ホワイトホール財団の資金援助に感謝します。貴重なコメントをいただいたSamuel T. Kissinger氏に感謝します。

<ol>
	<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+liposome+preparation+for+imaging+and+patch-clamp+electrophysiology.">Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo.">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).</li><li>Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MATLAB-based+automated+patch-clamp+system+for+awake+behaving+mice.">MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice.</a> J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+operation+of+the+autopatcher+for+automated+intracellular+neural+recording+in+vivo.">Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo.</a> Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+autopatching+with+automated+pipette+and+cell+detection+in+vitro.">Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro.</a> J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).</li><li>Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computer-assisted+multi-electrode+patch-clamp+system.">A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system.</a> J Vis Exp. (80), e50630 (2013).</li><li>Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+cell+patch+clamp+recording+performed+on+a+planar+glass+chip.">Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip.</a> Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. (20), (2008).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li><li>Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACQ4:+an+open-source+software+platform+for+data+acquisition+and+analysis+in+neurophysiology+research.">ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research.</a> Front Neuroinform. 8 (3), (2014).</li><li>Kolb, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning+patch-clamp+pipettes+for+immediate+reuse.">Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li></ol>

米国特許出願第15 / 353,719号（非特許文献2）は、2016年11月16日に出願された非暫定的特許出願である「バイロの自動イメージ誘導パッチクランプ電気生理学のためのシステムおよび方法」（Ref。番号：PRF 67270-02。

ここでは、インビトロで自動画像ガイドパッチクランプ記録のための方法を説明する。このプロセスの主要なステップを以下に要約します。まず、コンピュータビジョンを使用して、顕微鏡で取得した一連の画像を使用してピペットチップを自動的に認識させます。この情報は、次に、顕微鏡とマニピュレータ座標系との間の座標変換関数を計算するために使用される。コンピュータビジョンは、蛍光標識された細胞を自動的に検出し、それらの座標を同定するために使用される。これらのステップは、オープンソースのPythonプログラミング言語、PyQT、およびOpenCVライブラリを使用したピペットターゲティングと自動パッチ適用アルゴリズムと統合されています。 既存のインビトロパッチクランプ法と比較して、このシステムはいくつかの領域において顕著な改善を行う。人間の介入を最小限に抑えます。このシステムは、パッチクランプ実験のほとんどのステップを自動化し、req人間の介入のための欲求。低/高倍率顕微鏡レンズの切り替えを含む、残りの手動ステップの一部は、追加の電動ハードウェアを使用して自動化することができます。 パッチクランプ法はスループットを向上させます。このシステムを使用したパッチクランプ実験は、試行ごとに高い成功率と短い時間を達成し、全体のスループットを大幅に向上させました。蛍光細胞検出およびピペットチップ検出のコンピュータビジョンアルゴリズムは非常に堅牢であり、エラー率は非常に低かった。ピペットチップ検出の平均誤差は1.6μmであり、蛍光細胞検出の偽陽性率は4.9％±2.25％であった。従来の手動パッチと自動パッチの詳細な比較が行われました6 。 実験の詳細な文書化が可能です。各試行のパッチログを保存し、 事後分析することができます。そのような詳細な以前のマニュアルによるパッチ適用では利用できませんでした。これにより、独自の実験条件、細胞型、種およびスライス調製におけるパッチ試験の系統的分析が可能になる。 この方法は、標準のインビトロパッチクランプ装置との互換性を示す。この原稿で示されているように、私たちのシステムは、既存のインビトロパッチクランプリグを増強し、自動パッチ適用の能力を与えるように設計されています。平面パッチのアプローチとは異なり、このシステムは、手作業によるパッチクランプを行っているラボで、機器を最小限のコストで変換するのに適しています。同時に、同じシステムを使用して手動または半自動的にパッチを適用するオプションがあります。 上記のシステムの適応性のために、ハードウェアの接続とソフトウェアの構成は、システムを初めてセットアップするときに実験者が必要とします。問題が生じる可能性があります特定のハードウェアを制御するための不適切なポート割り当てと不適切なドライバライブラリから発生します。トラブルシューティングを行う場合は、手順1.2〜1.4を参照してください。 既存のシステムの部分的自動化と比較して、このシステムは、従来の急性脳スライス（および他のインビトロ調製物）のインビトロパッチクランプにおいて最大レベルの自動化を実現する。これは図7に示すように 、11パッチにセル検出からピペット校正に、すべてのステップについても同様です。唯一のボトルネックは、パッチピペットを塗りつぶし、変更する手作業のプロセスです。パッチピペットの再使用における最近の進展は、この問題を潜在的に解決する可能性があります12 。スライス準備の質に加えて、失敗した試行の最も一般的な理由は、マニピュレータの機械的誤差とチャンバ内のスライスの動きに起因します。これらの制限は、現在のシステム。この問題を説明するために、閉ループのリアルタイムの検出およびピペットの動きの制御を実施する努力がなされている。 将来の発展のために、我々は現在の蛍光細胞検出能力をDIC光学系の一般的な細胞検出に拡張することに興味がある。

パッチクランプ技術は、興奮性膜のイオンチャンネルを研究するために1970年代にNeherとSakmannによって最初に開発されました1 。それ以来、パッチクランプは、ニューロン、心筋細胞、アフリカツメガエル卵母細胞、人工リポソームを含む多くの異なる細胞タイプにおいて、細胞、シナプスおよび回路レベル（ インビトロおよびインビボの両方） で多くの異なる被験者の研究に適用されている2 。このプロセスは、細胞の正確な同定および標的化、細胞に近接してパッチピペットを動かすための複雑なマイクロマニピュレーター制御、適切な時間に陽圧および陰圧をピペットに適用して緊密なギガシールパッチを確立すること、セル全体のパッチ構成を確立するためのブレークインなどがあります。パッチクランプは、通常は手作業で行われ、マスタリングには大規模なトレーニングが必要です。パッチを経験した研究者であってもクランプ、成功率は比較的低いです。より最近では、パッチクランプ実験を自動化するためのいくつかの試みがなされている。自動化を達成するために2つの主要な戦略が進化しました。標準的なパッチクランプ装置を増強して、パッチ適用プロセスの自動制御と、新しい装置と技術の設計を根本から行いました。前者の戦略は、既存のハードウェアに適応可能であり、 インビボブラインドパッチクランプ3、4、5、急性脳切片のin vitroでのパッチクランプ、器官型スライス培養物を含め、パッチクランプ種々の用途に使用することができ、培養解離ニューロン6 。これは、複数のマイクロマニピュレータを同時に使用することにより、複雑なローカル回路の照会を可能にします7 。平面パッチ法は、新しい開発戦略の一例であり、高スループットの同時p薬物スクリーニング目的のための懸濁液中の細胞のクランプクランプ8 。しかしながら、平面パッチ法は、全ての細胞型、特に、長いプロセスを有するニューロンまたは広範な接続を含むインタクトな回路には適用できない。これは、従来のパッチクランプ技術の重要な利点である、神経系の複雑な回路をマッピングすることへのその適用を制限する。 我々は、標準的なパッチクランプハードウェアを増強することにより、手動パッチクランププロセスをインビトロで自動化するシステムを開発しました。当社のシステムであるオートパックャーIGは、自動ピペット校正、蛍光細胞標的同定、ピペット移動の自動制御、自動全細胞パッチ、およびデータロギングを提供します。このシステムは、異なる深さの脳スライスの複数の画像を自動的に獲得することができる。コンピュータビジョンを使ってそれらを分析する。蛍光標識された細胞の座標を含む情報を抽出する。この情報は、目的の細胞を標的とし、自動的にそれをパッチするために使用される。このソフトウェアは、いくつかのオープンソースライブラリを使用して、無料のオープンソースプログラミング言語であるPythonで書かれています。これにより、他の研究者へのアクセシビリティが確保され、電気生理学実験の再現性と厳しさが向上します。このシステムはモジュラー設計を採用しているため、追加のハードウェアをここで示した現在のシステムと容易にインターフェースすることができます。

<table width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">CCD Camera</td>
			<td style="width:115px;">QImaging</td>
			<td style="width:147px;">Rolera Bolt</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="width:231px;height:101px;">Electrophysiology rig</td>
			<td style="width:115px;">Scientifica</td>
			<td style="width:147px;">SliceScope Pro 2000</td>
			<td style="width:256px;">Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is &#8220;Linlab2&#8221;.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Amplifier</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:147px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:256px;">computer-controlled microelectrode amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Digitizer</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:147px;">Axon Digidata 1550</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="width:231px;height:55px;">LED light source</td>
			<td style="width:115px;">Cool LED</td>
			<td style="width:147px;">pE-100</td>
			<td style="width:256px;">488nm wavelength</td>
		</tr>
		<tr height="98">
			<td height="98" style="width:231px;height:98px;">Data acquisition board</td>
			<td style="width:115px;">Measurement Computing</td>
			<td style="width:147px;">USB1208-FS</td>
			<td style="width:256px;">Secondary DAQ. 
			See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">Solenoid valves</td>
			<td style="width:115px;">The Lee Co.</td>
			<td style="width:147px;">LHDA0531115H</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Air pump</td>
			<td style="width:115px;">Virtual industry</td>
			<td style="width:147px;">VMP1625MX-12-90-CH</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Air pressure sensor</td>
			<td style="width:115px;">Freescale semiconductor</td>
			<td style="width:147px;">MPXV7025G</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Slice hold-down</td>
			<td style="width:115px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:147px;">64-1415 (SHD-40/2)</td>
			<td style="width:256px;">Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Python</td>
			<td style="width:115px;">Anaconda</td>
			<td style="width:147px;">version 2.7 (32-bit for windows)</td>
			<td style="width:256px;">https://www.continuum.io/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:231px;height:20px;">Screw Terminals</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:115px;height:41px;">Sparkfun</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:147px;height:41px;">PRT - 08084</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:256px;height:41px;">Screw Terminals 3.5mm Pitch (2-Pin)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">(2-Pin)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">N-Channel MOSFET 60V 30A</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM - 10213</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="75">
			<td height="75" style="width:231px;height:75px;">DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-07937</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">LED - Basic Red 5mm</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM-09590</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">LED - Basic Green 5mm</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM-09592</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="99" style="width:231px;height:99px;">DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-12748</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="99" style="width:231px;height:99px;">Wall Adapter Power Supply - 12VDC 600mA</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">TOL-09442</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="159">
			<td height="159" style="width:231px;height:159px;">Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-11367</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="75">
			<td height="75" style="width:231px;height:75px;">Locking Male x Female X Female Stopcock</td>
			<td style="width:115px;">ARK-PLAS</td>
			<td style="width:147px;">RCX10-GP0</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="width:231px;height:77px;">Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings</td>
			<td style="width:115px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:147px;">14-171-129</td>
			<td style="width:256px;">Outer Diameter: 1/8 in. 
			Inner Diameter: 1/16 in.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">BNC male to BNC male coaxial cable</td>
			<td style="width:115px;">Belkin Components</td>
			<td style="width:147px;">F3K101-06-E</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">560 Ohm Resistor (5% tolerance)</td>
			<td style="width:115px;">Radioshack</td>
			<td style="width:147px;">2711116</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">Picospritzer</td>
			<td style="width:115px;">General Valve</td>
			<td style="width:147px;">Picospritzer II</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices

全細胞パッチクランプは、単細胞の電気的特性を測定する金標準的な方法です。しかし、 インビトロパッチクランプは、その複雑さおよびユーザの操作および制御への高い依存性のために、依然として困難で低スループットの技術である。この原稿は、急性脳スライスにおけるin vitro全細胞パッチクランプ実験のための画像ガイド自動パッチクランプシステムを実証しています。我々のシステムは、蛍光標識された細胞を検出し、マイクロマニピュレーターおよび内部のピペット圧力制御を用いた完全自動パッチングのためにそれらを標的にするコンピュータビジョンベースのアルゴリズムを実施する。プロセス全体は高度に自動化されており、人間の介入に対する必要条件は最小限に抑えられています。電気抵抗および内部ピペット圧力を含むリアルタイムの実験情報は、将来の分析および異なる細胞タイプへの最適化のために電子的に文書化されている。我々のシステムは、急性のbraiの文脈で記述されているn個のスライスレコーディングのために、解離ニューロン、器官型スライス培養物、および他の非ニューロン細胞タイプの自動画像誘導パッチクランプにも適用することができる。

<html>我々のシステムは、急性脳スライス、ニューロンに分化したマウス誘発多能性幹細胞（iPSC）、および関心のあるチャネルを人工的に発現するHEK293細胞に細胞をパッチする能力に関して試験されている。 図3は、視覚野における蛍光標識層5ピラミッドニューロンを標的とするThy1-ChR2-YFPトランスジェニックマウス（B6.Cg-Tg（Thy1-COP4 / EYFP）18Gfng / J）を用いた実験を示す。標的細胞は、自動的に同定された緑色蛍光陽性細胞の1つであった（ 図3b ）。 図3aは、パッチされたニューロンの差分干渉コントラスト（DIC）画像である。全細胞構成は、ステップ2.5〜2.6での自動パッチ適用プロトコルによって達成され、ステップ電流注入誘発活動電位によって検証された（ 図3c ） 1 &quot;&gt;追加の「コマンドシーケンス」機能を実証するために、我々は、細胞にパッチを当てながら脳スライス上の3つの位置に500mMのKClを200ms送達した（ 図4 ）。 &quot;Memory1&quot;のGUIに保存された座標は、 &quot;Unit1&quot;の下の &quot;Command Sequence&quot; GUIにロードされました。これはKCl-左の列にコマンドを設定して、+ 5VのTTL信号を500ms、続いて0Vを10秒間（ 図4a ）、セカンダリDAQボードのポートAチャネル0から、 図4cは、パッチされた細胞が通常のスパイキングニューロンであることを示している。薬物適用ピペット（ユニット1）は、3つの選択された位置を横断した。（ 図4b ）、電圧クランプ下で各アプリケーションごとに10秒を記録しました（ 図4d ）。 図4dのトレースの色は、 図4bの境界色に対応する。 KClが細胞に吹き出されると、大きな内向きの電流が観察され、KClが拡散するにつれて徐々に減少した。赤色蛍光色素をKCl溶液に加えて、薬物送達の空間分布を示し、DICとエピ蛍光造影とを組み合わせて画像化した。この実験では、TTL信号によるマニピュレータ/顕微鏡の動きと外部ハードウェアを制御するためのシステムの容易さと柔軟性が示されました。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig1.jpg" /> 図1.圧力制御ユニット。 A：バルブを接続するプリント回路基板（PCB）、圧力センサー、エアーポンプなどがあります。左側には、プロトコルに記載されている出力のラベル付け位置を示すPCBの詳細が表示されます。右側には、PCBとエアポンプ、USBポート、および配管の接続が示されています。 B： PCBの回路マップ。 <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56010/56010fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig2.jpg" /> 図2.オートパッチャーのGUIプロトコルに記載されているボタンは、赤い四角で示され、番号が付けられています。 1：キャリブレーションの開始、2：キャリブレーションの保存、3：キャリブレーションのロード、4：セカンダリキャリブレーション、5：セルの検出、6：パッチコントロール、7：ターゲットセル座標の移動、8：パッチ。 <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56010/56010fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください</a>。 <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig3.jpg" /> 図3.パッチを当てたChR2-YFP陽性細胞の例。 A： DIC光学系で倍率40倍。 B：パネルAの同じ細胞のエピ蛍光画像（488nmでのLED照明）。 C：一連の過分極および脱分極段階電流注入中のパッチされた細胞からの電流クランプ記録。 <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56010/56010fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig4.jpg" /> 図4.自動薬物送達実験の実施 A： 「Command Sequence」GUIにロードされた選択された場所。左の列には座標のリスト、および右の列は、各位置のTTL信号の形式でのコマンドのリストを示す。 B： 3つの選択された場所に対応する薬物適用実験中のスクリーンショット。ユニット1はKCl含有ピペットであり、ユニット2はパッチピペットであった。 KCl溶液を赤色蛍光色素と混合して可視化した。画像はDICと蛍光イメージングを組み合わせて得た。 C：通常のスパイクニューロンを示す電流注入をステップする。 D： 3ヶ所の500mM KCl溶液の局所適用による電圧クランプ記録のトレース。 KCl適用がパッチされた細胞の近くにあったときに、内向き電流を伴う赤いトレースが試験から記録された。赤い矢印は、KCl適用のタイミングを示します。 <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56010/56010fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <table border="1"fo：keep-together.within-page = &quot;1&quot; fo：keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> PCB上のアウトレット </td><td> DAQボード上のポート名 </td><td> DAQボード上のポート番号 </td><td> リマーク </td></tr><tr><td> DOUT V1 </td><td>ポートAチャネル1 </td><td> 22 </td><td>コントロールバルブ1 </td></tr><tr><td> DOUT V2 </td><td>ポートAチャネル2 </td><td> 23 </td><td>コントロールバルブ2 </td></tr><tr><td> DOUT P </td><td>ポートAチャネル3 </td><td> 24 </td><td>コントロールエアポンプ</td></tr><tr><td> Gr </td><td>接地</td><td> 29 </td><td>接地</td></tr></tbody></table> 表1.プリント回路基板（PCB）と二次データ集録（DAQ）ボードの接続構成。このテーブルを使用して、PCB出力（最初の列は左から）をDAQボードのポート（左から2番目の列）。セカンダリDAQのポート名と番号はシングルエンドモードを指します。 <img alt="表2" src="/files/ftp_upload/56010/56010table2.jpg" /> 表2圧力制御ユニットからピペットホルダーへのチューブ接続。接続ごとに、灰色のボックスで強調表示された対応するポートを軟質チューブ（ 表の表を参照）を使用して接続します。

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Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

このプロトコルは、標準的なインビトロ電気生理学装置用に最近開発されたシステムを用いて自動画像ガイドパッチクランプ実験を行う方法を説明している。

脳スライスにおけるニューロン研究のための自動画像誘導パッチクランプの応用

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K ビュー.  Purdue University. このプロトコルは、標準的なインビトロ電気生理学装置用に最近開発されたシステムを用いて自動画像ガイドパッチクランプ実験を行う方法を説明している。 

ビデオ: Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
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Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

NRCCパッチクランプチップ上で細胞の培養と電気生理学

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

神経科学

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

パッチクランプキャパシタンス測定とCa 2 +</sup網膜スライスにおける単一神経終末で>イメージング

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent neuropsychiatric disorder that stems from the biophysical and cellular actions of nicotine on nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) throughout the central nervous system. Understanding the various nAChR subtypes that exist in brain areas relevant to nicotine addiction is a major priority.
Experiments that employ electrophysiology techniques such as whole-cell patch clamp or two-electrode voltage clamp recordings are useful for pharmacological characterization of nAChRs of interest. Cells expressing nAChRs, such as mammalian tissue culture cells or Xenopus laevis oocytes, are physically isolated and are therefore easily studied using the tools of modern pharmacology. Much progress has been made using these techniques, particularly when the target receptor was already known and ectopic expression was easily achieved. Often, however, it is necessary to study nAChRs in their native environment: in neurons within brain slices acutely harvested from laboratory mice or rats. For example, mice expressing "hypersensitive" nAChR subunits such as &alpha;4 L9&prime;A mice 1 and &alpha;6 L9&prime;S mice 2, allow for unambiguous identification of neurons based on their functional expression of a specific nAChR subunit. Although whole-cell patch clamp recordings from neurons in brain slices is routinely done by the skilled electrophysiologist, it is challenging to locally apply drugs such as acetylcholine or nicotine to the recorded cell within a brain slice. Dilution of drugs into the superfusate (bath application) is not rapidly reversible, and U-tube systems are not easily adapted to work with brain slices.
In this paper, we describe a method for rapidly applying nAChR-activating drugs to neurons recorded in adult mouse brain slices. Standard whole-cell recordings are made from neurons in slices, and a second micropipette filled with a drug of interest is maneuvered into position near the recorded cell. An injection of pressurized air or inert nitrogen into the drug-filled pipette causes a small amount of drug solution to be ejected from the pipette onto the recorded cell. Using this method, nAChR-mediated currents are able to be resolved with millisecond accuracy. Drug application times can easily be varied, and the drug-filled pipette can be retracted and replaced with a new pipette, allowing for concentration-response curves to be created for a single neuron. Although described in the context of nAChR neurobiology, this technique should be useful for studying many types of ligand-gated ion channels or receptors in neurons from brain slices.

In this paper, we describe a useful method to study ligand-gated ion channel function in neurons of acutely isolated brain slices. This method involves the use of a drug-filled micropipette for local application of drugs to neurons recorded using standard patch clamp techniques.

マウスの脳スライスにおけるニコチン性アセチルコリン受容体機能を研究するための薬物のローカルアプリケーション

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

の感覚ニューロンの分離<em&gt;アメフラシカリフォルニ</em&gt;グルタミン酸作動電流のパッチクランプ記録のために

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

コンピュータ支援多電極パッチクランプシステム

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

黒質ドーパミンニューロンの細胞体樹状突起のドメインからの亜細胞パッチクランプ記録

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug application during electrophysiological recording is the puff technique, which can be used to study the effect of pharmacological reagents on neuronal activities in brain slices. The greatest advantage of puff application is that the drug concentration around the recording site increases rapidly, thus preventing desensitization of membrane receptors. Successful use of puff application involves careful attention to the following elements: the concentration of the drug, the parameters of the puff micropipette, the distance between the tip of a puff micropipette and the neuron recorded, and the duration and pressure driving the puff (pounds per square inch, psi). This article describes a step-by-step procedure for recording whole-cell currents induced by puffing gamma-aminobutyric acid (GABA) onto a neuron of a prefrontal cortical slice. Notably, the same procedure can be applied with minor modifications to other brain areas such as the hippocampus and the striatum, and to different preparations, such as cell cultures.

We describe the puff technique, by which pharmacological reagents can be administered during whole-cell patch-clamp recording, and highlight various aspects of the features that are crucial for its success.