著者は、このプロトコルの確立の間に彼の優秀なテクニカル サポート 1 月アペルをありがとうございます。Rada イグレシアス研究室で作業に支えられて CMMC 学内資金、DFG 研究助成 (RA 2547/1-1、RA 2547/2-1、および TE 1007/3-1)、カタルーニャ ・ オープン大学上級研究員グループ Grant、および CECAD グラント。

<ol>
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著者には、開示すること、競合する金銭的な利益はありません。

エピゲノム チップ seq を使用してヒストン修飾のプロファイリングは、異なる携帯電話4,5,18で脊椎動物のゲノムの機能アノテーションを改善するために使用できます。これらエピゲノム プロファイルは使用できます、他のものの間でエンハンサー エンハンサー (すなわち、アクティブ、プライミング、または構え)、規制の状態を定義し、異なる生物の主要な細胞アイデンティティ レギュレータを定義する要素を識別するためにまたは病理学的コンテキスト (例えば、広い H3K4me3 プロモーター ドメインおよびスーパー エンハンサー)6,7,9,10、11,19。ただし、通常細胞の数百万が必要です、チップ試金の特有の制限によりプロファイル細胞株の in vitroにおける生成されているし、セルのタイプすることができますほとんどのヒストン修飾の並べ替え生体内で大量に4. 最近で非常に低細胞数、細胞の種類の範囲を劇的に拡大と互換性があるいくつかのチップ seq プロトコルが記載されている、どのエピゲノムのプロファイルすることができます、原則として組織生成13 ,14,,1516。これら新しいチップ seq プロトコル各は、少なくともいくつかのケースで標準機器や試薬14,15,16を必要とする特定アドホックのライブラリの準備方法に依存します。
ここでは、生体内で異なる萌芽期ティッシュ10から得られる中間細胞数 (5 × 104 - 5 x 10 の5セル) に低で動作するチップ プロトコルについて述べる.当社チップ試金の感受性を高める、シーケンシャル細胞、核溶解、貴重な材料の進歩的な損失につながるなど、チップの中に通常使用されるいくつかの手順を排除している私たち。したがって、架橋結合の後サンプルは単一換散バッファーで処理され、その後サンプルの損失を最小限に抑えるために超音波処理が。重要なは、私たちのチップ プロトコルは qPCR 分析、従って興味の選択した軌跡のエピゲノム解析を有効にすると互換性が。さらに、標準的なチップ seq ライブラリ製法、従って次世代シーケンシング技術へのアクセスをほとんどの実験室に潜在的に有用であると私たちのチップ プロトコルを結合できます。
チップとチップ seq プロトコルは、ヒストンの結合プロファイルを調査するのみならず、転写因子や共活性剤 (例えばなどの他の重要な転写制御因子の結合部位を明らかにするも使用できます。p300 および CBP)20。通常、チップ (チップ seq) 転写因子の共活性剤はないとヒストンと同じくらい豊富、ヒストンのチップよりもかなりより原料を必要とします。したがって、ほとんどの転写因子の説明プロトコル可能性があります必ずしも動作しないまたは共同活性化しない限り、細胞の開始の数はかなり増加した (例えば5 × 105 - 5 x 10 の6セル) および/または非常に具体的、効率的な抗体があります。それにもかかわらず、さらなる最適化と絶えず改善ライブラリの準備方法、我々 は限られた細胞材料からチップ seq をほとんど調節蛋白質の可能になることを見込んでいます。
私達のチップとチップ seq のプロトコルは、さまざまなヒストン修飾と萌芽期ティッシュの広範囲検証されている、高品質エピゲノム プロファイルの生成に不可欠であると考えていくつかの重要なステップを強調したいと思います。まず、萌芽期のサンプルは新鮮なクロマチンの整合性を妥協しない条件下で分離する必要があります。十分な材料が蓄積されるまで、寒さの条件又はフラッシュ凍結標本の解剖を実行するが含まれます。もう一つの重要なステップは、超音波処理は、正確に高品質のチップを実行するように最適化する必要があります。最適な超音波処理条件よく、組織の種類によって異なります、組織、または使用されている超音波発生装置の量。最後になりましたが、成功したチップは最終的に特定および興味の蛋白質抗体チップ互換の可用性に依存します。

ヒストン翻訳後修飾は、転写、複製 DNA 修理1,2,3など、さまざまなクロマチンに依存するプロセスに直接関与しています。さらに、異なるヒストン修飾を示す正 (などH3K4me3 と H3K27ac) または負 (例えばH3K9me3 と H3K27me3) 遺伝子の発現との相関と広く定義することができます活性化または抑圧的なヒストンをマークしたようそれぞれ2,3。その結果、全体的なヒストン修飾マップ、エピゲノム マップとも呼ばれますが、機能的脊椎動物のゲノム4、5の注釈に強力で普遍的なツールとして浮上しています。たとえば、遠位規制エンハンサーを識別できるように基づく系列クロマチンの特定の存在 (例えば、アクティブなエンハンサー: H3K4me1 と H3K27ac)、近位プロモーター領域からそれらを区別する (など活性プロモーター: H3K4me3)6,7,8。その一方で、主要な細胞アイデンティティの規定する機能を持つ遺伝子、通常、広範なクロマチン ドメインそれぞれ根本的な遺伝子の転写活性アクティブまたは非アクティブの状態に応じて H3K4me3 と H3K27me3、マーク9 で発見します。 ,10。同様に、主要な細胞アイデンティティ遺伝子発現クラスター化エンハンサー (すなわち、超エンハンサー) 広範な H3K27ac マーク ドメイン11として識別することができます複数のと空間的に制御する頻繁にようであります。
現在、ヒストン修正図を生成する技術を使用してチップ seq チップ (チップ マイクロ アレイに結合) などの従来のアプローチと比較して高い解像度、ノイズ、大きい範囲、および下位以下の少ないアーティファクトを提供しますコスト12。それにもかかわらず、エピゲノム マップ チップ seq 技術を使用しての世代が関心のサンプル チップを正常に実行する能力と大抵関連付けられるその固有の限界あります。伝統的なチップ プロトコルは通常細胞の培養系にこの法の適用性線またはセル範囲が制限簡単に分離できます生体内で(例えば、血液細胞) 細胞の数百万を必要です。ここ数年で低細胞数と互換性のあるチップ プロトコルの修正の数は説明13,14,15,16をされています。ただし、これらのプロトコルを次世代シーケンス (すなわち、チップ seq) と結合される設計、彼らは通常アドホック図書館準備方法13,14,を使用15,16。
ここでは、我々 は中間に低細胞数 (5 × 104 - 5 x 10 の5セル) を使用して、ヒストン変更プロファイルを調査するためチップ プロトコルを記述した (すなわち、チップ qPCR) いずれかの選択した軌跡またはグローバル (すなわち、チップ seq) (図 1)。チップ seq 技術を組み合わせることで、当社のチップ プロトコルは標準ライブラリの製法をできるようになり、多くの研究所10に幅広くアクセスと共に使用できます。このプロトコルは、いくつかのヒストンを調査に使用されている(例えば、 H3K4me3、H3K27me3、および H3K27ac) 異なる鶏胚組織 (例えば、脊髄神経管 (SNT)、成人プロミネンスと胚盤葉上層) で。ただし、少量で、生物学的および臨床的に関連するサンプルをだけ得ることが他の生物に広く適用されると見込んでください。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3737.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Saline buffer (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL pH8.0</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3957.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Deoxycholate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6750-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-lauroylsarcosine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>61743-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3724,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3739.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I3021-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>1833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G/magnetic beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252549-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>12-RA-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46.35 E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SLB2659V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5892791001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBRgreen Mix</td>
			<td>biozym</td>
			<td>617004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1Kb ladder</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>SM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Sigma Alrich</td>
			<td>03756-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3051.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#180;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel loading tips Multiflex</td>
			<td>A.Hartenstein</td>
			<td>GS21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Plates</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>721,985,202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>721,985,202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000&#181;l Filter tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70,762,211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20&#181;l Filter tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70,760,213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-200&#181;l Filter tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70,760,211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-10&#181;l Filter tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>701,116,210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K27me3 antibody</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K27ac antibody</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K4me3 antibody</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K4me2 antibody</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End Repair Mix</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-121-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paramagnetic beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension buffer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-121-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-Tailing Mix</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-121-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Mix</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-121-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Adapter Indexes</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Ligation Buffer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-121-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Primer Cocktail</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-121-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced PCR Mix</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-121-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA ladder</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification Kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4835 &#8211; 07960204001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertile chicken white eggs</td>
			<td>LSL Rhein Main</td>
			<td>KN: 15968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (Neoject)</td>
			<td>A.Hartenstein</td>
			<td>10001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (Ecoject 10ml)</td>
			<td>Dispomed witt oHG</td>
			<td>21010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hermle</td>
			<td>Z 216 MK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>ITABIS</td>
			<td>MKR13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Active Motive</td>
			<td>EpiShear probe sonicator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>Bioruptor Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>SB3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable volume (5&#8211;1,000 &#956;l) pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic holder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>DynaMag-2 12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table spinner</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>Sprout</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer</td>
			<td>LMS</td>
			<td>VTX 3000L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR Cycler</td>
			<td>Roche</td>
			<td>Light Cycler; Serial Nr.5662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Gene Amp PCR System 9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA and RNA quality control system</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 4200 TapeStation System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>5-Inox-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>501997</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin immunoprecipitation (chip) protocol for low-abundance embryonic samples

クロマチン免疫沈降 (チップ) は、クロマチン修飾酵素特定の軌跡やゲノム規模で、転写因子やヒストン ファーストクリーニング変更されたヒストンのローカリゼーションをマッピングするための広く使われている手法です。次世代シーケンス (すなわち、チップ Seq) とチップ試金の組み合わせは、遺伝子制御ネットワークを世界的に明らかにして特に規制の非コーディング シーケンスのゲノムの機能アノテーションを改善する強力なアプローチです。チップ プロトコルは通常多量の細胞材料、従ってまれなセルタイプまたは小さい組織生検の調査にこの法の適用性を排除を必要です。チップ試金を初期脊椎動物胚体内で通常得られる生物学的材料の量に対応するために、するために述べるここでチップの簡易プロトコルを完了するために必要なステップ数、アッセイは、サンプルの損失を最小限に抑えるために減少しました。このチップ プロトコルは様々 なニワトリ胚および成体組織中細胞数 (5 × 104 - 5 x 10 の5セル) に低の異なるヒストン修飾を調査するため正常に使用されています。重要なは、このプロトコルは標準ライブラリの作製法を用いたチップ seq 技術と互換性のある、関連性の高い萌芽期ティッシュのマップ グローバル エピゲノムを提供します。

チップ seq 実験 HH19 鶏の胚からプールの SNT セクションを使用して、HH22 の上顎突起鶏胚との結合プロファイルを調査する段階 HH3 鶏胚を行ったチップ プロトコルのパフォーマンスを示すためには、各種のヒストンの修正は (すなわちH3K4me2、H3K27ac、H3K4me3、および H3K27me3)。チップ Dna が得られた後、超音波処理効率は対応する入力 Dna (図 3) のアガロース電気泳動で評価しました。チップと入力の Dna は遺伝子座のバインドまたは調査のヒストンの修正 (図 4 a) で非連結予想で濃縮を測定するチップ qPCR 解析に使用されました。図 4 aH3K27me3、H3K4me3 濃縮の例 HH19 SNT のセクションでレベルは SOX17、SOX2、非アクティブ、アクティブ、SNT では、それぞれ 2 つの遺伝子のプロモーター領域の周りチップ qPCR で評価しました。予想通り、SOX2 プロモーター強く示された H3K4me3 が、H3K27me3 ではなく SOX17 プロモーターを示した (図 4 a) の逆のパターン。いくつかの遺伝子座を評価することによって下流のチップ seq 分析多くの DNA 資料を失うことがなく、チップの品質を推定することが可能です。チップの品質を確認した、チップ seq ライブラリが準備し、シーケンスします。調査鶏胚組織のそれぞれの代表的な遺伝子座が表示されます: PAX7 (図 4 b); 周り HH19 SNT 鶏胚 H3K27me3 と H3K4me3 用プロファイル (i)(ii) HH22 鶏胚SNAI1 (図 4); 周りの上顎突起で H3K4me2 や H3K27ac のプロファイルTBX3/TBX5 軌跡 (図 4) 周り HH3 ステージ鶏胚における H3K27me3 (iii) プロファイル。これらチップ seq 実験が分かり、当社チップ プロトコルを使用して萌芽期ティッシュの広い範囲の生物材料の少量からエピゲノム プロファイルを生成できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56186/56186fig1.jpg"> 
図 1: 鶏の胚から分離した低豊富な胚サンプル チップ プロトコルの概要。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56186/56186fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56186/56186fig2.jpg"> 
図 2: SNT レーザーマイクロダイ セクション プロトコルの概要します。横の SNT セグメント HH19 鶏胚の上腕のレベルで切り離されています。トリプシン処理後は機械的に鉗子を使用して非神経組織を除去します。ない、脊索;SNT、脊髄神経管;そして、体節。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56186/56186fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56186/56186fig3.jpg"> 
図 3: 最適な超音波処理の例です。鶏 SNT HH19 サンプル 11 サイクル、30 s および、超音波発生装置を使用して「高」の振幅で 45 秒 OFF パルス超音波だった。クロスリンクが逆転した、精製した DNA は、1.5% の agarose のゲルに解決されました。200-500 跪くに至る 11 サイクル後最適なフラグメントのサイズを観察<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56186/56186fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56186/56186fig4.jpg"> 
図 4: チップ qPCR またはチップ シーケンスによるチップ解析の一例(A) H3K27me3 (左) と示された地域で H3K4me3 (右) レベルをチップ qPCR による HH19 ニワトリから分離された SNT セクションを用いて測定しました。SOX2 プロモーター領域の SNT でアクティブなと H3K4me3 によって H3K27me3 のではなく、したがってとしてマークSOX17 プロモーター領域の SNT でアクティブではないと H3K27me3 ではなく、H3K4me3; したがって濃縮されてChr6 ネガティブは鶏染色体 6 の遺伝子間領域を表します、ネガティブ コントロールとして機能します。誤差範囲は、3 つの技術的な複製から標準偏差を表しています。(マゼンタの H3K27me3、ブルー、H3K4me3 と赤で入力)、(B) のチップ seq PAX7 軌跡周り HH14 SNTs ニワトリ胚からのプロファイルが表示されます。(C) チップ seq (オレンジ色の H3K4me2、緑、H3K27ac、赤で入力) SNAI1 遺伝子座の周り HH22 のひよこの胚の上顎突起からプロファイルが表示されます。(D) チップ seq TBX3/TBX5 軌跡の周り HH3 ニワトリ胚から (マゼンタの H3K27me3) と赤で入力プロファイルが表示されます。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56186/56186fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56186/56186fig5.jpg"> 
図 5: チップ seq ライブラリ検証自動 RNA 品質管理システムを使用しての例です。(A) 前に自動化された RNA 品質管理システムで同じチップ seq ライブラリを行った、(B) プライマー二量体のクリーンアップの後。プライマー二量体は、(A) で弱い 〜 135 bp のバンドとして見なすことができます。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56186/56186fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>手順</td>
			<td>問題</td>
			<td>可能な理由</td>
			<td>ソリューション</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2,3,4 5 と 11</td>
			<td>QPCR チップやチップ seq によるとノイズ比低チップ信号</td>
			<td>組織の品質が損なわれます。</td>
			<td>冷たい条件でミクロ解剖を実行します。それ以外の場合、クロマチンの完全性が侵害されます。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>架橋サンプルの遠心分離後サンプル損失。</td>
			<td>10-20% 血清と繰り返し遠心分離のステップ DMEM 培地を使用し、10 分時間を増やします。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>架橋の期間です。</td>
			<td>架橋時間を最適化します。増加架橋回共活性剤と DNA に直接バインドしない共リプレッサーなどの特定のタンパク質の検出を促進できます。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS で洗浄によるサンプルの損失。</td>
			<td>洗浄する; の数を減らす1,500 × g で遠心分離手順を繰り返すことができます。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>長すぎるか短すぎる DNA サイズに最適な超音波。</td>
			<td>超音波照射条件を最適化する時間コース実験を実行します。200 から 500 に至るまで最適なフラグメント サイズ bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>抗体チップには適していません。</td>
			<td>内因性蛋白抗体が異なる、またはの外に表現された蛋白質 (例えばフラグ、HA) に追加されるタグ抗体を使用します。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>低または DNA の入力に対しても、qPCR でない信号</td>
			<td>最適なプライマー</td>
			<td>プライマー効率と特異性を確認します。新しいプライマーを設計します。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DNA の量が不足</td>
			<td>十分な原料。QPCR 反応ごとに使用される DNA の量を増やします。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
-ページ =「1」>表 1: プロトコルのさまざまな手順のトラブルシューティング ガイド。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>プライマー</td>
			<td>シーケンス</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2 F</td>
			<td>CCTTGCTGGGAGTACGACAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2 R</td>
			<td>GCCCTGCAGTACAACTCCAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX17 F</td>
			<td>CCCTGAACTGTCATGTGTGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX17 R</td>
			<td>CAAACAGTTGCCTTTGAGCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chr6-指定、総额-F</td>
			<td>CCGTCAATCTCTGCTTGTGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chr6-指定、総额-R</td>
			<td>TGGAATCTGCTTGTCACTGC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 2: チップ qPCR のプライマー シーケンス。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">週間</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>温度</td>
			<td colspan="2">時間</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95 ° C</td>
			<td colspan="2">5 分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">増幅</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>温度</td>
			<td colspan="2">時間</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95 ° C</td>
			<td>10 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 ° C</td>
			<td>10 s</td>
			<td>45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>72 ° C</td>
			<td>10 s</td>
			<td>サイクル</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">融解曲線</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>温度</td>
			<td colspan="2">時間</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95 ° C</td>
			<td colspan="2">5 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>65 ° C</td>
			<td colspan="2">1 分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">冷却</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ° C</td>
			<td colspan="2">30 s</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 3: チップ qPCR の PCR 条件です。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">初期変性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>温度</td>
			<td colspan="2">時間</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95 ° C</td>
			<td colspan="2">3 分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">増幅</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>温度</td>
			<td colspan="2">時間</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>98 ° C</td>
			<td>20 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 ° C</td>
			<td>15 s</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>72 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>サイクル</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">最終的な拡張</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>温度</td>
			<td colspan="2">時間</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>72 ° C</td>
			<td colspan="2">5 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">冷却</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 ° C</td>
			<td colspan="2">ホールド</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 4: PCR 条件チップ seq 図書館準備中に DNA のフラグメントの増幅。

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Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

ここでは、クロマチン免疫沈降 (チップ) と低豊富な鶏胚サンプルからグローバル エピゲノム プロファイルを生成するチップ seq ライブラリの準備のプロトコルについて述べる。

クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

chromatin-immunoprecipitation-chip-protocol-for-low-abundance

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

15.6K ビュー.  University of Cologne. ここでは、クロマチン免疫沈降 (チップ) と低豊富な鶏胚サンプルからグローバル エピゲノム プロファイルを生成するチップ seq ライブラリの準備のプロトコルについて述べる。

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Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous nature of most mammalian chromatin-modifying complexes. In order to overcome these hurdles, we have adapted a sequential salt extraction (SSE) assay for evaluating the relative binding affinities of chromatin-bound complexes. This easy and straightforward assay can be used by non-experts to evaluate the relative difference in binding affinity of two related complexes, the changes in affinity of a complex when a subunit is lost or an individual domain is inactivated, and the change in binding affinity after alterations to the chromatin landscape. By sequentially re-suspending bulk chromatin in increasing amounts of salt, we are able to profile the elution of a particular protein from chromatin. Using these profiles, we are able to determine how alterations in a chromatin-modifying complex or alterations to the chromatin environment affect binding interactions. Coupling SSE with other in vitro and in vivo assays, we can determine the roles of individual domains and proteins on the functionality of a complex in a variety of chromatin environments.

Sequential salt extraction of chromatin bound proteins is a useful tool for determining the binding properties of large protein complexes. This method can be employed to evaluate the role of individual subunits or domains in the overall affinity of a protein complex to bulk chromatin.

クロマチン複合体を変更するのプロパティをバインド一括クロマチンの分析の逐次塩抽出

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

遺伝学

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

クロマチン免疫沈降法を用いたc-KITリガンドプロモーターの解析

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

マウスT細胞株におけるクロマチン免疫沈降（ChIP）

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

ネイティブのクロマチン免疫沈降のヌクレオソーム密度解析ライブラリをシーケンスの生成

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

酵母からヒストン修飾のクロマチン免疫沈降 (チップ)

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

クロマチンのループ構造の再編を CRISPR 媒介

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

マウスの褐色脂肪組織のクロマチン免疫沈降

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

哺乳類細胞における微小コッカルヌクレアーゼを用いてクロマチン免疫沈殿アッセイ

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains

The organization and structure of chromatin domains are unique to individual cell lineages. Their misregulation might lead to a loss in cellular identity and/or disease. Despite tremendous efforts, our understanding of the formation and propagation of chromatin domains is still limited. Chromatin domains have been studied under steady-state conditions, which are not conducive to following the initial events during their establishment. Here, we present a method to inducibly reconstruct chromatin domains and follow their re-formation as a function of time. Although, first applied to the case of PRC2-mediated repressive chromatin domain formation, it could be easily adapted to other chromatin domains. The modification of and/or the combination of this method with genomics and imaging technologies will provide invaluable tools to study the establishment of chromatin domains in great detail. We believe that this method will revolutionize our understanding of how chromatin domains form and interact with each other.

A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains

This method is designed to follow formation of PRC2-mediated chromatin domains in cell lines, and the method can be adapted to many other systems.

クロマチンドメインのノボ形成を研究する方法

The organization and structure of chromatin domains are unique to individual cell lineages. Their misregulation might lead to a loss in cellular identity ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription factors, histone modifications, and other DNA-associated proteins. ChIP-seq data can also be used to find differential binding of transcription factors in different environmental conditions or cell types. Initially, ChIP was performed through hybridization on a microarray (ChIP-chip); however, ChIP-seq has become the preferred method through technological advancements, decreasing financial barriers to sequencing, and massive amounts of high-quality data output. Techniques of performing ChIP-seq with bacterial biofilms, a major source of persistent and chronic infections, are described in this protocol. ChIP-seq is performed on Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm and planktonic cells, targeting the master biofilm regulator, CsgD, to determine differential binding in the two cell types. Here, we demonstrate the appropriate amount of biofilm to harvest, normalizing to a planktonic control sample, homogenizing biofilm for cross-linker access, and performing routine ChIP-seq steps to obtain high quality sequencing results.

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

Chromatin immunoprecipitation coupled with next-generation sequencing (ChIP-seq) is a method used to establish interactions between transcription factors and the genomic sequences they control. This protocol outlines techniques for performing ChIP-seq with bacterial biofilms, using Salmonella enterica serovar Typhimurium bacterial biofilm as an example.

クロマチン免疫沈降とハイスループットシーケンシング(ChIP-seq)を用いたサルモネラバイオフィルムにおけるCsgD調節標的の発見

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...