私はAlex L. Kolodkinに感謝します。私は彼の研究室でこのフィレット付きの準備プロトコルを学びました。私はまた、技術支援のために香港のYoung Giに感謝します。この研究はNRF-2013R1A1A4A01011329（SJ）によって支持された。

1.準備<ol><li> 0.5Xのウシ血清アルブミン（BSA）と0.5mLのt-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（材料の表参照）を1×PBS（500mL）に加えて、t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（PBT）溶液で500mLのリン酸緩衝生理食塩水少なくとも30分間攪拌した。 4℃で保存する。比較的新鮮なときに使用し、清潔な瓶に保存してください。 </li><li> 4％パラホルムアルデヒド10 mLに、脱イオン水6.5 mLに16 mLストックパラホルムアルデヒド溶液2.5 mLと10 mL PBS 1 mLを加えて調製する。 4℃で保存し、1週間以内に使用してください。 注意：パラホルムアルデヒド溶液との接触は避けてください。毒性が強いためです。 </li><li> 1mLのDMSOあたり0.1gのX-Gal基質を溶解することにより、X-Gal基質（ジメチルスルホキシド（DMSO）中10％w / v X-Gal）を作製する。 100μLアリコートで-20℃で保存する。 </li><li> 10mMリン酸緩衝液（pH7.2）、150mM NaCl、1mM MgCl 2、3μlを用いてX-Gal染色溶液を作製する。MK 4 [FeII（CN） 6 ]、3mM K 3 [FeIII（CN） 6 ]、および0.3％t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール。暗所で4℃で保存する。 </li><li> 3％過酸化水素水を、30％原液の過酸化水素1:10を脱イオン水で希釈することによって調製する。 </li><li> DAB 1錠（10mg）を35mLの新鮮なPBT溶液に完全に溶解して3,3&#39;-ジアミノベンジジン（DAB）溶液を調製する。 0.2μmのシリンジフィルターでろ過し、-20℃で910μLのアリコートで保存します。 注意：すべてのDAB廃棄物を漂白剤に入れてDABを破壊してください。 </li><li>リンゴジュースで卵子を作る。 1L 35gの寒天と1Lの脱イオン水を2Lフラスコに加える。 33Lのスクロース、2gのテゴセプト、および375mLのリンゴジュースを1Lフラスコに加える。 30分間オートクレーブしてそれらを溶かす。両方の溶液を約60℃まで冷ます。これらの溶液を攪拌してよく混合する。 60ミリリットルの培養皿あたり〜11 mLの混合溶液を注ぐ。 </li><li>パン酵母をブレンドして酵母ペーストを作る（1：0.8の比）に入れ、4℃で保存する。 </li></ol> 2.胚コレクション（1日目） <ol><li>若い雌雄のハエ（5日未満）を採取し、1〜2日間、少量の酵母ペーストを中央に含む卵板（60mm×15mm）をプラスチックビーカーケージに入れて維持する。 </li><li>後期段階16胚の最適な収集のために、午後5時にハエ（&gt; 50）でボトルケージを設置し、3時間25℃で卵を産卵させる。 </li><li>フライドポテトを新鮮なフードボトルに移す。 </li><li>蓋をして卵プレートを閉じ、25℃で加湿インキュベーター（〜70％湿度）で一晩インキュベートする。 </li></ol> 3.免疫染色のための胚の調製（2日目） <ol><li>午前10時20分頃に1.8 mLのPBT溶液を卵板に加え、綿棒で卵を傾けながら胚を緩めます。 注：コットンを使用して酵母ペーストを静かにマッシュすることによりスワブ上に多数の胚が見つかった場合にはそれを溶かす。固定の約40分前（午前11時頃）に胚の採取を開始する。 </li><li> 1mLのピペットチップを使用して、卵プレートから1.5mLのマイクロチューブに胚を移す。 </li><li>胚を沈降させ、可能な限りPBT溶液を吸引する。 1mLのPBT溶液で胚を2回すすぐ。可能な限りPBT溶液を吸引する。 </li><li> 50％漂白剤（ すなわち、脱イオン水で希釈）1mLでチューブを満たし、室温（RT）で3分間ナットでインキュベートすることにより胚を脱皮する。 注：この手順では、脱皮した胚は死滅しません。 </li><li>脱皮した胚を沈降させ、できるだけ50％漂白剤を吸引し、1mLのPBT溶液で3回胚をすすいでください。 </li><li> 0.5mLのヘプタンを添加し、続いて0.5mLの4％パラホルムアルデヒド溶液を室温で午前11時頃に管に加える。 </li><li>インキュベートするRTで15分間ナッターで胚を摘出した。 </li><li> 4％パラホルムアルデヒド溶液（最下層）を除去する。 </li><li> 0.5mLの100％メタノールを添加し、30秒間激しくチューブを振盪することにより胚を脱皮する。 </li><li>ヘプタン（ すなわち、最上層）を除去する。 </li><li> 100mLのメタノール0.5mLを添加し、10秒間激しくチューブを振とうする。 </li><li>胚をチューブをタップして沈降させ、可能な限りメタノールを吸引する。 100％メタノール1 mLで胚をすすぎ、10秒未満振盪する。 注：メタノールへの長期暴露はβ-Gal活性を破壊する。 </li><li>メタノールを除去し、脱膜した胚をPBT溶液1mLで3回すすぐ。 </li></ol> 4. LacZ染色を用いた胚のジェノタイピング（2日目） <ol><li> PBT溶液1 mLをチューブに添加し、チューブを37℃のヒートブロックまたは水浴中で15分間インキュベートする。 </li><li>インキュベーション中に、X-Gal染色溶液（1mLあたり1mL水浴中で曇るまで65℃で保存してください。それを37℃の水浴中でインキュベートする。 </li><li> PBT溶液を吸引し、1 mLのX-Gal染色溶液と20μLのX-Gal基質をチューブに加えます。 </li><li>青色の沈殿が明らかになるまで、チューブを37℃で培養する。 注：第2 および第 3 のブルーバランサのインキュベーション時間は、一般に2〜4時間の範囲である。 </li><li> X-Gal染色溶液を除去し、1mLのRT PBT溶液で3回胚をすすぐ。 </li><li>針プローブまたは鉗子を用いて、所望の遺伝子型の胚（ すなわち、染色されていない白色胚）を光解剖顕微鏡（1.6X〜2.5X対物レンズ）で手で分類する。 注： CyO、アクチン-LacZおよびTM3、アクチン -LacZなどのいくつかのブルーバランサーは、 アクチンプロモーターの制御下で細菌β-Gal（LacZ）を発現するトランスジェニック構築物を担持しているため、遍在的に青く染色された胚は、青バランサー染色体の1つまたは2つのコピー。したがって、染色されていない白色胚は、所望の致死対立遺伝子についてホモ接合である。 </li></ol> 5.抗Fasciclin II抗体による胚の免疫染色（2-3日目） <ol><li>所望の遺伝子型の胚（ すなわち、染色されていない白色胚）を収集し、1mLピペットチップを用いて0.5mLマイクロチューブに移す。 注：この段階では、キュービクルのセグメンテーションパターンや頭と尾の構造を含む形態学的基準に従って、胚を大まかにステージングすることができます。頭部の崩壊の間、卵が飼育されてから10〜16時間の間に、胚は最も前側の部分9の顕著な減少を受ける。 </li><li> 0.4mLのPBT溶液で胚を1回洗浄し、0.3mLのブロッキング溶液（PBT溶液中5％正常ヤギ血清および5％DMSO）を加える。 </li><li> RTで15分間飼育して胚をブロックする。 </li><li&gt; 75μLの抗Fasciclin II抗体を添加し、チューブを室温で一晩インキュベートする。 </li><li> 1回の洗浄につき少なくとも20分間、0.4mLのPBT溶液で胚を4回洗浄する。 </li><li>ヤギ抗マウスHRP抗体（2μg/ mL）を含有するブロッキング溶液（PBT溶液中5％正常ヤギ血清）0.3mLを添加し、チューブを室温で一晩インキュベートする。 </li><li> 0.4mLのPBT溶液で胚を6回洗浄し、1回の洗浄につき少なくとも20分間洗浄する。 </li><li>チューブに0.3 mLのDAB溶液を加える。 注意：手袋を着用し、すべてのDAB廃棄物/チューブ/チップを漂白剤に入れてください。 </li><li> 3％過酸化水素2μLを添加し、望みの量の沈殿物が生成されるまで、チューブを室温で暗所でインキュベートする。 注：1D4免疫組織化学のインキュベーション時間は、一般に0.5〜1時間の範囲である。 </li><li> 0.4mLのPBT溶液で胚を4回洗浄する。 注意：DAB溶液を除去し、最初の2回の洗浄はピペットで行い、di漂白剤でそれらを傷つける。 </li><li> 70％グリセロール/ PBS溶液をチューブに0.2 mL添加し、室温または4℃で保存する。 注：チューブは光から遠ざけてください。胚を90％グリセロール/ PBS溶液10中に置くことにより、より明瞭な調製物を得ることができる。しかし、90％グリセロール/ PBS溶液で清澄された胚を、70％グリセロール/ PBS溶液10で浄化された胚よりも解剖することはより困難である。 </li></ol> 6.胚のステージング、解剖、マウントおよび画像化（4日目） <ol><li>ステージングのために、70％グリセロール/ PBSで平衡化した胚をガラススライド上に移す。 </li><li>腹部セグメント7（A7）、A8、およびA9 ISN神経が互いに接触するように収束する、および/または中腸が3つのバンドに細分される後期段階16の胚を収集する。 注：1D4抗体で染色された胚は、ISNおよびISNbモーター軸索の投影パターンに基づいてステージングすることができる。 CNSを出た後、A7、A8、およびA9 ISN ne後期段階-16の胚の群は互いに接触するように収束し、続いて発散して背側の筋肉に遠くまで広がる（ 図1Aの矢頭）。しかし、16段階中期胚では、A7 ISN神経はA8 / A9神経と平行して伸びる（ 図1Bの角括弧）。さらに、両半分のA6 ISNb神経（腹側筋に垂直）の投影軸は、CNS縦軸索束の後端とほぼ整列している（ 図1Cの矢印および線）。これらの形態学的基準は、異なる遺伝子型によって多少異なる。あるいは、胚の形態学に基づいて胚をステージングすることができる9,11。ステージ17に先立ち、中腸は心臓のような形をしているのに対して、中腸はステージ17,12によって3つのバンドに細分されている。 </li><li> 胚を解剖する。 <ol><li> 1mを使用するLシリンジで、各胚をグリセロール液滴から移動させ、胚を腹面を上にして置く。体の長さの1/4とモーター軸索のない最も後部の領域で前部を切断する。 </li><li>ニードルプローブを使用して、エンドカット胚をグリセロールドロップから移動させ、ロールバックして背側を上にして、フィールドに水平に置きます。 注：胚をグリセロール液滴の外に移動すると、胚に付随するグリセロールが少し粘着してしまいます。 </li><li>単一の非常に細かいタングステンの針13を使用して背面の正中線に沿って胚を切断します。胚の後端で小さな切れ目を作って、背中の正中線を前部に向かって引き下げ続けます。反対方向に切断しても問題ありません。 </li><li>ニードルプローブを使用して、正中線切断した胚をグリセロール液滴の中に移動させ、背側を上に置き、各腹壁を腹側（対角線）方向に展開することによって体壁から腸を分離する（2.5X対物レンズ）。 注：背中正中線が完全に切断されていることを確認し、左右の体壁を完全に分離します。 </li><li>慎重にグリセロールドロップから正中線切断胚を移動し、細い針のプローブ（2.5倍の対物レンズ）を使用してガラススライド上に体の壁の2つのフラップを置きます。 </li><li>非常に細かいタングステン針を使用して、横に（5Xの対物レンズ）それらを押すことにより、解剖された胚から内臓を除去する。 注：別の同様の解剖手順のより詳細な説明は、ウェブサイト5で見つけることができます。 </li></ol></li><li>マウントするには、70μlの70％グリセロール/ PBS溶液を2〜3μL添加して清潔な胚にし、細い針状プローブを使用して新しいスライドグラスに移し、7μLの70％グリセロール/ PBS溶液を広げてくださいセンター（2.5X対物レンズ）。 </li><li>カバースリップ（18mm×18mm）を置く。カバースリップのエッジを通常のマニキュアでシールします（どちらか透明または着色されています）。 </li><li>メーカーの指示に従って、微分干渉コントラスト（DIC）光学顕微鏡下で高解像度（20倍、40倍、および63倍油浸対物レンズ）で画像を取り込む。 注：ISNbモーター軸索の場合、特に視覚化と表現型の解析がより容易になるためには、63X油浸対物レンズを使用することができます。 </li></ol>

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著者は競合する金銭的利益がないと宣言します。

モーター軸索誘導欠陥の詳細は、蛍光標識されたもののレーザー走査共焦点顕微鏡によるよりも、DABで染色した胚のフィレット調製物により、より迅速かつより正確に得点される。したがって、固定された1D4染色胚のフィレット調製物は、誘導キュー分子の機能的特徴付けに最も適している。ネトリン、スリット、セマフォリン（セマ）、エフリンなどの4つの主要な手がかりとそれらの同族受容体は、虫、ハエ、および脊椎動物の進化的に保存された役割を果たしている20 。ショウジョウバエの受容体として働くラウンドアバウト（Robo）ファミリー分子の中で、 ショウジョウバエ Roboは、CNSにおける反発誘導機能を仲介することが最初に確認された6,21。セマは、プレキシン含有受容体複合体22に結合するガイダンス分子の大きなファミリーである22 。 Semasの軸索誘導機能ニジマスのCNS 14で最初に発見された。続いて、クラス1膜貫通セマフォリンSema-1aは、ショウジョウバエにおいて広範に特徴付けられた 。セマ1aは、プレキシンAのリガンドとしてだけでなく、未知のリガンドの受容体としても機能し、胚神経発達中の特定の選択点での軸索 - 軸索反発に重要な役割を果たす15,16,17,18（ 図2C ）。 現在のプロトコルで発生する一般的なトラブルシューティング手順がいくつかあります。第1に、段階3.9~3.13において、メタノール脱グリチル化手順において使用される胚が多すぎたり小さすぎたりする場合、胚を低効率で脱皮することができる。この場合、ステップ3.5で脱鞭毛のために40〜80μLの固定胚のベッド容積を使用することが推奨される。第二に、steps 3.9-3.13では、固定剤として使用されるメタノールがβ-Gal活性を破壊するので、メタノールまたは不完全ヘプタン除去に長時間さらされた場合、弱いX-Gal染色が起こり得る。この場合、工程3.9~3.13でメタノールを使用する脱揮発工程は、できるだけ迅速に実施されることが最良である。さらに、メタノール中で可溶化された残留ヘプタンは、染色を妨害し得る。したがって、ステップ3.11-3.13でできるだけ多くのメタノールを除去することが最善です。 現行のフィレット調製プロトコルは、機能喪失および機能獲得遺伝子スクリーンに適用して、モーター軸索経路探索および標的認識に関与する新規遺伝子を同定することができる。しかし、このプロトコールの欠点は、固定された胚を切開して、フィレット調製物を生成することはかなり時間がかかることである。この問題を克服するために、軸索突起の表現型の特徴付けを、1D4で染色されたembの全マウント調製物でモニターすることができるこの方法は周辺部の軸索突起の低解像度視覚化を提供するが、それにもかかわらず、全身調製プロトコールは、軸索誘導遺伝子をスクリーニングするための効率的なアプローチであることが証明されている4 。最近、系統的スクリーニングのために、蛍光標識された胚の生検を用いた別のプロトコールが開発された11 。ライブ解剖プロトコールは、表現型解析のための比較的迅速な準備を可能にする11 。しかし、このプロトコールは、ステージ17の開始よりも古い胚には適切ではない。 ここに記載されたフィレット調製プロトコールは、異なる抗体を用いたタンパク質発現パターンを調べるために使用することができる。さらに、このプロトコールは、発育の様々な段階でショウジョウバエの胚にも適用することができる。

ショウジョウバエの幼生における正常な運動のためには、胚発生の間に運動軸索と標的筋肉との間の正確で選択的な結合が不可欠である。腹部半分体A2〜A7の各々における30本の筋線維の胚形成は、段階16 1によって確立される。腹側神経脊髄で生成された36個の運動ニューロンは、軸索を末梢に伸ばして特定の標的筋肉を神経支配する2 。モーター軸索の経路探索および標的認識は、抗体（マウスモノクローナル抗体1D4） 3,4による免疫組織化学によって視覚化することができる。野生型胚のモーター軸索突起パターンの複数の画像がウェブ5上で利用可能である。 1D4抗体は、胚性中枢神経系（CNS） 4の正中線の両側にすべての運動軸索および3つの縦軸索束を標識する</sup&gt; 、 6 （ 図1Cおよび図2A ）。したがって、FasII抗体による免疫組織化学は、運動軸索誘導および標的認識の根底にある分子メカニズムを実証するために、神経筋結合に必要な遺伝子を同定するための強力なツールを提供する。 腹部半分体A2~A7のそれぞれにおいて、運動軸索は、2つの主要な神経枝である分節神経（SN）および椎間板神経（ISN） 2,4 、および軽微な神経枝に選択的に束縛され、横断神経） 7 。 SNは選択的に脱皮して、SNaおよびSNcと呼ばれる2つの神経分枝を生じさせるが、ISNはISN、ISNbおよびISNdと呼ばれる3つの神経分枝に分裂する。その中でも、ISN、ISNb、およびSNaモーター軸索投射パターンは、後期ステージ16胚がFasII抗体で染色され、フィレット化されたときに最も正確に視覚化される（ 図1Cおよび図2A ）。 ISN運動ニューロンは、それらの軸索を背側筋肉1,2,3,4,9,10,11,18,19、および20,2,4（ 図2A ）に神経支配するように拡張する。 ISNb運動ニューロンは、腹外側筋6,7,12,13,14,28、および30,2,4（ 図2Aおよび2B）を支配する。 SNa神経枝は、側方筋肉5,8,21,22,23、および24,2,4（ 図2A ）を神経支配するように突出する。 2つの運動軸索からなるTNは、筋肉25を神経支配するための分節境界に沿って同側に突出しており、筋肉25の外側二極樹状突起ニューロン（LBD）とシナプスを形成する周辺部7 （ 図2A ）。これらの標的筋の神経支配は、特定の選択点において運動軸索の選択的脱毛皮化を必要とするだけでなく、筋肉の認識を標的とすることを必要とする。さらに、中間標的として作用するいくつかの推定中胚葉誘導ポスト細胞は、ISNおよびSNa経路の両方で見出されたが、ISNb経路4では見出されなかった。これは、ISNbモーター軸索経路探索が、ISNおよびSNaモーター軸索ガイダンスと比較して明確な様式で調節され得ることを示唆し、また、周辺モーター軸索ガイダンスが、単一のガイダンスキューの差異または保存された役割を研究する魅力的な実験モデル分子8 。 この研究は、ショウジョウバエの胚運動ニューロンの軸索突起パターンを視覚化するための標準的な方法を提示する。記載されたプロトコールは、1D4aで染色された固定胚を解剖する方法を含むフィブリル化調製物のために3,3&#39;-ジアミノベンジジン（DAB）で処理した。固定された胚の平らな調製物の1つの重大な利点は、周辺における軸索突起および筋肉パターンのより良好な視覚化である。さらに、この研究は、LacZ染色法を用いて所望の突然変異胚を選別するための固定された胚を遺伝子型決定する方法も示している。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A7906</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">X100</td>
			<td style="width:228px;">t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">16% Paraformaldehyde Solution</td>
			<td style="width:144px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:131px;">18505</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">S5886</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">P5405</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">30435</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">71500</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">X-Gal Substrate</td>
			<td style="width:144px;">US Biological</td>
			<td style="width:131px;">X1000</td>
			<td style="width:228px;">X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Dimethyl Sulfxide</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">D4540</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">M8266</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:284px;">Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">P9387</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Potassium hexacyanoferrate(III)</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">244023</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">216763</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">3,3&#39;-diaminobenzidine Tetrahydrochloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">D5905</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Agar</td>
			<td style="width:144px;">US Biological</td>
			<td style="width:131px;">A0930</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sucrose</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">S5-3</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">H5501</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Culture Dish (60 mm)</td>
			<td style="width:144px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">430166</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">Tricon Beaker</td>
			<td style="width:144px;">Simport</td>
			<td style="width:131px;">B700-100</td>
			<td style="width:228px;">This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">Yeast</td>
			<td style="width:144px;">Societe Industrielle Lesaffre</td>
			<td style="width:131px;">Saf Instant Yeast Red</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:131px;">14220-263</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Eppendorf Tube (1.5 ml)</td>
			<td style="width:144px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:131px;">#72.690</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Bleach</td>
			<td style="width:144px;">The Clorox Company</td>
			<td style="width:131px;">Clorox</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Heptane</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">246654</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Methanol</td>
			<td style="width:144px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:131px;">UN1230</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">16210-064</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">Anti-FasciculinII Antibody</td>
			<td style="width:144px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:131px;">1D4 anti-Fasciclin II</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">Goat Anti-mouse-HRP Antibody</td>
			<td style="width:144px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:131px;">115-006-068</td>
			<td style="width:228px;">AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) 
			(min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Glycerol</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">G9012</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Slide Glass</td>
			<td style="width:144px;">Duran Group</td>
			<td style="width:131px;">235501403</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Coverslip</td>
			<td style="width:144px;">Duran Group</td>
			<td style="width:131px;">235503104</td>
			<td style="width:228px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">1 ml Syringe</td>
			<td style="width:144px;">Becton Dickinson Medical(s)</td>
			<td style="width:131px;">301321</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:284px;">Tungsten Needle</td>
			<td style="width:144px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:131px;">#27-11</td>
			<td style="width:228px;">Tungsten Wire, &#248;0.13mm/6.1m (&#248;.005&#34;/20 ft.)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">Nutator (Mini twister)</td>
			<td style="width:144px;">Korean Science</td>
			<td style="width:131px;">KO.VS-96TWS</td>
			<td style="width:228px;">Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the axonal projection pattern of embryonic motor neurons in drosophila

機能的な神経筋回路の確立は、運動軸索と標的筋肉の間の正確な接続に依存する。運動ニューロンは、周囲の細胞外環境から発する多数の軸索誘導手がかりに応答することによって、特定の経路に沿って移動する成長円錐を拡張する。成長円錐標的認識はまた、神経筋特異性において重要な役割を果たす。この研究は、後期段階16 ショウジョウバエメラノガスター胚の運動ニューロン投影を視覚化するための標準的な免疫組織化学プロトコルを提示する。このプロトコールは、所望の突然変異胚を選別するための遺伝子型決定手順を含むいくつかの重要なステップを含む。ファシクリンII（FasII）抗体で胚にタグ付けするための免疫染色手順;固定された胚からフィレット調製物を生成するための解剖手順を含む。末梢のモーター軸索突起および筋肉パターンは、filleted embryosの平らな調製物では、whよりもはるかに良好に視覚化されるオレ - マウント胚。したがって、FasII抗体で染色された固定胚のフィレット調製物は、モーター軸索経路探索および標的認識に必要とされる遺伝子を特徴付ける強力なツールを提供し、機能喪失および機能獲得遺伝子スクリーンの両方に適用することもできる。

神経発達中の運動軸索と標的筋肉との間の正確な接続は、選択的軸索 - 軸索反発および特定の選択肢4での標的認識に依存する。 ショウジョウバエでは、運動軸索間の選択的反発は、Sema-1a、Sema-2a、およびSema-2b 8,14,15,16,17,18を含むクラス1と2のセマフォリン（Semas）の併用作用によって部分的に制御される。したがって、 Sema-1a機能の喪失は、しばしば特定の選択点で脱皮して異常に厚い形態を示すISNb軸索の欠損をもたらす（ 図2Cの矢頭）。野生型胚では、少なくとも7つの運動ニューロンが伸長し、それらの軸索を束ねてI型を形成するSNb神経分岐（ 図2A ）。 ISNb神経枝が筋肉6と7との間に位置する選択点に達すると、2つの軸索が主ISNb束から選択的に脱皮し、続いて筋肉6および7を神経支配する（ 図2B ）。筋肉6,13、および30の間に位置する次の選択点で、別の3つの運動軸索は選択的に脱皮して筋肉13,14および30を神経支配する（ 図2B ）。残りの2つの軸索は、筋肉12の縁の近くの最後の選択点に達するように背側に延び、それによって筋肉12を反対方向に支配する（ 図2B ）。これらの結果は、フィレット調製プロトコールが、運動軸索誘導に必要な遺伝子を研究するための有用なツールを提供することを明らかに示している。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55830/55830fig1.jpg" /> <strong&gt;図1：ISNおよびISNbモーター軸索の投影パターンに基づく胚の病期分類。 （ A ）後期第16段階の野生型胚では、A7、A8、およびA9 ISN神経（矢印）が互いに接触するように収束する（矢頭）。前部は残され、腹部は下になる。スケールバー=15μm。 （ B ）段階16中期野生型胚において、A7 ISN神経はA8 / A9神経（角括弧）と平行して伸びる。矢印は、A7、A8、およびA9 ISN神経を示す。前部は残され、腹部は下になる。スケールバー=15μm。 （ C ）FasII抗体で染色された後期段階16野生型胚の作製。左右のA6 ISNb神経の投影軸（矢印）は、CNS縦軸索束（黒線）の後端とほぼ整列している。腹部セグメントA1~A7は、上部にラベルが付けられている。前方が残る。スケールバー=15μm。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55830/55830fig1large.jpg" target="_blank">歓喜</a>この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。 <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55830/55830fig2.jpg" /> 図2：野生型およびSema-1a突然変異体胚におけるモーター軸索突起パターン。 （ A〜C ）FasII抗体で染色された後期段階16胚の調製を完了した。前部は残され、腹部は下になる。各パネルで表される軸索投影パターンを示す概略図。スケールバー=15μm。 （ A ）野生型胚における2つの連続した腹部半分、A3およびA4の明視野写真。 3つの左右対称縦軸索束がCNSに存在する。 ISNb、SNa、ISN、およびTNモータ軸索の正常な神経支配パターンは、ボックスおよび周辺の矢印によって示される。腹筋を神経支配する横方向双極性樹状突起ニューロン（LBD）は、矢頭で描かれている。模式図では、ISNb（茶色）、SNa（青色）、ISN（緑色）、TN（黄色）運動ニューロンおよびそれらの標的筋肉の神経分枝および神経支配パターンが示されている。 CNSにおけるこれらの運動ニューロンの細胞体の位置もまた、それら自身の色で示される。 （ B ）野生型胚では、ISNb軸索は、番号が付けられた腹側の筋肉に投射し、それらを特定の選択点（DIC画像の矢印）に神経支配する。 （ C ） Sema-1a機能喪失突然変異体では、ISNb軸索は、筋肉6と13の間で相互に脱皮しないことが多い（DIC画像中の矢頭）。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55830/55830fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

この研究は、後期第16段階ショウジョウバエメラノガスター胚の運動ニューロン投影を視覚化するための標準的な免疫組織化学法を詳述している。 FasII抗体で染色された固定胚のフィレット調製物は、神経発達中にモーター軸索経路探索および標的認識に必要とされる遺伝子を特徴付ける強力なツールを提供する。

胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化<em&gt;ショウジョウバエ</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

visualization-axonal-projection-pattern-embryonic-motor-neurons

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

7.7K ビュー.  Chonbuk National University. この研究は、後期第16段階ショウジョウバエメラノガスター胚の運動ニューロン投影を視覚化するための標準的な免疫組織化学法を詳述している。 FasII抗体で染色された固定胚のフィレット調製物は、神経発達中にモーター軸索経路探索および標的認識に必要とされる遺伝子を特徴付ける強力なツールを提供する。 

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

神経科学

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

ホールマウントの胎児神経系の可視化ショウジョウバエ胚

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the 10-1000 &mu;dyne range1,2. Force measurements are obtained through observation of the Hookean bending of the glass needles, which are calibrated by a direct and empirical method3. Equipment requirements and procedures for fabricating, calibrating, treating, and using the needles on cells are fully described. The force regimes previously used and different cell types to which these techniques have been applied demonstrate the flexibility of the methodology and are given as examples for future investigation4-6. The technical advantages are the continuous 'visualization' of the forces produced by the manipulations and the ability to directly intervene in a variety of cellular events. These include direct stimulation and regulation of axonal growth and retraction7; as well as detachment and mechanical measurements on any type of cultured cell8.

Application and direct measurements of forces on neurons in the 2-1000 microdyne range are achieved with high precision using calibrated glass needles. This methodology can be used to control and measure several aspects of axonal development, including axonal initiation, axonal tension, velocity of axonal elongation, and force vectors.

軸索の開発を制御する神経細胞の機械的な操作

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

マウス胚の脊髄の全載標本での分岐軸索勉強するDRGニューロンのDII -標識

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

でProprioceptorsの可視化<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫および蛹

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

体外における筋モータープールのために運動ニューロンの識別<em&gt;アメフラシカリフォルニ</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アンテナ

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of abdominal ganglia (A1 to A6). This chain of ganglia includes the part of the central nervous system (CNS) that drives coordinated locomotion of the pleopods (swimmerets): the swimmeret system. It is known for over five decades that in crayfish each swimmeret is driven by its own independent pattern generating kernel that generates rhythmic alternating activity 1-3. The motor neurons innervating the musculature of each swimmeret comprise two anatomically and functionally distinct populations 4. One is responsible for the retraction (power stroke, PS) of the swimmeret. The other drives the protraction (return stroke, RS) of the swimmeret. Motor neurons of the swimmeret system are able to produce spontaneously a fictive motor pattern, which is identical to the pattern recorded in vivo 1.
The aim of this report is to introduce an interesting and convenient model system for studying rhythm generating networks and coordination of independent microcircuits for students&#8217; practical laboratory courses. The protocol provided includes step-by-step instructions for the dissection of the crayfish&#8217;s abdominal nerve cord, pinning of the isolated chain of ganglia, desheathing the ganglia and recording the swimmerets fictive motor pattern extracellularly from the isolated nervous system.
Additionally, we can monitor the activity of swimmeret neurons recorded intracellularly from dendrites. Here we also describe briefly these techniques and provide some examples. Furthermore, the morphology of swimmeret neurons can be assessed using various staining techniques. Here we provide examples of intracellular (by iontophoresis) dye filled neurons and backfills of pools of swimmeret motor neurons. In our lab we use this preparation to study basic functions of fictive locomotion, the effect of sensory feedback on the activity of the CNS, and coordination between microcircuits on a cellular level.

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

ザリガニのSwimmeretシステム：神経索と運動パターンの細胞外記録の解剖のための実践ガイド

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

なぜ定量事項：での表現型のキャラクタリゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経筋接合部

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

マウスにおける横隔膜の運動ニューロンの逆行性神経解剖学的トレーシング

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...