この作品は、ANR (ANR-11-LABX-0016-01)、IHU セスタス プロジェクトも、資金を管理する"Investissements d'Avenir"フランス政府プログラムの一部である Labex 囲碁プロジェクト (n ° ANR-11-LABX-0016-01) のコンテキストで実現した、"Investissements d'Avenir「フランス政府プログラム、管理によって、フランス国立研究機関 (ANR) (ANR-10-IBHU-005)。IHU セスタス プロジェクトはナントとペイ ・ ド ・ ラ ・ ロワール地方でもサポートされます。

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

新しく移植の受信者へ合計脾細胞の養子送金する誘導または治療による細胞の存在を検出する効率的な方法です。ホスト照射誘起過渡のリンパ球減少は、転送後の細胞生存率と許容範囲の確立を推進しています。また、亜致死照射は免疫寛容免疫再構築、感染耐性34と呼ばれる現象の中に新しい細胞に変換するプロパティを持つセルの時間を残します。通常、よく説明 CD4+CD25高Foxp3+CD127低トレランスを観察すると Treg が学んだ最初。ただし、負の分数の転送 (脾細胞の cd4 枯渇+Treg) により時々 拡張機能はすでに知られている細胞と新しい細胞集団1、2の同定 3,4。AdCD40Ig 誘起寛容で、CD4 の転送+T 細胞枯渇脾細胞は、CD8 の発見を明らかに+CD45RC低Treg1。さらに、合計 CD8 の連続転送+ T 細胞と徐々 に細胞の新しい人口を識別するためにそのような方法の可能性を示した、CD45RC低細胞に限定。さらに、この戦略は、すべての人口の分析をできます。確かに、多くの細胞が共存できるも可能性が高いと2,4を代償機構が存在することを示します。CD40Ig、CD8 の枯渇投与ラットにおける+細胞 B 細胞と規制性骨髄性細胞の出現を可能し、2上記プロトコルに従ってラット心臓移植への耐性を転送します。IL34、CD4 の過剰発現による耐性のモデルで+および CD8+Treg が許容値4を転送することができます。
治療による耐性のドナー監督の特異性は、携帯電話や体液レベルで評価できます。セルの最初のドナー移植33特定場合許容値を転送するのにサード パーティ製移植の受信者に細胞の最初、養子の転送は成功しません。第二に、抑制細胞は効率的に移植の最初のドナーから Apc による刺激に対する応答として細胞の増殖を抑制、3 分の 1 からではなくパーティー ドナー2べきです。最後に、上記で説明したプロトコルを使用して、受信者の合計の Ig 生産から移植のドナーに対する体液性応答を区別できます。さらに、最初の移植ドナーに耐性の場合は、受信者は、セカンダリ サードパーティ移植、新しい抗原または元の知られていた抗原16に対して新しい体液性応答を開発することができるはず。
脾臓のコラゲナーゼ D 治療は優先および器官からすべてのセル人口を抽出することをお勧めします。最後に、細胞の表現型がそう不完全に表されるセルがあるタイトな (脾細胞の < 1%)、総人口の転送と比較して否定的な割合の転送は、この小さなの抑制活性を区別を助けることができます。人口。たとえば、CD40Ig 誘起 CD8+Treg 同種ペプチドを特定できるテトラマーを使用して染色 FACS しますが、それらの低い数字は、肯定的な養子転送に33,38を許可しません。ただし、養子伝四量体枯渇 CD8+CD45RC 合計させ、この亜種の可能性を強調する許容値と比較して転送されなかった低T 細胞。この結果は、生体外で抑制実験により確認しました。確かに、抑制の実験はまた33免疫応答を抑制する Du51 固有の樹木の容量を示す説得力のある方法です。
上記抑制プロトコルは制限された受信者エフェクター CD4 に+ドナーから Pdc に T 細胞応答。このプロトコルは、cDCs または合計 Apc によって Pdc を交換が、エフェクター: 刺激比率は、抑制細胞によって管理しやすい適度な拡散を達成するために適切なことを確認によって合わせることができます。確かに、CD4 の比+CD25-T 細胞: Pdc 必要がありますは 4:1 で、CD4 の比+CD25 8:1 にする必要があります- T 細胞: cDCs が CD4+CD25- T 細胞: Apc、1:1 または 1:2。ドナーとレシピエントの間 alloreactivity に依存する比率上記の比率が、7 日目で発生する急性拒絶反応と LEW.1W:LEW.1A の組み合わせに適したが、レスポンダー: 刺激比の範囲は、動物の犠牲の前にテスト必要があります。最後に、CFSE チミジン抑制活動、安全性と信頼性の問題を分析するためにお勧めします。場合に、抑制細胞とレスポンダーの可能な区別 CFSE 分析用セルをただし、6 日目でに、cd4 陽性エフェクター+CD25- T 細胞は合計脾細胞に置き換えられます。同様に、35 Gy 照射刺激細胞の間で残りの T 細胞が増殖できないことを確認します。
FACS 染色のデザインは、表 3に記載されている抗体の可用性に基づいています。類似したプロトコルはマウス モデル、ターゲット名称 (たとえば骨髄細胞はマウスおよびラットに特異的説明) を確保するために適応させることができます。
ラット異所性心臓移植は、移植の結果を監視するための絶好の機会と固形臓器移植モデルです。一方同種移植腎のモデルは、受信者の突然の死によって特徴付けられる、腹壁を通して心臓移植のビートの強さの触診に移植進化39,40の通知します。メモリ応答41を勉強する心臓移植の受信者に対する併用皮膚移植または 2 つ目の心臓移植が実現できます。さらに、生体分子工学と生物学的または化学的ツール (IgM KO) B 細胞、CD8 細胞 (抗 CD8α 抗体)、または骨髄細胞 (局所リポソーム) のような特定の細胞型の枯渇のため、このような細胞の重要性を測定するための便利なツール誘導の時間に応じて耐性のメンテナンス集団ポスト移植受信者1,2,3,4にオゾン治療が運営。
日付は、Bregs、骨髄系細胞および CD8 をラットに+Treg は記述されていません。ラット細胞1,2,3,4の特性評価のための参照として寛容誘導上のプロトコルを提案する.さらにこれらの細胞の移植および他の種の他の機種と比較する表現型の説明は、大きな関心のマーカーを識別する助けることができます。確かに、許容および運用耐性患者のマウス ・ モデルから Bregs の比較は Bregs3,23,24,のバイオ マーカーとして CD5 または CD24 のマーカー式の優位性を強調表示します。42,43,44,45.AdCD40Ig CD8α 枯渇併用による耐性のモデルで B 細胞抑制活性2に比べて CD24 の過剰を発現します。高スループット デジタル遺伝子発現 RNA シーケンスは、さらに制御性細胞46を特徴付けるための革新的なツールとして最近浮上してください。
最後に、免疫寛容治療により誘導される細胞の存在を検出するためのプロトコルは、他のモデルに合わせることができます。ここで約 7 日間の拒絶によって特徴付けられる同種の組み合わせを LEW.1A に LEW.1W を使用しました。厳しいとして述べてきたよう、急性拒絶反応がより速くより強くを起こると、反転の組み合わせを使用できます。自己免疫疾患モデルは移植治療と寛容の誘導メカニズムの解明のための私たちの経験からもいただけます。

ラット心臓移植寛容誘導とメンテナンスのメカニズムを解読するためのトレランス誘導治療を評価するために信頼性の高い臓器移植モデルで、機能的有能で支配的な細胞を誘発する可能性があります。以下のプロトコルは、ルイス 1 a 受信者ラット (LEW.1A、RT1、) に、完全に不一致異所性心臓移植ルイス 1 w ドナー ラット (LEW.1W、RT1u) をについて説明します。この台木に急性拒絶反応は急速に (約 7 日間) で発生して簡単に測定、腹部の触診を破って移植によって評価されることができます。ここでラットの心臓移植への耐性を誘導するために 3 つのプロトコルを提案する.これらのモデルで耐性誘導や各種規制のセルによって維持されます。最初に、CD40Ig をエンコード アデノ ウイルスと CD40 CD40L の相互作用のブロック (AdCD40Ig) による CD8 の世代二次グラフト受信者1に転送+ Treg ときに対して耐性を誘導することができます。さらに、による cd8 陽性+細胞 (抗 CD8α 抗体) に生成 AdCD40Ig 扱われる受信者 Bregs と RegMCs の2。CD8 の深い分析+ Treg プロパティは、インターロイキン-34 (IL-34)、Fibroleukin 2 (FGL-2)3,4,5,6 として定義されているいくつかの免疫調節分子の重要な役割を強調表示.(AAV ベクター) と IL-34 の過剰発現は、RegMCs の世代を通じて自己寛容を誘導に対し FGL 2 の過剰発現は細胞の複雑なネットワークを基になる Bregs を誘発しました。
慢性拒絶反応はゆっくり開発し、長期、慢性拒絶反応に対する許容範囲を区別するために詳細な分析が必要です。移植は通常細胞浸潤の評価 immunohistology7による血管壁と補完 C4d 沈着の肥厚、線維化。組織学方法、動物の犠牲を必要とするまたは生検を移植、ここで忍容性同種のさまざまな機能を評価する簡単な方法を説明: 出現および細胞と血液から抗ドナー抗体応答の機能フローサイトメトリーによるサンプル (ここでは、我々 は蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えを使用)。
公差、同種移植を治療の逮捕後のメンテナンスは8細胞の誘導と一般に関連付けられました。最後の十年の研究は、CD4 に焦点を当てた+Treg 満場一致で特徴と+キー マーカー Foxp3 によってそれら、CD25高CD127-9,10,11。同様に、いくつかのマーカーは、CD8 に帰因した+ Treg CD122 よう+、CD28-、CD45RC低、PD1+とヘリオス+1、12,13,14,15,16,17. 年、GITR、CTLA4、およびサイトカインの発現 (IL-10、TGFβ、イリノイ州 34、IL 35、FGL-2) Treg プロファイル3,4,6,13にさらに関連付けられました。 18,19,20,21。Bregs、RegMCs、NKTregs などの新たな規制のセル人口は、関連性の高い特定のマーカーを欠けています。確かに、Bregs は大抵未熟な CD24 として報告されますあいまいな CD27 の発現と時々 IL-10、TGFβ、またはグランザイム B22,23,24の生産、+の細胞します。骨髄性細胞系列の複雑さには、CD14、CD16、CD80、CD86、CD40、CD209a、または CD163 の25,26などの規制や炎症性のプロファイルを定義するいくつかのマーカーの組み合わせが必要です。最後に、いくつかのマーカーは、CD11b など NKTregs を識別するために報告されている+CD27+表現型を記述するために27,28,29 TGFβ+、しかしより多くの研究が必要 ,30,31,32。したがって、抑制活性の証拠はさらに新しいバイオ マーカーの同定については表現型を正当化するために必要な新しい免疫メディエーターと新しい細胞療法に範囲を拡張します。
細胞の抑制活性を評価する 2 つの補完的な手法を提案する.まず、体外法ドナー抗原提示細胞 (APCs) 異なる比率で 6 日間で刺激したラベル付きエフェクター T 細胞の抑制細胞を培養で構成され、分析、エフェクター T 細胞の増殖をドナー監督免疫抑制を反映しています。投与したラットからの細胞は素朴なラットおよび非投与移植ラット抑制活性のため (またはその他の規制のセル人口) から抑制: エフェクターの比率の範囲内のセルに直接比較できます。また、このメソッドは、すべての移植を必要としない、6 日以内に結果が得られます。第二に、体内のメソッドは、目的の細胞を投与群のラットから新しく照射移植の受信者に転送するで構成されます。B 細胞、骨髄細胞、T 細胞から世間知らずの非投与ラット、養子の転送時にグラフト生存を延長する、急性拒絶反応を抑制することができる通常、扱われる受信者から増強作用抑制活性を持つ細胞があるこれらの属性1,2,3,4,33。受信者の照射によるリンパ球減少症に対して転送細胞血液の恒常性によって影響を受けませんし、抗ドナー免疫反応をより簡単にマスターできるように推奨します。両方の方法は、同種造血幹細胞の in vitro利用第三者 Apc または生体内で養子伝達抑制のためサードパーティ心移植の受信者に細胞は抗ドナー特異性の解析を許可します。体内法表現悪い細胞のかなりの数を必要とするのに対し、細胞の亜集団は抑制活性の in vitro33より簡単に評価できます。
体液性応答は、寛容の状態、ドナー抗原に対する抗体の監督のコントロールを評価するためにも測定できます。確かに、寛容は、ドナーに対する体液性応答の不在が、受信者が新しい抗原に対する体液性応答を開発するための能力の保全と記憶応答の保全によって特徴付けられます。まず、alloantibody 検出の原理は、移植の受信者から次のドナー細胞血清型のインキュベーション受信者抗体によるドナー細胞の認識に基づいています。外因性の抗原に対する 2 番目、体液性応答は、長期許容受信者鍵穴カサガイ ヘモシアニン (KLH) が乳化フロイント完全アジュバントの評価次刺激をすることができます。抗原に対する特異 IgM および IgG 抗体の存在を検出できます 4 と 13 日、それぞれ、免疫、酵素リンク免疫測定法 (ELISA)34以下。第三に、移植と赤血球染色受信者血清日収集 +8 と移植 +17 日-7 と +3 で異種の赤い血球 (赤血球) の注射による免疫学的記憶の保存を評価できます。これらすべてのメソッドは、免疫グロブリンのサブタイプの同定、特定の二次抗体と FACS の汚損によって未満 1.5 h で結果の迅速な収集や elisa 法によるいくつかの時間を使用しています。
最後に、これらのプロトコルは移植モデルのために設計されて、ある程度、自己免疫疾患モデルに適用することができます。法の原則は、すべての種に置き換えることができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEW.1W and LEW.1A rats</td>
			<td>Janvier Labs, France</td>
			<td></td>
			<td>8 weeks old,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BN third party donor rats</td>
			<td>Janvier Labs, France</td>
			<td></td>
			<td>8 weeks old,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>name</td>
			<td>company</td>
			<td>catalogue number</td>
			<td>comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdCD40Ig</td>
			<td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France</td>
			<td></td>
			<td>home made plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL34-AAV</td>
			<td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France</td>
			<td></td>
			<td>home made plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGL2-AAV</td>
			<td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France</td>
			<td></td>
			<td>home made plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TCR</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>R7/3 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD25</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX39 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD8</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX8 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45RA</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX33 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD161</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>3.2.3 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD11b/c</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX42 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TCRgd</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>V65 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45RC</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX22 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD4</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX35 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45R</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#554881, His24 clone</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat IgG-FITC</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA</td>
			<td>#112-096-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat IgG1</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>#MCA 194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat IgG2a</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>#MCA 278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat IgG2b</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>#MCA 195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat IgM-FITC</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA</td>
			<td>#115-095-164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin HRP</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#554066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLH</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>#9013-72-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td></td>
			<td>Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma, Saint-Louis, USA</td>
			<td>#9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB substrate reagent kit</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#555214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTraceTM CFSE cell proliferation kit</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium 1X</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline streptomycine</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 beta mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma, Saint-Louis, USA</td>
			<td>#M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Proliferation Dye eFluor&#174; 450 Cell</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#65-0842-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma, Saint-Louis, USA</td>
			<td>#G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche Diagnostics, Germany</td>
			<td>#11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma, Saint-Louis, USA</td>
			<td>#E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>#B230561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic dynabeads</td>
			<td>Dynal, Invitrogen</td>
			<td>#11033</td>
			<td>Goat anti-mouse IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Comp eBeads</td>
			<td>Ebiosciences, San Diego, USA</td>
			<td>#01-1111-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naplbuphine</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terramycine</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#39;s adjuvant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer lactate</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 50&#181;g (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90&#956;l DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5&#956;M solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>complete medium for coculture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>name</td>
			<td>company</td>
			<td>catalog number</td>
			<td>comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>falcon 50ml</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>falcon 15ml</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning plastic culture dishes</td>
			<td>VWR, Pessac</td>
			<td>#391-0439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#181;m and 60&#181;m tissue filters</td>
			<td>Sefar NITEX, Heiden, Switzerland</td>
			<td>#03-100/44 and #03-60/35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells U bottom plates for coculture</td>
			<td>&#160;Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning</td>
			<td>#353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells V bottom plates for FACS staining</td>
			<td>ThermoScientifique, Danemark</td>
			<td>#249570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells flat bottom ELISA plates</td>
			<td>Nunc Maxisorb</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seringue for spleen crush</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#309649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA reader</td>
			<td>SPARK 10M, Tecan, Switzerland</td>
			<td>SPARK 10M, Tecan, Switzerland</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bain marie&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X rays irradiator</td>
			<td>Lincolshire, England</td>
			<td>Faxitron CP160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solar agitator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Canto II</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Aria II</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnet</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>12302D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo assessment of t, b and myeloid cells suppressive activity and humoral responses from transplant recipients

移植の主な関心事は、細胞の誘導を介して特定のトレランスを達成するためにです。トレランスのメカニズムの理解には、信頼性の高いモデルが必要です。ここでは、共刺激が引き起こす信号の封鎖すること遺伝子導入による免疫制御分子の発現によって誘導されるラットの心臓移植への耐性のモデルについて述べる。これらの各モデルは、制御性 T 細胞 (Treg)、B 細胞 (Bregs) や骨髄性細胞 (RegMCs) など細胞の生体内で生成できます。本稿で述べる特定し、寛容誘導と保守.に彼らの責任を決定するための in vitroとin vivoの規制細胞活性の定義に使用されている 2 つの相補的なプロトコルまず、体外抑制アッセイは用量依存的にエフェクター免疫応答の抑制能力を持つ細胞の迅速な同定を可能し、サイトカイン測定や細胞毒性などさらに分析に使用することができます。第二に、新しく照射接木された受信者に寛容な扱われた受信者からセルの養子転送監督移植免疫反応を制御するおよび/または新しい細胞 (の変換でこれらの細胞性免疫寛容を強調表示呼ばれる感染性トレランス)。これらのメソッドは、表現型の既知のマーカーとセルに制限されておらず、任意のセル人口を拡張することができます。さらに、ドナー監督 allospecificity 細胞 (フィールドで重要な目標) の第三者によるドナーの細胞を使用して評価することができますまたは体外か体内に移植します。最後に、これらの細胞の特定の免疫寛容の容量を調べるには、体液性抗ドナー抗体と受信者の新しいまたは元の知られている抗原に対する体液性応答を開発する能力を評価するためのプロトコルを提供します。説明耐性のモデルはさらに新しいバイオ マーカーと免疫制御分子を識別するために細胞を特徴付けるために使用ことができます、他の移植モデルまたは齧歯動物または人間の自己免疫疾患に適応。

(図 2)、同時に Apc (図 1)、細胞および Treg の並べ替えに続く抑制の活動の評価、または個別に (図 4)、他の推定上規制セル (図 3) ができ完了生体内で直接注入する細胞と体外CFSE 明るさ (図 5) の測定によって。ドナー (図 6) や (図 7と8) 外因性の抗原に対する受信者の体液性応答のステータスは評価生体外で描かれる生体内での予防接種も可能です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55510/55510fig1.jpg"> 図 1.Pdc をソートするための戦略をゲーティングします。 形態サイズと粒度 (SSC-A/FSC-A) 上で選択したセル、ダブレットが FSC W/FSC H と SSC W/SSC H パラメーターによって除外された、生きた細胞が DAPI-細胞のゲーティングによって選ばれた、Pdc で選択した TCR-CD45RA-CD4+CD45R+式。純度は、細胞に DAPI を追加し、並べ替えのパラメーターを持つセルソーターで実行されている評価しました。まれな並べ替えられた人口 (2% 未満) の純度は 95% 以上にする必要があります。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55510/55510fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55510/55510fig2.jpg"> 図 2.+CD4 の並べ替えに戦略をゲートCD25- T 細胞および CD8+CD45RC低 Treg 。 形態、すなわちサイズ、粒度 (SSC-A/FSC-A) 上で選択したセル、ダブレットが FSC W/FSC H と SSC W/SSC H パラメーターによって除外された、生きた細胞が DAPI-細胞のゲーティングによって選択された、細胞は TCR で選択されました。+CD4+CD25-式。CD8+Treg は同時にゲーティング TCR+CD4 の-CD45RC低セルによってソートされています。純度は、細胞に DAPI を追加し、並べ替えのパラメーターを持つセルソーターで実行されている評価しました。純度は 95% 以上にする必要があります。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55510/55510fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55510/55510fig3.jpg"> 図 3: 並べ替え B 細胞、骨髄細胞、NK 細胞に戦略をゲーティングします。 形態サイズと粒度 (SSC-A/FSC-A) 上で選択したセル、ダブレットが FSC W/FSC H と SSC W/SSC H パラメーターによって除外された、生きている細胞が DAPI-細胞のゲーティングによって選ばれた、B 細胞で選択した CD45RA+式CD11b/c+式で骨髄系細胞と NK 細胞 CD45RA-CD11b/c-CD161高式。純度は、細胞に DAPI を追加し、並べ替えのパラメーターを持つセルソーターで実行されている評価しました。純度は 95% 以上にする必要があります。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55510/55510fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55510/55510fig4.jpg"> 図 4.ゲート戦略 CD8 の並べ替えに+CD45RC低と CD4+CD45RC低 Treg 。 形態サイズと粒度 (SSC-A/FSC-A) 上で選択したセル、ダブレットが FSC W/FSC H と SSC W/SSC H パラメーターによって除外された、生きた細胞が DAPI-細胞および CD4 にゲートによって選ばれた+Treg が TCR で選択されました。+CD4+CD45RC低発現および CD8+Treg TCR+CD4 の-CD45RC低式。純度は、細胞に DAPI を追加し、並べ替えのパラメーターを持つセルソーターで実行されている評価しました。純度は 95% 以上にする必要があります。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55510/55510fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55510/55510fig5.jpg"> 図 5.代表的な解析、 の in vitro 抑制アッセイ。 形態・ サイズと粒度 (SSC-A/FSC-A)、FSC W/FSC H と SSC W/SSC H パラメーターによってダブレットの排除、死んだ細胞および CD4 の除外に選択によるレスポンダー細胞増殖を行った+ Treg DAPI-CPDV450 のゲートで-セル、+の TCR+CD4 の選択セル、および CFSE プロファイル分析。CFSE ゲートは些細 CFSE 分類されたレスポンダー セルに基づいていた。CFSE高細胞は非増殖細胞と CFSE低≥ 1 と細胞分裂。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55510/55510fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55510/55510fig6v3.jpg"> 図 6.ドナーの特定の alloantibody 反応の代表的な分析。 希薄化後の熱非動化血清処理または未処理の受信者、または素朴なラットからの範囲とし、抗ラット IgG FITC ドナー ラットからの脾細胞培養。同種抗体は、SSC と FSC のダブレット除外後 DAPI- z セルの FITC の MFI を分析することによって検出されます。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55510/55510fig6v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55510/55510fig7.jpg"> 図 7.抗 KLH 検出法の原則です。 受信者は、免疫の 120 日と CFA、KLH 移植が補われ、血液サンプルは、予防接種後 4 と 13 日が収穫された後だった。KLH 蛋白質は井戸の 96 フラット底板、上にコーティングされ、免疫ラットの血清で培養します。ビオチン標識ヤギ抗ラット IgG または IgM 抗 KLH Ab 血清に存在の検出を許可、予防接種後 4 〜 13 日を収穫しました。HRP 結合ストレプトアビジンは、黄色に変わり、硫酸と反応が停止されたときに青い色の製品に TMB 基板を変形させた。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55510/55510fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55510/55510fig8.jpg"> 図 8.抗赤血球検出法の方式です。 受取人が免疫の 7 日前に、と 3 日後から収穫された異種の赤い血球 (赤血球) と血液サンプルを移植免疫受信者 5 と 14 日最後の予防接種後。赤血球免疫ラットの血清で培養。赤血球の抗赤血球抗体の存在は、標識ヤギ抗ラット IgG または IgM 抗体カント FACS 解析と染色によって検出されました。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55510/55510fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

ここでは、受信者からの明瞭な細胞のサブセットの抑制能力と受信者ドナーまたは外因性の抗原への免疫の状態、移植、耐性を誘導し、 in vitroとin vivo評価プロトコルを提案します。

体外と体内の T, B, 骨髄細胞の抑制活性と移植から体液性応答の評価

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

in-vitro-vivo-assessment-t-b-myeloid-cells-suppressive-activity

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

14.0K ビュー.  INSERM, Université de Nantes. ここでは、受信者からの明瞭な細胞のサブセットの抑制能力と受信者ドナーまたは外因性の抗原への免疫の状態、移植、耐性を誘導し、 in vitroとin vivo評価プロトコルを提案します。

ビデオ: In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the immunoglobulin locus undergoes a series of genetic modifications to alter the binding capacity and effector function of secreted antibodies. This process is highlighted by a genomic recombination event known as class switch recombination (CSR) in which the default IgM antibody isotype is substituted for one of IgG, IgA, or IgE. Each isotype possesses distinct effector functions thereby making CSR crucial to the maintenance of immunity. Diversification of the immunoglobulin locus is mediated by the enzyme activation-induced cytidine deaminase (AID). A schematic video describing this process in detail is available online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID's activity and the CSR pathway are commonly studied in the assessment of B cell function and humoral immunity in mice. The protocol outlined in this report presents a method of B cell isolation from murine spleens and subsequent stimulation with bacterial lipopolysaccharide (LPS) to induce class switching to IgG3 (for other antibody isotypes see Table 1). In addition, the fluorescent cell staining dye Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is used to monitor cell division of stimulated cells, a process crucial to isotype switching 1, 2. The regulation of AID and the mechanism by which CSR occurs are still unclear and thus in vitro class switch assays provide a reliable method for testing these processes in various mouse models. These assays have been previously used in the context of gene deficiency using knockout mice 3. Furthermore, in vitro switching of B cells can be preceded by viral transduction to modulate gene expression by RNA knockdown or transgene expression 4-6. The data from these types of experiments have impacted our understanding of AID activity, resolution of the CSR reaction, and antibody-mediated immunity in the mouse.

Following antigen exposure, subpopulations of activated B cells undergo a process known as class switch recombination (CSR) to produce antibody isotypes with distinct effector functions. The protocol outlined in this report explains how CSR can be induced and analyzed in vitro for the purposes of studying B cell function.

マウスB細胞を精製における誘導とクラススイッチ組み換えの評価

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

免疫・感染学

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

T細胞応答の評価のための蛍光ターゲット配列の使用<em&gt;インビボ</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

T細胞の導出<em&gt;体外</em&gt;マウス胚性幹細胞からの

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

の測定<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1プレインテグレーション複合体の統合活動

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are used for host defense. For the quantitative determination of the functional status of the humoral immune response of an individual, both serum Abs and circulating ASCs are commonly measured as functional readouts. In humans, peripheral blood is the most convenient and readily accessible sample that can be used for the determination of the humoral immune response elicited by host B cells. Distinct B-cell subsets, including ASCs, can be isolated directly from peripheral blood via selection with lineage-specific Ab-conjugated microbeads or via cell sorting with flow cytometry. Moreover, purified na&#239;ve and memory B cells can be activated and differentiated into ASCs in culture. The functional activities of ASCs to contribute to Ab secretion can be quantified by ELISpot, which is an assay that converges enzyme-linked immunoabsorbance assay (ELISA) and western blotting technologies to enable the enumeration of individual ASCs at the single-cell level. In practice, the ELISpot assay has been increasingly used to evaluate vaccine efficacy because of the ease of handling of a large number of blood samples. The methods of isolating human B cells from peripheral blood, the differentiation of B cells into ASCs in vitro, and the employment of ELISpot for the quantification of total IgM- and IgG-ASCs will be described here.

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

単離、分化、および血液からヒト抗体を分泌するB細胞の定量化：体液性免疫の機能読み出しなどのELISpot

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

勉強する人間の T 細胞のリコール反応体内吸引水疱プロトコル

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to substrates to create phosphorylated products. The use of &#947;-32-P labeled NTP precursors allows simultaneous monitoring of substrate utilization and product formation by radiography. Thin layer chromatography (TLC) on cellulose plates allows rapid separation and sensitive quantification of substrate and product. We present a method for utilizing the thin-layer chromatography to assay the pyrophosphokinase activity of a purified (p)ppGpp synthetase. This method has previously been used to characterize the activity of cyclic nucleotide and dinucleotide synthetases and is broadly suitable for characterizing the activity of any enzyme that hydrolyzes a nucleotide triphosphate bond or transfers a terminal phosphate from a phosphate donor to another molecule.

A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Here, we describe a method for purifying histidine-tagged pyrophosphokinase enzymes and utilizing thin layer chromatography of radiolabelled substrates and products to assay for the enzymatic activity in vitro. The enzyme activity assay is broadly applicable to any kinase, nucleotide cyclase, or phosphor-transfer reaction whose mechanism includes nucleotide triphosphate hydrolysis.

浄化、体外(p) ppGppクロストリジウム ・ ディフィシルから合成酵素の活性

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to ...