R. b. は、サール学者プログラム、大戦スミス財団 (C1404) および (1-年度-15-344) ・ ダイムズ財団の 3 月によって支えられました。:Wii は、NIH からのサポートは R01GM110174 と NIH の R01AI118891 を付与し、DOD、BC123187P1 を付与を認めています。R. W. T.NIH のトレーニングの許可 T32GM008216 によって支えられました。

1。 文化と mESCs の拡大 注: マウス胚性幹細胞は文化に手軽な高速サイクリング時間のおかげで生化学的な実験に必要な大量に迅速に展開できます。健康 mESCs ダブルすべての 12 h.
37 ° c、5% CO 2、ティッシュ文化のインキュベーターで <ol><li>mESC 糊板に希望の番号を mESCs を展開中 (下記参照) を保持し、&#62; 湿度 95% 。
	注: 十分なプレートは、3-5 生物複製しのために準備されるべき、+ 4SU サンプルと 4SU コントロール。1 つ 10 cm プレート (すなわち 500 万セル) で各生物の複製よりも十分です</li>。
	<li>MESCs のための媒体はダルベッコから成る &#39; s 変更イーグル &#39; ペニシリン/ストレプトマイシン、1 x 非本質的なアミノ酸、100 μ M β-メルカプトエタノール、1,000 U x 0.5 15% ウシ胎児血清 (FBS)、2 mM L-グルタミンを添加した s 培地 (DMEM)/mL の白血病抑制因子 (LIF) 3 μ M CHIR99021、1 μ M PD0325901</li>。
	<li>MESCs を通過、前に 10 cm 板の必要な数を準備します。
	<ol><li>プレートの表面全体が覆われているかどうかを確かめる水に 4 mL 0.1% ゼラチンを追加 (RT) 室温で 10 分間インキュベート; ゼラチン溶液を削除します</li>。
	</ol></li> <li>通路の細胞に達するとプレートあたり 1000 万セル通常接種 ~ 48 h 。
	注: mESCs は、密なコロニーが大きくなるとプレートことはできません単分子膜 (例えば HEK293 または 3T3 細胞) における成長細胞の観察、100% の confluency に到達します。MESC プレートは ~ 50% コンフルエントと媒体の前に間違いなく黄色に変わったら継代する必要があります。
	<ol>細胞をデタッチする <li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2 mM EDTA を添加した x 1 に一度密 mESC 文化とプレートを洗う DMEM に溶解した 0.05% トリプシンを追加し、5 分のためのインキュベーターにプレートを返す (37 ° C、5% CO 2 と &#62; 95%湿度).</li>
		<li>インキュベーターからプレートを削除し、上下に精力的に数回ピペッティングによる DMEM の等量と細胞を再懸濁します、</li>。
		<li>検定を使用してセルをカウントし、単一細胞懸濁液を細胞に形成を確保する (すなわち クラスターがありません)、セルの混合物 500 x g 室温で 5 分間遠心分離します。上清を除去し、1-2 の mL DMEM で細胞ペレットを再懸濁します</li>。
		<li>MESC 培地 (すなわち 〜 800,000 10 cm プレートごとのセル) で 10,000 のセル/cm 2 の密度で細胞を接種する 1.3.1 準備したゼラチン コーティング プレートを使用しています</li>。
	</ol></li></ol> 2。タンパク質の架橋 &#8211; 生細胞における RNA 相互作用 注: RNA タンパク質架橋は、写真アクティブ化可能なリボヌクレオシド アナログ 4-thiouridine (4SU) によって媒介される 4SU は内因性よりも長い吸光度の最大値。ヌクレオチド RNA; だけに組み込むことが、したがって中間波長の UVB は、選択的に架橋 RNA 蛋白質 25 , 26 を使用できます。4SU を含む RNA とアミノ酸、Tyr の報告された好みの共有結合性の架橋につながる 4SU 処理細胞の UVB 治療 Trp、Met、リシン、およびシステイン 27。
<ol><li>に記載されているステップ 1 として必要な数 10 cm プレートを展開 mESCs. 
	注: 十分なプレートは、3-5 生物複製しのために準備されるべき、+ 4SU サンプルと 4SU コントロール。1 つ 10 cm プレート (すなわち 500 万セル) はそれぞれの生物の複製のために十分</li>。
	<li>プレートの confluency に到達、前に 500 の最終的な集中に媒体に直接 4SU を追加 μ m 残す - 未処理の 4SU 制御料理</li>。
	<li>配布中で均一 4SU に優しく振るプレート。2 時間同じ培養孵卵器にそれらを返す (37 ° C、5% CO 2 と &#62; 湿度 95%).</li>
	<li>氷のバケツにプレートを転送し、媒体を破棄します</li>。
	<li>リンス 5 mL の氷冷 PBS で軽く板 。
	注: リンス優しくまたはセル可能性がありますデタッチします</li>。
	<li>は紫外線発光電球搭載架橋剤で蓋なし氷冷 PBS と場所のプレートの 2 mL を追加 (312 nm)。1 J/cm 2 のエネルギー設定で板の照射します 。
	注: プラスチック蓋が削除されますまたは彼らが紫外線から細胞を守るかもしれないし、架橋を防ぐことが重要です</li>。
	<li>は、セルは、リフターを使用して細胞を収集し、氷冷 PBS の円錐管に転送。2,000 x g で 4 ° C、5 分間遠心</li>
	<li>上澄みを除去し、2 mM EDTA、0.2 mM 特異のフッ化物 (PMSF) 5 mL 氷冷 PBS で細胞ペレットを再懸濁します</li>。
	<li>診断のセルを数える。それぞれ 10 cm と 15 cm のプレートから 5-10 と 1000 万の細胞を期待します</li>。
	2,000 x g で 4 ° C、5 分間遠心する <li> 
	注: 播種細胞すぐ使用できますステップ 3 のまたは液体窒素でフラッシュ凍結でき無期限に-80 ° C で保存します。これは潜在的なポイントを停止します</li>。
</ol> 3。核の隔離 注: 核は細胞質蛋白質を削除および核蛋白質のカバレッジを高めるから切り離されています。この手順は、別の細胞コンパートメントに Rbp を勉強する細胞分別の他の形態と置き換えることができます。
<ol><li>準備氷冷バッファー (10 mM トリス塩酸 pH 7.9, 4 ° C、MgCl 2、1.5 mM 10 mM KCl)。(カウント 2.9 の手順で) 1000 万の細胞あたり少なくとも 2.5 mL、抽出に使用します 。
	注: バッファー A の在庫 (例えば 500 mL のボトル) することができます事前に準備、6 ヶ月のための 4 ° C で保存します。
	<li>使用前に 0.5 mM ジチオトレイトール (DTT) と 0.2 mM PMSF 冷たいバッファー A. の希望の金額 (1000 万セルあたり 2.5 mL) を追加</li> <ol>
	</ol></li> <li>1000 万セルあたり 2 mL バッファー A を使用してセルを洗浄します。4 ° C で 5 分間 2,500 x g でスピン</li>
	<li>破棄清追加バッファー オクチル フェノキシ polyethoxy エタノールなど、非イオン性、非変化洗剤の 0.2% を添加した A (材料の表 を参照)、1000 万セルごと 500 μ L。4 ° C で 5 分間回転</li>
	<li>2,500 x g で 5 分間遠心分離</li>
	上澄みを除去 <li>; ペレット細胞質を欠いてそのまま核で構成されています 。
	注: 核することができます手順 4 または液体窒素でフラッシュ凍結のためすぐに使用し、無期限に-80 ° C で保存します。これは潜在的なポイントを停止します</li>。
</ol> 4。核の溶解 注: 架橋核タンパク質とタンパク質・ RNA 複合体を解放する質量分析法と互換性のあるバッファーで分離が。
<ol><li>追加換散バッファー (9 M 尿素、100 mM トリス塩酸 pH 8.0、24 の ° C)、1000 万セルあたり 200 μ L。1/8 を使用してクロマチンをせん断する超音波 &#34; 5-10 の 50% 振幅設定でプローブ</li>
	ペレットを避けるために清の <li>スピン 12,000 × g で 5 分で収集 175 μ L. 
	注: RBR ID、次の手順のため 100 μ L が使用され、後で使用および/または西部のしみの分析-80 ° C でライセートの残り 75 μ L を格納できます</li>。
	<li>ブラッドフォードの試金または類似の技術 28 を介して測定蛋白質の集中。1 mg/mL に異なるサンプルの蛋白質の集中または換散バッファーの適切な量を使用して最低のサンプル濃度を希釈します 。
	注: 1000 万 mESCs の核から蛋白質の 100-200 μ g を期待します</li>。
</ol> 5。トリプシンの消化力 注: ペプチド s を生成するタンパク質が消化されてルータ ボトムアップ型質量分析法 (MS) 分析のために適しています。
<ol><li>室温 1 時間孵化させなさい核溶解 (5 mM 最終); に DTT の追加ソリューション</li>
	<li>新鮮な在庫 (最終的な 14 mM) からヨードアセトアミドを追加; 暗闇の中室温で 30 分間インキュベートします</li>。
	<li>5 倍量の 50 mM NH 4 HCO 3 lysate Dilute</li>
	<li>トリプシンを追加 (μ g タンパク質: μ g トリプシン = 200:1); 37 ° C で一晩インキュベートします</li>。
</ol> 6。ペプチドの脱塩 <ol><li>サンプルあたり 1 つのカスタムメイド ステージ先端の準備します。
	<ol><li>6.1.1 200 μ l ピペット チップの底に固相抽出 C18 材料のディスクを配置します。</li>。
		<li>追加 50 μ L オリゴ R3 の逆相 C18 ディスク上に樹脂になります。遠心分離アダプターの内部ステージ ヒントと場所の先端 1.5 mL および microfuge の管の内部アダプターを配置します</li>。
		<li>追加 100 μ L 100% アセトニ トリルを洗うのヒントに。溶媒を削除する 1 分 1000 × g で遠心する</li>。
		<li>Equilibrate 50 μ L 0.1% トリフルオロ酢酸 (TFA)。1000 × g で 1 分間遠心</li>
	</ol></li> <li>100% ギ酸を 2-3 に pH が低下する消化された蛋白質のサンプルに追加します 。
	注: これは希釈ペプチド試料 1 mL あたり 〜 5 μ L 必要が、pH は測定しよりギ酸の追加をする必要があります必要に応じてします</li>。
	<li>特注ステージ ヒント、1000 × g で遠心するサンプルのすべてまで 1 分の上にサンプルをロードし先端を通過します</li>。
	<li>洗浄結合ペプチドの 50 μ L 0.1 %tfa。1000 × g で 1 分間遠心</li>
	<li>50 μ L の溶出バッファーを追加してペプチドの溶出 (75% アセトニ トリル、0.025 %tfa) ステージの先端と先端から溶出バッファーを強制的に 1 分 1000 × g で遠心する</li>。
	<li>乾燥 150 x g と 1 のための 1-3 kPa で設定真空遠心分離機を使用してサンプル 
	注: 乾燥ペプチドが-80 ° C で不明確に保存されます。これは潜在的なポイントを停止します</li>。
</ol> 7。架橋 RNA の除去 注: 架橋 RNA を削除するヌクレアーゼのペプチドを扱う。
<ol><li>50 μ L 2 ヌクレアーゼ バッファー (100 mM NH 4 HCO 3、4 mM MgCl 2) x でペレットを再懸濁します</li>。
	280 吸光度を用いた <li>メジャー ペプチド濃度 1 の A 280 のペプチドの 1 mg/mL と仮定すると nm 。
	注: 予想される濃度が 1 mg/mL</li>。
	<li>すべてのサンプル 1 mg/mL、ヌクレアーゼ バッファー x 2 を使用して最低の濃度を調整します</li>。
	<li>50 μ L H 2 O + 1 μ L 高純度ヌクレアーゼのマスター ミックスを調製 (&#8805; 250 U) (材料の表 を参照してください) サンプルあたり</li>。
	<li>ペプチドのサンプルの 50 μ L を取り、50 μ L H 2 O の + ヌクレアーゼ マスター ミックスを追加します</li>。
	1 h. 質量分析を実行する続行の 37 ° C に加温 <li>. 
	注: ペプチッドは質量分析の準備が整いました。彼らは、すぐに解析または無期限に-80 ° C で保存できます。これは潜在的なポイントを停止します</li>。
</ol> 8。ナノ液体クロマトグラフィー、質量分析法、および Raw データ現像処理 注: 4SU 架橋ペプチドの質量が変更されるため、イオンはカウントされません非架橋ペプチドの強度 LC ・ MS/MS 中、したがって、架橋によって減るべきなら表示されます。程度と減少の一貫性の各ペプチド 24 タンパク質-RNA 架橋度を反映している。
<ol><li>次のようにバッファーの準備高速液体クロマトグラフィー: HPLC 級水 (バッファー A) の 0.1% ギ酸; 高速液体クロマトグラフィー用アセトニ トリル (バッファー B) の 0.1% ギ酸</li>。
	<li>ナノ高速液体クロマトグラフィーが利用できない場合は以下の仕様のナノ列を接続: 内部直径 75 μ m 充填 C18 AQ 粒子; 長さ 20-25 cm 。
	注: 高速液体クロマトグラフィーを利用できる高い流動度で実行されている場合は、指定された流量の適切な列サイズを使用します。高い流れクロマトグラフィー感度が低下します</li>。
	<li>は高速液体クロマトグラフィー法を次のようにプログラム: フロー レート 250 300 nL/min; 2 から 120 分で 80 %b 次の 5 分、10 分のイソクラティック 80% B 28 から 28% バッファー B へのグラデーション 
	注: HPLC に自動列の平衡事前サンプル読み込みがあるない場合プログラムを起動 0 %b で 10 分間のサンプルをロードする前にします</li>。
	<li>は、MS 獲得手法として標準的な散弾銃プロテオミクス実験データ依存型獲得 (DDA) を実行するプログラムします。楽器デューティ サイクル タンデム MS スキャン (MS/MS) 信号の最も激しいの MS フルスキャンを代替する必要があります。最適な設定を使用して、実行する MS プロテオミクス 。
	注: 自信を持って結果を得るのため、少なくとも完全 MS を実行できます使用楽器は高解像度モード (例えば orbitrap、飛行時間) でスキャンします。正確な定量化のためフルスキャン MS 間の間隔は、もはやよりも 3 s. 長くデューティ ・ サイクルは、抽出したイオンのクロマト グラムの正確な定義をできない可能性があることを確認します</li>。
	<li>は、HPLC カラムにサンプルの 1-2 μ g を読み込み、プログラム、高速液体クロマトグラフィー/タンデム質量メソッドを実行します。各生物の複製のために少なくとも 2 つの独立した実行し、技術的複製を扱う</li>。
	<li>後 MS は、MS/MS スペクトル同定及び抽出したイオンクロマトグラフィーによるペプチド定量化のプロテオミクス ソフトウェア パッケージに raw ファイルをインポートします。複数のクロマト グラフの配置を実行することができますソフトウェア パッケージをお勧めします MS (参照 材料表) 29 , 30 を実行します</li>。
	<li>オプションのソフトウェア スイートで利用可能な場合を有効にする &#34; マッチの間実行 &#34; データ処理を開始する前にします</li>。
	<li>分析が完了すると、定量値と共にペプチド リストをエクスポートします</li>。
</ol>

<ol>
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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+U1+snRNP,+a+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle,+reveals+the+mechanism+of+5'+splice+site+recognition.">Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5' splice site recognition.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins.">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

MESCs と、4SU の RNA を組み込むことができます任意のセルに、適切な修正と RBR ID を実行する詳細な実験的プロトコルについて述べる。他の細胞型は、十分な信号対雑音比を確実にとる方法の最適化を必要があります。さらに、プロトコルは、核 Rbp の検討に焦点を当ててを記載、一方 RBR ID 技術は異なる分別法による細胞質または特定の細胞小器官などの異なる細胞コンパートメントに容易に適応する必要があります。戦略。最適化が必要な可能性がありますパラメーターは、UV 架橋のエネルギーと同様、4SU の濃度と時間に含まれます。これらのパラメーターは、RNA タンパク質クロスリンクの効率的な形成を確保し、良好な信号対雑音比をもたらすに重要です。312 nm 紫外線光は、365 と比較して 4SU を含む Rna タンパク質架橋ではるかに効率的な示されている nm パー クリップ32で通常使用される UVA。312 と RBR ID の比較を直接 nm、365 nm を発揮する 312 nm UVB は知られている Rbp24の大部分の特定につながった。
プロテオーム全体 RBP の識別を実行する他の 2 つの方法があります。1 つは、RBDmap と呼ばれる、UV 架橋を利用して、Rbp を識別するために使用されたさん RBDmap で RBR ID に似ているし、HeLa 細胞23RNA 結合活動をマップします。このメソッドは RNA 結合部位に隣接するペプチドの正の識別に依存している、2 つ連続したオリゴ dT プルダウン ・ リスト、RBR ID より低い偽陽性率を有するかもしれないことを示唆しているに依存していますただし、プルダウン ・ リストにより polyA + RNA に結合し、入力材料の最大 10-100 倍以上の RBR ID 大量 Rbp の同定のみRBR ID は、250,000 細胞から集めることができる生物的複製 (技術的複製あたり 〜 2 μ g) あたり蛋白質のわずか 5 μ g で実行できます。
ソナーと呼ばれる 2 番目の方法は、蛋白質それはよく知られている Rbp と浄化共同およびこれらの Rbp とその相互作用かもしれない RNA18によって媒介されるためを検出する大規模なタンパク質-タンパク質相互作用データベースのデータマイニングに依存します。この巧妙なアプローチは非常に強力、適切なデータベースが利用可能な任意のウェット研究室の実験を実行せずを新しい Rbp 識別できます。ただし、相互作用部位を明らかにすることはできませんし、したがって、補完しますですが、ない代替 RBR id です。
要約すると、私たちの RBR ID 技術は新しい Rbp を識別し、限られた入力サンプル量と架橋の蛋白・ RNA 複合体のすべての生化学的な浄化を必要とせず、RBRs をマップできます。テクニック識別された Rbp によってバインドされている RNA の種類想定はありません、したがって非翻訳、RBR ID が研究に有用な技術を証明するかもしれないことを示唆しているが多くの非-polyadenylated に結合する蛋白質の RNA 結合活性にマップできます、非翻訳 Rna の調節的役割。

RBR ID メソッドの目的は、新規 RNA 結合タンパク質 (Rbp) を識別し、RNA 結合変異体のデザインと生物学的・生化学的研究を促進するペプチド レベルの解像度とその RNA 結合領域 (RBRs) を割り当てるには蛋白質と核酸の相互作用の機能。
RNA は、遺伝情報を運ぶメッセンジャーとして行動することができも折る蛋白質1,2のものに似ている生化学的機能を持つ複雑な三次元構造、生体分子間で一意です。証拠の成長するボディは、Rna (ncRNAs) は様々 な遺伝子規制およびエピジェネティックな経路3,4,5で重要な役割を果たすし、コンサートでこれらの規定する機能を仲介する通常、示唆しています。具体的には特定の RNA と相互作用する蛋白質。特定の関連性の相互作用の蛋白質のセットは激しく勉強長い ncRNA (lncRNA) この lncRNA が女性の細胞6,7 における x 染色体不活性化に仲介する貴重な洞察を提供する Xist の最近確認されました。 ,8。とりわけ、Xist と相互作用するタンパク質のいくつかの標準的な RNA 結合ドメイン9が含まれていない、したがって、RNA 結合活性予測できなかったインシリコ単独で主なシーケンスに基づいています。LncRNAs の何千もが任意の特定のセルの10で表されることを考えると、それは、それらの多くを RNA 結合タンパク質 (Rbp) が発見される、まだ行動との相互作用を介して可能性がありますと仮定するが妥当。これらの新しい Rbp を識別する実験的戦略 ncRNAs の生物学的機能のタスクが大いに促進したがって。
経験的 Rbp を識別する以前の試みは、polyA + 質量分析法 (MS)11,12,13,14,15と結合した RNA 選択に頼ってきました。これらの実験は、デザイン polyadenylated 成績証明書にバインドされているタンパク質を検出できるだけで推定 Rbp のリストに多くの蛋白質を追加。ただし、ほとんどの小さな Rna と多くの lncRNAs は polyadenylated ではありません。16,17との相互作用の蛋白質が可能性が見逃しているこれらの実験で。最近の研究では、複数の知られている Rbp と精製には共同、これら再発 RBP パートナーの RNA 結合活動18を持っている可能性が高いを示した蛋白質を識別するタンパク質インタラクトーム データベースに機械学習を適用されます。ただし、この方法は、既存の大規模な相互作用データベースのマイニングに依存し、共同知られている Rbp、不溶性、膜に埋め込まれて、希少な解析から除いたと非変化条件で精製することができます蛋白質を識別することができますのみ蛋白質。
しばしばbona fide RBP としてタンパク質の同定はタンパク質-RNA 相互作用の生物学的・生化学的機能に関する情報を自動的に生成しません。この点に対処するため、それは通常各小説 RBP19、のコンテキストで RNA 結合の関数をテストする特定の変異体を設計できますように蛋白質のドメインとアミノ酸の相互作用に関与する残渣を識別することが望ましい20. 私達のグループと他の前の努力は RNA 結合領域 (RBRs)19,20,21,22; を識別する組換えタンパク質断片と欠失変異株を使用しています。ただし、このようなアプローチは手間と高スループット解析と互換性がありません。最近では、研究が質量23; を使用して高スループット方法で RNA 結合アクティビティにマップする実験的戦略を説明ただし、このアプローチはダブル polyA + RNA 選択に頼った、従って上記 RBP 同定アプローチと同じ制限を実施します。
光架橋蛋白質 RNA と蛋白質とことがなく生細胞における RNA と相互作用するタンパク質領域を識別するために定量的質量分析を利用する RNA 結合領域識別 (RBR-ID) と呼ばれる手法を開発RNA の起こる状況を想定、こうして Rbp を含む polyA Rna24にバインドされています。また、このメソッドは架橋に専ら依存しているとタンパク質溶解度またはユーザー補助の要件を持たないし、膜 (例えば核封筒) または難溶性コンパートメント (内 RNA 結合アクティビティをマッピングに最適です。例えば核マトリックス)。マウス胚性幹細胞 (mESCs) の核の RBR ID の実験手順について述べるが、マイナーな修正とこのプロトコルに適しているべき様々 な細胞の種類、彼らは効率的に文化から 4SU を組み込むことができますされます。媒体。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, qualified, US origin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution 200 mM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PZ0162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution,2% in water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-thiouridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4509</td>
			<td>50 mM stock in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrolinker XL-1500</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-992-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>78830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CO-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>542334</td>
			<td>Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, sequencing grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore solid phase extraction disk</td>
			<td>3M</td>
			<td>66883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLIGO R3 Reversed - Phase Resin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1133903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8263</td>
			<td>High purity nuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator Model 100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>updated with FB505110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReproSil-Pur 18-AQ</td>
			<td>Dr. Maisch GmbH HPLC</td>
			<td>r13.aq.0003</td>
			<td>Packing material for HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary for nano columns (75 &#181;m)</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068150017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant software</td>
			<td>Max Planck Institute for Biochemistry</td>
			<td></td>
			<td>Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for mass spectrometry-based identification of rna-binding regions

Rna は、遺伝子発現、クロマチン構造と DNA 修復を規制を含むいくつかの核プロセスで重要な役割を果たします。ほとんどの場合、非翻訳 Rna のアクションは蛋白質の機能が Rna とこれらの相互作用によって規制されて順番によって媒介されます。これと一致して、増えて核機能に関与するタンパク質の RNA をバインドする報告されているし、いくつかのケースでこれらの蛋白質の RNA 結合領域マップされている、多くの場合骨の折れる、候補者ベースのメソッドを使用します。
ここで、RNA 結合タンパク質と RNA 結合領域の高スループット、プロテオーム的公平な識別を実行する詳細なプロトコルを報告します。方法論は、光反応性ウリジン細胞 RNA、蛋白・ RNA の UV を介した架橋と質量分析に続いて、プロテオーム内 RNA 架橋ペプチドを明らかにするためにアナログの取り込みに依存しています。マウス胚性幹細胞のための手順を説明する、プロトコルは、簡単にさまざまな培養細胞に適応する必要があります。

図 1は、RBR ID ワークフローを示しています。この手法の比較的低い架橋効率のため生物学的複製間で枯渇レベルと観測の効果 (P値) の一貫性の両方を考慮する非常に重要です。図 2は、RBR ID の結果の火山プロットを示しています。RNA 認識モチーフ (RRM) ドメインをオーバー ラップするペプチドは、非常に一貫した枯渇のレベルを表示します。RRM のドメインは、RBR ID 分析用ポジティブ コントロールとして使用できます。
RBR ID は生きているセルで RBRs にマップする使用できます。各ペプチド RNA 結合のポテンシャルを推定する RBR ID スコアを計算できます: RBR ID スコア = -2対数 (正規化された 4SU 強度/正規化 + -4SU 強度) (ログ10(P値))2x。図 3は、遺伝子発現の多様サブユニット U1-70 k のサーフェスに投影 RBR ID スコアのヒートマップを示しています。RNA の接触の近くに鮮やかな赤い色結晶の構造から決定される蛋白質と核酸の相互作用を正確に識別を示します。
小説 Rbp の同定とその RBRs、その RNA 結合活性が独立したメソッドによって確認されることを強くお勧めします。私たち以前研究24では、RBP 小説として TET2 を識別し、タンパク質の一次配列に沿って RBR ID スコアをプロットすることによって図 4 aに示すように、RNA 結合活性を C 末端領域にマップします。図 4 bは RBR はパー クリップを実行することによって確認でしたこの小説の要件を示す26 WT シーケンスを使用して、予測された RBR に欠けている突然変異体の信号を比較します。彼らの追加のコントロールと検証実験の詳細な説明があります。201624。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56004/56004fig1.jpg"> 
図 1: RBR ID 概要。マウス Esc は 4SU と扱われるか (1-2) 312 nm UV (3) 照射しました。核が分離 (4) およびエキス プロテアーゼやヌクレアーゼ、架橋、uncrosslinked ペプチド (5) を降伏と消化です。共有結合 RNA 付加体の架橋でサイト変更ペプチドの質量は、uncrosslinked ペプチドの質量スペクトル (6、矢印) の強度の対応する低下に 。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56004/56004fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56004/56004fig2.jpg"> 
図 2: mESCs のプロテオーム的 RBR ID 。火山プロットのx軸とスチューデントのtのペプチド強度の表示ログ フォールドの変更- P± 4SU トリートメントのy軸の値をテスト (312 nm)。注釈付きの RRM ドメインを重複するペプチドは、ブルーです。HNRNPC からの RNA 結合ペプチドは、赤色でハイライトされます。以前は彼ら201624で公開。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56004/56004fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56004/56004fig3.jpg"> 
図 3: RBR ID マップ-RNA 蛋白質の相互作用のサイト。地域拡大で U1 snRNP の結晶構造 (PDB ID: 4PJO31) 色分けされた RBR ID スコアによると、相互作用する Rna の U1-70 K の表面蛋白質を示します。以前は彼ら201624で公開。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56004/56004fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56004/56004fig4.jpg"> 
図 4: TET2 の RBR の検証します。(A) 一次配列および知られているドメイン型 TET2;一次配列 (中央); に沿ってプロットされる平滑の残留レベル RBR ID スコア触媒ドメインのタグ付きのエピトープ フラグメント (CD) ・検証 (下) に使用される RBR 削除 (CDΔRBR) 構造の方式。(B) パー - 一過性発現型 TET2 CD と ΔCDΔRBR HEK293 細胞でのクリップ。放射線写真法32P 標識 RNA (上) とコントロールの西部のしみ (下)。以前は彼ら201624で公開。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56004/56004fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

RNA 結合蛋白質を識別し、紫外線による光架橋と質量分析法を用いた生細胞におけるその RNA 結合領域をマップするためのプロトコルについて述べる。

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

sample-preparation-for-mass-spectrometry-based-identification-rna

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.0K ビュー.  University of Pennsylvania Perelman School of Medicine. RNA 結合蛋白質を識別し、紫外線による光架橋と質量分析法を用いた生細胞におけるその RNA 結合領域をマップするためのプロトコルについて述べる。

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A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the abundances of key metabolites to which regulatory factors respond, adjusting cellular metabolism. In recent years, a number of proteins and RNA have emerged as important regulators of virulence gene expression. For example, the CodY protein responds to levels of branched-chain amino acids and GTP and is widely conserved in low G+C Gram-positive bacteria. As a global regulator in Staphylococcus aureus, CodY controls the expression of dozens of virulence and metabolic genes. We hypothesize that S. aureus uses CodY, in part, to alter its metabolic state in an effort to adapt to nutrient-limiting conditions potentially encountered in the host environment. This manuscript describes a method for extracting and analyzing metabolites from S. aureus using liquid chromatography coupled with mass spectrometry, a protocol that was developed to test this hypothesis. The method also highlights best practices that will ensure rigor and reproducibility, such as maintaining biological steady state and constant aeration without the use of continuous chemostat cultures. Relative to the USA200 methicillin-susceptible S. aureus isolate UAMS-1 parental strain, the isogenic codY mutant exhibited significant increases in amino acids derived from aspartate (e.g., threonine and isoleucine) and decreases in their precursors (e.g., aspartate and O-acetylhomoserine). These findings correlate well with transcriptional data obtained with RNA-seq analysis: genes in these pathways were up-regulated between 10- and 800-fold in the codY null mutant. Coupling global analyses of the transcriptome and the metabolome can reveal how bacteria alter their metabolism when faced with environmental or nutritional stress, providing potential insight into the physiological changes associated with nutrient depletion experienced during infection. Such discoveries may pave the way for the development of novel anti-infectives and therapeutics.

Here we describe a protocol for the extraction of metabolites from Staphylococcus aureus and their subsequent analysis via liquid chromatography and mass spectrometry.

代謝産物分析のためのタンデム液体クロマトグラフィー - 質量分析に基づくアプローチ<em&gt;黄色ブドウ球菌</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

生化学

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

(CARIC) 戦略をキャプチャするキャプチャとクリック化学支援 RNA インタラクトームを用いた RNA 結合タンパク質の同定

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences in a structurally similar protein, in order to determine the functional importance of these regions. Such chimeras are generated by means of a nested PCR protocol using overlapping DNA fragments and adequately designed primers, followed by their expression within a mammalian system to ensure native secondary structure and post-translational modifications. 
The functional role of a distinct region is then indicated by a loss of activity of the chimera in an appropriate readout assay. In consequence, regions harboring a set of critical amino acids are identified, which can be further screened by complementary techniques (e.g. site-directed mutagenesis) to increase molecular resolution. Although limited to cases in which a structurally related protein with differing functions can be found, chimeric proteins have been successfully employed to identify critical binding regions in proteins such as cytokines and cytokine receptors. This method is particularly suitable in cases in which the protein's functional regions are not well defined, and constitutes a valuable first step in directed evolution approaches to narrow down the regions of interest and reduce the screening effort involved.

Structurally related proteins frequently exert distinct biological functions. The exchange of equivalent regions of these proteins in order to create chimeric proteins constitutes an innovative approach to identify critical protein regions that are responsible for their functional divergence.

キメラ蛋白質の構築による機能性タンパク質領域の同定

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) in eukaryotic cells. Precise identification of nitration sites on proteins is crucial for understanding the physiological and pathological processes related to protein nitration, such as inflammation, aging, and cancer. Since the nitrated proteins are of low abundance in cells even under induced conditions, no universal and efficient methods have been developed for the profiling and identification of protein nitration sites. Here we describe a protocol for nitropeptide enrichment by using a chemical reduction reaction and biotin labeling, followed by high resolution mass spectrometry. In our method, nitropeptide derivatives can be identified with high accuracy. Our method exhibits two advantages compared to the previously reported methods. First, dimethyl labeling is used to block the primary amine on nitropeptides, which can be used to generate quantitative results. Second, a disulfide bond containing NHS-biotin reagent is used for the enrichment, which can be further reduced and alkylated to enhance the detection signal on a mass spectrometer. This protocol has been successfully applied to the model peptide Angiotensin II in the current paper.

Proteomic profiling of tyrosine-nitrated proteins has been a challenging technique due to the low abundance of the 3-nitrotyrosine modification. Here we describe a novel approach for nitropeptide enrichment and profiling by using Angiotensin II as the model. This method can be extended for other in vitro or in vivo systems.

アンジオテンシンIIによるニトロペプチドプロファイリングと同定

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves numerous incubation and liquid transfer steps in order to achieve denaturation, reduction, alkylation, and cleavage. Adapting this workflow onto an automated workstation can increase efficiency and reduce coefficients of variance, thereby providing more reliable data for statistical comparisons between sample types. We previously described an automated proteomic sample preparation workflow1. Here, we report the development of a more efficient and better controlled workflow with the following advantages: 1) The number of liquid transfer steps is reduced from nine to six by combining reagents; 2) Pipetting time is reduced by selective tip pipetting using a 96-position pipetting head with multiple channels; 3) Potential throughput is increased by the availability of up to 45 deck positions; 4) Complete enclosure of the system provides improved temperature and environmental control and reduces the potential for contamination of samples or reagents; and 5) The addition of stable isotope labeled peptides, as well as &#946;-galactosidase protein, to each sample makes monitoring and quality control possible throughout the entire process. These hardware and process improvements provide good reproducibility and improve intra-assay and inter-assay precision (CV of less than 20%) for LC-MS based protein and peptide quantification. The entire workflow for digesting 96 samples in a 96-well plate can be completed in approximately 5 hours.

Here, we present an automated plasma protein digestion method for mass spectrometry-based quantitative proteomic analysis. In this protocol, the liquid transferring and incubation steps for protein denaturation, reduction, alkylation, and trypsin digestion reactions are streamlined and automated. It takes approximately five hours to prepare a 96-well plate with desired precision.

自動ワークステーションを用いた質量分析のためのプラズマサンプル調製

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ratios (m/z), which are useful to deduce molecular weights and structures. While it is essentially a destructive analytical method, recent advancements in the ambient ionization technique have enabled us to acquire data while leaving tissue in a relatively intact state in terms of integrity. Probe electrospray ionization (PESI) is a so-called direct method because it does not require complex and time-consuming pretreatment of samples. A fine needle serves as a sample picker, as well as an ionization emitter. Based on the very sharp and fine property of the probe tip, destruction of the samples is minimal, allowing us to acquire the real-time molecular information from living things in situ. Herein, we introduce three applications of PESI-MS technique that will be useful for biomedical research and development. One involves the application to solid tissue, which is the basic application of this technique for the medical diagnosis. As this technique requires only 10 mg of the sample, it may be very useful in the routine clinical settings. The second application is for in vitro medical diagnostics where human blood serum is measured. The ability to measure fluid samples is also valuable in various biological experiments where a sufficient volume of sample for conventional analytical techniques cannot be provided. The third application leans toward the direct application of probe needles in living animals, where we can obtain real-time dynamics of metabolites or drugs in specific organs. In each application, we can infer the molecules that have been detected by MS or use artificial intelligence to obtain a medical diagnosis.

This article introduces sample preparation methods for a unique real-time analytical method based on the ambient mass spectrometry. This method lets us perform real-time analysis of the biological molecules in vivo without any special pretreatments.

プローブエレクトロスプレーイオン化質量分析のためのサンプル調製

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management of product yield and quality. Metabolomics data provides a read-out of these interactions at a given moment in time and is informative of an organism&#39;s biochemical status. Further, individual metabolites or panels of metabolites can be used as precise biomarkers for yield and quality prediction and management. The plant metabolome is predicted to contain thousands of small molecules with varied physicochemical properties that provide an opportunity for a biochemical insight into physiological traits and biomarker discovery. To exploit this, a key aim for metabolomics researchers is to capture as much of the physicochemical diversity as possible within a single analysis. Here we present a liquid chromatography-mass spectrometry-based untargeted metabolomics method for the analysis of field-grown wheat grain. The method uses the liquid chromatograph quaternary solvent manager to introduce a third mobile phase and combines a traditional reversed-phase gradient with a lipid-amenable gradient. Grain preparation, metabolite extraction, instrumental analysis and data processing workflows are described in detail. Good mass accuracy and signal reproducibility were observed, and the method yielded approximately 500 biologically relevant features per ionization mode. Further, significantly different metabolite and lipid feature signals between wheat varieties were determined.

A method for the untargeted analysis of wheat grain metabolites and lipids is presented. The protocol includes an acetonitrile metabolite extraction method and reversed phase liquid chromatography-mass spectrometry methodology, with acquisition in positive and negative electrospray ionization modes.

無標的液体クロマトグラフィー-質量分析法ベースの小麦粒のメタボロミクス分析

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view of the impact of a disease, treatment, or other condition on the proteome as a whole. This report provides a detailed protocol for the extraction, quantification, precipitation, digestion, labeling, and subsequent data analysis of protein samples. Our optimized TMT labeling protocol requires a lower tag-label concentration and achieves consistently reliable data. We have used this protocol to evaluate protein expression profiles in a variety of mouse tissues (i.e., heart, skeletal muscle, and brain) as well as cells cultured in vitro. In addition, we demonstrate how to evaluate thousands of proteins from the resulting dataset.

We present an optimized tandem mass tag (TMT) labeling protocol that includes detailed information for each of the following steps: protein extraction, quantification, precipitation, digestion, labeling, submission to a proteomics facility, and data analyses.

プロテオミクス施設提出のためのTMTサンプル調製とその後のデータ分析

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, including RNA processing, signal transduction, DNA damage response, miRNA biogenesis, and translation.
In recent years, thanks to biochemical and analytical developments, mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as the most effective strategy to characterize the cellular methyl-proteome with single-site resolution. However, identifying and profiling in vivo protein R-methylation by MS remains challenging and error-prone, mainly due to the substoichiometric nature of this modification and the presence of various amino acid substitutions and chemical methyl-esterification of acidic residues that are isobaric to methylation. Thus, enrichment methods to enhance the identification of R-methyl-peptides and orthogonal validation strategies to reduce False Discovery Rates (FDR) in methyl-proteomics studies are required.
Here, a protocol specifically designed for high-confidence R-methyl-peptides identification and quantitation from cellular samples is described, which couples metabolic labeling of cells with heavy isotope-encoded Methionine (hmSILAC) and dual protease in-solution digestion of whole cell extract, followed by off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) chromatography fractionation and affinity enrichment of R-methyl-peptides using anti-pan-R-methyl antibodies. Upon high-resolution MS analysis, raw data are first processed with the MaxQuant software package and the results are then analyzed by hmSEEKER, a software designed for the in-depth search of MS peak pairs corresponding to light and heavy methyl-peptide within the MaxQuant output files.

Protein Arginine (R)-methylation is a wide-spread post-translational modification regulating multiple biological pathways. Mass spectrometry is the best technology to globally profile the R-methyl-proteome, when coupled to biochemical approaches for modified peptide enrichment. The workflow designed for the high confidence identification of global R-methylation in human cells is described here.

質量分析に基づくプロテオミクスアプローチによるグローバルで信頼性の高いタンパク質R-メチル化分析

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, mostly at 4 &#176;C and occasionally at room temperature. Recently, we discovered that the protein structure solved at low temperature may not be functionally relevant, particularly for proteins from thermophilic archaea. A procedure was developed to prepare protein samples at higher temperatures (up to 70 &#176;C) for cryo-EM analysis. We showed that the structures from samples prepared at higher temperatures are functionally relevant and temperature dependent. Here we describe a detailed protocol for preparing sample grids at high temperature, using 55 &#176;C as an example. The experiment made use of a vitrification apparatus modified using an additional centrifuge tube, and samples were incubated at 55 &#176;C. The detailed procedures were fine-tuned to minimize vapor condensation and obtain a thin layer of ice on the grid. Examples of successful and unsuccessful experiments are provided.

This paper provides a detailed protocol for preparing sample grids at temperatures as high as 70 &#176;C, prior to plunge freezing for cryo-EM experiments.

クライオ電子顕微鏡用高温サンプルグリッドの作製

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...