著者らは、この研究に利用されたRhipicephalus microplus ticksとLucas Karbanowiczのビデオ撮影の支援について、Biosecurity Tick Colony（Queensland Agriculture＆Fisheries、Australia）に感謝したい。

1. R. microplusからのGut上皮の解剖<ol><li>実験の日に牛の半虫歯のダニを集める。宿主から取り出した後24時間以内にダニを解剖する。 </li><li> 92 mm×16 mmのペトリ皿の底にダクトテープのストリップを貼り付けます。スーパーグルーをテープに追加してください。ティックを腹側をスーパーグルーの上に置き、2分間乾燥させる。 </li><li> 100mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）をペトリ皿に注ぎ、またはダニが完全に沈むまで。 </li><li>サイズ11のメスを使用して、目の上から下の祝祭に、ダニの両側を切ります。 </li><li>滅菌鉗子を使用して、完全に内部の器官を公開するために、 傷跡とalloscutumを削除します。 </li><li>汚染を防ぐために、細かい白い糸状の器官（気管）および他の膜を除去する。 </li><li>鉗子を使用して腸を取り除き、上部領域をつまみ、カーカス。他の組織が解剖されていないことを確認して、残りの腸組織を除去する。 </li><li>塩化カルシウムおよび硫酸マグネシウムを含まない氷冷ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）にプロテアーゼ阻害剤カクテル（PIC）を入れて腸管を保管する。ガットをドライアイスで凍らせ、-20℃で保存する。 注：腸内臓の切開および内臓器官の詳細を補助するために、D. Sonenshineの第3.1章、「生物学の目録」 19を参照のこと 。 </li></ol> 2.上皮細胞の解離<ol><li>解剖した腸を50 mLチューブの中の70μmセルストレーナーに注ぎます。 </li><li>溶液が透明になるまで腸組織をPICで50mLの氷冷HBSSで洗い流し、腸が白く/澄んだ外観になるようにする。 </li><li> PICを含む30 mLの氷冷HBSS中で腸を再懸濁し、穏やかに混合し、4℃で500 xgで10分間遠心して腸をペレット化する。上清を除去し、洗浄プロセスを3回繰り返す。 </li><l（DMEM）、2％ウシ胎仔血清（FCS）、0.5mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、1mMトリス（2mM）、​​10mMトリス-HCl （TCEP）、PICを添加し、6rpmのローラーを用いてゆっくりと回転させながら37℃で60分間インキュベートする。 </li><li>懸濁液を250μmの細胞ストレーナでろ過し、フロースルーをボルテックスし、70μmの細胞ストレーナに通して残りのフロースルーを集める。 </li><li>懸濁液を4℃で500 xgで20分間遠心分離して、単一細胞をペレット化する。 </li></ol>密度遠心分離勾配を用いた単一上皮細胞の単離<ol><li> AP15プレフィルターペーパーでろ過することにより、密度遠心分離勾配（ 例えば 、Percoll）を調製する。 mqH 2 0（v / v）中の40％および20％パーコールを調製し、4℃で1時間冷却してから、勾配を層状にする。 </li><li>蠕動の使用ポンプを最低速度でセットし、層3mLの40％密度遠心分離勾配を16mL超遠心管に入れ、氷上で15分間静置する。ポンプの速度は、1分あたり1mL未満の流速につながるはずです。 </li><li>チューブを45°の角度に傾け、蠕動ポンプを使用して40％層の上に20％密度の遠心分離勾配を層状にする。ポンプの速度は1分あたり1mL以下の流量になるはずです。層を氷上で15分間静置する。 </li><li>蠕動ポンプを流速1mL以下で使用して、20-40％密度遠心分離勾配上にダニ腸細胞を含むDMEM培地3mLを層状にする。 </li><li>最大加速と最小減速のために遠心機をプログラムします。 600×gで10分間遠心分離する。 DMEM：20％密度遠心分離勾配と20％：40％密度遠心分離勾配との間の中間相を収集し、上皮単細胞を単離する。その後の分析のために収集した中間相を4℃で保存する。 </li></ol><html> 4.細胞単離の評価<ol><li> 血球計算盤 <ol><li>赤血球計スライドをアルコールできれいにする。 </li><li>細胞を静かに上下にピペッティングして細胞を再懸濁する。 100μLの細胞懸濁液をピペットし、1.5mLのマイクロ遠心チューブに入れる。 </li><li> 400μLの0.4％トリパンブルーを加える。チューブを軽く叩いて軽く混ぜる。 </li><li>トリパンブルー処理した細胞懸濁液100μLをピペットして、血球計の両室をゆっくりと満たす。 </li><li> 10倍の対物レンズを備えた血球計のグリッドラインに焦点を当て、光学顕微鏡下に血球計を置く。 </li><li>ハンドヘルドタリーカウンターを使用して、16個の正方形のセット内の生きていない染色されていない細胞を数えます。同じ広場内で、青色の死んだ細胞を数えます。 16個の四角形の4つのセットがカウントされるまでカウントを続けます。 </li><li>次の式を使用して、mLあたりの総細胞数を計算します。 47eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li>次の式を使用して、細胞の生存率を計算します。 <img alt="式2" src="/files/ftp_upload/55747/55747eq2.jpg" /></li></ol></li><li> 細胞分離の可視化 <ol><li>単離した細胞1μLをHBSS 9μLに1.5 mLのマイクロ遠心チューブで希釈します。微量遠心チューブを軽くたたいて混合します。 </li><li>スライドガラスの中央にHBSS中の単離された細胞5μLをピペットで加える。 4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を用いて3滴のマウント媒体を塗布する。 </li><li>スライドを室温で5分間インキュベートする。気泡を避けて、慎重に準備の上にカバースリップを置きます。 </li><li> DAPIで染色した細胞を蛍光顕微鏡下で励起360nm、発光460nmで可視化する。 </li></ol></li></ol> 5.細胞表面タンパク質ビオチン化<ol><li>ビオチン化ビオチン（タイプA）コンジュゲーションを用いた100μLの単細胞上皮細胞キットに、製造者の指示に従って、1：1の表面タンパク質とコンジュゲートのモル比</li><li>細胞溶解のために、100μLのPBS、1％Triton X-100,10％グリセロール、100μM酸化型グルタチオンおよびPICをビオチン化細胞に加える。 10分ごとに穏やかに混合しながら、氷上で1時間インキュベートする。 </li><li>ビオチン化細胞を20,000 xgで4℃で20分間遠心分離し、不溶性物質をペレットにします。細胞質およびビオチン化膜タンパク質を含む上清を集める。 </li><li> Bradfordアッセイを用いてタンパク質濃度を決定する。 </li></ol> 6.ビオチン化表面タンパク質の単離<ol><li> 1.5 mLのマイクロ遠心チューブに50μLのストレプトアビジン磁性ビーズを加えます。 </li><li>チューブを磁気スタンドに入れ、ビーズをチューブの側面に集めます。上清を除去して捨てる。 </li><li> 1000μLのTBS、0.1％Tween-20をチューブに添加する。静かに混ぜて、磁性スタンでビーズを集めるd。上清を除去して捨てる。 </li><li> 40μgのビオチン化細胞表面タンパク質を、洗浄した磁気ビーズを含む1×PBS中で300μLに希釈する。撹拌しながら室温で2時間インキュベートする。 </li><li>磁気スタンドでビーズを回収し、上清を除去して捨てる。 </li><li>チューブに300μLのTBS、0.1％Tween-20を加え、穏やかに混合してビーズを再懸濁する。ビーズを回収し、上清を除去し、廃棄する。この洗浄工程を2回繰り返す。 </li><li> 100μLの0.1MグリシンpH2.0を磁気ビーズに添加し、室温で5分間インキュベートする。ビーズを回収し、溶出したビオチン化表面タンパク質を含む上清を除去する。 </li><li> 4〜20％Tris-MOPS SDS-PAGEゲル上で分離した表面タンパク質を可視化する。 </li></ol>ビオチン化表面タンパク質の評価<ol><li> ドットブロット <ol><li>ニトロセルロース膜の7cm×3cmのストリップを切断する。 </li><li>合計10μgを適用するt含有量（上記1.8から）、および10μgのビオチン化表面タンパク質を膜に添加した。室温で15分間乾燥させる。 </li><li>容器に移し、100mLのブロッキングバッファーに浸す。攪拌しながら室温で1時間インキュベートする。ブロッキングバッファーを破棄します。 </li><li>攪拌しながら100μLのPBS、0.05％Tween-20中でニトロセルロース膜を5分間洗浄する。洗浄バッファーを捨て、洗浄を3回繰り返す。 </li><li> 100μLのPBS、0.05％Tween-20中の1/5000ストレプトアビジン - 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を室温で2時間インキュベートし、残りの溶液を捨てる。 </li><li>ニトロセルロース膜を100μLのPBS、0.05％Tween-20中で5分間攪拌しながら洗浄する。洗浄バッファーを捨て、洗浄を3回繰り返す。 </li><li>検出のために、4-クロロ-1-ナフトール1錠を10mLの氷冷メタノールに溶解する。メタノールストック4mLを20mLのTBSに加える。 10μLの新鮮な30％過酸化水素とイミドニトロセルロース膜に適用する。 </li><li>基質が不溶性青色最終生成物を生成するまで、室温で攪拌しながらインキュベートする。これには2〜15分かかります。 </li><li>検出溶液を捨て、膜を100μLのmqH 2 Oで3回洗浄する。 </li></ol></li><li> ELISAアッセイ <ol><li> 200 ngの各サンプルを100 mM炭酸塩コーティングバッファー400μLで希釈し、ELISAプレート（平底ウェル）の最初の列（A＃）の2レーンをコートし、 </li><li>列（BH）の他のすべての対応するウェルに100mM炭酸塩コーティングバッファー100μLを加えます。 </li><li>行Aの各ウェルから100μLをピペッティングし、行Bに移すことによって、各サンプルの連続希釈物を調製する。ピペットで穏やかに混合し、泡を発生させない。行Hの各ウェルから最後の100μLを捨てて、各列の希釈を繰り返す。 </li><li>プレートをパラフィルムで覆い、4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>板を洗う200μLのPBS、0.05％Tween-20 /ウェルで3回洗浄した。 </li><li>コーティングしたウェルに200μLのブロッキングバッファーを加え、Parafilmで覆い、4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>ブロッキング緩衝液中で1 / 15,000のストレプトアビジン-HRPを希釈し、100μLをプレートの各ウェルに加える。パラフィルムで覆い、4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>ウェルあたり200μLのPBS、0.05％Tween-20でプレートを5回洗浄する。 </li><li>検出するために、1ウェル当たり100μLのTMB試薬を加える。十分な発色の後、通常10〜15分の間に、100μLの1Mリン酸を加えて反応を停止させる。 </li><li> λ= 450nmで各ウェルの吸光度を読み取る。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rodriguez-Valle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Rhipicephalus+(Boophilus)+microplus+Bm86+against+Hyalomma+dromedarii+and+Amblyomma+cajennense+tick+infestations+in+camels+and+cattle.">Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle.</a> Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).</li><li>De Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bm86+antigen+induces+a+protective+immune-response+against+Boophilus+microplus+following+DNA+and+protein+vaccination+in+sheep.">Bm86 antigen induces a protective immune-response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 71, 151-160 (1999).</li><li>Garc&#237;a-Garc&#237;a, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+variations+in+the+Boophilus+microplus+Bm86+locus+and+implications+for+immunoprotection+in+cattle+vaccinated+with+this+antigen.">Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen.</a> Exp. Appl. Acarol. 23, 883-895 (1999).</li><li>Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acaricide+resistance+in+cattle+ticks+and+approaches+to+its+management:+The+state+of+play.">Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: The state of play.</a> Vet. Parasitol. 203, 6-20 (2014).</li><li>Kearney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Acaricide (chemical) resistance in cattle ticks. , (2013).</li><li>Foil, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+influence+the+prevalence+of+acaricide+resistance+and+tick-borne+diseases.">Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases.</a> Vet. Parasitol. 125, 163-181 (2004).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+level+expression+of+the+B.+microplus+Bm86+antigen+in+the+yeast+Pichia+pastoris+forming+highly+immunogenic+particles+for+cattle.">High level expression of the B. microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle.</a> J Biotechnol. 33, 135-146 (1994).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+vaccination+with+a+recombinant+Bm86+antigen+preparation+on+natural+infestations+of+Boophilus+microplus+in+grazing+dairy+and+beef+pure+and+cross-bred+cattle+in+Brazil.">Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of Boophilus microplus in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil.</a> Vaccine. 13 (18), 1804-1808 (1995).</li><li>Lew-Tabor, A. E., Rodriguez Valle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+reverse+vaccinology+approaches+for+the+development+of+vaccines+against+ticks+and+tick+borne+diseases.">A review of reverse vaccinology approaches for the development of vaccines against ticks and tick borne diseases.</a> Ticks Tick Borne Dis. 7, 573-585 (2016).</li><li>Capella, A. N., Terra, W. R., Ribeiro, A. F., Ferreira, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+removal+and+characterization+of+the+microvillar+membranes+isolated+from+two+midgut+regions+of+Spodoptera+frugiperda+(Lepidoptera).">Cytoskeleton removal and characterization of the microvillar membranes isolated from two midgut regions of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera).</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 793-801 (1997).</li><li>Cioffi, M., Wolfersberger, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+separate+apical,+lateral+and+basal+plasma+membrane+from+cells+of+an+insect+epithelium.+A+procedure+based+on+tissue+organization+and+ultrastructure.">Isolation of separate apical, lateral and basal plasma membrane from cells of an insect epithelium. A procedure based on tissue organization and ultrastructure.</a> Tissue Cell. 15, 781-803 (1983).</li><li>Koefoed, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+method+to+isolate+the+basal+lamina+of+insect+midgut+epithelial+cells.">A simple mechanical method to isolate the basal lamina of insect midgut epithelial cells.</a> Tissue Cell. 17, 763-768 (1985).</li><li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon.">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods Mol. Med. 50, 15-20 (2001).</li><li>Terra, W. R., Costa, R. H., Ferreira, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membranes+from+insect+midgut+cells.">Plasma membranes from insect midgut cells.</a> An. Acad. Bras. Ci&#234;nc. 78, 255-269 (2006).</li><li>Vargas, A. E., Markoski, M. M., Ca&#241;edo, A. D., Helena, F., Nardi, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation+and+culture+of+intestinal+epithelial+stem+cells+from+murine+intestine.">Identification, isolation and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine.</a> Stem Cells. 879, 479-490 (2012).</li><li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function.">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).</li><li>Karhemo, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+isolation+of+biotinylated+cell+surface+proteins+reveals+novel+players+in+cancer+metastasis.">An optimized isolation of biotinylated cell surface proteins reveals novel players in cancer metastasis.</a> J. Proteomics. 77, 87-100 (2012).</li><li>Obenchain, F. R., Galun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+Ticks.">Physiology of Ticks.</a> Current Themes in Tropical Science Volume 1. , 201-205 (1982).</li><li>Sonenshine, D., Roe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.1.">Chapter 3.1.</a> &amp;#34;Biology of Ticks&amp;#34. 1, (2014).</li><li>Raikhel, A. S., Balashov, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &amp;#34;An Atlas of Ixodid Tick Ultrastructure&amp;#34 (English Translation). , (1983).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

蔓延をチェック牛が殺ダニ剤1、4の使用に頼るコントロールの最も一般的な方法で、世界の熱帯・亜熱帯地域で家畜産業にとって大きな問題となります。 Bm86は、以前に起因するBm86地理的配列変異と通常は4を昇圧する要件へのワクチン戦略として限られた成功を収め、R.のmicroplusの侵入に対する保護10抗原としてダニの腸上皮表面の中に同定されました。 上皮分離方法論に応じ焦点以前の刊行物は、主に、脊椎動物や昆虫種9、11、12、13、14に着目しました。例えば、中腸を分離する早期分画試行哺乳類の技術を利用して、異なる細胞構造および組織による同じ方法論を昆虫に適用することができないことを見出した12 。また、哺乳類の技術は、酵素的に細胞-細胞接合タンパク質9、13を消化するために、dipaseまたはコラゲナーゼのいずれかの使用に依存します。ディパーゼおよびコラゲナーゼは、細胞表面結合タンパク質にかなり影響するため、その使用に依存する技術は細胞表面タンパク質研究には適していません15 。昆虫中腸細胞分離は、現在、2つの技術に焦点を当てている。最初は、連続した線状スクロース勾配8、11、12、14上の分離に続いて、超音波を介して腸の機械的破壊を利用します。この機械的技術は、汚染物質がほとんどないサンプルを生成し、ハウverはマイクロビル膜14の収率が低い。第2の技術は、微小柱膜を放出させるための膜のトリス破壊に依存する8 。 この論文で概説されている技術は、上皮細胞の単離、表面タンパク質のビオチン化およびそれらの単離16を可能にし、質量分析法またはFACSのような下流の適用によるさらなる研究を可能にする。本明細書に記載の方法は、キレート剤EDTAおよび還元剤TCEPを利用する。 EDTAはカルシウムイオンを封鎖し、カドヘリンを阻害し、カドヘリン媒介細胞 - 細胞接合部を破壊するのに対して、TCEPは、腸内腔を上皮から隔てるグリカンに富む粘液様腹膜マトリックスの粘性を与えるジスルフィド結合を減少させる。上皮は、振盪することによって組織を機械的に破壊した後、不均一な勾配遠心分離遠心分離勾配。 DMEM：20％密度遠心分離勾配と20％：40％密度遠心分離勾配層との間で上皮細胞を単離する。 上皮細胞解離中のより高い温度の利用は、巨大組織を腸から解離させ、上皮細胞を単離することができなくなる。上皮細胞の解離が迅速に行われることを確実にする。氷冷緩衝液の使用および高い遠心分離速度の回避は、生きた生存細胞を保持する上で重要である。それにもかかわらず、基底板からのより大きな細胞の離脱は、いくらかの汚染をもたらす可能性がある。また、ダニの中腸上皮は、最後の血液ミール18、19、20からの時間に大幅に依存して変化させます。 したがって、このプロトコルは、 R。microplus </em&gt;ダニを開始し、処方された技法は、ダニの最後の血液摂取がいつ行われたかに依存して変化する細胞集団を有し得る。このプロトコルは、様々な上皮細胞集団を収集するように設計されているが、使用されるダニが半エンボスされるにつれて、視覚化された細胞（ 図1 ）は均一な性質を有する。 結論として、この研究で利用された方法はR. microplusの腸全体から上皮細胞を首尾よく分離した。 R. microplus上皮細胞の表面からのタンパク質をさらなる分析および研究のために得た。最後に、開発されたプロトコールは、ダニの腸からの上皮細胞の潜在的収量、および細胞のビオチン化表面タンパク質の効率を実証した。開発されたプロトコルは、ダニを調査するための努力の中で経済的に重要なダニ種に利用することができる：膜タンパク質comを研究することによる宿主相互作用腸の位置。

それはウシダニ熱（バベシア症）、アナプラズマおよびウマピロプラズマ病1、2、3、4をベクターとして牛がダニリピセファルスmicroplusは 、熱帯及び亜熱帯地域の家畜産業上の経済的影響の点で最も重要な外部寄生虫です。化学殺ダニ剤の使用のような従来の方法は、ミルクおよび肉の化学的残留物の存在、化学的に耐性のあるマダニの有病率の増加などの暗黙の欠点を有するが、有害作用を減少させるために、ウシのダニ防除に努力が払われてきた5、6、7。その結果、耐性牛、生物学的防除（バイオ農薬）およびワクチンの使用など、ダニ防除の代替法の開発が研究されているINES 4、5、6、7、8、9。 ワクチン候補として利用できるタンパク質の追求において、現在の研究はダニの腸に焦点が当てられている。中腸壁は、基底板の外側が筋肉のネットワークを形成しながら、薄い基底板上に載っている上皮細胞の単一層から構築される。光および電子顕微鏡観察は、中腸が予備細胞（未分化細胞）、分泌細胞および消化細胞の3つのタイプからなることを示している。細胞型の数は、生理学的相によってかなり異なる。分泌及び消化細胞は予備セル18、19、20に由来両方。 cDNAライブラリーの構築ダニ腸の組成物は、潜在的なワクチン候補2、3、4のように、そのようなBm86などの抗原性タンパク質の同定につながっている調べました。糖タンパク質Bm86はダニ腸細胞の表面に局在し、ワクチン接種された牛のウマダニ （ R. microplus ）に対する防御免疫応答を誘導する。免疫された宿主により産生された抗Bm86 IgGは、ダニによって摂取され、ダニ腸細胞の表面上でこの抗原を認識し、その後ダニ腸組織の機能および完全性を妨げる。 Bm86抗原に基づくワクチンは、萌芽雌の数、体重および生殖能力を低下させることにより、 R. microplusおよびRhipicephalus annulatusの効果的な防除を示し、その後のダニ世代において幼虫の蔓延を減少させる4 。しかし、Bm86ベースのワクチンはすべてのティックステージに対して有効ではなく、R.のmicroplusのいくつかの地理的な株に対する不満足な有効性を示し、その結果、牛肉及び酪農産業が乏しいこれらのワクチン2,4を採用しています。 ダニの腸から上皮細胞を単離する能力は、異なる環境条件下での形態学および生理学を含むタンパク質膜組成を決定する研究の進行を可能にする重要な革新である。本明細書に記載の方法は、キレート剤エチレンジアミン四酢酸（EDTA）および還元剤トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）を利用して、その上皮支持組織10から上皮を放出させる。上皮は、振盪による組織の機械的破壊、続いてPercollにおける不連続勾配遠心分離の後に回収される。本稿では、ダニ腸内分泌腺の単離のための実現可能かつ新規な技術について述べる。真菌細胞。これらの上皮細胞の表面から単離されたビオチン化細胞表面タンパク質は、その後、FACSおよび/またはLC-MS / MS分析などの下流の用途で分析され得る。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mM Carbonate Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mL centrifuge tubes with sealing cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3138-0016</td>
			<td>Cool in ice prior to gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#181;M cell strainer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>87791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;,5,5&#8242;-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0440</td>
			<td>Stored at 4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Labscene</td>
			<td>BSPA5.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Tris-MOPS Gel</td>
			<td>Gen Script</td>
			<td>M42015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Chloro-1-naphthol tablet</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tube</td>
			<td>Corning Blue</td>
			<td></td>
			<td>30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP15 filter paper</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AO1504200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin (Type A) Conjugation Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab102865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DP Manager&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>2.2.1.195</td>
			<td>Cell imagery software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duct Tape</td>
			<td>Home Handyman</td>
			<td></td>
			<td>48mm x 25mm Duct Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>DMEM - ice cold for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0105-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F96 Maxisorp Immuno Plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td>FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope&#160;</td>
			<td>&#160;Olympus&#160;</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6057-20ML</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td>#9 Dumont - Switerzland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Glycerol for molecular biology &#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>410225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-Held Counter</td>
			<td>Officeworks</td>
			<td>JA0376230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>H9394</td>
			<td>HBSS &#8211; ice cold for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Optik Lakor</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione oxidized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separation Stand</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>-</td>
			<td>4-Tube Magnetic Separation Rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZRXQ003WW</td>
			<td>Integral Water Purification System for Ultrapure Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose Membrane</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>66485</td>
			<td>30cm x 3M pure nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained protein Ladder</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>SM0671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1644-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>7518-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>37573</td>
			<td>Stored at 4C. Blocking Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8215-5ML</td>
			<td>PIC &#8211; stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford Dye Reagent 1x</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>500-0205</td>
			<td>For Bradford Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start BSA Standards</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>500-0207</td>
			<td>BSA standards for Bradford Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Lab. Co</td>
			<td></td>
			<td>Size 11 Scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SilverQuest TM Staining Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simply Blue TM Safe Stain&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall C6+ Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1420S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue - Ultra Fast Mini</td>
			<td>UHU</td>
			<td></td>
			<td>UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table-top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>VM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>GD100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of biotinylated cell surface proteins from rhipicephalus microplus epithelial gut cells

Rhipicephalus microplus - 家畜ダニ - いくつかの病原体のベクターとしての家畜への経済的影響の観点から、最も重要な外部寄生生物である。ダニ腸管上皮細胞の表面上に位置するBM86などのワクチン候補の発見に焦点を当てて、その有害な影響を減少させるための牛ダニ制御に努力が払われてきた。現在の研究は、他のワクチン候補をスクリーニングするために、cDNAおよびゲノムライブラリーの利用に焦点を当てている。ダニ腸細胞の単離は、ダニ腸細胞膜上の表面タンパク質の組成を調べる上で重要な利点を構成する。この論文は、半エンボスされたR. microplusのダニの腸内容物から、上皮細胞を単離するための新規かつ実行可能な方法を構成する。このプロトコルは、上皮細胞を上皮支持組織から放出させるためにTCEPおよびEDTAを使用し、不連続密度遠心分離グラジエント他の細胞型から上皮細胞を分離することができる。 FACSまたはLC-MS / MS分析での下流の適用を可能にするストレプトアビジン結合磁気ビーズを用いて、細胞表面タンパク質をビオチン化し、ダニ消化管上皮細胞から単離した。

R. microplusの腸組織から上皮細胞を単離した（ 図1） 。 このプロトコールを用いて調製したダニ腸上皮細胞の代表的蛍光顕微鏡画像を図2Aに示す 2B。 セミエンゴールR.マイクロプラスで細胞単離を行うと、細胞は、特異的、球状、平滑な表面形態およびサンプル全体にわたって一貫したサイズとして現れる。腸の細胞集団のサイズとタイプの違いは、刻み目が充実した成人になると明らかになります。 単離された上皮細胞の核のDAPIによる蛍光染色は、細胞を視覚化するのを助ける。不十分な分離は、エピスの不完全な解離を含むように視覚化される変化する細胞サイズおよび形態（ 図2Cおよび2D ）によって同定された様々な細胞集団を有するエリアル細胞は、 このプロトコールを利用して、75-80％の生存率を有する、50ダニの腸切除術からの約1.2×10 7細胞/ mLをR. microplus tick gutから首尾良く単離した。チックガットを白く塗りつぶして白く透明なPercoll勾配にするまで、宿主タンパク質（ 図3A ）からの交差汚染を最小限に抑えることができます （ 図3B ）。 表面に結合したタンパク質を、表面結合タンパク質のビオチン化、細胞膜の破壊および磁気ストレプトアビジンビーズによるビオチン化表面タンパク質の精製によって単離した。合計20〜24μgの精製された生物細胞このプロトコールを利用して、50倍ダニ腸の初期切開からダウンストリーム適用のために、浮遊表面タンパク質を単離することができる。 SDS-PAGE（ 図4A ）、銀染色（ 図4B ）、ドットブロット（ 図5 ）およびELISA（ 図6 ）によるタンパク質の比較は、記載された方法がR. microplus tickから単離された上皮細胞からのビオチン化表面タンパク質腸。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55747/55747fig1.jpg" /> 図1 ： R. microplus 中腸細胞の 表面に存在するビオチン化タンパク質を単離するための模式 図 。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55747/55747fig1large.jpg" target="_blank">してください</a>この図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。 <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55747/55747fig2.jpg" /> 図2 ： DAPIで染色し た R. microplus midgut上皮細胞の 蛍光顕微鏡視覚化（100倍） 。このソフトウェアを用いて蛍光オーバーレイを行った。 A＆B） R. microplus中腸から正常に単離された上皮細胞を表す。 C / D） R. microplus腸から単離された上皮細胞は、より大きなダニ組織で汚染されていた。 <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55747/55747fig3.jpg" /> 図3 ：DMEMを含有するパーコール勾配：20％パーコール：40％パーコール。上皮細胞層は、DMEM：20％PercollとPercoll 20：40％を使用しています。 （ A ）十分な洗浄工程なしに腸切除を行う。 （ B ）適切な洗浄ステップで腸切除を行う。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55747/55747fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55747/55747fig4.jpg" /> 図4 ：ビオチン化表面タンパク質の電気泳動分離を、10μgの試料を用いて55分間140Vで4〜20％Tris-MOPSゲル上で実行した。 （L）PageRulerプレステインドプロテインラダー（1）非標識R. microplus全体腸サンプルを（2）ビオチン化タンパク質は、ステップ6に従ってR.のmicroplus全体腸から抽出した（3）非標識R.のmicroplus腸から抽出された上皮細胞からのタンパク質（4 ） R. microplusから抽出したビオチン化タンパク質（ A ）Comassie blue（ B ）Silver染色によって染色されたSDS-PAGE。 <img alt="図5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55747/55747fig5.jpg" /> 図5 ：ドットブロット分析。ストレプトアビジン-HRP結合体は1 / 5,000に希釈した。 （ A ）生のダニ腸内タンパク質抽出物の合計10μg（ B ）精製された上皮細胞（10μg）から抽出されたビオチン化表面タンパク質。 <img alt="図6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55747/55747fig6.jpg" /> 図6 ：ELISAを利用したビオチン化表面タンパク質生存度の評価。異なる濃度のビオチン化ticに対して1 / 15,000に希釈したStrep-HRPコンジュゲート抗体によって表面タンパク質のELISAを開発したk腸内タンパク質（0.7 ng〜100 ng）。 ELISAの陰性対照として、非標識ダニ腸内タンパク質およびウシ血清アルブミン（BSA）を用いた。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55747/55747fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rhipicephalus microplus腸組織から上皮細胞を単離するために、改変密度遠心分離勾配に基づく方法論を利用した。表面結合タンパク質をビオチン化し、下流の用途に利用するためにストレプトアビジン磁気ビーズで精製した。

ビオチン化細胞表面タンパク質の精製<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt;上皮腸細胞

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

purification-biotinylated-cell-surface-proteins-from-rhipicephalus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

9.4K ビュー.  The University of Queensland.  Rhipicephalus microplus腸組織から上皮細胞を単離するために、改変密度遠心分離勾配に基づく方法論を利用した。表面結合タンパク質をビオチン化し、下流の用途に利用するためにストレプトアビジン磁気ビーズで精製した。 

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Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

真核細胞からのタンパク質複合体のタンデムアフィニティー精製

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

生化学

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

細胞内タンパク質間相互作用を研究するビオチン化セル透過ペプチド

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for culturing or for obtaining cell lysates. In this protocol, the portal vein is used as the site for catheterization, rather than the vena cava, as this limits contamination of other possible cell types in the final liver preparation. No special instrumentation is required throughout the procedure. A water bath is used as a source of heat to maintain the temperature of all the buffers and solutions. A standard peristaltic pump is used to drive the fluid, and a refrigerated table-top centrifuge is required for the centrifugation procedures. The only limitation of this technique is the placement of the catheter within the portal vein, which is challenging on some of the mice in the 18 - 25 g size range. An advantage of this technique is that only one vein is utilized for the perfusion and the access to the vein is quick, which minimizes ischemia and reperfusion of the liver that reduces hepatic cell viability. Another advantage to this protocol is that it is easy to distinguish live from dead hepatocytes by eyesight due to the difference in cellular density during the centrifugation steps. Cells from this protocol may be used in cell culture for any downstream application as well as processed for any biochemical assessment.

The goal of this protocol is to obtain high viability and high yield of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from liver. This is accomplished by perfusing the liver with a type IV collagenase solution via the portal vein, followed by differential centrifugation to obtain hepatocytes and sinusoidal endothelial cells.

精製マウス肝類洞内皮細胞と肝細胞の灌流

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and podocytes with their slit diaphragms. The delicate structure of the glomerular filter, especially the slit diaphragm, relies on the interplay of diverse cell surface proteins. Studying these cell surface proteins has so far been limited to in vitro studies or histologic analysis. Here, we present a murine in vivo biotinylation labeling method, which enables the study of glomerular cell surface proteins under physiologic and pathophysiologic conditions. This protocol contains information on how to perfuse mouse kidneys, isolate glomeruli, and perform endogenous immunoprecipitation of a protein of interest. Semi-quantitation of glomerular cell surface abundance is readily available with this novel method, and all proteins accessible to biotin perfusion and immunoprecipitation can be studied. In addition, isolation of glomeruli with or without biotinylation enables further analysis of glomerular RNA and protein as well as primary glomerular cell culture (i.e., primary podocyte cell culture).

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Here we present a protocol for murine in vivo labeling of glomerular cell surface proteins with biotin. This protocol contains information on how to perfuse mouse kidneys, isolate glomeruli, and perform endogenous immunoprecipitation of the protein of interest.

腎糸球体と腎糸球体細胞表面タンパク質の標識体内の分離

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

生体内細胞からのRNA単離に対するリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

フマリアルセトーアセテートヒドロラーゼドメイン含有タンパク質の発現、精製、結晶化、酵素アッセイ

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) hydration, mucus viscosity and activity of antimicrobial peptides, key parameters involved in innate defense of the lungs. This is of primary relevance in the field of chronic respiratory diseases such as cystic fibrosis (CF) where these parameters are dysregulated. While different groups have studied ASL pH both in vivo and in vitro, their methods report a relatively wide range of ASL pH values and even contradictory findings regarding any pH differences between non-CF and CF cells. Furthermore, their protocols do not always provide enough details in order to ensure reproducibility, most are low throughput and require expensive equipment or specialized knowledge to implement, making them difficult to establish in most labs. Here we describe a semi-automated fluorescent plate reader assay that enables the real-time measurement of ASL pH under thin film conditions that more closely resemble the in vivo situation. This technique allows for stable measurements for many hours from multiple airway cultures simultaneously and, importantly, dynamic changes in ASL pH in response to agonists and inhibitors can be monitored. To achieve this, the ASL of fully differentiated primary human airway epithelial cells (hAECs) are stained overnight with a pH-sensitive dye in order to allow for the reabsorption of the excess fluid to ensure thin film conditions. After fluorescence is monitored in the presence or absence of agonists, pH calibration is performed in situ to correct for volume and dye concentration. The method described provides the required controls to make stable and reproducible ASL pH measurements, which ultimately could be used as a drug discovery platform for personalized medicine, as well as adapted to other epithelial tissues and experimental conditions, such as inflammatory and/or host-pathogen models.

We present a protocol to make dynamic measurements of the airway surface liquid pH under thin film conditions using a plate-reader.

初代ヒト気道上皮細胞の気道表面液 pH をリアルタイムで半自動で蛍光測定

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug targets. Yet, a major barrier to their characterization and exploitation in academic or industrial settings is that most biochemical, biophysical, and drug screening strategies require these proteins to be in a water-soluble state. Our laboratory recently developed the peptidisc, a membrane mimetic offering a &#8220;one-size-fits-all&#8221; approach to the problem of membrane protein solubility. We present here a streamlined protocol that combines protein purification and peptidisc reconstitution in a single chromatographic step. This workflow, termed PeptiQuick, allows for bypassing dialysis and incubation with polystyrene beads, thereby greatly reducing exposure to detergent, protein denaturation, and sample loss. When PeptiQuick is performed with biotinylated scaffolds, the preparation can be directly attached to streptavidin-coated surfaces. There is no need to biotinylate or modify the membrane protein target. PeptiQuick is showcased here with the membrane receptor FhuA and antimicrobial ligand colicin M, using biolayer interferometry to determine the precise kinetics of their interaction. It is concluded that PeptiQuick is a convenient way to prepare and analyze membrane protein-ligand interactions within one&#160;day in a detergent-free environment.

We present a method that combines membrane protein purification and reconstitution into peptidiscs in a single chromatographic step. Biotinylated scaffolds are used for direct surface attachment and measurement of protein-ligand interactions via biolayer interferometry.

PeptiQuick、合理化されたタンパク質結合アッセイのためのバイオチン化ペプチドディスクへの膜タンパク質のワンステップ組み込み

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm phenotyping can be used to classify genotypes based on SG morphotype using scanning electron microscopic (SEM) analysis. SGs can be visualized using SEM by slicing through the kernel (pericarp, aleurone layers, and endosperm) and exposing the organellar contents. Current methods require the rice kernel to be embedded in plastic resin and sectioned using a microtome or embedded in a truncated pipette tip and sectioned by hand using a razor blade. The former method requires specialized equipment and is time-consuming, while the latter introduces a new host of problems depending on rice genotype. Chalky rice varieties, particularly, pose a problem for this type of sectioning due to the friable nature of their endosperm tissue. Presented here is a technique for preparing translucent and chalky rice kernel sections for microscopy, requiring only pipette tips and a scalpel blade. Preparing the sections within the confines of a pipette tip prevents rice kernel endosperm from shattering (for translucent or &#8216;vitreous&#8217; phenotypes) and crumbling (for chalky phenotypes). Using this technique, endosperm cell patterning and the structure of intact SGs can be observed.

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

This protocol allows for the preparation of transverse sections of cereal seeds (e.g., rice) for the analysis of endosperm and starch granule morphology using scanning electron microscopy.

成熟米の横断断面(オリザ・サティバ L.ピペットチップを固定化支援として用いた走査電子顕微鏡イメージング用カーネル

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and isopycnic density gradient centrifugation. The major advantage of this procedure is that it does not rely on the sole use of solubilizing detergents to obtain subcellular fractions. This makes it possible to separate the plasma membrane from other membrane-bound organelles of the cell. This procedure will facilitate the determination of protein localization in cells with a reproducible, scalable, and selective method. This method has been successfully used to isolate cytosolic, nuclear, mitochondrial, and plasma membrane proteins from the human monocyte cell line, U937. Although optimized for this cell line, this procedure may serve as a suitable starting point for the subcellular fractionation of other cell lines. Potential pitfalls of the procedure and how to avoid them are discussed as are alterations that may need to be considered for other cell lines.

This fractionation protocol will allow researchers to isolate cytoplasmic, nuclear, mitochondrial, and membrane proteins from mammalian cells. The latter two subcellular fractions are further purified via isopycnic density gradient.

等密度勾配精製によるU937細胞の細胞分画

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...