This study was supported by a research grant from the Ministry of Science and Technology of the Executive Yuan of Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). I would like to acknowledge the excellent service provided by the Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core of the First Core Laboratory in College of Medicine of National Taiwan University.

ヒト末梢血は、インフォームドコンセントの下で健康なドナーから得なければならない、と血液サンプルの使用は、個々の治験審査委員会によって確立され承認されたガイドラインに準拠する必要があります。本研究では、フローサイトメトリーの結果のデモンストレーションでは、ヒトの血液を使用するプロトコル（ 図1）およびELISPOTアッセイ（ 図3）は、国立台湾大学病院（プロトコル番号201307019RINB）の内部審査委員会によって承認されました。 ヒト末梢血B細胞の1単離および精製<ol><li> K 2 EDTA（1.5〜2.0ミリグラム/ mLの血液）を含む15-mLのチューブに（肘に肘窩の前方で）肘正中皮静脈から血液の〜10mLのを描画し、すぐに凝血塊を防止するために、チューブを数回転倒形成。 </li><li> P;（121℃、15分）、オートクレーブ処理の35 mLを加え、赤血球（RBC）溶解バッファー（150mMのNH 4 Cl を 、10mMのKHCO 3、および1mM EDTA新鮮な血液サンプル（≥3を含有するチューブにH 7.4）：1体積/体積）をし、もはやより5分間室温（RT）でインキュベート。 注：管を通る光の透過の外観は、RBC溶解が完了したことを示しています。 </li><li>室温で5分間600×gで遠心分離します。ペレットの色が白であることを確認してください。 </li><li>ステップ1.3のように遠心分離器;オートクレーブしたリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4のPBS、137mMの塩化ナトリウム、2.7のKCl、4.3 mMののNa 2 HPO 4、および1.47 mMのKH 2 PO 4）10mLでペレットを再懸濁。 </li><li> 、その後プレート：上清を捨てRPMI 1640培地（10％ウシ胎児血清、100 U / mLのペニシリン/ストレプトマイシン、0.25 / mlのアンホテリシンB、および2mM L-グルタミンサプリメント）10mLでペレットを再懸濁10 cmの培養皿（皿当たり10mlの血液）への細胞。 30分間、5％CO 2で37℃のインキュベーターに皿を置きます。 </li><li>静かに培養皿を数回旋回し、配置15-mLのプラスチック製コニカルチューブに培地（浮遊細胞）。培養皿に接着細胞（主にマクロファージ）を捨てます。 </li><li>室温で5分間600×gで遠心分離します。上清を捨てます。 </li><li> RPMI 1640培地1mLでペレットを再懸濁します。血球計数器または自動細胞カウンターで細胞数をカウントします。 注：分離された白血球の生存率は、通常、トリパンブルー排除によって90％以上です。 </li><li> 10×10 6細胞/ mL - 5の濃度で工程1.7と同様に遠心分離し、冷PBS緩衝液〜200μL（0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）および2mM EDTA）中で細胞を再懸濁します。 </li><li> 10 6個の細胞あたり（B細胞の負の選択のための）血液細胞に特異的なビオチン化抗ヒト抗体カクテルの5μLを加え、30分間21氷上でインキュベートします。 注：抗ヒト抗体カクテルは、少なくともCD2（またはCD3）、CD14、およびCD16に特異的な腹筋を含める必要があります。 </li><li> 10倍過剰量を追加滅菌PBSの細胞、5分間600×gで遠心分離し、上清を廃棄します。 </li><li>ペレットにストレプトアビジン結合マイクロビーズ（10 6細胞あたり5μL）の等量を加え、よく混ぜます。 </li><li> 15-mLのプラスチック円錐管中で30分間氷上でインキュベートします。 </li><li>チューブにPBS緩衝液2mLのを追加します。 </li><li>磁気スタンドにチューブを置き、8分間RTでインキュベートします。茶色のマイクロビーズは徐々に次の磁石22に管壁に付着します。 </li><li>チューブを磁気スタンドに残っていると、慎重に新しい滅菌15 mLチューブ22に上清を移します。 </li><li>繰り返しは、1.16から1.14までを段階的に説明し、手つかずのB細胞を含む2つの上清を兼ね備えています。マイクロビーズを捨てます。 </li><li>室温で5分間600×gで遠心分離します。上清を捨てます。 </li><li>下流の実験のためにRPMI 1640培地中でペレットを再懸濁。 注：一般的に、1から5×10 5 B細胞のウィットHA末梢血10mLの95％を超える純度が23を単離することができます。 </li></ol> 2.精製および単離されたB細胞からのメモリとナイーブB細胞の分離<ol><li>ステップ1から精製された細胞を使用し、血球計または自動セルカウンターを用いて細胞数を決定します。 </li><li> 5分間600×gで遠心分離し、RT後の冷PBS緩衝液100μLで細胞を再懸濁します。 </li><li> 10 6個の細胞あたりビオチン化CD27 mAbを2μgの氷上で30分間インキュベート- 1を追加します。 </li><li> 5分間、600×gでチューブと遠心分離機にPBS緩衝液の10 mLを加え。 </li><li>上清を捨て、PBS緩衝液の50μLで細胞を懸濁します。 </li><li> 15 mLのプラスチックコニカルチューブ中の細胞に- （2μgの/ 10 6細胞1）ストレプトアビジン磁性マイクロビーズの等量を追加します。 </li><li>穏やかによく混合し、氷上で30分間インキュベートします。 </li><li>チューブにPBS緩衝液3mLの - 2を追加します。 </li><li>置き磁気スタンドにチューブとは、茶色のマイクロビーズが磁石に近い側に取り付けることができるように、8分間RTでインキュベートします。 </li><li>磁気スタンドでの管で、慎重に新しい滅菌チューブに上清画分を転送します。ナイーブB細胞-この画分は、濃縮されたCD27が含まれています。 </li><li>マイクロビーズを含むチューブに5 mLを加え、穏やかにマイクロビーズを再懸濁（ すなわち、CD27 +メモリーB細胞の濃縮分画）24-25。 </li><li>室温で5分間600×gで遠心分離します。下流の実験のためのRPMI 1640培地でペレットを再懸濁します。 注：典型的には、約30 - B細胞の60％が健康なドナー7、25-26のPBMCからCD27 +記憶細胞として精製することができます。 </li></ol>ナイーブB細胞、メモリーB細胞、およびPBS /パソコンのコレクションのソート3.セル<ol><li>ステップ1から精製された細胞を用いて、hemocytomeを用いて細胞数を決定しますターまたは自動セルカウンター。 </li><li> 5-mLのポリスチレンチューブ中で、mL当たり10 7の濃度で冷PBS緩衝液中で細胞を再懸濁します。 </li><li> 10 6個の細胞当たりのヒトIgGを2μgおよびFcブロックのために10分間氷上でインキュベート- 1を追加します。 </li><li> 1μgの抗CD19-APC（クローン：HIB19）のそれぞれを追加し、抗CD27-eFluor450（クローン：O323）、および抗CD38-PE（クローン：HIT2）10 6細胞あたり。よく混ぜ、30分4、27氷上でインキュベートします。 </li><li>ステップ3.4の最後の5分で、商業7-アミノD（7-AAD）の5μLを追加します。 </li><li> 5分間、600×gでチューブ、ボルテックスし、遠心分離機にPBSの2ミリリットルを追加します。 </li><li> 15 mLチューブに、mL当たり5×10 7細胞- 1の濃度で（2％BSAおよび2mMのEDTAを含む滅菌PBS）バッファーを並べ替え中に細胞を再懸濁します。 </li><li>細胞塊を除去するためにナイロンメッシュセルストレーナー（40μmの孔サイズ）を介して細胞をフィルタリングします。 </li><li>フローサイトメトリーソートして細胞を分離紫色（405 nm）と、青（488 nm）で、赤色（640nmの）：えー3つのレーザを搭載しました。 注：単独の青色レーザーは、27-28サイトメトリー3色のフローのために十分です。 </li><li>ナイーブB細胞（CD19 + CD27 - ）を同時に収集するための3つの15 mLチューブ（RPMI培地5mlを含有する）にソート細胞、記憶B細胞（CD19 + CD27 +）、およびPBS /パソコン（CD19 + CD27 + /ハイ CD38 +）3-4、28。 注：ステップ4で説明したようにソートさナイーブおよびメモリーB細胞を培養することができます。 </li></ol>ナイーブB細胞-単離されたヒトCD19 + B細胞、CD19 + CD27 +メモリーB細胞、およびCD19 + CD27のインビトロ分化4. <ol><li>手順1.19、2.10、2.11および3.10で精製された細胞を用いて、血球計または自動セルカウンターで細胞数を決定します。 </li><li> RPMI 1640培地で細胞を再懸濁1の濃度- 、mL当たり10×10 5、12ウェルプレートのウェルにそれらをアリコート。 </li><li> 5μgの/ 10 6細胞/ mLの18、29でのCpG（ODN 2006）を追加します。 </li><li> 5日間培養し、5％CO 2、37℃インキュベーターで細胞。 </li><li>各ウェルから細胞を採取、15-mLのチューブに別々に配置し、各チューブにPBSの5 mLを加え、5分間600×gで、室温でそれらを遠心分離します。 </li><li>血球計数器または自動細胞カウンターを用いて細胞を数えます。 RPMI 1640培地で、mL当たり10×10 5から1までの濃度で細胞を再懸濁します。 </li></ol> 5.エリスポットアッセイ<ol><li> 30秒間ELISPOTプレートの各ウェルに蒸留水に35％エタノールの30μLを加えます。 注：ピペッティングすると、すべての回でウェル中の膜には触れないでください。 </li><li>エタノールを除去したELISpotプレートを反転。 </li><li>各ウェルにオートクレーブ滅菌のddH 2 Oの150μLを入れ、インキュベート室温で5分間、それらは、残留エタノールをオフにフラッシュします。 3分間室温で滅菌PBSの洗浄に従ってください。 注：5.3から5.1までは、プレートの製造に応じて、任意であるステップ。 </li><li> ELISPOTプレートの各ウェルに（PBS中）抗ヒトIg抗体（IgG + IgM抗体+型IgA）の5μg/ mlのポリクローナルF（ab &#39;）2フラグメントの50μLを入れ、4℃で一晩（好ましい）でそれらをインキュベートまたは2時間11 37℃です。 注：使用するまでパラフィルムでプレートの端をシール。 </li><li>たびに、未結合のAbを除去し、各ウェルに200μlのPBSを追加し、3分間室温で二度、それらをインキュベートし、プレートを反転。 </li><li>遮断するための各ウェルに5％BSA（またはRPMI 1640培地）を含むPBSを200μLを追加し、室温で2時間、それらをインキュベートします。 </li><li>ブロッキングバッファーを除去するためにプレートを反転。ステップ5.5のように、PBS200μlで各ウェルを二回洗浄します。 </li><li>各ウェルにRPMI 1640培地100μLを加え、37℃でそれらをインキュベートします。 </li><li>準備ができた細胞をシードするときは、RPMI 1640培地を除去するためにプレートを反転。 </li><li>シード100μL（5×10 4）、50μL（2.5×10 4）、および（ステップ1.19、2.10、2.11、3.10から、および4.6）細胞の25μL（1.25×10 4）のウェルにELISPOTプレート。 RPMI 1640培地で、/だけでなく150μLにボリュームをもたらします。 注：細胞をプレーティングするための1つまたは2つの2倍連続希釈の最小値が推奨されます。 </li><li> 14時間18から8のために、5％CO 2で37℃インキュベーターで培養します。インキュベーション中にプレートを移動しないでください。 </li><li>細胞およびRPMI 1640培地を除去するためにプレートを反転。 </li><li> 3分間、室温で毎回5回（0.05％のTween 20を含むPBS）を200μL/ウェルのPBS-Tのを追加し、それらをインキュベートします。 5回の洗浄との間に洗浄バッファーを除去するためにプレートを反転。 </li><li> IgGの検出、1のFcγ特異的、ヤギ抗ヒトIgGアルカリホスファターゼ（AP）のいずれかを追加するABS（：PBS-Tで5,000）またはヤギ抗ヒトIgM-AP、Fcμフラグメント固有のAbs（IgM抗体検出、1：PBS-Tで5,000）指定されたウェルに、暗所で室温で2時間インキュベートします。 </li><li>ステップ5.5のように、PBS200μlで各ウェルを二回洗浄します。 </li><li> 50μL/ウェルのブロモクロロインドリルリン酸ニトロブルーテトラゾリウム（BCIP / NBT）基質溶液を追加します。 15分 - 紫色の斑点は、通常5に表示されます。 </li><li>スポットの過剰発生を防止するために、100μL/ウェルのddH 2のOを追加します。 </li><li>すべてのスポットの完全な開発後に水道水でプレートを洗浄します。 </li><li>プレートの暗渠を削除し、それらは暗闇の中で空気乾燥することができます。 </li><li>画像取得/解析部（ 例えば、自動スキャナまたは手動で解剖顕微鏡を介して）で自動化プレートリーダーを使用してスポットをカウントします。 注意：プレートを暗所で室温で保存し、後で分析することができます。 </li></ol>

The author declares no competing financial interests.

B細胞は、体液性免疫の発達において中心的な役割を果たしています。彼らは当初、骨髄で開発し、さらなる発展のために、ナイーブ脾臓などのリンパ組織へと移動することができるB細胞、リンパ節、および扁桃として血流を入力してください。銀遭遇すると、いくつかのナイーブB細胞が胚中心B細胞は、記憶B細胞および形質（PBS）/プラズマ細胞（パソコン）に分化することができるリンパ濾胞へ移行します。ほとんどのPB / PCが血流に発信されているが、いくつかは、最終的には長寿命のパソコン1に最終的に分化するために骨髄に存在します。循環中のB細胞は不均一であり、かつ定常状態で、PBS / PCは、末梢血2で稀です。系統特異的表面マーカーの利用可能性の結果として、フローサイトメトリー末梢血中のB細胞サブセットの同定および特徴付けのための一般的な方法となっています。フローcytometrの拡張アプリケーションYは、高純度で分離し、B細胞の個々のサブセットの単離を可能にするセルソーター機能の追加です。異なる発生段階の特定の表面受容体の発現に基づいて、人間の循環B細胞は一般的に3つの主要な亜集団に分類される、記憶B細胞（CD19 + CD27 + CD38 - ）、ナイーブB細胞（ - - CD38 CD19 + CD27）、およびPBS /パソコン（CD19 + CD27 + CD38 +）3-4（ 図1）。本質的にナイーブB細胞はのAgに遭遇していません。しかし、それらはIgM抗体+ CD27 +メモリーB細胞に分化することができます。ナイーブB細胞（BCR）関連分子（ 例えば、CD19、CD20およびCD22）、B細胞抗原受容体を発現に均質であるが、それらは、免疫グロブリンレパートリー5に不均質です。 CD27 +メモリーB細胞の大部分はCD27に分化することができます+ /ハイCD38 + PBS /パソコン6。また、メモリーB細胞およびPBS / PCはポリクローナルであり、発達および機能異質4-7を示します。循環中のPB / PCは、通常短命であり、CD138を発現しないが、骨髄に落ち着くために作られたものは、末端分化し、長寿命となります。最終的に分化したPCは、CD138を発現し、その表面8上にCD27分子をダウンレギュレートします。 PBSおよびPCの両方が腹筋を分泌することができるので、多くの場面では、それらを総称したASCと表記されています。対照的に、ナイーブB細胞や記憶B細胞のいずれもは、ABS 9-10のかなりの量を生成することができます。適切な培養条件6、11-15に置かれたとき、10日-単離された場合、それにもかかわらず、両方のナイーブ及びメモリーB細胞は、3でのASCに分化させることができます。実際には、ASCを、それらの直接分離されたFRとCD27とCD38のインビトロ分化を共有同様の表面式から導出しますオム末梢血6。また、in vitroで分化したASCは、PBS /パソコン6の循環同様の表面CD20の低レベルを発現します。文化由来のASCは、すべての短命ですが、彼らは機能的に有能で、体液性免疫に貢献することが可能であることを示す、ABS樹脂を分泌することができます。 遠くで最も一般的に適用される方法は、体液性免疫応答の機能情報を取得することにより、ELISAおよびエリスポットの両方があります。 ELISAは、96ウェルプレートに基づくアッセイであり、しばしば血清Ag特異ABSおよび他の検体（ 例えば、サイトカイン）の力価を測定するために使用されます。これは、便利かつスケーラブルです。 ELISAは、液体試料16中、ABS又は血清のような他の物質の存在を検出するための固相酵素アッセイを使用するように設計されています。血清のELISAからの読み出しが広く体の免疫応答を表すために使用されてきました。再取得のために必要なツールELISAアッセイからadoutsは、分光光度マイクロプレートリーダーです。リーダは、典型的には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）共役検出ABSおよびその特異的な基質17の反応から得られる最終生成物の光学密度（OD）を決定することができます。体液性免疫応答の報告に関して、ELISAによって決定した血清抗体レベルは、体内でのASCの集団ではなく、個々の性能を示します。また、ELISAは、アカウントに腹筋を分泌しない記憶B細胞による参加を取ることができません。 ELISAのように、エリスポットは、末梢血サンプル17-18で免疫応答を検出し、監視するための広く用いられている方法です。 ELISpotは、サンドイッチELISAに関連する技術です。その中で、細胞をポリビニリデンジフルオリド（PVDF）短期培養のためのマイクロプレートの96ウェルの膜・バックウェルに配置されています。 ELISpotアッセイは、マイクロプレートとdevelopinにウェスタンブロッティングを行うに類似していますグラム各ウェルのPVDF膜上のスポット。自動ELISPOTリーダーシステムやマニュアルの計数のための実体顕微鏡が必要です。免疫応答を検出するのELISpotの主な利点は、ASCにおよびサイトカイン分泌細胞の定量化におけるその優れた感度です。それは、それぞれ、体液性および細胞性免疫におけるそれらの機能の活動を報告します。体液性免疫機能の測定では、ELISAおよびELISPOTによって列挙されたASCの数によって決定される血清抗体レベルは、しばしば相関しているが、これらの2つのアッセイからのデータ読み出しは、機能的意味19-20でいくつかの違いがあります。エリスポットの主な利点は、この方法の感度です。 Abの適切なアイソタイプの既知量を参考のために含まれている場合に、ELISAによって報告されているように、血清抗体力価のレベルは、濃度の読み出しとして、より定量的に相対的な抗体のレベルを示す、ODの読み出しとして半定量的に提示、またはされています。対照的に、のELISpotの結果はpresenteあります関心対象の細胞プールでのASCの絶対数としてD（ 例えば、未分画の末梢血単核細胞（PBMC）及びPBMCから精製したB細胞）。エリスポットは、単一のASCを検出することができますが、ELISAは、測定前に最適化されたアッセイに依存する濃度に到達するのASCからのAbの量を必要とします。したがって、エリスポットは、定量化の感度のELISAに明らかに優れています。また、エリスポットはまた、活性化された記憶B細胞のインビトロ分化のASCを定量化するのに適しています。記憶B細胞は、ABSを分泌しないが、活性化の際のASCに分化することができます。彼らは、したがって、ELISAによって検出された血清のAbsへの貢献を持っていません。従って、エリスポットは、培養中の活性化した後、記憶B細胞の循環の免疫応答の測定で選択する方法です。これは、長期的な体液性免疫の維持の監視を可能にします。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer K2E</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>367525</td>
			<td>10 ml tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>endotoxin-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.5% solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-102-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMag Human B lymphocyte enrichment set</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated CD27 mAb</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302804</td>
			<td>clone O323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin magnetic microbeads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>9000810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Falcon tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue nylon mesh cell strainer, 40 &#956;m</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD19-APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302212</td>
			<td>clone HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD27-eFluor 450</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-0279-42</td>
			<td>clone O323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD38-PE-Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>303516</td>
			<td>clone HIT2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD38-PE-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560677</td>
			<td>clone HIT2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD45-FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304006</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD45-FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555482</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>124213</td>
			<td>clone LG.3A10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD27-PerCP Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>65429</td>
			<td>clone L128</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD19-FITC</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-064</td>
			<td>clone LT19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD19-FITC</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX75599</td>
			<td>clone LT19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD20-FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555622</td>
			<td>clone 2H7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti-human CD27</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302804</td>
			<td>clone O323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti-human CD27</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0279-80</td>
			<td>clone O323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG (ODN 2006)&#160;</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-2006</td>
			<td>type B CpG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-21</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human sCD40L</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>310-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A of S. aureus Cowan (SAC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pokeweed mitogen (PWM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiScreen filter plates, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MSIPS4510</td>
			<td>sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>ES006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>009-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG, Fc fragment</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>009-000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#39;)2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-006-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-055-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fc&#181; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-055-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human IgG-peroxidase, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-035-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human IgM-peroxidase, Fc&#181; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-035-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD ELISPOT AEC substrate kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.T.L. ImmunoSpot analyzer</td>
			<td>C.T.L.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the isolation, differentiation, and quantification of human antibody-secreting b cells from blood: elispot as a functional readout of humoral immunity

体液性免疫の特徴は、合成し、そのような病原体としての抗原（Ag）から、固有の腹筋を分泌し、宿主防御のために使用される機能のASCを、生成することです。個体の体液性免疫応答の機能状態を定量的に決意するために、血清のAb及び循環のASCの両方は、一般的に機能的な読み出しとして測定されます。ヒトにおいては、末梢血は、宿主B細胞によって誘発される体液性免疫応答を決意するために使用することができる最も便利で容易にアクセス可能な試料です。 ASCを含む異なるB細胞サブセットは、系統特異的抗体コンジュゲートビーズまたはフローサイトメトリーで細胞選別を介して選択を介して、末梢血から直接単離することができます。また、精製されたナイーブ及びメモリーB細胞を活性化し、培養中のASCに分化させることができます。抗体分泌に貢献するのASCの機能活性は、酵素を収束するアッセイであるエリスポットによって定量することができます- 結合immunoabsorbanceアッセイ（ELISA）およびウエスタンブロッティング技術は、単一細胞レベルでの個々のASCの列挙を有効にします。実際には、ELISpotアッセイは、ますますために血液試料の多数の取り扱いの容易さのワクチンの有効性を評価するために使用されています。末梢血からのヒトB細胞を単離する方法は、 インビトロでのASCへのB細胞の分化、および総IgM-およびIgG-ASCを定量化するためのELISpotの使用は、ここで説明します。

PBMCを赤血球および接着細胞（1.7から1.2ステップ）の枯渇させました。細胞のアリコート（2×10 6）を 、ナイーブB細胞、メモリーB細胞、及びPBS /末梢血中のPC（ 図1）の集団を説明するためにフローサイトメトリー分析に供しました。このドナーのPBMCにおける、リンパ球の約10％がCD19 + B細胞でした。 B細胞区画において、CD19 + CD27の百分率-ナイーブB細胞は約50％でした。一方、CD19 + B細胞の約50％がCD27 +メモリーB細胞7、25-26ました。注目すべきは、CD27 +メモリーB細胞は、さらに、IgDの4を含めて分離することができます。 2、30-31 -のPB循環の表現型は、より良い低または無表面CD20の発現（CD19 + CD27 + /ハイ CD38 + CD20 LO /）で定義することができます。死細胞、7-AADを除外するには細胞染色（ステップ3.5）に含まれ、及び7-AAD 対 FSCためのプロットは、生細胞（7-AAD - ）集団をゲーティングを可能にすることができます。 ELISpotアッセイの重要なステップは、 図2に示されています。精製されたヒトB細胞およびCD19 + CD27 +記憶B細胞の両方は、5日間のRPMI 1640培地でのCpGの存在下で培養しました。細胞は、新たに出現したASCを定量するためのELISpotアッセイのために回収しました。存在する場合、既存のPBは、48時間11で出て死んでしまう末梢血から単離しました。 ELISpotアッセイを行い、自動プレートスキャナにより取得されたスポット像を図3に示されます。 10 4個の細胞11に50 -のIgG-たASCの数は10であるのに対し、5日間のCpGで処置した10 4 B細胞から200のIgM-のASC -のELISpotの結果は、典型的には50が表示されます。 ナイーブB細胞、メモリーB細胞、及びPBMC中のPBを分離するためのゲーティング戦略の 図1. イラスト。 （A）細胞（2×10 6）は、CD19-APC、CD27-eFluor450、およびCD38-PEモノクローナル抗体（ステップ3.4）の各2μgで染色しました。リンパ球コンパートメントは、側散乱（SSC）対前方散乱（FSC）のドットプロットに（G1）にゲートされました。貼り合わせ2細胞によって形成されている（B）細胞ダブレットは、FSC-H（高さ）対FSC-W（幅）についてのプロットに（それらの外G2）は除外しました。 （C）CD19 + B細胞は、SSC-A（面積）およびCD19-APCのためのプロット上G3としてゲートしました。 CD19 +細胞の（D）、CD27およびCD38のパラメータのドットプロットは、ナイーブB細胞（CD19 + CD27 - ; Q1およびQ4）を示し、記憶B細胞（CD19 + CD27 +を 、Q2とQ3）、およびPBS（CD19 + CD27 + /ハイ CD38 +、G4、Q2の0.6％）。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54582/54582fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54582/54582fig2.jpg" /> エリスポットアッセイの重要なステップの 2. イラスト図 。 （A）は 、37℃で、または一晩4℃で2時間のELISpotプレートに抗ヒトIg抗体（IgG + IgM抗体+型IgA）のF（ab &#39;）2断片の50μL/ウェル（5μg/ ml）を入れてC（優先）（ステップ5.4）。 ELISPOTプレートのウェルに細胞を播種します。 14時間（ステップ5.11） - ASCには、PVDF膜に付着し、8のために腹筋を分泌することができます。 （B）は （0.05％Tween 20で）PBSで細胞を洗い流します。 （C）AP-あるいはHRP-CONJを追加ugated検出は、IgGまたはIgMのいずれかに特異的なABS。 （D）未結合している検出腹筋を洗い流します。 （E）検出腹筋と一致するように、APまたはHRPの基質溶液とスポットを開発します。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54582/54582fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54582/54582fig3.jpg" /> 代表プレートから 3 のELISpot結果を 図 。 （A）精製されたCD19 + B細胞を、ELISPOTプレートの（それぞれウェル＃3によく＃1において50,000細胞を、ウェル＃2で25,000細胞および12,500細胞）は、3つの隣接するウェルに入れました。細胞を、RPMI 1640培地で一晩（〜14時間）で培養しました。 ELISpotアッセイは、培養（5.18に5.12ステップ）を完了した後に行きました。アナライザーへE結果、ELISPOTプレートは、スキャナとソフトウェアを備えた自動分析装置を介して画像を取得するためにスキャンしました。 （B）精製されたCD19 + CD27 +記憶細胞（10 6 / mL）を5日間のCpGの5μg/ mlの存在下で培養しました。細胞を、ELISpotアッセイのための（A）のように処理しました。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54582/54582fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

単離、分化、および血液からヒト抗体を分泌するB細胞の定量化：体液性免疫の機能読み出しなどのELISpot

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

the-isolation-differentiation-quantification-human-antibody-secreting

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.1K ビュー.  National Taiwan University. Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

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Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

マウス腹腔細胞の分離

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

免疫・感染学

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

拡大、精製、及びヒト末梢血NK細胞の機能的評価

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell anemia 1-3. Due to the presence of multitude of antigens on the RBC surface (~308 known antigens 4), patients in the chronic blood transfusion therapy develop alloantibodies due to the miss match of minor antigens on transfused RBCs 4, 5. Grafting of hydrophilic polymers such as polyethylene glycol (PEG) and hyperbranched polyglycerol (HPG) forms an exclusion layer on RBC membrane that prevents the interaction of antibodies with surface antigens without affecting the passage of small molecules such as oxygen ,glucose, and ions3. At present no method is available for the generation of universal red blood donor cells in part because of the daunting challenge presented by the presence of large number of antigens (protein and carbohydrate based) on the RBC surface and the development of such methods will significantly improve transfusion safety, and dramatically improve the availability and use of RBCs. In this report, the experiments that are used to develop antigen protected functional RBCs by the membrane grafting of HPG and their characterization are presented. HPGs are highly biocompatible compact polymers 6, 7, and are expected to be located within the cell glycocalyx that surrounds the lipid membrane 8, 9 and mask RBC surface antigens10, 11.

The cell membrane modification of red blood cells (RBCs) with hyperbranched polyglycerol (HPG) is presented. Modified RBCs were characterized by aqueous two phase partitioning, osmotic fragility and complement mediated lysis. The camouflage of surface proteins and antigens was evaluated using the flow cytometry and Micro Typing System (MTS) blood phenotyping cards.

抗原は、コンパクトな多分岐ポリグリセロールのグラフト膜によって機能赤血球を保護

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

臍帯血から前駆B細胞サブセットの分離

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

フローから白血球の補充に間質細胞の影響を分析する

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

単離、特徴付けおよび歯肉免疫細胞ネットワークの機能検討

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

デキストランは、マウスとヒト NK 細胞のレンチ ウイルスの伝達効率を向上します。

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells differentiate to form platelet precursors called megakaryocytes, which terminally differentiate to release platelets from long cytoplasmic processes termed proplatelets. Megakaryocytes are rare cells confined to the bone marrow and are therefore difficult to harvest in sufficient numbers for laboratory use. Efficient production of human megakaryocytes can be achieved in vitro by culturing CD34+ cells under suitable conditions. The protocol detailed here describes isolation of CD34+ cells by magnetic cell sorting from umbilical cord blood samples. The necessary steps to produce highly pure, mature megakaryocytes under serum-free conditions are described. Details of phenotypic analysis of megakaryocyte differentiation and determination of proplatelet formation and platelet production are also provided. Effectors that influence megakaryocyte differentiation and/or proplatelet formation, such as anti-platelet antibodies or thrombopoietin mimetics, can be added to cultured cells to examine biological function.

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

A highly pure population of megakaryocytes can be obtained from cord blood-derived CD34+ cells. A method for CD34+ cell isolation and megakaryocyte differentiation is described here.

巨核球分化および人間の血小板形成臍帯血由来 cd34 陽性細胞の+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...