この作品は、チェコ教育省、青年、およびスポーツ（LO1304）、チェコ共和国の科学技術振興機構（TE01020028）からの助成金によってサポートされていました。著者は、環境蓋の静止画を撮影するための博士ラクシュマンバラナシに感謝したいと思います。

アガロースでコーティングされたプレートの調製<ol><li>低融点アガロースの0.75グラムを計量し、血清を含まない（フェノールレッドの有無にかかわらず）マッコイ5A培地の100ミリリットルに追加します。電子レンジ内の溶液を加熱し、完全にアガロースを溶解するために、すべての1-2分を旋回。それを殺菌するための解決策をオートクレーブ。 </li><li>約70℃にアガロースオートクレーブし冷却し、層流ボックス内の真空濾過により500ミリリットル、0.22μmのフィルター上部からそれをフィルタリングします。一度に全体のソリューションを使用していない場合はより小さなボリュームに0.75％フィルタリングアガロース溶液（FAS）を等分。低温室または4週間まで4℃の冷蔵庫で、このすぐに使用アガロース溶液を無菌的に保管してください。 </li><li> 70％エタノール（エタノール）でカセットコンビ試薬ディスペンサーとプライムにplastic-または金属傾け調剤カセットで小さなチューブを取り付け、その後、フローボックス内の滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で。 </li><li>使用前に、FAS私の保存されたアリコートを加熱<html> nは、マイクロ波は、溶融しました。総理アガロース溶液とコート384ウェル、組織培養（TC）との分注カセットは、FASの15μLとマイクロプレート「特別な」 - 処置しました。プレート内のアガロースは細胞を播種する前に、15〜20分間冷却してください。低温室で、または4℃、直射光からポリエチレン袋に包まれ、無菌的にアガロースコーティングしたプレートを保管してください。 注：原液中のアガロースの濃度の変化を防止するために、0.75％FASの繰り返し加熱を避けてください。上記の条件で保存した場合、アガロースでコーティングされたプレートは、最長2週間保存することができます。 FASは、プレートのコーティング時の加熱を必要としません。 </li><li>カセットのヒントやチューブに残っているアガロースを除去するために、70〜80℃の滅菌水でそれをプライミングすることにより、分注カセットをきれいにしてください。 </li></ol> 2.細胞培養およびMCTSの形成<ol><li>培養ヒト結腸直腸癌HCT116細胞を、前述のように小娘= &quot;外部参照&quot;&gt; 8。 </li><li>アガロースでコーティングされたの必要数を削除し、384ウェル、冷蔵保存からマイクロTC処理し、15分間室温（RT）にそれらを平衡化。 </li><li> 70％エタノールと滅菌PBSで標準管分配カセットをプライミングすることによって、細胞播種のためのコンビ試薬ディスペンサーを準備します。ディスペンサーの手動設定ボタンを使用して、メディアに必要μLに播種量と分注速度を調整します。 注記：全細胞播種プロセスは、無菌条件下で層流ボックス内で行われます。 </li><li>組換え細胞解離酵素を用いて組織培養フラスコから接着細胞を解離します。完全増殖培地50μL中ウェル当たり2.5×10 4細胞/ mlの密度でシード細胞と無菌ビーカー中の細胞懸濁液のストックを作ります。複数の384-WPを播種する際、ビーカーの底に沈降するのを防ぐために、マグネチックスターラーを用いて細胞をかき混ぜます。 </li><li>許可しますプレートを室温で30分間休憩した後、4×gで15分間遠心分離します。 </li><li>一方、蒸発還元環境蓋を取り、短辺中の滅菌H 8mLの2 Oまたは5％のジメチルスルホキシド（DMSO）で塗りつぶし5mLのピペット（ 図1A）を使用して（左および右）。まず、ゆっくりと上下にピペットチップを掃引することにより、左側の谷に液体を充填4mLのを分配します。右側の谷で、この手順を繰り返します。 注：サイドトラフに追加された液体は、蓋の中央部で合流し、ガス交換（ 図1A）のためのギャップを残さないことを確認してください。蓋の外部にH 2 Oの浸透2 O結果Hの過剰量を添加し、続いて384ウェルTCプレートの外側のウェルに。 </li><li> （ 図2Aを滅菌H 2 Oで384ウェルTCプレートの液溜りを記入し、液体充填環境蓋との定期的なプレートの蓋を交換）。 </li><li>湿度95％、5％CO 2及び20％O 2、37℃のロータリーインキュベーターにプレートを置き、そして細胞を4日間MCTSesに凝集することを可能にします。突然落下湿度レベルを防ぐために、後続の日には長すぎるためのインキュベーターの扉を開けないでください。 </li></ol> 3.培地交換ロボットシステムを使用して<ol><li> MCTSの形成後4日目に、よく自動化されたマイクロプレートウォッシャーディスペンサーを使用して、あたり予め温め媒体の30μLを追加します。 MCTSesは、さらに3日間増殖することを可能にします。彼らは実験のために希望のサイズを達成するまで、定期的に3日ごとに培地を交換してください。 </li><li>各ウェルから培地の定義されたボリュームを吸引するために、経験的にワッシャーマニホールドのz -heightを調整します。ウェルあたり培地を吸引30μL、新鮮な、予め温めた培地を30μLと交換してください。 注：ディスペンシング速度を設定し、ワッシャーマニホールドがダウンして移動する速度最低速度でのウェルにウェル内の乱流を最小限に抑えることができます。 </li></ol> 4. MCTSの高コンテンツイメージングと半自動画像解析<ol><li>画像4X空気対物レンズを用いた高含量の自動画像化システムにおけるMCTS（NA 16）。 </li><li> 4×4に11ミリ秒とビニングに露光時間を設定して実験のために所望のようにウェル当たり全体MCTSをキャプチャするために数と間隔のz -stacksのとピクセルビニングを調整します。 </li><li>プログラミング言語で記述され、社内のルーチンを使用して &quot;は、Readme」に記載されているように、画像を段階的に処理します。 注：.mファイルコード.txtのreadmeファイルには、補助コードファイル（ 図1B）として入手可能です。ルーチン対策2D画像からMCTS面積、長軸と短軸、周囲、および堅牢。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55403/55403fig1.jpg" /> 図1：環境蓋の調製と半自動ルーチンのフローチャート。正しい（左）および過剰の液体を充填する（右）の量（ここでは、5％DMSO）で充填された蒸発還元環境蓋の（A）画像。矢印は、液体を追加するための短辺のトラフを示します。アスタリスクは、DMSOの正しいボリュームの添加後、蓋の中央にあるギャップを示しています。 （B）半自動画像解析ルーチンに必要な手順を示すワークフロー。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55403/55403fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<ol>
	<li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three-dimensional+(3D)+models+in+cancer+research:+An+update.">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update.</a> Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).</li><li>Das, V., Bruzzese, F., Kone&#269;n&#253;, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajd&#250;ch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiologically+relevant+in+vitro+tumor+models+for+drug+screening.">Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening.</a> Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).</li><li>Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+need+for+complex+3D+culture+models+to+unravel+novel+pathways+and+identify+accurate+biomarkers+in+breast+cancer.">The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).</li><li>Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+angiogenic+capability+is+regulated+by+3D+culture+and+integrin+engagement.">Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).</li><li>Lao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Methods+to+Generate+Spheroid+Cultures+from+Tumor+Cells,+Tumor+Cells+&amp;+Fibroblasts+or+Tumor-Fragments:+Microenvironment,+Microvesicles+and+MiRNA.">Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells &amp; Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA.</a> PLoS ONE. 10 (7), e0133895 (2015).</li><li>Wenzel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+high-content+screening+for+the+identification+of+compounds+that+target+cells+in+dormant+tumor+spheroid+regions.">3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions.</a> Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Models+of+Epithelial-Mesenchymal+Transition+in+Breast+Cancer+Metastasis:+High-Throughput+Screening+Assay+Development,+Validation,+and+Pilot+Screen.">3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen.</a> J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).</li><li>Das, V., F&#252;rst, T., Gursk&#225;, S., D&#382;ub&#225;k, P., Hajd&#250;ch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+Uniform+Spheroid+Formation+in+384-Well+Plates:+The+Effect+of+Medium+Evaporation.">Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation.</a> J. Biomol. Screen. , (2016).</li><li>Celli, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+imaging-based+platform+for+high-content,+quantitative+evaluation+of+therapeutic+response+in+3D+tumour+models.">An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models.</a> Sci. Rep. 17 (4), 3751 (2014).</li><li>Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+tumor+spheroid+culture+model+amenable+to+high-throughput+testing+of+potential+anticancer+nanotherapeutics.">Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics.</a> J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).</li><li>Costa, E. C., Gaspar, V. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+evaporation+for+more+robust+microscale+assays.+Part+1.+Volume+loss+in+high+throughput+assays.">Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays.</a> Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening:+a+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Sci. Rep. 6, 19103 (2016).</li><li>Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Evaluation+of+Oxygen+and+Water+Permeation+through+Microplate+Sealing+Tapes.">Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes.</a> Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).</li><li>Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Assays+for+Characterizing+the+Viability+and+Morphology+of+3D+Cancer+Spheroid+Cultures.">High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures.</a> Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).</li><li>Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Image+Analysis+of+Tumor+Spheroids:+A+User-friendly+Software+Application+to+Measure+the+Size+of+Spheroids+Automatically.">High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically.</a> J. Vis. Exp. (89), e51639 (2014).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

フィルタリングされたアガロースで384ウェルTCプレートをコーティング LOTにおける標準的技法を被覆するアガロース、アガロースを必要とする、及び/又は分配ユニットは、アガロース6のゲル化を防ぐために加熱保持するプレートを1〜1.5％の低融点を使用することです。直径が0.2〜0.4ミリメートルの範囲の小さなチューブ開口を有する液体分注カセットを使用して複数のプレートを準備している間、アガロースのゲル化は、潜在的な関心事です。それは分配中は追加の加熱を必要としないように分配するカセットを目詰まりの潜在的な問題を克服するために、0.75％FASは、使用されました。なお、それはまた、0.75％FASはとして急速に濾過されていない1〜1.5％、またはさらには0.75％アガロース溶液としてゲル化しないことが観察されました。 0.75％FASを使用して、分注カセットを詰まらせることなく被覆する35未満の全384ウェルTCプレートをとります。カセットは、残留Aを除去するために加熱された水でプライミングすると、最後に洗浄することができますカセットを使用していないときのヒントを詰まらせる可能性がgarose、。 レギュラープレート蓋とインキュベーターの上に環境蓋とロータリーインキュベーター媒体の蒸発によって誘発される不均一な損失を大幅に均一MCTS形成の再現性に影響を及ぼし、その結果、アッセイの14の結果を損ないます。驚くべきことに、環境蓋/回転式インキュベーターの組み合わせの下で384ウェルTCプレートのグループ1ウェルは、OGの吸光度（ 図2C）において統計的に有意な変動を示しました。しかし、グループ1ウェル中OGの吸光度の低いCVは、環境蓋を有する回転インキュベーターで384ウェルTCプレートの外側のウェル中の蒸発がMCTSの成長（ 図2D）に影響を与えるほど過大ではないことを示しています。これは、環境蓋/回転式インキュベーターの組み合わせでプレートに、グループ1のウェル内に形成された均一なサイズのMCTSesから明らかです。また、損失を減少させましたメディアの環境蓋8と、回転インキュベーター中で培養384ウェルTCプレートからの薬物アッセイにおけるウェル間のばらつきを防ぐことができます。 提示された方法論はまた、いくつかの他の癌と非癌細胞株8の均一MCTSesの形成をもたらします。全ての細胞は本質的に非接着性表面上MCTSesに凝集することができないので、この方法は、多くの均一MCTS形成の再現性について試験されなかった他の細胞株には適していません。また、焦点は主にMCTS形成の再現性を高めるために、蒸発低減国会議員とプレートの蓋との組み合わせで高度な技術インキュベーターの使用にありました。 MCTS形成の再現性を高めるための別の安価で簡単な解決方法は、胚グレードの鉱物油や蒸発を防ぐ通気性シールテープまたは膜の使用であるが、通常のガス交換1の可能性があります5。アガロース高コンテンツイメージングへの障壁となることができボトムスをプレートに余分な厚さを加算したが、透過光イメージングにおけるアガロースボトムによって作成された被写界深度は、薬物治療後MCTSの大きさや形状の確認を妨げません。したがって、提示された方法は、MCTS文化のLOTで再現性の問題に直面している研究者への潜在的な対象としています。 半自動画像解析ルーチン MCTSの画像解析のために利用可能な多くの半自動/自動化されたソフトウェアがあるが、完全な対部分崩壊MCTSes薬物治療後の大きさの測定は誤差16,17を起こしやすいです。提示ルーチンの最初のステップでは、最良焦点を合わせた画像が自動的に画像の勾配のノルムを計算し、最大0.999資格を有するものを選択することにより、Z -stack画像のセットから選択されますNTILE。これは、最大の堅牢性とノイズを区別しない尺度です。 次に、暗い境界がトリミングされ、処理された画像は、ポータブルネットワークグラフィックス形式で元の解像度で保存されています。このプロセスは、約100メガバイトに、全体を384ウェル、TC処理プレートを撮影から、2.5ギガバイトから合計サイズを削減します。その後、MCTSの中心は、ユーザー定義の半径の円形フィルターとの畳み込みを介して発見された（私たちは20ピクセルを使用; 図4A）。フィルタリングされた画像の明確な極小値は、中心（ 図4A）の位置を提供します。同心の環状部でこの中心から移動すると、中央値グレースケール値、Mは、各シェルでシェル半径の関数として計算され、R.関数M（R）の数値微分の後、最初の（実質的な）最大値であり、見つかった（ 図4B）。この最大の点MのOPTは、最適閾値として撮影し、画像は、Sでありますこのレベルで閾値処理することによってegmented。 MCTSは、画像の最大中央セグメントとして識別されます。多くの場合、薬物治療（ 図4Cおよび4D）から生じる崩壊部分からMCTSコアを分離することができるため、この手順は、通常、標準的な閾値処理技術よりも優れて動作します。また、ここで採用されたアプローチは、MCTSの球形の暗黙的に使用します。アクティブな輪郭に基づいて、単純な閾値処理ルーチン、またはアルゴリズムは、球状の物体が発見される先験的知識を悪用しないでください。 MCTSが明確に検出し、線引きされた場合、最大のM OPTは、明確かつ単一です。次いで、ルーチンは、このような領域としてMCTSの特性、長軸と短軸、周囲、そして当てはめた楕円の堅さを測定し、セグメント化された画像のプレビューを保存します。最大値は明確ではない場合、および/または複数の極大値は、事前に存在する場合提案したセグメント化の観点からは、補正フォルダに保存されます。 最後から二番目のステップでは、ルーチンは手動で上下のしきい値を移動させ、マスクの可能な冗長部分を遮断するために関心の多角形領域を選択することにより、提案したセグメンテーションを調整するための補正フォルダを介してユーザーを歩きます。この手動補正した後、ルーチン対策、上述したように、MCTS特性を保存します。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55403/55403fig4.jpg" /> 図4：画像分割手順のイラスト。 （A）MCTSの中心は緑のアスタリスクでマークされています。環の例は、赤色で描画されます。各シェルにおけるメジアン階調値（B）はシェルの半径（青線）の関数としてプロットされています。この曲線の数値誘導体（赤線）が計算されます。最初の実質的なミリアンペア数値誘導体のximumは（黒アスタリスク）を発見されました。 （C）MCTSコアおよび崩壊MCTSパーツと背景に画像の結果の正しいセグメンテーション。 （D）大津の方法によって得られる誤った区分。 4X目的。スケールバー=500μmの。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55403/55403fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

腫瘍中の癌細胞は、生理学的に細胞外マトリックスと相互作用する細胞に囲ま複雑な3次元（3D）構造に配置されています。ほぼ組織内のすべてのセルは、3D環境内に存在する、より生理学的に関連する腫瘍の特性を模倣するインビトロ腫瘍モデルでの必要性は、いくつかの3次元培養技術1、2、3の開発をもたらしました。これらのモデルは、現在、3D 2の治療薬への転移および細胞応答に腫瘍微小環境の役割を研究するための基礎的な研究ツールになってきています。また、2次元（2D）細胞培養物4と比較して、3Dモデルは、細胞シグナル伝達経路に影響を与える、腫瘍-間質相互作用のよりよい理解を可能にします。 癌細胞株の多腫瘍スフェロイド（MCTSes）は、しばしば、3DセルCで使用されていますin vivoでの腫瘍に対するそれらの相対的な近さに起因するultureモデル。使用中のいくつかの技術のうち、アガロースでコーティングされたプレート上でMCTS生成の液体オーバーレイ技術（LOT）は、リード最適化とターゲットバリデーション5、6、7、8、9、10、11のために大きな関心を集めています。これが成功しLOT 6、7を使用してMCTS培養における化合物ライブラリーのパイロットの画面を実行することができました最近の研究から明らかです。しかし、媒体の蒸発によって誘導される不均一な損失にMCTSの形態と成長のウェル間の変動は、マイクロタイタープレートを使用して、LOT（MPS）を伴う一般的なハードルがあります。その結果、不均一なMCTSesの形成は有意との関連性を損ないます薬理学的アッセイ8、12、13からのデータ。自動液体分注装置を使用する際の再現性の問題に加えて、LOTベースのハイスループットアッセイに影響を与える別の実用的な問題は、アガロースでMPのコーティングです。分配ユニットは、アガロースのゲル化を防ぐために加熱保持することができるが、分注カセットおよび管の目詰まりは、ロボットシステム6のための潜在的な問題です。 これらの課題のいくつかを克服するために、我々は最近、MCTS文化8用のLOTでいくつかの変更を考案しました。これらの修飾は、主に一般的ハイスループットスクリーニング実験室で発見された機器を用いたMPから不均一媒体の損失を防止することができる方法に基づいています。 3に均一なサイズで再現性のMCTSesの世代のために修正されたLOTの詳細な手順84ウェルプレート（WPS）は、ここに提示されています。原稿は、特に断面積の測定のために明確に定義された境界を持っていない、部分的に崩壊し、薬剤処理MCTSesで、MCTSサイズの評価のための半自動化ルーチンを示しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Low-melting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCOY&#39;s 5A Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8220;rapid&#8221; Filtermax filter</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99505</td>
			<td>0.22 &#956;m, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multidrop&#8482; Combi Reagent Dispenser&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Tube Dispensing cassette&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24073295</td>
			<td>Metal tip&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well TC plate&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6057308</td>
			<td>Plate type- CellCarrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Tube Dispensing Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24072670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroClime Environmental Lid</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>LLS-0310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Incubator (SteriStore )</td>
			<td>HighRes Biosolutions</td>
			<td>23641</td>
			<td>Serial No.: D00384</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Washer Dispenser&#160;</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Unspecified</td>
			<td>Model: EL406&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Content Imaging System (CellVoyager )</td>
			<td>Yokogawa Electric Corporation</td>
			<td>Unspecified</td>
			<td>Model: CV7000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7022S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE&#8482; Express recombinant cell dissociation reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604021</td>
			<td>Phenol red free</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaporation-reducing culture condition increases the reproducibility of multicellular spheroid formation in microtiter plates

密接にインビボ条件で模倣する腫瘍モデルは、潜在的な抗癌薬のスクリーニングのための薬物発見および開発にますます普及しつつあります。多腫瘍スフェロイド（MCTSes）を効果的にリード最適化および標的バリデーションのためのインビトロモデルにおけるそれらの優れた製造、固形腫瘍の生理学的条件を模倣します。 MCTS培養のための利用可能な様々な技術のうち、アガロース上に液体オーバーレイ方式は、MCTSの世代のための最も安価な方法の一つです。しかし、ハイスループットスクリーニングのための液体オーバーレイを使用してMCTS培養の信頼できる転送をアガロースウェルにわたって均一MCTS形成の非再現性を有するマイクロタイタープレート（MPS）のコーティングを含む多くの制限によって妥協されてもよいです。国会議員は、薬物のためのプレート全体の使用を防止する、プレートの外部から媒体の過度の蒸発に起因するエッジ効果に有意傾向がありますテスト。この原稿は、均一なMCTS形成の拡張性と再現性を高めるために液体オーバーレイ技術に詳細な技術改良を提供します。薬物治療が提示された後に加えて、MCTSの評価のためのシンプルな、半自動、および普遍的に適用するソフトウェア・ツールの詳細については備えています。

特に、周辺井戸からの媒体の不均一な損失は、小さな培養容量を持つ国会議員で頻繁に遭遇する問題です。このような、よく制御された温度/加湿システムと蒸発低減国会議員とプレートの蓋付きインキュベーターと実質的に改善された培養条件は、井戸8を横切る媒体の重大な損失を低減します。相対蒸発を測定するために、オレンジG（OG）の等容積を各ウェルに添加し、3日間のOGの吸光度の変化は、標準、ロータリーインキュベーターで定期的かつ環境ふたを有するプレートに記録しました。プレートウェルプレート（ 図2A）の端からの距離に基づいて6つのグループに分けました。グループ1-4では、標準のインキュベータ（ 図2B）で定期的にふたを有するプレートの経時OGの吸光度に大きな変化がありました。 OGの吸光度の変化からもありましたが、グループ環境蓋/回転式インキュベーターの組み合わせ（ 図2C）の下のプレート中の1ウェルは、変動係数（CVが）標準インキュベータ（ 図2D）での定期的な蓋つきのプレートに比べてはるかに低かったです。 媒体の蒸発によって誘導される不均一な損失は、国会議員8でMCTSサイズおよびアッセイ読み出しにおけるウェル間の変動の潜在的な理由の一つです。しかしながら、環境蓋/ロータリーインキュベーターの組み合わせで384ウェルTCプレートウェルの6つの群（ 図2E）にわたって均一MCTSesの形成をもたらしました。これとは対照的に、定期的な蓋/標準インキュベーターの組み合わせを有するプレートでMCTSesは、大きさや堅（ 図3F）で大幅に変化します。ソリディティはMCTSの真球度の尺度であり、MCTSの崩壊の度合いを与えます。 2D領域の堅牢性は、共同での画素の割合でありますnvex関心領域（ROI）の船体およびROIの凸包の面積によりROIの領域を分割することによって決定されます。円形や楕円両領域1の堅さを持っている、とMCTSは崩壊として、堅牢は減少します。面積の差は、既にダスらに報告されています。 （2016年）8。ボリュームはMCTSesの長軸と短軸から計算しました。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55403/55403fig2.jpg" /> 図2：増加MCTS再現性の最小限の蒸発結果にプレート。 （A）のプレートマップは6グループに井戸の区分を示すために提示されています。 （BおよびC）正規の蓋（B）と標準的なインキュベーターで培養プレート内のグループ1-4のウェルからOGの相対的な吸光度の大幅な時間依存性のばらつきがあり、グループ1、私たちからロータリーインキュベーター（C）の環境ふたを有するプレートでLLS。日3-5 OGの吸光度は、0日目（D）に正規化グループのOGの吸光度のCVの日3-5から1ウェルが2板蓋/インキュベーターの組み合わせのために示されているが平均化されます。 CVが3つの独立した実験の平均です。環境蓋/回転式インキュベーターの組み合わせでプレートに形成された（E）MCTSesウェルの6グループ間で有意差は認められませんでした。 （B）ただし、標準のインキュベータ内で定期的にふたを有するプレートは、可変サイズのMCTSesが形成されました。データは1群につきn&gt;は60 MCTSesのために示されています。箱と箱ひげ図でボックス内の水平バーは、それぞれ、25 番目と75 番目のパーセンタイル値と中央値を表します。ウィスカは5 番目と95 番目のパーセンタイルを表し、外れ値は、箱ひげ図で整列黒丸で示されています。クラスカル・ワリス分析のp値は、EACの下に提示されます時間箱ひげ図。データは、プレート蓋/インキュベーターの組み合わせごとに少なくとも3つの独立した実験からのものです。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55403/55403fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ルーチンの適用可能性を判断するには、7日齢MCTSesは、3つの異なる濃度でパクリタキセル（PTX）、ビンクリスチン（VCR）、オキサリプラチン（OXA）、ドキソルビシン（DOX）、および5-フルオロウラシル（5-FU）で処理しました4日間。薬は大学病院オロモウツ、パラツキー大学から入手しました。 MCTSの画像は分析された、面積、長軸と短軸、周囲、および処理されたMCTSesの堅牢性は、対照（CTL）を比較しました。長軸と短軸は、幾何学的体積を計算するために使用しました。薬物治療（ 図3）後の濃度依存性のMCTS面積の減少とボリュームがありました。 0.001 / mlのVが、CRおよび0.4 / mlのDOXおよび5-FUは、MCTS面積の増大をもたらし、体積が大きく0.001 / mlのVCR以下だけ増加しました。 MCTSの周囲にのみ完全にMCTSのサイズに影響を与えPTX、DOX、及び5-FUの最高濃度で有意差がありました。 PTXおよび0.25μgの/ mLおよび0.06μgの/ mLおよびDOXおよび100μg/ mLの5-FUでVCRがMCTSes（ 図3）の完全な対の部分的崩壊を示し、堅牢性の有意な減少をもたらしました。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55403/55403fig3.jpg" /> 図3：半自動化ルーチンによってMCTSesにおける薬物効果の測定。 CTLおよび薬物処理MCTSesの（A）の画像が提示されています。 =10μmのスケールバー。 / mlの中の濃度は、画像ごとに与えられています。 （B）棒グラフは、上のPTX、VCR、OXA、DOX、5-FUの用量依存効果を示します地域と治療の4日後7日齢MCTSesのボリューム。 MCTSの周囲はかなりの0.25μg/ mLのPTXおよび100μg/ mLのDOXと5-FU以下に減少しました。 MCTSesの完全なツー部分的崩壊をもたらした薬物濃度が有意CTLに比べMCTSの堅牢性を減少させました。データは3つの独立したプレートから少なくとも5 MCTSesの平均±SDです。 * P &lt;0.001、＃の P &lt;0.01、φて p &lt;0.05 CTL対薬物処理、Dunnettの多重比較検定で一方向ANOVA。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55403/55403fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

マイクロタイタープレートからの培地の不均一な損失は、均一な多細胞腫瘍スフェロイド形成の再現性に影響を与えます。重要な媒体の損失を低減するために培養条件を改善するスフェロイド形成の再現性及び液体オーバーレイ技術を使用して回転楕円体に基づくアッセイの結果を改善します。

蒸発低減文化条件は、マイクロタイタープレートに多細胞スフェロイド形成の再現性を高め

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

evaporation-reducing-culture-condition-increases-reproducibility

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

6.9K ビュー.  Palacky University in Olomouc. マイクロタイタープレートからの培地の不均一な損失は、均一な多細胞腫瘍スフェロイド形成の再現性に影響を与えます。重要な媒体の損失を低減するために培養条件を改善するスフェロイド形成の再現性及び液体オーバーレイ技術を使用して回転楕円体に基づくアッセイの結果を改善します。 

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Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

癌細胞スフェロイド培養における潜在的に新規薬剤標的を同定するためのスクリーニング機能ゲノミクスを利用

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

がん研究

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas including genome integrity, genotoxicity, radiation biology, aging, cancer, and drug development. In response to DSB, the histone H2AX is phosphorylated at Serine 139 in a region of several megabase pairs forming discrete nuclear foci detectable by immunofluorescence microscopy. In addition, 53BP1 (p53 binding protein 1) is another important DSB-responsive protein promoting repair of DSB by nonhomologous end-joining while preventing homologous recombination. According to the specific functions of &#947;H2AX and 53BP1, the combined analysis of &#947;H2AX and 53BP1 by immunofluorescence microscopy may be a reasonable approach for a detailed analysis of DSB. This manuscript provides a step-by-step protocol supplemented with methodical notes for performing the technique. Specifically, the influence of the cell cycle on &#947;H2AX foci patterns is demonstrated in normal fibroblasts of the cell line NHDF. Further, the value of the &#947;H2AX foci as a biomarker is depicted in x-ray irradiated lymphocytes of a healthy individual. Finally, genetic instability is investigated in CD34+ cells of a patient with acute myeloid leukemia by immunofluorescence microscopy of &#947;H2AX and 53BP1.

This manuscript provides a protocol for the analysis of DNA double-strand breaks by immunofluorescence microscopy of &#947;H2AX and 53BP1.

ΓH2AX、53BP1 形成と DNA 二重鎖切断の修復を分析するための蛍光顕微鏡観察

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with or without surgery. While platinum-based chemotherapy regimens currently represent the gold standard in terms of efficacy and are given in the vast majority of cases, new chemotherapy regimens, namely immunotherapy are emerging. However, the response rates and therapy resistance mechanisms for either chemo regimen are hard to predict and remain insufficiently understood. Broad variations of chemo and radiation resistance mechanisms are known to date. This study describes the development of a standardized, high-throughput in vitro assay to assess HNSCC cell line&#39;s response to various therapy regimens, and hopefully on primary cells from individual patients as a future tool for personalized tumor therapy. The assay is designed to being integrated into the quality-controlled standard algorithm for HNSCC patients at our tertiary care center; however, this will be subject of future studies. Technical feasibility looks promising for primary cells from tumor biopsies from actual patients. Specimens are then transferred into the laboratory. Biopsies are mechanically separated followed by enzymatic digestion. Cells are then cultured in ultra-low adhesion cell culture vials that promote the reproducible, standardized and spontaneous formation of three-dimensional, spheroid-shaped cell conglomerates. Spheroids are then ready to be exposed to chemo-radiation protocols and immunotherapy protocols as needed. The final cell viability and spheroid size are indicators of therapy susceptibility and therefore could be drawn into consideration in future to assess the patients&#39; likely therapy response. This model could be a valuable, cost-efficient tool towards personalized therapy for head and neck cancer.

We describe the evolution of a spheroid-based, three-dimensional in vitro model that enables us to test the current standard of experimental therapy regimens for head and neck squamous cell carcinoma on cell lines, aiming at evaluating therapy susceptibility and resistance on primary cells from human specimens in the future.

治療の頭頸部扁平上皮癌に対する回転楕円体に基づく 3 D 細胞培養モデルのテスト

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human central nervous system (CNS). However, both the cytological origin and the evolutionary process of HBs (including neovascularization) remain controversial, and anti-angiogenesis for VHL-HBs, based on classic HB angiogenesis, have produced disappointing results in clinical trials. One major obstacle to the successful clinical translation of anti-vascular treatment is the lack of a thorough understanding of neovascularization in this vascular tumor. In this article, we present a comprehensive procedure to evaluate in vitro whether classic tumor angiogenesis exists in HBs, as well as its role in HBs. With this procedure, researchers can accurately understand the complexity of HB neovascularization and identify the function of this common form of angiogenesis in HBs. These protocols can be used to evaluate the most promising anti-vascular therapy for tumors, which has high translational potential either for tumors treatment or for aiding in the optimization of the anti-angiogenic treatment for HBs in future translations. The results highlight the complexity of HB neovascularization and suggest that this common form angiogenesis is only a complementary mechanism in HB neovascularization.

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

This paper presents a comprehensive procedure to evaluate in vitro whether classic tumor angiogenesis exists in hemangioblastomas (HBs) and its role in HBs. The results highlight the complexity of HB-neovascularization and suggest that this common form of angiogenesis is only a complementary mechanism in the HB-neovascularization.

発芽アッセイ回転楕円体を使用して推定される芽新生体外パフォーマンスを評価する包括的な手順

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased metastatic potential. Recently, mono-chemotherapies continue to improve by melanoma specific combination therapies with targeted kinase inhibitors. Still, metastatic melanoma remains a life-threatening disease because tumors exhibit primary resistance or develop resistance to novel therapies, thereby regaining tumorigenic capacity. In order to improve the therapeutic success of malignant melanoma, the determination of molecular mechanisms conferring resistance against conventional treatment approaches is necessary; however, it requires innovative cellular in vitro models. Here, we introduce an in vitro three-dimensional (3D) organotypic melanoma spheroid model that can portray the in vivo architecture of malignant melanoma and may warrant new insights into intra-tumoral as well as tumor-host interactions. The model incorporates defined numbers of mature and differentiated melanoma spheroids in a 3D human full skin reconstruction model consisting of primary skin cells. The cellular composition and differentiation status of the embedded melanoma spheroids is similar to the one of cutaneous melanoma metastasis in vivo. Using this organotypic melanoma spheroid model as a drug screening platform may support the identification of responders to selected combination therapies, while sparing the unnecessary treatment burden for non-responders, thereby increasing the benefit of therapeutic interventions.

Here, we present a protocol to generate a 3D organotypic melanoma spheroid skin model that recapitulates both the architecture and multicellular complexity of an organ/tumor in vivo but at the same time accommodates systematic experimental intervention.

黒色腫切片 3 D 回転楕円体の皮膚モデル

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy against cancer. Here we provide a protocol to identify a rational combination at the preclinical step. First, we describe a cell-based assay to assess the synergism between anticancer mAb and cytotoxic drugs, that uses the combination index equation of Chou and Talalay1. This includes the measurement of tumor cell drug- and antibody-sensitivity using an MTT assay, followed by an automated computer analysis to calculate the combination index (CI) values. CI values of &lt;1 indicate synergism between tested mAbs and cytotoxic agents1. To corroborate the in vitro findings in vivo, we further describe a method to assess the combination regimen efficacy in a xenograft tumor model. In this model, the combined regimen significantly delays tumor growth, which results in a significant extended survival in comparison to single-agent controls. Importantly, the in vivo experimentation reveals that the combination regimen is well tolerated. This protocol allows the effective evaluation of anticancer drug combinations in preclinical models and the identification of rational combination to evaluate in clinical trials.

This protocol describes how to assess synergism between an anticancer antibody and antineoplastic drugs in preclinical models by using the combination index equation of Chou and Talalay.

抗がん剤抗体抗悪性腫瘍薬による効果の増強: 組み合わせインデックス式を用いた抗体医薬の相乗作用の検出

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate cancer (PCa). Understanding the anatomy and histology of the mouse prostate is important for the efficient use and proper characterization of such animal models. The mouse prostate has four distinct pairs of lobes, each with their own characteristics. This article demonstrates the proper method of dissection and identification of mouse prostate lobes for disease analysis. Post-dissection, the prostate cells can be further cultured in vitro for mechanistic understanding. Since mouse prostate primary cells tend to lose their normal characteristics when cultured in vitro, we outline here a method for isolating the cells and growing them as 3D spheroid cultures, which is effective for preserving the physiological characteristics of the cells. These 3D cultures can be used for analyzing cell morphology and behavior in near-physiological conditions, investigating altered levels and localizations of key proteins and pathways involved in the development and progression of a disease, and looking at responses to drug treatments.

Genetically engineered mice are useful models for investigating prostate cancer mechanisms. Here we present a protocol to identify and dissect prostate lobes from a mouse urogenital system, differentiate them based on histology, and isolate and culture the primary prostate cells in vitro as spheroids for downstream analyses.

培養 3 D 回転楕円体モデルでのマウス前立腺の葉の解剖組織学的特性及び

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells obtained the most spectacular results, in particular with pediatric B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Classical validation methods of CAR T cells rely on the use of specificity and functionality assays of the CAR T cells against target cells in suspension and in xenograft models. Unfortunately, observations made in vitro are often decoupled from results obtained in vivo and a lot of effort and animals could be spared by adding another step: the use of 3D culture. The production of spheroids out of potential target cells that mimic the 3D structure of the tumor cells when they are engrafted into the animal model represents an ideal alternative. Here, we report an affordable, reliable and easy method to produce spheroids from a transduced colorectal cell line as a validation tool for adoptive cell therapy (exemplified here by CD19 CAR T cells). This method is coupled with an advanced live imaging system that can follow spheroid growth, effector cells cytotoxicity and tumor cell apoptosis.

This protocol is designed to assess immunotherapeutic redirected T-cell (CAR T-cell) cytotoxicity against 3D structured cancerous cells (spheroids) in real time.

車 T 細胞スフェロイド殺害アッセイ

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

三次元スフェロイド浸潤アッセイにおける完全ヒト腫瘍ベースマトリクス

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

癌細胞の3Dスフェロイド培養における細胞生存率と死の評価

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...