The authors have no acknowledgements.

保健省とヒューマンサービスの規制に準拠する非識別組織サンプル、45 CFR 46.101（b）は（4）が付与されたを使用して研究を行うための免除の承認（3002から13）。全層皮膚を待機手術から受信されます。この記事では、組織供給源は、66歳の白人女性の胸です。 エラストマーコーティングされたカバーガラスの作製<ol><li> 20mLのガラスバイアルにおいて、5.893グラムベースでのSylgard 184硬化剤の0.107グラム混ぜます。 1：全混合物の質量は55のエージェントの比率を硬化する塩基で6グラムです。 </li><li>均質性を確実にするためにガラス棒を用いて混合した後、すべての気泡を除去する真空チャンバと脱ガスガラスバイアルを置きます。 </li><li>スピンコーターの中心にガラスカバースリップ（55ミリメートル×25 mm）を配置します。カバースリップの中央に混合物の約1 mLを加え。ハサミで切断端と5,000μLピペットを使用してください。スピンコート60秒間2,000 rpmでカバースリップ。 <ol><li>このPを繰り返し5-6の基板を作成するrocess。 </li></ol></li><li> 60℃で12時間、オーブンでカバーグラスを治します。 </li><li>部分的に犠牲基板からエラストマー膜を除去するためにカミソリの刃を使用してください。エラストマーフィルムと露出したガラスの上側をマークするために、消えないマーカーを使用してください。 </li><li>倒立顕微鏡でサンプルをマウントし、2つのマークの焦点面との間のz高さの差を記録するために、リモートフォーカスアクセサリを使用しています。これは、エラストマー基板の厚さ、hに対応します。 </li></ol>角質層の調製<ol><li>半分を60℃に、脱イオン水（DW）を充填したガラスビーカーを加熱するために水浴または加熱撹拌プレートを使用してください。生物学的安全キャビネットの内部には、4分間水中での全厚ヒトの皮膚を浸します。 </li><li>すぐにDWは4分間、&lt;10℃に冷却含むビーカーに皮膚サンプルを転送します。ビーカーを埋める半分は生体有害物質の飛散を最小限に抑えます。 </li><li>曲がった鼻の組織ピンセットを用いて表皮を分離優しくペトリ皿でビーカー、場所から肌を削除し、。 </li><li>ガーゼを敷いたペトリ皿に分離された表皮基底側を下に置きます。基底層が完全にガーゼと接触していることを確認します。 <ol><li> 0.25％（重量/容量）を室温で6-8時間、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水に溶解したIX-Sブタ膵臓トリプシン溶液を入力中にガーゼを浸し。ガーゼを湿らせる容器に十分なだけのトリプシンを追加します。 </li></ol></li><li>組織ピンセットでガーゼを持ち上げて、部分的にDWを充填した容器の中に浮かんでいます。ゆっくりガーゼからそれを分離するためにSCを引きます。 </li><li> SCに付着したまま残留表皮組織を除去するために、DWで角質層3-4回洗浄します。 </li><li> DWで0.4％グリシンマックス（大豆）トリプシン阻害剤の溶液中に単離されたSCフロート。 10分間組織を攪拌するプレートシェーカーを使用してください。 </li><li>部分的にペトリ皿にSCフロートDWで満たされました。 10分間組織を攪拌するプレートシェーカーを使用してください。 </li><li>室温で48時間超微細プラスチックメッシュ上に、単離されたSC紙を乾燥（25℃、40％相対湿度（RH））。 </li><li>メッシュからSCを分離し、円形の穴パンチを使用して、個々の円形R = 3mmの半径サンプルを切り出します。マーク消えないマーカーを用いた小型のスパイラルマークの付いた一番外側の面の中心。これは、SCの上側を認識するための視覚的な手がかりを提供します。 注：足跡は、乾燥変形が最小になる試料の中央に適用されるべきです。これは、記録された乾燥変位プロファイル上のマーカーの影響を最小限に抑えることができます。 </li></ol> 3.サンプル処理と堆積<ol><li> 90μL蛍光マーカービーズを含む15 mLのDWで30分間SCサンプルを攪拌（505/515 nmで、直径1μm、カルボキシレートは、修飾されました）。 SCの表面にこの預金ビーズ 注：ながらリットルの堆積SC上のビーズのARGE数は、それが続いて得られる面内変形場の空間分解能をビーズ現在12ないサンプルにわずかに遅い乾燥を相対的に最大にすることができます。追加されたビーズ容量の選択は、したがって、 アドホックなされるべきです。 </li><li> SCサンプルを削除し、部分的にDWで満たされたペトリ皿に配置します。 </li><li>部分的に15-30°の浅い角度でDW内の基板を浸します。 </li><li>基板と水の界面との間の接触線での浮動SCサンプルのエッジをピン。垂直方向にスムーズにしわや閉じ込められた気泡のない基板へのSCサンプルをラミネートします水から基板を取り出します。 </li><li>各基板上に6 SCサンプルまでを配置するための手順を繰り返し3.4。サンプルの間に少なくとも2〜3ミリメートルのギャップのままにして、基板エッジに近いサンプルの積層を避けます。これは別のもので、乾燥変位に影響を与える一つの試料の乾燥を防ぐことができます。 </l私&gt; <li> 60分間実験室条件に搭載SCサンプルを乾燥させます。これは、SCと基板との間の残留水が蒸発することを可能にし、完全な組織接着を確実にします。 注：この時点では、SCサンプルは時間の必要な期間、所望の溶液中に逆さまに基板を配置することにより、化学的または化粧品配合物7,8を用いて治療することができます。処理工程が実行されると、ステップ3.6を繰り返します。乾燥した後、基板にSCサンプルの不完全密着は、透過光顕微鏡を用いて確認することができます。 SCサンプルまたは剥離縁下敷き気泡が明確に定義されたエッジを有するサンプル中の明確なコントラスト変動を形成することになります。 </li><li>部分的に密閉された容器に水で満たされたペトリ皿を置くことによって、湿度室を作成します。 </li><li> 24時間チャンバ内に置き基板は、99％の相対湿度に平衡化します。ペトルに基板を配置しないでください私は皿。 </li></ol> 4.顕微鏡環境制御<ol><li>顕微鏡マウント灌流チャンバーに接続された湿度制御システムを介して環境条件の制御を達成します。湿度制御システムの詳細は、ドイツらに設けられています。 （2013年）7と劉とドイツ（2015年）8。 </li><li> 、顕微鏡上に基板をマウント基板上に灌流チャンバーを配置し、真空グリースを使用してエラストマーに灌流チャンバーの端をシールします。 </li><li>一度取り付けられ、実験前に99％RHに内部の空気を平衡化。これは、実験前に水の蒸発を防ぐことができます。セクション5または7での撮影が始まったら、所望の値に内部の空気の湿度を低下させます。 注：この記事では、SCのサンプルを25％RHに乾燥しています</li></ol>飛行機乾燥変位5.イメージング<ol><li>反転microscoを使用して、SCサンプルの画像を取得1X対物レンズとPE。 FITCフィルター（503から530 nmの放射帯域）の光エンジンを用いた蛍光ビーズを励起します。複数のサンプルは、自動化されたX-Yステージを使用して乾燥を通して連続的に撮像することができます。 </li><li> 1392 X 1040ピクセルの解像度でデジタルCCDカメラを使用して、レコード蛍光と透過光画像。各画像の視野は、完全なSCのサンプルをキャプチャするために単一の画像を可能8.98 X 6.71 mmです。 16時間10分の頻度で画像を取ります。 </li></ol>厚測定のための6基質の準備<ol><li>いくつかの小さなプラスチック製のキャップで、化学ヒュームフードでは、1 mLのシラン（≥98％3-アミノプロピルトリエトキシシラン）を配置。セクション1と5時間密閉容器内キャップからエラストマー基板を配置します。基板は、シランと直接接触して来ないようにしてください。 </li><li> 1.5 mLチューブに、5 EDCのMG（≥99％Nエチルカルボジイミド塩酸塩- - （3-ジメチルアミノプロピル）N）を追加します。 50を追加します。EDCへのDWの0μL。ボルテックスミキサーで10秒のためのソリューションを撹拌。 </li><li> 20 mLのDWに0.076グラムの四ホウ酸ナトリウムおよび0.1グラムのホウ酸を追加します。 70℃（1時間）で、マグネチックスターラーを用いて混合します。 pHが7.4になるまで、ホウ酸を追加します。 </li><li> 50 mL遠心管にホウ酸緩衝液の20 mLを加え。ホウ酸緩衝液に1μmのビーズ（575分の535 nmのカルボン酸で修飾された）の60μLを追加します。最後に、ボトルにEDC溶液200μLを追加します。ビーズ溶液を混合するためにチューブを振って、その後、直径10cmのペトリ皿に注ぎます。 </li><li>コンテナからシラン化基板を取り外し、それらをダウンビーズ溶液中にフィルム側をエラストマー置きます。捕獲されたなってから気泡を防止するために、ゆっくりと行ってください。二つの基板は、各ペトリ皿に収まります。 </li><li> 45分間ビーズ溶液中で浮いているように、基板を残します。 </li><li>結合していないビーズを除去するために、DWで洗い流した後、ビーズ溶液から基板を除去するためにピンセットを使用します。 </li><li>空気は、基板を乾燥させます。以上の圧縮空気を吹き付けますエラストマーフィルム表面が水のスポットの形成を減少させます。 </li><li> SCサンプル沈着までビーズの光退色を防ぐために、不透明なボックス内の基板をシール。 </li></ol> SCの7イメージング厚さ<ol><li>ただし部3を用いて基板上へ預金SCサンプルは、DWに蛍光ビーズを追加することなく、ステップ3.1を実行してください。さらに、ステップ3.6が完了する前にピペットを用いて各堆積SC試料の表面に希釈していない蛍光マーカービーズ溶液（505/515 nmで、直径0.1μm）の5μLのドロップを適用します。 </li><li> 40X対物レンズと顕微鏡を使用してSCの厚さの測定値を確立します。 SC-基板界面とSCの上側に位置する2つのビード層の焦点面との間のz高さの差を記録するためにリモートフォーカスアクセサリを用いて経時SC試料の厚さを測定します。 </li><li> 3時間の乾燥期間にわたって各SC試料の3つの領域の厚さを測定します。厚さSC試料のこの時間枠8内の定常状態値に達します。 </li></ol> 8.定量化とモデリングの組織変形<ol><li>記録された各時間ステップで蛍光画像から空間分解の面内乾燥変位を得るために、粒子画像流速13を使用してください。 </li><li>各放射状に対称SCサンプルの変位場から方位角平均半径方向および方位角の変位プロファイルを得るためにMATLABを使用してください。 注：例えば、データセット（題する &#39;d.mat&#39;）と、この工程および8.3の両方を実行するMATLABコード（題する「PIV-processing.m &#39;）は補足情報で提供されています。 </li><li>収縮線形弾性circulaとして乾燥SCを記述するモデル7、8、14、15、16に半径方向の変位プロファイルを適合、E.がSCを想定弾性率を有する変形可能な弾性基質に付着厚さ、時間SC、半径R、および弾性率、E SCを 、時間変化のRディスクは、よく定義され、一定のポアソン比を有する、νSC = 0.4 7 、8。最小二乗法を使用して最高のフィットを取得します。 注：フィッティングのために使用されたモデルが修正ベッセル関数の面で放射状の変位を説明します： <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq2.jpg" /> （1） とともに<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq3.jpg" /> 、 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq4.jpg" />そして<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq13.jpg" /> 用語<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq6.jpg" />によって与えられる浸透深さに対応し、 <img alt= &quot;式&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 55336 / 55336eq7.jpg&quot; /&gt;。 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq8.jpg" />基板の剛性パラメータです。有効サンプルサイズは、基板の厚さよりもはるかに大きい場合。ここでは、パラメータ<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq9.jpg" />そして<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq10.jpg" />それぞれ基板厚ポアソン比を表します。シリコーンエラストマー基板17のポアソン比をν= 0.5です。 </li><li>モデルパラメータは、半径方向の変位プロファイルに式（1）の最小二乗適合から、各時間ステップで、α、β得ます。 <ol><li>式を使用して、SC弾性率、E SCを得るために、フィッティングパラメータβを採用し、 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq11.jpg" /></li><li>収縮乾燥STRE時間変化を得るために、フィッティングパラメータαを使用しますssは、PSC、式を使用して、 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq12.jpg" /></li></ol></li></ol>

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	<li>Van Hal, D., Jeremiasse, E., Junginger, H. E., Spies, F., Bouwstra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+fully+hydrated+human+stratum+corneum:+a+freeze-fracture+electron+microscopy+study.">Structure of fully hydrated human stratum corneum: a freeze-fracture electron microscopy study.</a> J. Invest. Dermatol. 106 (1), 89-95 (1996).</li><li>Norl&#233;n, L., Al-Amoudi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stratum+corneum+keratin+structure,+function,+and+formation:+the+cubic+rod-packing+and+membrane+templating+model.">Stratum corneum keratin structure, function, and formation: the cubic rod-packing and membrane templating model.</a> J. Invest. Dermatol. 123 (4), 715-732 (2004).</li><li>Liu, X., Cleary, J., German, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+mechanical+properties+and+multi-scale+failure+mechanics+of+heterogeneous+human+stratum+corneum.">The global mechanical properties and multi-scale failure mechanics of heterogeneous human stratum corneum.</a> Acta Biomater. , (2016).</li><li>Geerligs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Skin layer mechanics. , (2010).</li><li>Farage, M. S., Miller, K. W., Maibach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Textbook of Aging Skin. , (2010).</li><li>Levi, K., Kwan, A., Rhines, A. S., Gorcea, M., Moore, D. J., Dauskardt, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emollient+molecule+effects+on+the+drying+stresses+in+human+stratum+corneum.">Emollient molecule effects on the drying stresses in human stratum corneum.</a> Br. J. Dermatol. 163 (4), 695-703 (2010).</li><li>German, G. K., Pashkovski, E., Dufresne, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+treatments+influence+drying+mechanics+in+human+stratum+corneum.">Surfactant treatments influence drying mechanics in human stratum corneum.</a> J. Biomech. 46 (13), 2145-2151 (2013).</li><li>Liu, X., German, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+barrier+disruption+and+moisturization+on+the+dynamic+drying+mechanics+of+human+stratum+corneum.">The effects of barrier disruption and moisturization on the dynamic drying mechanics of human stratum corneum.</a> J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 49 (13), 80-89 (2015).</li><li>Levi, K., Weber, R. J., Do, J. Q., Dauskardt, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drying+stress+and+damage+processes+in+human+stratum+corneum.">Drying stress and damage processes in human stratum corneum.</a> Int. J. Cosmet. Sci. 32 (4), 276-293 (2010).</li><li>Levi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+glycerin+on+drying+stresses+in+human+stratum+corneum.">Effect of glycerin on drying stresses in human stratum corneum.</a> J. Dermatol. Sci. 61, 129-131 (2011).</li><li>Fluhr, J. W., Darlenski, R., Surber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycerol+and+the+skin:+holistic+approach+to+its+origin+and+functions.">Glycerol and the skin: holistic approach to its origin and functions.</a> Br. J. Dermatol. 159 (1), 23-34 (2008).</li><li>German, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+drying+stresses+in+stratum+corneum.">Heterogeneous drying stresses in stratum corneum.</a> Biophys. J. 102 (11), 2424-2432 (2012).</li><li>Willert, C. E., Gharib, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+particle+image+velocimetry.">Digital particle image velocimetry.</a> Exp. Fluids. 10 (4), 181-193 (1991).</li><li>Mertz, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+of+traction+forces+with+the+size+of+cohesive+cell+colonies.">Scaling of traction forces with the size of cohesive cell colonies.</a> Phys. Rev. Lett. 108 (19), 1-5 (2012).</li><li>Banerjee, S., Marchetti, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+rigidity+deforms+and+polarizes+active+gels.">Substrate rigidity deforms and polarizes active gels.</a> Euro Phys. Lett. 96 (2), 28003 (2011).</li><li>Edwards, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+localization+in+contracting+cell+layers.">Force localization in contracting cell layers.</a> Phys. Rev. Lett. 107 (12), 128101 (2011).</li><li>Cesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+silicone+elastomer+substrates+for+high+resolution+analysis+of+cellular+force+patterns.">Micropatterned silicone elastomer substrates for high resolution analysis of cellular force patterns.</a> Rev. Sci. Instrum. 78 (3), 34301 (2007).</li><li>Wu, K. S., Van Osdol, W. W., Dauskardt, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+And+Microstructural+Properties+Of+Stratum+Corneum.">Mechanical And Microstructural Properties Of Stratum Corneum.</a> Mater. Res. Soc. 724, 27-33 (2002).</li><li>Yuan, Y., Verma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+microelastic+properties+of+stratum+corneum.">Measuring microelastic properties of stratum corneum.</a> Colloids Surf. B. 48 (1), 6-12 (2006).</li><li>Christensen, M. S., Hargens, C. W., Nacht, S., Gans, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+intact+human+skin:+instrumentation,+hydration+effects,+and+the+contribution+of+the+stratum+corneum.">Viscoelastic properties of intact human skin: instrumentation, hydration effects, and the contribution of the stratum corneum.</a> J Invest. Dermatol. 69 (3), (1977).</li><li>Pailler-Mattei, C., Bec, S., Zahouani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurements+of+the+elastic+mechanical+properties+of+human+skin+by+indentation+tests.">In vivo measurements of the elastic mechanical properties of human skin by indentation tests.</a> Med. Eng.Phys. 30 (5), 599-606 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

この記事では、動的な乾燥挙動とヒトSCの機械的特性を測定するために使用することができる技術を説明します。以前の研究は、この技術は、環境条件、一般SC 7,8の動的な乾燥挙動の化粧品洗浄剤及び保湿に使用される化学製品の効果を定量するために使用することができることを実証しました。プロトコルにおける重要なステップの数があります。まず、SCは、水分含有量で顕著に膨潤します。したがって、SCの厚さの測定だけでなく、面内変位が正確に弾性率を予測し、ストレスの大きさを乾燥させるために不可欠です。次に、サンプルは完全に基板に接着する必要があります。彼らはかなり乾燥変形の分布に影響を与えるし、半径方向の変位プロファイルを使用しているため、不完全な接着、非放射対称性サンプルまたは小さな裂け目や穴を有するサンプルは避けるべきですモデルフィッティングのためにD。 湿度制御システムが使用できない場合の技術を用いることができます。環境制御することなく、組織サンプルは、実験条件12で乾燥します。このように、実験室環境が継続的に監視および維持、乾燥挙動として、結果の再現性は、温度や湿度の日変化と季節変化の両方の影響を受けるべきです。 現在、この技術は、基板のみに付着してエラストマーフィルム内の変形を誘導することができるサンプルに限定されています。技術は、容易に基板弾性率12を減少させることによって、より小さな面内変位を受ける試験試料に適応することができるが、単に基板上に滑るの試料からの結果の意味を欠いているであろう。 多数の生体内およびex vivoでの技術評価することができる乾燥挙動と機械SCの特性は、3、8、9、10、18、19、20、21に報告されています。しかし、 生体内での技術は完全に基礎となる表皮と真皮層からのSCでの機械的変化を区別することはできません。また、ex vivoでの技術は、一般的にのみ、実験ごとに1つのサンプルを評価することができます。私たちはこの記事で報告した方法は、最大6 SCサンプルは実験毎に評価することができます。基板と環境室の大きさは、しかし、より多くのサンプルを同時に評価することができるようにスケールアップすることができます。我々は、N = 6 SCサンプルのために13時間を基板の硬化や組織の平衡を除く、準備とテストのために必要とされる〜のタイムスケールを推定します。比較では、我々はより多くを必要とする一軸tensometryテストを見積もります二回この期間より。大幅に少ないSC組織はまた、tensometry 9インチ（2.5cm 2）に要求されるものと比較して、個々のサンプル（0.28センチメートル2）ごとに必要とされます。この技術は、さらにSC組織の下からの蒸発を防止することにより、より生理学的に関連の乾燥を可能にします。 SCで乾燥挙動と力学を評価することに加えて、我々は、この技術はまた、乾燥時に凝集性フィルムを形成ポリマーもしくはコロイド系の研究に適用することができると信じています。

最も外側の表皮の層、または角質層（SC）は、脂質が豊富なマトリックス1、2に囲まれた凝集角質細胞の細胞からなります。 SCの組成と構造的完全性は、微生物からの侵入を防ぎ、機械的な力と過度の水分損失4の両方に抵抗する正しいバリア機能3を 、維持するために必須です。皮膚のバリア機能を維持又は低下させるためにパーソナルケア製品の容量は、皮膚、医療および化粧品産業5に大きな関心があります。パーソナルケア製品の毎日の適用はSC 6、7、8の機械的特性を変化させることが知られています。例えば、化粧品の洗浄剤に含まれる界面活性剤は、弾性率とのビルドアップの大幅な増加を引き起こす可能性があります、SC内の応力を乾燥7をクラックする組織の傾向を増加させること、9。ほぼすべての化粧料の保湿剤に含まれるグリセロールは、SCを柔らかくし、組織破壊の可能性を減少させる、乾燥ストレス8、10、11の蓄積を減少させることができます。 この記事では詳細な方法は、動的な乾燥挙動と制御された環境7、8でSC乾燥の機械的特性を定量化することが可能です。以前に、この技術は、動的な乾燥挙動の変化やSC組織の機械的性質の異なる化粧品の効果を解明することができることが実証されています。これは、単純で乾燥変位フィッティング、ソフトエラストマー基質に付着ヒトSC組織の乾燥誘導性の収縮を定量化することによって達成されます。次に収縮モデル、及び弾性係数を抽出し、嵌合プロファイルから応力を乾燥。複数SC試料の検査が必要な場合、この方法は、一軸tensometryのより迅速な代替手段を提供する著しく少ない組織を利用し、試料裏面からの蒸発を防止することにより、より生理学的に適切な乾燥を提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer base</td>
			<td>Dow-Corning</td>
			<td>1064291</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer Curing Agent</td>
			<td>Dow-Corning</td>
			<td>1015311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Carboxylate 0.1 &#181;m yellow green fluorescent 505/515&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F8803</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Carboxylate 1 &#181;m yellow green fluorescent 505/515&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F8823</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Carboxylate 1 &#181;m nile red fluorescent 535/575&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F8819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6567</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor type II-s</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9128</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221732</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0294</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6mm diameter hole punch</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z708860</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLA 6-LCR-SB&#160;</td>
			<td>Lummencor light engine</td>
			<td>No.3526</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cfi Plan Achro Uw 1x Objective</td>
			<td>Nikon Plan UW</td>
			<td>MRL00012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Fluor 40x Oil Objective 1.3 na - 0.20mm wd</td>
			<td>Nikon Plan Fluor</td>
			<td>MRH01401</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-U inverted microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEA53200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clara-E Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DR-328G-C02-SIL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Remote Focus Attachment E-RFA Ergo Design</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>99888</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-S-E Motorized Stage</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MEC56110</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring and modeling contractile drying in human stratum corneum

角質層（SC）は、ほとんどの表皮層です。外部環境との接触は、この組織層が、洗浄剤および周囲湿度で毎日変動の両方に供されることを意味します。その両方は、組織の水分含有量を変化させることができます。重度のバリア機能不全または低湿度環境からの水分含有量の減少は、SCの剛性を変化させ、乾燥ストレスの蓄積を引き起こす可能性があります。極端な条件では、これらの要因は、組織の機械的破壊を引き起こす可能性があります。私たちは、乾燥時にSCの機械的特性の動的変化を定量化するハイスループット法を確立しました。この技術は、乾燥挙動の変化や化粧品洗浄剤と保湿剤治療とSCの機械的特性を定量化するために使用することができます。これは、エラストマー基材に接着円形の組織試料の空間分解面内乾燥変位における動的変化を測定することによって達成されます。面内の半径方向の変位ACQ乾燥中uired方位角を平均し、線形弾性収縮モデルに基づいてプロファイルが備わっています。乾燥ストレス及びSC弾性率の動的変化は、次に、当てはめモデルプロファイルから抽出することができます。

図1（a）は、蛍光ビーズ（セクション3）で被覆されたSC試料の代表的な蛍光画像を示します。サンプルの対応する透過光像（b）はによりサンプルの円対称に25％RHで16時間乾燥した後に形成空間分解乾燥変位の矢印プロットを重ね1図に示されている、これらの変位は、方位角することができます平均しました。 図1（c）は、および方位角（Uθ、青い点線）変位プロファイルは無次元半径位置、R / Rに対してプロット（uはrは 、赤の実線）の半径方向を示しています。ここで、Rは、平均SC試料の半径であり、r / R = 0は、サンプルの中心を示し、R / R = 1エッジを意味します。各半径位置における標準偏差は平均値の周りの斜線領域によって示されています。これらの変化は、主に&lt;3 SCの構造的不均一性によって引き起こされますSUP&gt;、7、12。乾燥を通して、方位角変位は小さいまま。ラジアル変位プロファイルしかしエッジと平衡に達するまでの大きさに成長し、中心から単調に増加します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55336/55336fig1.jpg" /> 図1：25±1％RHの環境下で15時間乾燥させた後弾性率E = 16±1キロパスカルでエラストマー基材に接着円形SCサンプル（6.2ミリメートル直径）。 （a）は、空間分解面内乾燥変位を追跡するために使用される堆積蛍光マーカービーズを強調SC試料の蛍光画像。 SC試料の透過光画像に重ね空間分解面内の乾燥変位の（b）の矢筒プロット。 （c）の方位角は、ラジアル平均（uは、赤の実線をR）およびサンプルの方位角（Uθ、青い破線）変位が無次元半径位置、R / Rに対してプロット。 Uの正の値は変位を収縮に対応するrを 。ラインを囲む網掛けの領域は、各半径位置での平均に関する標準偏差を示します。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55336/55336fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 30分間隔で記録されたプロファイルは、図2（A）にプロットし、面内変位の時間変化を示しています。平均SC厚さ、H SCは 、 図2（B）にプロットされています。最初の2時間かけて起こる主に乾燥中にSCの減少。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55336/55336fig2.jpg" /> 図2（A）典型的なSCサンプルに対して無次元半径位置r / Rに対してプロットし、25％RHの条件で15時間の乾燥期間にわたって30分間隔での半径方向の変位プロファイルのオーバーレイ（uは、固体の赤い線をR）。 Uの正の値は変位を収縮に対応するrを 。 （B）平均SCサンプル厚さ（時間SC、n = 3）は、乾燥時間に対してプロットしました。 （c）のラジアル変位プロファイル（A）から、最初と最後の記録された半径方向の変位プロファイルの式（1）の最小二乗フィット（青破線）を重ね。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55336/55336fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 式（1）によって記述される線形弾性収縮モデルとのフィッティング変位プロファイル乾燥SCの機械的性質へのさらなる洞察を提供しています。変位プロファイルA<html> 図2（c）に示すように、Tの各時間ステップは、最小二乗法を使用してモデルを装備しています。収縮乾燥ストレス、P SCを、弾性率、E SCは 、その後、各時間ステップにおけるモデルから抽出されます。 （3個々のSCサンプルに基づいて）、これらのパラメータの平均値の変化は、 図3（a）および図3（b）にそれぞれ示されています。両方のパラメータは、最初の2時間乾燥期間で急速に増加し、5時間以内にプラトーに達します。 <img alt="Figure3" src="/files/ftp_upload/55336/55336fig3.jpg" /> 図3（a） は 15時間にわたって乾燥時間に対してプロットし、SC弾性率、E SCを平均しました。 （B）平均収縮乾燥ストレス、P SCは 、15時間にわたって乾燥時間に対してプロットしました。&quot;_blank&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Measuring and Modeling Contractile Drying in Human Stratum Corneum

この記事では、エラストマー基板に付着した円形の組織試料の空間分解面内乾燥変位を測定することにより、動的な乾燥挙動と角質層の機械的特性を定量化する方法について説明します。この技術は、化学的処理、乾燥及び組織の機械的特性を変化させる方法の異なる測定するために使用することができます。

計測とモデリング収縮乾燥ヒト角質層で

Stratum corneum (SC) is the most superficial skin layer. Its contact with the external environment means that this tissue layer is subjected to both ...

measuring-and-modeling-contractile-drying-in-human-stratum-corneum

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.5K ビュー.  Binghamton University. この記事では、エラストマー基板に付着した円形の組織試料の空間分解面内乾燥変位を測定することにより、動的な乾燥挙動と角質層の機械的特性を定量化する方法について説明します。この技術は、化学的処理、乾燥及び組織の機械的特性を変化させる方法の異なる測定するために使用することができます。 

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Measuring Left Ventricular Pressure in Late Embryonic and Neonatal Mice

Blood pressure increases significantly during embryonic and postnatal development in vertebrate animals. In the mouse, blood flow is first detectable around embryonic day (E) 8.51. Systolic left ventricular (LV) pressure is 2 mmHg at E9.5 and 11 mmHg at E14.52. At these mid-embryonic stages, the LV is clearly visible through the chest wall for invasive pressure measurements because the ribs and skin are not fully developed. Between E14.5 and birth (approximately E21) imaging methods must be used to view the LV. After birth, mean arterial pressure increases from 30 - 70 mmHg from postnatal day (P) 2 - 353. Beyond P20, arterial pressure can be measured with solid-state catheters (i.e. Millar or Scisense). Before P20, these catheters are too big for developing mouse arteries and arterial pressure must be measured with custom pulled plastic catheters attached to fluid-filled pressure transducers3 or glass micropipettes attached to servo null pressure transducers4.
Our recent work has shown that the greatest increase in blood pressure occurs during the late embryonic to early postnatal period in mice5-7. This large increase in blood pressure may influence smooth muscle cell (SMC) phenotype in developing arteries and trigger important mechanotransduction events. In human disease, where the mechanical properties of developing arteries are compromised by defects in extracellular matrix proteins (i.e. Marfan's Syndrome8 and Supravalvular Aortic Stenosis9) the rapid changes in blood pressure during this period may contribute to disease phenotype and severity through alterations in mechanotransduction signals. Therefore, it is important to be able to measure blood pressure changes during late embryonic and neonatal periods in mouse models of human disease.
We describe a method for measuring LV pressure in late embryonic (E18) and early postnatal (P1 - 20) mice. A needle attached to a fluid-filled pressure transducer is inserted into the LV under ultrasound guidance. Care is taken to maintain normal cardiac function during the experimental protocol, especially for the embryonic mice. Representative data are presented and limitations of the protocol are discussed.

Measuring left ventricular pressure (LV) in embryonic and neonatal mice is described. Pressure is measured by inserting a needle connected to a fluid-filled transducer into the LV under ultrasound guidance. Care must be taken to maintain normal cardiac function during the experimental protocol.

後期胚と新生児マウスの計測左心室圧

Blood pressure increases significantly during embryonic and postnatal development in vertebrate animals. In the mouse, blood flow is first detectable ...

生物工学

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip：マイクロアレイヒト細胞におけるDNA損傷を測定するためのハイスループット96ウェルプラットフォーム

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

パラメータ化拡張期充満フォーマリズムを経由Transmitral流れの運動学的モデルベースの​​解析によるグローバル拡張期機能の定量化

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which facilitate the functional assessment of the seeded cells. To that end, microscale cantilever technology offers a platform with which to measure the contractile functionality of a range of cell types, including skeletal, cardiac, and smooth muscle cells, through assessment of contraction induced substrate bending. Application of multiplexed cantilever arrays provides the means to develop moderate to high-throughput protocols for assessing drug efficacy and toxicity, disease phenotype and progression, as well as neuromuscular and other cell-cell interactions. This manuscript provides the details for fabricating reliable cantilever arrays for this purpose, and the methods required to successfully culture cells on these surfaces. Further description is provided on the steps necessary to perform functional analysis of contractile cell types maintained on such arrays using a novel laser and photo-detector system. The representative data provided highlights the precision and reproducible nature of the analysis of contractile function possible using this system, as well as the wide range of studies to which such technology can be applied. Successful widespread adoption of this system could provide investigators with the means to perform rapid, low cost functional studies in vitro, leading to more accurate predictions of tissue performance, disease development and response to novel therapeutic treatment.

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

This protocol describes the use of microscale silicon cantilevers as pliable culture surfaces for measuring the contractility of muscle cells in vitro. Cellular contraction causes cantilever bending, which can be measured, recorded, and converted into readouts of force, providing a non-invasive and scalable system for measuring contractile function in vitro.

携帯収縮機能を評価するために、マイクロスケールのシリコンカンチレバーの活用<em&gt;体外</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

生産、特性評価および3D組織工学ヒト食道粘膜モデルの使用可能性

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

乾燥風-LCインターフェイス上Megamolecular生体高分子の自己統合するための方法

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Microhoneycomb Monoliths Prepared by the Unidirectional Freeze-drying of Cellulose Nanofiber Based Sols: Method and Extensions

Monolithic honeycomb structures have been attractive to multidisciplinary fields due to their high strength-to-weight ratio. Particularly, microhoneycomb monoliths (MHMs) with micrometer-scale channels are expected as efficient platforms for reactions and separations because of their large surface areas. Up to now, MHMs have been prepared by a unidirectional freeze-drying (UDF) method only from very limited precursors. Herein, we report a protocol from which a series of MHMs consisting of different components can be obtained. Recently, we found that cellulose nanofibers function as a distinct structure-directing agent towards the formation of MHMs through the UDF process. By mixing the cellulose nanofibers with water soluble substances which do not yield MHMs, a variety of composite MHMs can be prepared. This significantly enriches the chemical constitution of MHMs towards versatile applications.

Here, we present a general protocol to prepare a variety of microhoneycomb monoliths (MHMs) in which fluid can pass through with an extremely low pressure drop. MHMs obtained are expected to be used as filters, catalyst supports, flow-type electrodes, sensors and scaffolds for biomaterials.

セルロースナノファイバーの一方向凍結乾燥法により作製した Microhoneycomb モノリス基づくゾル: メソッドと拡張機能

Monolithic honeycomb structures have been attractive to multidisciplinary fields due to their high strength-to-weight ratio. Particularly, microhoneycomb ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

世界的な細胞のマトリックスメタロプロテアーゼと 3 D ゲルの代謝活性を測定

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

マトリックス細胞代謝クロストークを研究するためのヒト3D細胞外マトリックス-脂肪細胞培養モデル

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

生体組織の刺激のための電界・磁場装置

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...