順と細胞の増殖は簡単に 3 D 細胞培養プロセスによって評価されました。ヒドロゲルは細胞のための 3 D 環境の生理学的な模倣は利益を得た別の研究のための調節可能なプラットフォームを提供できます。そのマルチ応答性、自己 healable と注射のプロパティと共に、ヒドロゲルは薬と将来の生物医学アプリケーションのセルに複数のキャリアとして可能性があります適用できます。

ゲルの調製とその 3 D 細胞培養上でこのプロトコルの図式は、図 1で提供しています。ハイドロゲルの内容と異なる機械的強さの準備率の情報は表 1のとおりです。ヒドロゲルの自己 healable とレオロジー特性図2 周波数テスト対貯蔵弾性率によるハイドロゲルの剛性をプレゼントします。細胞の共焦点画像とヒドロゲルの文化の日と携帯電話の番号は、図 3、3 D 細胞培養による細胞増殖と細胞生存率を確認するのに提示されます。図 4は、顕微鏡、共焦点イメージ、および注入後文化に苦しんだヒドロゲルに埋め込まれた細胞の細胞増殖率の分析を示します。高細胞生存率、細胞増殖を示し、ハイドロゲルに埋め込まれた細胞破壊の被害を被っていない、ハイドロゲルの injectability を示す後の文化によって回復する可能性が。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56253/56253fig1.jpg"> 
図 1: ハイドロゲルとその 3 D 細胞培養の準備。(A) ハイドロゲルの準備;(B) 細胞の懸濁液の準備;ゲル注入の有無 (C) 3 D の細胞の培養。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56253/56253fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56253/56253fig2.jpg"> 
図 2:ハイドロゲル剛性。貯蔵弾性率 G' (A) の元の周波数と (B) 自己治癒ハイドロゲルです。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56253/56253fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56253/56253fig3.jpg"> 
図 3: ヒドロゲルの 3 D 細胞培養。硬い強度ハイドロゲルに埋め込まれた L929 細胞 (A) の 3 D 共焦点画像 (緑: 細胞;赤: 死んでいるセル);(B) セル示されて時にセル封止後、ゲルに埋め込まれた L929 細胞の結果をカウントします。スケールバー = 300 μ m. 示されるデータを平均 ± SD.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56253/56253fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56253/56253fig4.jpg"> 
図 4: 3 D 培養の後注入後ハイドロゲルで。(A) A 注入後文化セル ロード ハイドロゲルのイメージ図。ゲル注入 (左) 前後 (中・右) 7 日間培養後の細胞の顕微鏡画像の埋め込みを挿入:。スケールバー = 100 μ m;L929 細胞の共焦点画像を (B) 硬い強度ハイドロゲルに埋め込まれ、注射後培養後 (緑: 細胞;赤: 死んでいるセル)、スケールバー = 300 μ m。(C) A ヒドロゲル カプセル化後注入の有無で培養された細胞の増殖率の比較。平均 ± SD. (参照12; から適合として提示されたデータ著作権 © 2017年エルゼビア)。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56253/56253fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ハイドロゲル剛性</td>
			<td>ソフト</td>
			<td>媒体</td>
			<td>硬い</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>グリコール キトサン (mg)</td>
			<td>6.6</td>
			<td>6.6</td>
			<td>6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DF ペグ (mg)</td>
			<td>4.4</td>
			<td>8.8</td>
			<td>17.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>高分子ゲル化剤含有量 (wt %)</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>脱イオン水 (mL)</td>
			<td>0.4</td>
			<td>0.4</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelaion 時間 (分)</td>
			<td>7.5</td>
			<td>5</td>
			<td>3.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G' (Pa)*</td>
			<td>900</td>
			<td>2100</td>
			<td>4700</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*周波数 6.3 rad s-1下でのテスト、平行平板を使用して 1% のひずみ (直径 20 mm) 回転レオメーターに。</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1: 異なる機械的強さを使用したゲルの情報。

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Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

ここで動的イミン化学を用いたキトサン ベース注射ゲルの作製について述べる。ハイドロゲルの機械的強度と 3 D 細胞培養への応用を調整する方法が掲載されています。

キトサンを用いた注射ゲルおよび 3 D 細胞培養への応用の準備

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is ...

preparation-chitosan-based-injectable-hydrogels-its-application-3d

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

19.0K ビュー.  Tsinghua University. ここで動的イミン化学を用いたキトサン ベース注射ゲルの作製について述べる。ハイドロゲルの機械的強度と 3 D 細胞培養への応用を調整する方法が掲載されています。

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Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

細胞培養用ヒドロゲルの蛋白質ベースのアーキテクチャの簡単な操作

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

生化学

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively for tissue regeneration, a number of variables must be taken into account. These variables include: the total volume and surface area of the implantation site, the mechanical properties of the tissue and the tissue microenvironment, which includes the amount of vascularization and the components of the extracellular matrix. Therefore, the materials being used to deliver these cells must be biocompatible with a defined chemical composition while maintaining a mechanical strength that mimics the host tissue. These materials must also be permeable to oxygen and nutrients to provide a favorable microenvironment for cells to attach and proliferate. Chitosan, a cationic polysaccharide with excellent biocompatibility, can be easily chemically modified and has a high affinity to bind with in vivo macromolecules4-5. Chitosan mimics the glycosaminoglycan portion of the extracellular matrix, enabling it to function as a substrate for cell adhesion, migration and proliferation. In this study we utilize chitosan in the form of microspheres to deliver adipose-derived stem cells (ASC) into a collagen based three-dimensional scaffold6. An ideal cell-to-microsphere ratio was determined with respect to incubation time and cell density to achieve maximum number of cells that could be loaded. Once ASC are seeded onto the chitosan microspheres (CSM), they are embedded in a collagen scaffold and can be maintained in culture for extended periods. In summary, this study provides a method to precisely deliver stem cells within a three dimensional biomaterial scaffold.

A major hurdle in current stem cell therapies is determining the most effective method to deliver these cells to host tissues. Here, we describe a chitosan-based delivery method that is efficient and simple in approach, while allowing adipose-derived stem cells to maintain their multipotency.

幹細胞にロードされたキトサンミクロスフェアの配信のためにコラーゲンハイドロゲルの構築

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

生物工学

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

関節軟骨細胞培養軟骨の生成のための3Dハイドロゲルの足場

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Formation of Human Periodontal Ligament Cell Spheroids on Chitosan Films

Periodontal ligament (PDL) cells hold great promise for periodontal tissue regeneration. Conventionally, PDL cells are cultured on two-dimensional (2D) substrates such as tissue culture polystyrene (TCPS). However, characteristic changes of PDL cells have been observed during in vitro culture. This phenomenon is probably because the 2D TCPS differs from the in vivo three-dimensional (3D) microenvironment. Compared to cells cultured on 2D substrates, cells grown in a 3D microenvironment exhibit more similarities to in vivo cells. Therefore, 3D cell culture models provide a promising alternative for conventional 2D monolayer cell culture. To improve conventional PDL cell culture models, we have recently developed a 3D cell culture method, which is based on spheroid formation of PDL cells on chitosan films. Here, we present detailed cell spheroid culture protocols based on chitosan films. The 3D culture system of PDL cellular spheroids overcome some of the limitations related to conventional 2D monolayer cell culture, and thus may be suitable for producing PDL cells with an enhanced therapeutic efficacy for future periodontal tissue regeneration.

Here, we present protocols of culturing human periodontal ligament (PDL) cell spheroids by chitosan films. The culture of three-dimensional (3D) cellular spheroids provides an alternative to conventional tissue culture polystyrene (TCPS) culture system.

キトサン膜上のヒト歯周靭帯細胞スフェロイドの形成

Periodontal ligament (PDL) cells hold great promise for periodontal tissue regeneration. Conventionally, PDL cells are cultured on two-dimensional (2D) ...

発生生物学

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3D細胞培養のための肺細胞外マトリックスから調整可能なヒドロゲル

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

注射の再生療法と高スループットの薬剤のスクリーニングのための 3 D への放射能

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

カプセル化と 3 D の細胞の免疫染色のエラスチン様タンパク質ゲルの生産

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell lines using conventional two-dimensional (2D) cell culture. These challenges can be overcome by using bioprinting techniques to build heterogeneous three-dimensional (3D) tumor models whereby different types of cells are embedded. Alginate and gelatin are two of the most common biomaterials employed in bioprinting due to their biocompatibility, biomimicry, and mechanical properties. By combining the two polymers, we achieved a bioprintable composite hydrogel with similarities to the microscopic architecture of a native tumor stroma. We studied the printability of the composite hydrogel via rheology and obtained the optimal printing window. Breast cancer cells and fibroblasts were embedded in the hydrogels and printed to form a 3D model mimicking the in vivo microenvironment. The bioprinted heterogeneous model achieves a high viability for long-term cell culture (&#62; 30 days) and promotes the self-assembly of breast cancer cells into multicellular tumor spheroids (MCTS). We observed the migration and interaction of the cancer-associated fibroblast cells (CAFs) with the MCTS in this model. By using bioprinted cell culture platforms as co-culture systems, it offers a unique tool to study the dependence of tumorigenesis on the stroma composition. This technique features a high-throughput, low cost, and high reproducibility, and it can also provide an alternative model to conventional cell monolayer cultures and animal tumor models to study cancer biology.

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

We developed a heterogeneous breast cancer model consisting of immortalized tumor and fibroblast cells embedded in a bioprintable alginate/gelatin bioink. The model recapitulates the in vivo tumor microenvironment and facilitates the formation of multicellular tumor spheroids, yielding insight into the mechanisms driving tumorigenesis.

Bioprintable アルギン酸/ゼラチン ゲル 3 Dの in Vitroモデル システム細胞スフェロイドの形成を誘導します。

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

ゼラチンメタクリロイルヒドロゲルベースバイオインクの3Dバイオプリンティングのプロトコル

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Fabrication of Size-Controlled and Emulsion-Free Chitosan-Genipin Microgels for Tissue Engineering Applications

Chitosan microgels are of significant interest in tissue engineering due to their wide range of applications, low cost, and immunogenicity. However, chitosan microgels are commonly fabricated using emulsion methods that require organic solvent rinses, which are toxic and harmful to the environment. The present protocol presents a rapid, non-cytotoxic, non-emulsion-based method for fabricating chitosan-genipin microgels without the need for organic solvent rinses. The microgels described herein can be fabricated with precise size control. They exhibit sustained release of biomolecules, making them highly relevant for tissue engineering, biomaterials, and regenerative medicine. Chitosan is crosslinked with genipin to form a hydrogel network, then passed through a syringe filter to produce the microgels. The microgels can be filtered to create a range of sizes, and they show pH-dependent swelling and degrade over time enzymatically. These microgels have been employed in a rat growth plate injury model and were demonstrated to promote increased cartilage tissue repair and to show complete degradation at 28 days in vivo. Due to their low cost, high convenience, and ease of fabrication with cytocompatible materials, these chitosan microgels present an exciting and unique technology in tissue engineering.

The present protocol describes a non-emulsion-based method for the fabrication of chitosan-genipin microgels. The size of these microgels can be precisely controlled, and they can display pH-dependent swelling, degrade in vivo,&#160;and be loaded with therapeutic molecules that release over time in a sustained manner, making them highly relevant for tissue engineering applications.

組織工学用途のためのサイズ制御およびエマルジョンフリーのキトサン-ジェニピンミクロゲルの製造

Chitosan microgels are of significant interest in tissue engineering due to their wide range of applications, low cost, and immunogenicity. However, ...

キトサンを用いた注射ゲルおよび 3 D 細胞培養への応用の準備

要約

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細胞培養用ヒドロゲルの蛋白質ベースのアーキテクチャの簡単な操作

幹細胞にロードされたキトサンミクロスフェアの配信のためにコラーゲンハイドロゲルの構築

関節軟骨細胞培養軟骨の生成のための3Dハイドロゲルの足場

キトサン膜上のヒト歯周靭帯細胞スフェロイドの形成

3D細胞培養のための肺細胞外マトリックスから調整可能なヒドロゲル

注射の再生療法と高スループットの薬剤のスクリーニングのための 3 D への放射能

カプセル化と 3 D の細胞の免疫染色のエラスチン様タンパク質ゲルの生産

Bioprintable アルギン酸/ゼラチンゲル 3 Dの in Vitroモデルシステム細胞スフェロイドの形成を誘導します。

ゼラチンメタクリロイルヒドロゲルベースバイオインクの3Dバイオプリンティングのプロトコル

組織工学用途のためのサイズ制御およびエマルジョンフリーのキトサン-ジェニピンミクロゲルの製造

キトサンを用いた注射ゲルおよび 3 D 細胞培養への応用の準備

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細胞培養用ヒドロゲルの蛋白質ベースのアーキテクチャの簡単な操作

幹細胞にロードされたキトサンミクロスフェアの配信のためにコラーゲンハイドロゲルの構築

関節軟骨細胞培養軟骨の生成のための3Dハイドロゲルの足場

キトサン膜上のヒト歯周靭帯細胞スフェロイドの形成

3D細胞培養のための肺細胞外マトリックスから調整可能なヒドロゲル

注射の再生療法と高スループットの薬剤のスクリーニングのための 3 D への放射能

カプセル化と 3 D の細胞の免疫染色のエラスチン様タンパク質ゲルの生産

Bioprintable アルギン酸/ゼラチン ゲル 3 Dの in Vitroモデル システム細胞スフェロイドの形成を誘導します。

ゼラチンメタクリロイルヒドロゲルベースバイオインクの3Dバイオプリンティングのプロトコル

組織工学用途のためのサイズ制御およびエマルジョンフリーのキトサン-ジェニピンミクロゲルの製造

Bioprintable アルギン酸/ゼラチンゲル 3 Dの in Vitroモデルシステム細胞スフェロイドの形成を誘導します。