この作品は、国立癌研究所（R15CA173657 AWとTSGにR01CA109446へ）、（AW）はシモンズがん研究所、及びMinnestoaの大学からの補助金（TSG）は4腎臓がん財団を登るによってサポートされていました。私たちは、免疫蛍光法の支援のために博士クリスティン・アンダーソン感謝します。

以下のプロトコルは、実験同所性腎腫瘍および任意の潜在的な自発的転移の増殖を誘導し、監視するための実験手順を記載しています。以下の手順はすべて、実験動物の人道的使用に関する制度の方針および承認された手順に従って行われます。 細胞株の1メンテナンス<ol><li> 10％ウシ胎児血清（FCS）を補充したロズウェルパーク記念研究所（RPMI）1640培地、1％ペニシリン - ストレプトマイシン、及び1mMの非必須アミノ酸のそれぞれ、L-グルタミンに、マウス腎腺癌細胞株、のRencaを維持（完全なRPMI呼ばれる）、及びピルビン酸ナトリウム。 37℃でインキュベーター、5％CO 2で培養細胞。 注：任意の株化細胞と同じように、長期的なカルト後に発生する可能性のある表現型または遺伝的変化を最小限にするために、トランスフェクションとその後の移植のための低継代数RENCA細胞を使用することをお勧めしますURE。 <ol><li>安定した緑色蛍光タンパク質（GFP）とホタルルシフェラーゼを発現するようにRENCA細胞を操作するトランスポゾンシステムを使用します。 <ol><li>カチオン性リポソームベースのトランスフェクション試薬、トランスポザーゼ発現ベクター（PPGK-SB11）及びホタルルシフェラーゼの発現のためのトランスポゾンをコードするベクター、ならびにGFPための融合をコードする遺伝子およびゼオシン耐性遺伝子と同時トランスフェクトRENCA細胞を用い両方の双方向プロモーターの転写制御下（PKT2 / LuBiG）19。 </li><li>二日後、限界希釈でトランスフェクトした細胞をプレートし、細胞を完全RPMI中で展開することを可能にするゼオシン（300μgの/ ml）を補充しました。フローサイトメトリーにより各クローンにおけるGFP発現を確認してください。これらの細胞は、のRenca-GLと呼ばれています。 注：限界希釈クローニングには、選択した細胞は、単一細胞に由来することが可能になります。 </li></ol></li></ol></li><li> intrarenally RENCA細胞を移植するために、RENCA細胞Iを準備ハンクス平衡塩溶液（HBSS）で2×10 6細胞/ mLの単一細胞懸濁液NTO。 <ol><li> HBSS中の0.25％トリプシンを用いて組織培養フラスコから付着RENCA細胞を除去します。 〜5分後、トリプシンを中和し、洗浄用遠心管に細胞を転送するフラスコに、完全RPMIを追加します。遠心分離機25°Cで5分間300 gで相対遠心力（RCF XG）の細胞。 </li><li>上清を除去し、HBSSで細胞を懸濁します。血球計数器を用いて細胞をカウントし、2×10 6細胞/ mLを得たHBSSで音量を調整します。 </li><li>細胞上の剪断応力を防止するために、18ゲージの針を取り付けた1-mLシリンジに細胞を描きます。腫瘍細胞の注射の前に28ゲージの針18ゲージ針を交換してください。 0.1ミリリットルの注射は、腎臓に2×10 5個の細胞を送達します。 </li></ol></li></ol> 2.手術領域の準備<ol><li>無菌の手術を準備加熱パッド上に滅菌外科用ドレープを配置することにより、安全キャビネット内の領域。ピンセット、メス、ハサミ、点眼剤、5％ポビドンヨード消毒、および滅菌ガーゼを含む、すべての電源を集めます。使用前に、すべての楽器をオートクレーブ。 </li><li>無菌先端技術を用いて手術を行います。ビーズ滅菌器と動物の間Resterilize楽器。滅菌手袋、実験室コート、およびフェイスマスクを着用します。 </li></ol> 3.動物の準備<ol><li>制度ガイドラインに従って（それぞれ、87.5ミリグラム/ kgおよび12.5ミリグラム/ kg、腹腔内）をケタミン/キシラジンでマウスを麻酔。つま先のピンチを実行することにより、麻酔深度を決定します。 </li><li>動物は非応答と見なされた場合、（指で）摘採によってBalb / cマウスに注射部位（ 例えば、左脇腹）を準備したり、シェービング（バリカンを使用して）毛皮。 </li><li>手術領域に手術の準備エリア（ 例えば、住宅ケージ）からマウスを移動し、獣医に軟膏を適用します乾燥を防ぐために、目。たっぷりの5％ポビドンヨード消毒と準備切開部位を綿棒。 </li><li>切開が手術前鎮痛として説明するエリアにブピバカイン塩酸塩（2.5 mg / mlとの溶液、SCの0.1 ml）を注入します。 </li><li>腹膜を貫通しないように慎重に、滅菌メスやハサミを使って動物の左脇腹に - （1.5センチメートル〜1.0）単一の切開を行います。滅菌ハサミで腹膜から真皮を分離します。すべての血液を除去するために滅菌綿ガーゼで切開部位を、DAB。 </li><li>脇腹をサポートするために、頭と右手を保持するために左手を使用して、両手でマウスを押したまま。 </li><li>腹膜を通して脾臓を識別し、右手の指一本で、下からマウスを触診。腎臓は現在、腹膜を介して表示する必要があります。腹膜および腎全体のテンションを提供するために、動物をしっかりホールドしてください。 </li><li>二人目は、腫瘍のCEを注入していますLLS（セクション1.2で調製した。）完全な腹膜を介して28ゲージの針を取り付けた1-mLのシリンジを用いて、腎臓の中心に。ゆっくり細胞の0.1mLの（2×10 5）を送達します。細胞の逆流を減らすために10秒 - 細胞が注入されると、5のための場所に針を保持します。細胞を注入する人はマウスを持っている人の指に近接に針をもたらすだろうと、このステップの間に細心の注意が必要に注意することが重要です。 </li><li>針を外し、シアノアクリレート組織接着剤の薄層で切開部を閉じます。 </li><li>滅菌ペーパータオルできれいなケージに戻って動物を置きます。動物は、加熱パッド上で回復できるようにします。回復期間中に無人の動物を放置しないでください。彼らは直立し、胸骨されるまでの標準的な住宅事情に動物を返さないでください。実験動物を使用して、すべての手順で制度的なガイドラインに従ってください。 </li></ol> 4.バイオ発光イメージング<ol><li>生物発光イメージングによる腫瘍の成長を監視します。 注：生物発光イメージングを行うための手続きの詳細は、リムらから得ることができます。 20ルシフェラーゼシグナルは、腫瘍細胞移植後早くも24時間として検出することができます。このモデルには外部に見える腫瘍がないので、定期的に腫瘍の成長を監視することが不可欠です。設計された実験に応じて、同所性腫瘍増殖は、時間の長さを変化させるために進むことができます。ルシフェラーゼ発現RENCA細胞を使用する利点の1つは、腫瘍増殖を繰り返し実験期間中一定の間隔で同じ動物で監視することができ、腫瘍を有すると腫瘍のない臓器の特定の問い合わせがで行うことができることですエンドポイントを定義しました。 <ol><li>ルシフェリンのIP（無菌PBS中の15 mg / mlと溶液0.1ml）を注入し、それが生物発光イメージングシステムにマウスを配置する前に10分間循環することを可能にします。 MOを配置<html>その背側を上にして使用し、上向きに注入腎臓を持っているために、その側に少し巻い。 </li><li>画像解析ソフトウェアを使用して関心のある規定された領域（ROI）内の第2あたり放出される光の光子における腫瘍量（光子束）を測定します。 </li></ol></li><li>個々の器官における腫瘍負荷の定量。 注：定量は、安楽死させたマウスからのそれらの除去後に個々の器官に定義された時点で行うことができます。 <ol><li>ステップ4.1のように、ルシフェリンをマウスに注入します。 </li><li> 10分後、承認された手順を使用して、マウスを安楽死させます。 </li><li>関心の臓器うち解剖する（ 例えば、腎臓および肺を、以下のセクション5を参照）。 35×10mmのペトリ皿に組織を移し、生物発光イメージングシステムにそれらを置きます。 </li><li>画像解析ソフトウェアを使用して定義されたROI内の第2の（光子束）あたりの放出された光の光子における腫瘍負荷を測定します。 </li></ol></li></ol><html> e_title &quot;&gt; 5。オルガン収穫<ol><li>個々の実験のために定義されたエンドポイントで、好ましい制度ガイドライン（ 例えば、CO 2、頚椎脱臼、麻酔の過剰摂取）によれば、腫瘍を有するマウスを安楽死させます。肺は墨汁インフレ後に収集されるようにしている場合は、頸椎脱臼を避けます。 </li><li>湿潤器官重量を測定することにより、注入腎臓における原発性腎腫瘍増殖の肉眼的評価を行います。 <ol><li> （G）に腫瘍質量を決定するために、21を分離し、腫瘍を有する腎臓および腎臓重量の差は、腫瘍塊を定義同じマウスから反対側の腎臓の重量を量ります。慎重にその重量を測定する前に摘出した腎臓から余分な結合組織を離れて解剖。 </li></ol></li><li>前切除に墨汁で肺を膨らませると、すぐにFeketeの溶液中の肺を固定することにより、肺に腫瘍転移の程度を評価小娘= &quot;外部参照&quot;&gt; 22。肺表面上の転移病変の手動計算は、実行することができます。 <ol><li>胸郭を通じて、半ば腹部から始まるハサミを使用して正中切開を行い、最大のネック/唾液腺による。慎重に肺組織を損なうことなく、ハサミやピンセットを用いて胸郭を削除します。 </li><li>結合組織を除去することにより、気管を公開します。 </li><li> HBSS中の10％墨汁溶液を充填した18ゲージ針を3 mLの注射器を準備します。 </li><li>鉗子を使用して、慎重に気管の下に絹縫合糸を通します。これは、一度膨張気管を縛るのに使用されます。 </li><li>慎重に気管ダウン針を挿入し、ゆっくりと墨汁溶液で肺を膨らませるために注射器を押し下げます。約1 - 墨汁溶液1.5mLを完全に肺を膨らませるでしょう。 </li><li>インクの逆流を阻止するために針以下縫合糸で、いくつかの結び目を結ぶことにより、シャット気管ピンチ。 </li><li> Remov電子針と慎重には、膨張した肺を削除するために結合組織を切り取ります。 </li><li>化学ドラフト内、Feketeの溶液5mL（95％EtOH中の35 mLの、のdH 2 O、ホルムアルデヒドを5mL、及び中氷酸性酸の2.5 mLを15 mLを含む15 mLコニカルチューブに肺を配置100mLのガラス瓶）23。 </li><li>前に手動で脱色腫瘍結節を計数するために室温で48時間 - 肺は24 /脱色を修正することを可能にします。 </li><li>脱色後に無傷の肺を除去し、慎重に35×10 ム・ペトリに葉によって固定肺を解剖。解剖顕微鏡下で各ローブ上の腫瘍結節（白結節）の数を数えます。 </li></ol></li></ol>

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+intravascular+staining+redefines+lung+CD8+T+cell+responses.">Cutting edge: intravascular staining redefines lung CD8 T cell responses.</a> J. Immunol. 189, 2702-2706 (2012).</li><li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes.">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nat. Protocols. 9, 209-222 (2014).</li></ol>

The authors declare no conflicts of interest.

私たちは、同所RCCマウスモデルのためのプロトコルを提示します。マウス腎臓へのマウスの腎腺癌腫瘍細胞の移植は、MRCCの臨床的に関連したモデルを提供します。このモデルは、高度なRCCの特徴であるどちらの肺、腎臓内および遠隔転移以内に原発腫瘍を生じます。本明細書に提示される説明は、免疫応答性Balb / cマウスでのRenca細胞株に特異的です。この同所性モデルを用いて、我々は、治療のテスト17、24、25、26、27、このモデルの有用性を実証し、のRenca腫瘍は免疫療法に応答性であることが示されています。移植のために同系腫瘍細胞株を使用する能力は、免疫学的に無傷で動物に腫瘍の進行を研究する利点を提供します。同系、同所性、および臨床的に関連characteこのシステムのristicsは、関連する前臨床モデルにおける治療の試験を可能にする優れたモデルを提供します。これは、腫瘍が皮下に移植されたときに複製することはできません。このようなモデリングシステムは、抗腫瘍免疫応答またはRCCを治療するための様々な免疫療法アプローチを評価することに限定されるものではないことを言及することは重要です。行われている実験の種類に応じて、免疫不全マウスに移植しintrarenallyヒト腫瘍細胞を使用することは可能だろう。すべての動物を同時に腫瘍細胞の等しい数を移植することができるようにin vitroで培養することができる確立されたRCC細胞株の利用可能性は、このin vivoでの同所性モデルの再現性を向上させることができます。さらに、腫瘍細胞は、細胞が成長する方法を制御および/または環境シグナルに応答する可能性を提供する前に腎内注入をin vitroで操作することができます。この（最も）implanと一つの制限テーブルの腫瘍モデルは、彼らが腫瘍形成、遺伝的に土着腫瘍の形成のために設計マウスモデルを使用することによってもたらされる利益のために責任を負う初期事象を回避することです。 同所性モデルの1つの欠点は、腫瘍増殖を視覚化する一般的な不能、容易キャリパー測定による皮下腫瘍のために監視される特徴です。遺伝的に操作された腫瘍細胞および生物発光イメージングを使用して、現在の技術では、内部腫瘍の長手方向の測定が可能になります。我々は生物発光イメージングおよび/または臓器抽出17、24、25に基づいて種々の時点で原発性腎腫瘍および転移性負荷を決定する能力を実証しています。我々のモデルの強さは、GFPおよびルシフェラーゼ発現のRenca細胞株の利用可能ですが、このモデルは、成功のために、この機能を必要としません。私たちは、特徴づけていますか親のRencaとのRenca-GL細胞の両方でthotopic RCCモデル。 Renca-GL細胞の移植後、原発腫瘍は容易に生物発光イメージングによって測定することができます。原発腫瘍が転移部位から放出される可能性が低い信号を圧倒信号を生成することができるように、しかし、全体の動物における転移を監視することは困難です。全動物からの個々の器官を切除し、撮像すると、それらの器官における転移の可視化および定量化を可能にします。 Renca同所性モデルでは、一次腎臓腫瘍は切除肺組織17における発光によって見られるように、早くも7日後にインプラントとして動物の肺における自発的微小転移を生じます。 この系におけるルシフェラーゼ発現腫瘍細胞株の使用は、同じ動物における長手方向の腫瘍の進行を追跡する能力をユーザに提供するが、それはまた、evaluatする能力をユーザに提供します注入技術の精度を電子。マウスの腎臓は、腎臓を通って直接腹膜に腫瘍細胞を注入するために、長い針を使用する場合は特に、それが可能となって、小さな解剖学的構造です。注射の数日以内にマウスを画像化することは、腫瘍細胞の移植は、腎臓に局在化される程度を決定します。腎内注入を複雑にする可能性があるもう一つの特徴は、動物の年齢として蓄積できる内臓脂肪の豊富な、の存在です。腎臓は、リーンマウスにおける腹膜を通じて簡単に表示されますが、腎臓は、時間をかけて開発することができ、内臓脂肪のローブの下に隠さになることができます。 所定の実験の終了時に、評価の数は、全身腫瘍組織量を決定するために用いることができます。摘出した臓器の生物発光イメージングは​​、腫瘍負荷の客観的尺度を提供します。原発腫瘍の湿重量対kidneに正規化内部対照としてのYは、バルク質量測定を提供します。肺における転移の負担も、解剖顕微鏡を用いた白色肺腫瘍結節の可視化を可能にするために、 一括墨汁で肺を膨張させることによって決定することができます。これらの読み出しは、医薬品開発の前臨床段階での治療効果を調査するためのベースラインとして使用することができます全身腫瘍組織量を、確立することができます。 Renca-GL細胞によるGFPの発現は、フローサイトメトリーに適している腫瘍を有する組織の解析。しかし、注意が治療の結果として生成された免疫応答の組成及び大きさを調べる場合は特に、腫瘍を有する腎臓の任意のフローサイトメトリー評価のために行使されなければなりません。腎臓は全体の担癌腎臓における免疫応答の評価（プロ腫瘍のいずれかまたは抗腫瘍）は、「組織と血管系局在化の両方を含むものである可能性が高い作り、非常に血管器官でありますD」器官収穫時の免疫細胞が血液免疫細胞に対する組織を区別するために、我々は、蛍光色素標識抗CD45.2モノクローナル抗体（mAb）は、安楽死の前に静脈内注射された技術を使用する。腎臓は、フローのために準備されていますフローサイトメトリーは、異なる蛍光色素標識抗CD45.2のmAb 28、29とエクスビボ染色を含む。デュアルCD45.2染色は、収穫時に組織から脈管構造内の細胞を判別する。この単純なプロトコルは、主要な白血球の識別を可能にしますそうでない場合は、組織における適応と自然免疫応答の解釈を混乱させる可能性がある血管系内に含まれる系統が。このプロトコルはまた、意図しない結果28、29を有していてもよい、灌流する必要がなくなります。 増加のための感謝と免疫療法の使用は現在あり癌を治療します。 MRCC（および他の癌）の将来の免疫学に基づく治療の開発はclin​​ically-および生理学的に関連のモデルを使用して実験室で開始します。本明細書に記載の同所性RCCモデルは、治療様式の種々の効果を試験するための重要な特徴（ 例えば、原発性腎腫瘍、遠隔転移、腫瘍誘発性免疫抑制、及び腫瘍増殖の長手方向のモニタリングのための成分）の数を含んでいます。また、このモデルは、そのような外科的および/または局所治療プロトコルとしてRCCを治療する他の手段の進歩を評価するために、将来的に適合させることができることを推測したくなります。

腎細胞癌（RCC）は、悪性腎腫瘍の大部分を占め、全成人悪性疾患の約3％世界中で1、2。症状の欠如、誤診、及びRCCのために不十分なスクリーニングツールのために、患者のほぼ30％は、転移性ステージ2に進行患者の追加の20〜30％で、診断時に転移性RCC（MRCC）を呈するであろう。これらのケースは、毎年〜13,500人の死亡1、3になります。主RCCの早期発見と治療が改善したものの、RCC関連死の割合は、転移性疾患が死亡3のために主に責任があることを示唆し、増加し続けています。 RCCのための治療法の開発が発見し、標的療法と免疫療法の実施で過去10年間に進展しています。残念ながら、無進行survivAl及び高度症例の全生存率は依然として患者4、5、6の大部分のウェルの下で2年です。これらの統計は、RCCのための効果的な治療法の同定および開発へのさらなる研究の必要性を保証します。適切MRCCのための治療的介入を進めるために、疾患の翻訳関連前臨床モデルが最初に必要とされています。 高度なRCCの人間の状態を再現するために適切かつ一貫性のあるモデルの開発は、いくつかの重要な質問に対処すべきである：1）解剖学的に関連したモデルです。 2）ヒト病理と同様に腫瘍の進行をありません。 3）転移は、原発腫瘍から発生するようにしてください。そして4）原発性および転移性腫瘍の進行を経時的にモニターすることができますか？調査中の治療の種類に応じて、マウスRCCの腫瘍細胞株、ヒトRCCの腫瘍細胞株、およびヒトRCC患者由来xenogラフトは、免疫応答性や免疫不全マウスに使用することができます。無傷のおよび機能的な免疫系を有する宿主は、Balb / cマウス7の自発腎腺癌に由来するよく記載のRenca細胞株の使用を必要とする、免疫療法のいくつかの局面を評価するこれらの研究のために必要とされます。ほとんどの研究は、実験的肺「転移」8、9、10、11、12を生成する（IV）Balb / cマウスに静脈内やすい尺度局所腫瘍を形成し、又はRENCA細胞を皮下（SC）を、注入します。ヒトRCCモデル化するためのSC注入のRenca腫瘍の使用は、血管系13の不正確な神経支配を含む多くの制限を有し、微小環境14、15、及び器官の欠如/腫瘍細胞communicにおける差異エーション13、16。さらに、多くの皮下腫瘍（特にのRenca）は、一般的な臨床特性17であるイベントの研究を阻害し、遠位の臓器に転移しません。 MRCCを研究するために、RENCA細胞は、肺、腎細胞癌患者における転移の主要な場所に腫瘍負荷を確立するために静脈注射することができます。転移性腫瘍を開始する静脈注射の方法は、しかし、どのように、または、なぜ細胞が離れた部位への主要臓器（ すなわち、腎臓）から移行しているの調査を許可していません。同じ動物で明らかに両方の原発性および転移性疾患を持つモデルは、特に、転移は通常、これらの患者の死亡の原因であることを考えると、先進的な疾患の進行と治療を研究することが重要です。 私たちの研究室では、上記で概説したすべての機能を組み込んだMRCCのマウスモデルを開発しました。 PRを確立するために、imary、同所性腫瘍は、RENCA細胞を、半透明の腹膜を介し動物の腎臓に直接注入されます。左側腹部に小さな切開（ランドマークなど）、脾臓および左腎臓の可視化を可能にします。小さなゲージの針を使用して、のRenca腫瘍細胞を同所移植のために腹膜を通って腎臓に直接注入されます。腎臓カプセル18の下方にRENCA細胞を移植する他の方法と比較して、移植のこの方法は、縫合を必要としない、かなり非侵襲的であり、低痛みクラスであり、かつ時間効率的であるように、より高いスループットを可能にします練習。 肺内注入腎臓に再現原発腫瘍量（〜99％テイクレート）ならびに転移性腫瘍負荷におけるこの十分に特徴付けられたモデルの結果。このモデルの大きな利点は、免疫療法の調査を可能に、その同系の自然を含めます。その自発的な転移は、勉強しますdvanced疾患;そしてその同所移植は、疾患の進行および治療に関する解剖学的な影響をモデル化します。 RCCをターゲットに向けた治療法が大幅に前臨床開発中のこのモデルの利用の恩恵を受けるだろう。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="420">
	<colgroup>
		<col span="2" />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:88px;">Artificial tears ophthalmic ointment</td>
			<td style="width:88px;">Akorn</td>
			<td style="width:156px;">NDC 17478-162-35</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:88px;">Vetbond Tissue Adhesive</td>
			<td style="width:88px;">3M</td>
			<td style="width:156px;">CBGBIW011019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:88px;">Betadine Solution (Povidone-iodine, 5%)</td>
			<td style="width:88px;">Purdue Products, L.P.</td>
			<td style="width:156px;">NDC 67618-155-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:88px;">0.25% Marcaine (bupivavaine HCL injection)</td>
			<td style="width:88px;">Hospira</td>
			<td style="width:156px;">0409-1587-50&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Heating pad</td>
			<td style="width:88px;">Sunbeam</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Syringes</td>
			<td style="width:88px;">BD</td>
			<td style="width:156px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Gauze</td>
			<td style="width:88px;">Venture</td>
			<td style="width:156px;">908291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="51" rowspan="2" style="height:51px;width:88px;">Ketamine</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">Phoenix Pharmaceuticals</td>
			<td rowspan="2" style="width:156px;">NDC 57319-609-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Xylazine&#160;</td>
			<td style="width:88px;">Akorn</td>
			<td style="width:156px;">NDC 59399-111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:88px;">Hank&#8217;s Balanced Salts</td>
			<td style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">H2387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">IVIS</td>
			<td style="width:88px;">Caliper</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:88px;">D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td style="width:88px;">GoldBio</td>
			<td style="width:156px;">LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">India Ink</td>
			<td style="width:88px;">Chartpak Inc</td>
			<td style="width:156px;">44201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Scissors</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Forceps</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:88px;">Sleeping Beauty (SB) transposon system</td>
			<td style="width:88px;">Neuromics</td>
			<td style="width:156px;">SBT0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Renca</td>
			<td style="width:88px;">ATCC</td>
			<td style="width:156px;">CRL-2947</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a syngeneic mouse model of metastatic renal cell carcinoma for quantitative and longitudinal assessment of preclinical therapies

腎細胞癌（RCC）は、毎年米国では&gt; 60,000人に影響を与え、〜RCC患者の30％が診断時に複数の転移を持っています。転移性RCC（MRCC）はわずか18ヶ月の生存期間中央値と、不治です。免疫ベースの介入（ 例えば、インターフェロン（IFN）およびインターロイキン（IL）-2）MRCC患者の割合で耐久性応答、及びマルチキナーゼ阻害剤（ 例えば、スニチニブまたはソラフェニブ）または抗VEGF受容体モノクローナル抗体（モノクローナル抗体）を誘導しています完全寛解は稀であるとして、主に、緩和的。 MRCC患者のための現在の治療法ではこのような欠点は、新規治療プロトコールの開発のための理論的根拠を提供しています。 MRCCのための新たな治療法の前臨床試験における重要な構成要素は、適切な動物モデルです。人間の条件を再現有益な特徴は、任意の治療主導免疫effectoを調査するために原発性腎腫瘍、腎腫瘍転移、および無傷の免疫系を含みますR応答および腫瘍誘発性免疫抑制因子の形成。この報告書は、これらの機能のすべてを持っている同所MRCCマウスモデルを記述しています。我々は、腫瘍の腎臓の成長（プライマリサイト）と肺（転移部位）の評価に続いて、マウスの腎腺癌細胞株でRencaを使用して、腎内注入技術を説明します。

<html> RENCA細胞の移植の成功は、マウスの肺への腎臓および転移における腫瘍発生になります。担癌と反対腎臓の切除後、湿潤組織重量（g）を増加量（ 図1）に基づいて、腫瘍負荷を示すために測定しました。 RENCA腫瘍は、サイトケラチン8および18染色（ 図2）を介して免疫組織化学によって同定することができます。縦方向の研究のために、ルシフェラーゼ発現のRenca細胞株を移植しました。生物発光イメージングは、腫瘍負荷及び時間（ 図3A）にわたって治療に対する応答を追跡するために、 インビボイメージングシステム（IVIS）を用いて行きました。肺への転移は、生物発光イメージング（ 図3B）とインドインク肺インフレ（ 図3C）によって確認されました。 S / ftp_upload / 55080 / 55080fig1.jpg」/&gt; Renca腫瘍細胞の図1同所性移植は、大きな腎臓塊を形成します。 RENCA-GL細胞（0.1中2×10 5 mL）をintrarenally注射し、グラム（+ SEM）で切除腫瘍を有する腎臓及び腫瘍のない対側腎臓の重量は、日24、N = 15腫瘍で測定しました自由と担癌腎臓。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55080/55080fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55080/55080fig2.jpg" /> 腫瘍のない対側および担癌腎臓の図2免疫蛍光顕微鏡画像。 RENCA-GL細胞（0.1mLの2×10 5）を intrarenally注射し、そして腫瘍担持および腫瘍フリー腎臓が腎臓がスナップ凍結し、immunofために処理12日目に採取しましたコラーゲン、ケラチン8および18、およびCD31の位置を可視化するluorescenceイメージング。 10Xのイメージを取り、全体の腫瘍を有する腎臓を表示するために縫い合わせました。スケールバー= 1ミリメートル。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55080/55080fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55080/55080fig3.jpg" /> Renca腫瘍細胞の図3.同所移植は、自発的な肺転移につながります。 A.のRenca-GL細胞（0.1mLの2×10 5）を Balb / cマウスにintrarenally注射しました。生物発光画像が示された日に撮影しました。 B.は、23日目に、無腫瘍および腫瘍担持マウスから肺を摘出し、生物発光画像が撮影されました。 23日目のマウスのC.パラレルセットは、彼らの肺は、肺腫瘍結節を視覚化するために墨汁で膨らませていました。スケールバー= 1 cmです。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55080/55080fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

免疫適格マウスにおける腎細胞癌の同所性モデルの実装では、研究者、同じ動物における原発性腎腫瘍および肺転移の存在によって定義される臨床的に関連するシステムを提供します。このシステムは、前臨床in vivoでの様々なトリートメントをテストするために使用することができます。

定量的および前臨床治療の縦評価のための転移性腎細胞癌の同系マウスモデル

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

a-syngeneic-mouse-model-metastatic-renal-cell-carcinoma-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

13.4K ビュー.  University of Minnesota. 免疫適格マウスにおける腎細胞癌の同所性モデルの実装では、研究者、同じ動物における原発性腎腫瘍および肺転移の存在によって定義される臨床的に関連するシステムを提供します。このシステムは、前臨床in vivoでの様々なトリートメントをテストするために使用することができます。 

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Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor pieces are injected subcutaneously into athymic nude mice (immunocompromised, T cell deficient) to create a bank of tumors and subsequently are passaged into different generations of mice in order to maintain these tumors from patients. Importantly, cellular heterogeneity of the original tumor is closely emulated in this model, which provides a more clinically relevant model for evaluation of drug efficacy studies (single agent and combination), biomarker analysis, resistant pathways and cancer stem cell biology. Some limitations of the PDTX model include the replacement of the human stroma with mouse stroma after the first generation in mice, inability to investigate treatment effects on metastasis due to the subcutaneous injections of the tumors, and the lack of evaluation of immunotherapies due to the use of immunocompromised mice. However, even with these limitations, the PDTX model provides a powerful preclinical platform in the drug discovery process.

Utilizing patient-derived tumors in a subcutaneous preclinical model is an excellent way to study the efficacy of novel therapies, predictive biomarker discovery, and drug resistant pathways. This model, in the drug development process, is essential in determining the fate of many novel anti-cancer therapies prior to clinical investigation.

前臨床患者由来の腫瘍新規抗がん療法の調査のための異種移植モデルの開発とメンテナンス

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

がん研究

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Pre-clinical models evaluating adjuvant therapy targeting breast cancer metastasis are lacking. To address this, we developed a murine model of de novo pulmonary mammary adenocarcinoma metastasis, wherein therapies administered in the adjuvant setting (post surgical resection of primary tumors) can be evaluated for efficacy in impacting previously seeded pulmonary metastases.

前臨床マウスモデルのための外科手術手順および方法論<em&gt;デ・ノヴォ</em&gt;乳がん転移

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and activation of lipolysis and proteolysis systems. Cancer patients with cachexia benefit less from anti-neoplastic therapies and show increased mortality1. Several animal models have been established in order to investigate the molecular causes responsible for body and muscle wasting as a result of tumor growth. Here, we describe methodologies pertaining to a well-characterized model of cancer cachexia: mice bearing the C26 carcinoma2-4. Although this model is heavily used in cachexia research, different approaches make reproducibility a potential issue. The growth of the C26 tumor causes a marked and progressive loss of body and skeletal muscle mass, accompanied by reduced muscle cross-sectional area and muscle strength3-5. Adipose tissue is also lost. Wasting is coincident with elevated circulating levels of pro-inflammatory cytokines, particularly Interleukin-6 (IL-6)3, which is directly, although not entirely, responsible for C26 cachexia. It is well-accepted that a primary mechanism by which the C26 tumor induces muscle tissue depletion is the activation of skeletal muscle proteolytic systems. Thus, expression of muscle-specific ubiquitin ligases, such as atrogin-1/MAFbx and MuRF-1, represent an accepted method for the evaluation of the ongoing muscle catabolism2. Here, we present how to execute this model in a reproducible manner and how to excise several tissues and organs (the liver, spleen, and heart), as well as fat and skeletal muscles (the gastrocnemius, tibialis anterior, and quadriceps). We also provide useful protocols that describe how to perform muscle freezing, sectioning, and fiber size quantification.

Mice bearing the Colon-26 (C26) carcinoma represent a classical model of cancer cachexia. Progressive muscle wasting occurs in association with tumor growth, over-expression of muscle-specific ubiquitin ligases, and reductions in muscle cross-sectional area. Fat loss is also observed. Cachexia is studied in a time-dependent manner with increasing severity of wasting.

大腸-26癌腫瘍を有するがん悪液質の研究のためのモデルとしてマウスを

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, radiation, and chemotherapy, locoregional recurrences and distant metastases occur at higher rates, and overall survival is decreased by 40% compared to HNSCC without PNI. In vitro studies of the pathways involved in HNSCC PNI have historically been challenging given the lack of a consistent, reproducible assay. Described here is the adaptation of the dorsal root ganglion (DRG) assay for the examination of PNI in HNSCC. In this model, DRG are harvested from the spinal column of a sacrificed nude mouse and placed within a semisolid matrix. Over the subsequent days, neurites are generated and grow in a radial pattern from the cell bodies of the DRG. HNSCC cell lines are then placed peripherally around the matrix and invade preferentially along the neurites toward the DRG. This method allows for rapid evaluation of multiple treatment conditions, with very high assay success rates and reproducibility.

Perineural invasion (PNI) is a common feature of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), conferring lower survival rates. Its mechanisms are poorly understood. Utilizing neurites generated from murine dorsal root ganglia confined to a semisolid matrix, the pathways involved in the PNI of HNSCC cell lines can be investigated.

頭頸部扁平上皮癌における神経周囲の浸潤のためのモデル

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with or without surgery. While platinum-based chemotherapy regimens currently represent the gold standard in terms of efficacy and are given in the vast majority of cases, new chemotherapy regimens, namely immunotherapy are emerging. However, the response rates and therapy resistance mechanisms for either chemo regimen are hard to predict and remain insufficiently understood. Broad variations of chemo and radiation resistance mechanisms are known to date. This study describes the development of a standardized, high-throughput in vitro assay to assess HNSCC cell line&#39;s response to various therapy regimens, and hopefully on primary cells from individual patients as a future tool for personalized tumor therapy. The assay is designed to being integrated into the quality-controlled standard algorithm for HNSCC patients at our tertiary care center; however, this will be subject of future studies. Technical feasibility looks promising for primary cells from tumor biopsies from actual patients. Specimens are then transferred into the laboratory. Biopsies are mechanically separated followed by enzymatic digestion. Cells are then cultured in ultra-low adhesion cell culture vials that promote the reproducible, standardized and spontaneous formation of three-dimensional, spheroid-shaped cell conglomerates. Spheroids are then ready to be exposed to chemo-radiation protocols and immunotherapy protocols as needed. The final cell viability and spheroid size are indicators of therapy susceptibility and therefore could be drawn into consideration in future to assess the patients&#39; likely therapy response. This model could be a valuable, cost-efficient tool towards personalized therapy for head and neck cancer.

We describe the evolution of a spheroid-based, three-dimensional in vitro model that enables us to test the current standard of experimental therapy regimens for head and neck squamous cell carcinoma on cell lines, aiming at evaluating therapy susceptibility and resistance on primary cells from human specimens in the future.

治療の頭頸部扁平上皮癌に対する回転楕円体に基づく 3 D 細胞培養モデルのテスト

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches including the promising immunotherapeutic strategies. Irreversible electroporation (IRE) is a non-thermal ablation technique that induces tumor cell death without destruction of adjacent collagenous structures, thus enabling the procedure to be performed in tumors very close to blood vessels. Unlike thermal ablation techniques, IRE results in gradual apoptotic cell death, along with immediate ablation induced necrosis, and is currently in clinical use for selected patients with locally advanced PC. An ablative, non-target specific procedure like IRE can induce a myriad of responses in the tumor microenvironment. A few studies have addressed the effects of IRE on tumor growth in other tumor types, but none have focused on PC. We have developed a syngeneic mouse model of PC in which subcutaneous (SQ) and orthotopic tumors can be successfully treated with IRE in a highly controlled setting, facilitating various longitudinal studies post procedure. This animal model serves as a robust system to study the effects of IRE and ways to improve the clinical efficacy of IRE.

Irreversible electroporation (IRE) is a non-thermal ablation technique used for the treatment of locally advanced pancreatic cancer. Being a relatively new technique, the effects of IRE on the tumor growth are poorly understood. We have developed a syngeneic mouse model that facilitates studying the effects of IRE on pancreatic cancer.

不可逆エレクトロポレーションの効果を研究する同系膵癌マウス モデル

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and transgenic genetically engineered mouse models. Unlike subcutaneous tumors, orthotopic tumors contain more clinically accurate vasculature, tumor microenvironment, and responses to multiple therapies. In contrast to genetically engineered mouse models, orthotopic models can be performed with lower cost and in less time, involve the use of highly complex and heterogeneous mouse or human cancer cell lines, rather that single genetic alterations, and these cell lines can be genetically modified, such as to express imaging agents. Here, we present a protocol to surgically injecting a luciferase- and mCherry-expressing murine prostate cancer cell line into the anterior prostate lobe of mice. These mice developed orthotopic tumors that were non-invasively monitored in vivo and further analyzed for tumor volume, weight, mouse survival, and immune infiltration. Further, orthotopic tumor-bearing mice were surgically castrated, leading to immediate tumor regression and subsequent recurrence, representing castration-resistant prostate cancer. Although technical skill is required to carry out this procedure, this syngeneic orthotopic model of both androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer is of great use to all investigators in the field.

The goal of this protocol is to demonstrate the intra-prostatic injection of prostate cancer cells, with subsequent castration. Orthotopic pre-clinical models of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer are critical to study the disease in the context of a clinically relevant tumor microenvironment and an immunocompetent host.

アンドロゲン依存性去勢抵抗性前立腺癌の生物発光と蛍光の同所性同種同系マウスモデル

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen receptors (CARs) for acute lymphoblastic leukemia (ALL) andnon-Hodgkin lymphoma (NHL). The focus of the field is now on emulating these successes in other hematological malignancies where less impressive complete response rates are observed. Further engineering of CAR T cells or co-administration of other treatment modalities may successfully overcome obstacles to successful therapy in other cancer settings.
We therefore present a model in which others can conduct pre-clinical testing of CD19 CAR T cells. Results in this well tested B-cell lymphoma model are likely to be informative CAR T-cell therapy in general.
This protocol allows the reproducible production of mouse CAR T cells through calcium phosphate transfection of Plat-E producer cells with MP71 retroviral constructs and pCL-Eco packaging plasmid followed by collection of secreted retroviral particles and transduction using recombinant human fibronectin fragment and centrifugation. Validation of retroviral transduction, and confirmation of the ability of CAR T cells to kill target lymphoma cells ex vivo, through the use of flow cytometry, luminometry and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), is also described.
Protocols for testing CAR T cells in vivo in lymphoreplete and lymphodepleted syngeneic mice, bearing established, systemic lymphoma are described. Anti-cancer activity is monitored by in vivo bioluminescence and disease progression. We show typical results of eradication of established B-cell lymphoma when utilizing 1st or 2nd generation CARs in combination with lymphodepleting pre-conditioning and a minority of mice achieving long term remissions when utilizing CAR T cells expressing IL-12 in lymphoreplete mice.
These protocols can be used to evaluate CD19 CAR T cells with different additional modification, combinations of CAR T cells and other therapeutic agents or adapted for the use of CAR T cells against different target antigens.

Here, we present a protocol for the production and pre-clinical testing of murine CD19 CAR T cells by retroviral transduction and utilization as a therapy against established syngeneic A20 B-cell lymphoma in BALB/c mice with or without lymphodepleting pre-conditioning.

同系マウス B 細胞リンパ腫モデル CD19 車 T 細胞の前臨床評価

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop better therapeutic strategies, understanding tumor microenvironmental factors that contribute to the treatment resistance is important. A major impediment to understanding disease mechanisms and improving therapy has been a lack of murine cell lines that resemble the aggressive and metastatic nature of human HNSCCs. Furthermore, a majority of murine models employ subcutaneous implantations of tumors which lack important physiological features of the head and neck region, including high vascular density, extensive lymphatic vasculature, and resident mucosal flora. The purpose of this study is to develop and characterize an orthotopic model of HNSCC. We employ two genetically distinct murine cell lines and established tumors in the buccal mucosa of mice. We optimize collagenase-based tumor digestion methods for the optimal recovery of single cells from established tumors. The data presented here show that mice develop highly vascularized tumors that metastasize to regional lymph nodes. Single-cell multiparametric mass cytometry analysis shows the presence of diverse immune populations with myeloid cells representing the majority of all immune cells. The model proposed in this study has applications in cancer biology, tumor immunology, and preclinical development of novel therapeutics. The resemblance of the orthotopic model to clinical features of human disease will provide a tool for enhanced translation and improved patient outcomes.

Here we present a reproducible method for developing an orthotopic murine model of head and neck squamous cell carcinoma. Tumors demonstrate clinically relevant histopathological features of the disease, including necrosis, poor differentiation, nodal metastases, and immune infiltration. Tumor-bearing mice develop clinically relevant symptoms including dysphagia, jaw displacement, and weight loss.

腫瘍免疫プロファイル用のマウスおよび治療応答評価における扁平上皮癌細胞の粘膜接種

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new tumors at distant sites. CTCs are found in the bloodstream of patients as single cells (single CTCs) or as multicellular aggregates (CTC clusters and CTC-white blood cell clusters), with the latter displaying a higher metastatic ability. Beyond enumeration, phenotypic and molecular analysis is extraordinarily important to dissect CTC biology and to identify actionable vulnerabilities. Here, we provide a detailed description of a workflow that includes CTC immunostaining and micromanipulation, ex vivo culture to assess&#160;proliferative and survival capabilities of individual cells, and in vivo metastasis-formation assays. Additionally, we provide a protocol to achieve the dissociation of CTC clusters into individual cells and the investigation of intra-cluster heterogeneity. With these approaches, for instance, we precisely quantify survival and proliferative potential of single CTCs and individual cells within CTC clusters, leading us to the observation that cells within clusters display better survival and proliferation in ex vivo cultures compared to single CTCs. Overall, our workflow offers a platform to dissect the characteristics of CTCs at the single cell level, aiming towards the identification of metastasis-relevant pathways and a better understanding of CTC biology.

Here, we present an integrated workflow to identify phenotypic and molecular features that characterize circulating tumor cells (CTCs). We combine live immunostaining and robotic micromanipulation of single and clustered CTCs with single cell-based techniques for downstream analysis and assessment of metastasis-seeding ability.

下流の分子分析と転移性電位評価のための循環腫瘍細胞のマイクロマニピュレーション

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...