This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).

動物実験は、関連するすべての政府や機関の規制に準拠する必要があります。 試薬の調製<ol><li>ヒドロゲルモノマー溶液（A4P0）の場合：0.1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の450 mLにアクリルアミドの20グラムを追加し、0.1×PBSで500 mLに音量を調整します。 注意：アクリルアミドモノマーは有毒です。顔面シールド、白衣、手袋、およびクローズドつま先の靴を含め、個人用保護具とヒュームフード内のすべての手順を実行します。 <ol><li>ヒュームフードの下で50 mLのコニカルチューブ中のヒドロゲルモノマー溶液（A4P0）40mLのに2,2&#39;-アゾビス100mgの[2-（2-イミダゾリン-2-イル）プロパン]二塩酸塩を追加し、使用直前に。 </li></ol></li><li>電気泳動組織クリア（ETC）バッファに：ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）および脱イオンH 2 O（DH 2 O）の800 mLまでホウ酸12.37 gとを40g加えます。 NaOHでpHを8.5に調整し、に音量を調整追加の dH 2 Oで1 L 注意：SDSは、有害な化学物質です。そのため、注意してそれを扱います。 </li><li>立方マウント液にスクロース250gの尿素125gの、およびN、N、N 125gののdH 2 Oを150mLまで&#39;、N&#39; -tetrakis（2-ヒドロキシプロピル）エチレンジアミンを加え、体積をdH 2 Oで500 mLまで</li></ol> 2.サンプル調整および固定<ol><li>マウスの安楽死。 <ol><li>同じ注射器でアルファキサロン（1mg / kg）およびキシラジン（0.5ミリグラム/キログラム）を準備します。 </li><li>腹腔内にアルファキサロンおよびキシラジンの混合物を注入し、マウスのための3分間は無意識になることを許可。 </li><li>麻酔をかけたマウスはもはや先に進む前に、このようなテールピンチなどの疼痛刺激に応答するまで待ちません。 注意：動物を処理するための適切な施設のガイドラインに従ってください。 </li></ol></li><li>経の0.9％NaCl（pHが7.4から7.5）溶液100 mLでマウスを灌流1X PBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）を100mL（pH7.4）で14に続いて、放血するために、ヘパリン（100 U / ml）を含みます。 注意：PFA液は有毒です。 PFA溶液およびすべてのその後の取り扱いの調製はドラフト内および個人用保護具を用いて行われなければなりません。 </li><li> 、マウスの頭を切り落とし、皮膚を開き、小さなはさみを使用して、目の間の頭蓋骨を破ります。 </li><li>小さな、湾曲したピンセットを用いて頭蓋骨の部分を削除します。 </li><li>脳または所望の臓器を取り出します。 </li><li> 4℃で一晩ポストフィックス4％PFA溶液中の脳や臓器をインキュベートします。 注：特定の領域の組織をクリアするための特定の領域を分析または組織固定後の組織をトリミングします。 注意：PFA液は有毒です。 transcardial灌流およびそれ以降のすべてのマウス操作はドラフト内および個人用保護具を用いて行われなければなりません。 </li></ol> 3.ハイドロゲルモノマー輸液とポルymerization <ol><li>穏やかに振盪しながら12〜24時間、4℃でA4P0ヒドロゲルモノマー溶液中で固定した器官をインキュベートします。 </li><li>ヒドロゲル組織重合モノマーは、注入されました。 <ol><li>ヒドロゲルモノマー溶液の5 mLを10 mLの丸底チューブに試料を移します。パラフィルム付き丸底管の上部を包みます。 </li><li> 1分間液体窒素をバブリングすることによりハイドロゲルを注入した全マウスの脳試料を含む丸底チューブから酸素を除去。迅速かつ緊密にサンプルを含むチューブを閉じます。 </li></ol></li><li> 2時間水浴（37℃）にチューブを転送します。 </li><li>過剰なヒドロゲルを除去するために、0.1×PBSで簡単に重合したサンプルを洗ってください。 注意：ハイドロゲルモノマーは有毒です。 、ハイドロゲルモノマーとの皮膚接触を避けるドラフト内で、フェースシールド、実験室のコート、手袋などの個人用保護具、とすべての手順を実行します。 注：重合組織4℃で2週間以上のアジ化ナトリウムを含む0.1×PBS中に保存することができます。 注意：アジ化ナトリウムは、高度かつ急性毒性です。顔面シールド、実験室のコート、手袋など、換気フード内および個人用保護具ですべての手順を実行します。 </li></ol> 4.電気泳動の組織のクリア（ETC） <ol><li>組織コンテナに重合したサンプルを移し、ETC室で組織コンテナを配置します。 </li><li>蠕動ポンプを使用して、ETC緩衝液でETC室を埋めます。 </li><li> ETCの条件を設定し、ETC.を実行します次の設定を使用します。 <ol><li>全体の臓器のためのETCの設定については、次の設定を使用します。（1.5アンペア）、温度（37℃）、時間（6.0時間）、ポンプ速度（30 rpm）を実行しています。 </li><li>時間（2.0時間）、ポンプ速度（30 rpm）を実行して、電流（1.5アンペア）、温度（37℃）：1〜2ミリメートルの厚さのマウスの脳切片のためのETCの設定については、次の設定を使用します。 </li></ol></li><li>転送トン彼は、0.1×PBSの45 mLを50 mLのコニカルチューブにサンプルをクリア。チューブが簡単に振られたときに気泡が見られなくなるまで0.1×PBSでクリアサンプル数回洗浄する（SDSの完全な除去を確認するため）。 </li></ol> ACT処理組織の5.免疫標識<ol><li>マウス全脳の場合：希釈1×PBS、6％ウシ血清アルブミン（BSA）、0.1％トリトンX-100、および0.01％アジ化ナトリウム（抗体希釈液）を含む抗体溶液を3 mLの量で試料をインキュベート穏やかな振とうしながら37℃で4日間、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）抗体のための1/500の要因。 2日目の終わりに抗体溶液を交換してください。 <ol><li> 3のために0.1×PBSの45 mLを50 mLのコニカルチューブにサンプルを洗う - 5時間とバッファごとに時間を変更します。 </li><li>穏やかな振とうしながら37℃で4日間、ロバ抗ウサギ488二次抗体のための1/500の希釈係数を有する抗体希釈液の3-mL容量でサンプルをインキュベートします。 REPL2日目に希釈した抗体溶液をエース。 </li></ol></li><li> 1〜2ミリメートルの厚さのスライスした脳組織の場合：37でのIV型コラーゲン抗体についての1/500の希釈係数を有する抗体希釈液の0.5〜1-mL容量で一晩または最大1日のサンプルをインキュベート穏やかな振とうしながら°C。 <ol><li> 1-2時間、0.1×PBSの12-mL容量で、15 mLコニカルチューブにサンプルを洗ってください。バッファごとに時間を変更します。 </li><li>抗ウサギ二次抗体で一晩または軽度に振とうしながら37℃で最大1日のCy3結合のための1/500の希釈係数を有する抗体希釈液の0.5〜1 mLの体積でサンプルをインキュベートします。 </li></ol></li><li> 3のために0.1×PBSでサンプルを洗う - 5時間。バッファごとに時間を変更します。 </li><li>撮影の前に、穏やかに振盪しながら室温で1時間CUBIC-マウントソリューションの適切な量のサンプルをインキュベートします。新鮮CUBIC-マウント溶液で交換し、さらに1時間インキュベートします。 注意： </b&gt;抗体の76型が31モノクローナル抗体14を含む、マウスACT-処理した組織でうまくいきました。前標識された組織は、ACT-処理組織における2つの蛍光色素の免疫標識と組み合わせることができます。 </li></ol>高密度組織の6免疫標識（さきがけ） <ol><li> C-PRESTO 注：C-PRESTOは、全精巣、腎臓全体、またはより大きな臓器の小さいセクションとして小型のサンプルに適しています。 <ol><li> 、1.5 mLチューブに試料を移しIV型コラーゲン抗体のための1/500の希釈率で抗体希釈溶液500μLを追加し、2時間600×gでチューブを遠心します。 </li><li> 30分間600×gで遠心分離することにより0.1×PBSで染色されたサンプルを洗ってください。 </li><li> 2時間600×gでCy3結合抗ウサギ二次抗体および遠心分離機のための1/500の希釈率で抗体希釈溶液500μLを追加します。 </li><li> 0で染色したサンプルを洗ってください。30分間、600×gでの遠心分離によってPBSを1倍。 </li></ol></li><li> S-PRESTO 注：S-PRESTOは、より大きな組織に適しています。 <ol><li>シリンジ（30-mL容量）を準備し、3方弁（ 図1A）に接続します。高圧力条件（ 図1B）のためにグルーガンでバルブを接着。 </li><li>閉弁位置に3方弁に接続されたシリンジにサンプルを転送します。 </li><li>コラーゲンIV型抗体のための1/500の希釈率で抗体希釈溶液の7mLの - 5を加えます。バルブを開くことにより、試料中に抗体溶液を離します。 </li><li>注入/撤退の動きのための十分な余地を提供するために、17-mLの位置に注射器のピストンを設定します。これは開弁位置で行うことができます。注射器の設定が終了した後、3ウェイバルブを閉じます。 </li><li>シリンジポンプでサンプルを含む注射器を置きます。 10ml /分の注入/撤退の体積、4-へシリンジポンプ条件を設定します連続サイクルモード（ 図1C）上の分休止時間。 注：それはターゲット・ボリューム（10 mL）を加え、その後短い休止（4分）後の流れの変化の方向に達するまでポンプが注ぎこみます。 </li><li>室温（ 図1F）で24時間- 3用シリンジポンプを実行します。 </li><li> 3ウェイバルブを開き、0.1×PBSで溶液を交換してください。 </li><li>シリンジポンプを使用して、各時間1時間0.1×PBSで2回染色したサンプルを洗ってください。 </li><li> Cy3結合抗ウサギ二次抗体（1/500の希釈率）を含む抗体希釈液を用いて変更し、3のためのシリンジポンプを実行する - 24時間。 </li><li> 3ウェイバルブを開き、0.1×PBSで溶液を交換してください。 </li></ol></li><li>撮影の前に、穏やかに振盪しながら室温で1時間CUBIC-マウントソリューションの適切な量で染色されたサンプルをインキュベートします。新鮮CUBIC-マウント溶液で交換し、さらに1時間インキュベートします。 </li></ol> 7. Imaging <ol><li>共焦点皿に標識された組織を置き、組織がカバーされるまでCUBIC-マウントソリューションを追加します。組織上のカバーガラスを配置します。 10X対物レンズの下の画像に組織14を共焦点顕微鏡を使用してください。 </li></ol>

<ol>
	<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Dodt, H. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> NATURE. 497, 332-337 (2013).</li><li>Ke, M. -. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li><li>Kim, S. -. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain.">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends Cogn Sci. 17, 596-599 (2013).</li><li>Yushchenko, D. A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+for+optical+anatomy.">Tissue clearing for optical anatomy.</a> Angew Chem Int Edit. 52, 10949-10951 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+(3D)+imaging.">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Sci Rep. 6, 18631 (2016).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems.">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163, 1500-1514 (2015).</li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

組織への悪い固定またはヒドロゲルの浸漬は、タンパク質の損失と組織のクリア処理の間に組織の歪みを引き起こす可能性があります。穏やかに振盪しながら18時間 - 全体の成体マウスの脳は12のためのハイドロゲルモノマー溶液の20ミリリットルの最小容積に浸漬し、その後、一晩、4％パラホルムアルデヒド中でインキュベートされるべきです。脳スライスおよび脊髄などのヒト組織を含む大規模な組織では、ヒドロゲルモノマー溶液中で拡張浸漬時間が必要となります。組織固定とポリマー注入ステップが分離されているので、ACTプロトコルは、固定された組織のクリアに容易に適用可能です。組織クリアした後、ヒト組織は、いくつかの抗体でよく染色しました。 ACTクリア技術は、エタノールやメタノールなどのアルコール固定剤、と互換性がないことに注意してください。 組織ヒドロゲル重合工程は、クリア処理以下の良質な組織を生成するために重要です。なぜなら酸素は、アクリルアミドの重合を阻害し、それは、窒素ガス注入システム下組織を含む溶液を脱気することによって除去されるべきです。あるいはまた、脱酸素化は、23時間の加熱ブロックと真空チャンバーを使用して実行することができます。 クリア率は、ほとんどの成体マウスの組織を一晩ETCによってクリアすることができるなどの器官の大きさ、脂質またはECM線維性タンパク質の内容、固定の状態、を含む多数の要因に依存します。しかし、過剰清算および組織腫脹不要の危険性があります。このように、クリア時間の差が重要な考慮事項です。組織クリア条件は、経験的に決定されるべきです。重要なことには、ECMの内容がクリアされた組織の外観に影響を与え得ます。 ACTは、緻密なタンパク質繊維をクリアしていないため、組織の色は、あってもETCバッファ内のACTの後、白または不透明のまま。しかしながら、これらの器官は、RIマッチング溶液中に浸漬したときyが透明になりました。 組織腫脹率は、組織のECMの内容に依存するように表示され、脳などの柔らかい臓器は、高密度の臓器よりも大きな膨潤率を示します。増加した組織の腫れが組織決済手続きを支援するため、ACTは、日常的に、ほとんどの場合、蒸留水ベースのバッファを利用しています。組織の腫脹または過渡変形は、胚のような、望ましくない場合、いくつかのケースでは、緩衝液を含む0.1×PBSは、高分解能イメージングのために適用することができます。また、緩衝液中のより高い塩濃度は、組織の収縮を引き起こす可能性があることに留意すべきです。 ACTの方法は、マウス14の器官全体、さらには全身を明確にすることができます。しかし、透明な組織の深部組織のイメージングは​​、特殊な顕微鏡や目標が必要です。従って、1〜2mmの厚さの脳組織は、従来の共焦点顕微鏡で画像化するために最も効果的です。私たちの手で、ラベルの除去ACT-処理した組織からのエド抗体は、抗体依存性であり、そして異なる抗体標識のラウンドは推奨されません。このようなTHおよびGFAPなどのいくつかの抗体は、全脳免疫標識14のために特によく働きました。一方、例えばするTuj1またはマップMap2のようないくつかの抗体は、多くの場合、組織の表面のみが標識されます。これは、スイッチ15のような他の方法によって改善されるかもしれません。別の潜在的な制限は、原因で組織クリアステップの間に膨潤・収縮組織のACT加工組織に微細なタンパク質構造を維持することは困難であるかもしれないということです。 PRESTO技術は、組織標識技術の広範囲に適用可能です。例えば、このようなSeeDB 4とiDISCO 7などの前標識された組織を使用して、組織の透明な方法で、緻密な組織の免疫標識は、週に数日より長いインキュベーション期間を必要とします。しかし、さきがけは数時間のインキュベーション時間を短縮することができる、電子1mm厚緻密な組織を持つ日以内に全体のプロセスの完了をnabling。 PRESTOは厚い深い標識、密な組織、あるいは未クリア厚い組織の有効性を高めることができます。 PRESTOテーブルトップ遠心分離機またはシリンジポンプを使用し、特別な装置を必要としないので、ルーチン実験室手順を用いてこの方法を実施することは比較的容易です。

神経科学における課題の一つは、神経回路配線と、無傷の脳組織内の個々の細胞の視覚化です。最近まで、このようにニューロン間の接続を実証するには、組織の1）連続切片を必要と。このような軸索やタンパク質などの具体的な目標、の2）分子の標識。計算登録または2Dシリアル画像1のアライメントを経由して脳全体の3D再構成によると、3）可視化。これらの手順は、手間がかかる多大な時間を必要とし、神経細胞のネットワークマッピングが極めて困難にし、切片およびラベリング中に情報を失うおそれがあります。しかし、切片なしで無傷の組織の可視化を可能にする多くの方法が開発されています。生物組織は、組織透明技術2-10により、光学的に透明にすることができます。主要な方法の一つは、順番に、無傷の組織と浸漬液との間の屈折率の差を低減することですこのように透明な組織をレンダリングし、深部構造の観察を可能にする、無傷の組織内での光散乱を低減することができます。浸漬溶液の種類によっては、脱水過程中に高速の蛍光クエンチングをもたらす疎水性を有しています。したがって、これらの方法は、時間11,12の長い期間にわたって蛍光イメージングと互換性がありません。代わりに疎水性試薬の、他の方法は、生体組織の4,6,8の構造情報と蛍光を維持SeeDB 4とのSca リットル電子 6、のような組織をクリアするための親水性試薬を使用しています。ただし、巨大分子は、抗体を含む、拡散のみによって無傷組織のコアに到達することはできません。したがって、稠密組織の深部領域における標的分子の前標識は技術的に困難です。 最近開発された組織クリア方法では、CLARITY 3、ハイドロゲル包埋生体組織の私アクリルアミド、および脂質で形成されるのは、溶液を含有ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）下で、電気泳動によって除去されます。次いで、試料を3散乱光を低減するために一致する屈折率を有する溶液中に浸漬されます。脂質除去システムは、後に高度なCLARITY 13とPACT（パッシブ明確にする技術）10に変更されました。重合後、アクリルアミド鎖はヒドロゲル組織を形成し、タンパク質と架橋します。脂質成分は、アクリルアミドと架橋することはできません。このように、脂質は、SDS含有緩衝液下での電気泳動によって除去することができます。脂質の活性排除を通じて、脳組織は、著しく透明9増加します。しかし、これらの方法は自由拡散によって深い標識の不可能に対処していません。この制限を克服するために、厚い組織の最も深い部分に試薬の能動輸送のための技術が必要とされます。 CLARITYは、組織の清算と深い組織を可能にするが可視化は、それが容易または高速処理ではありません。これは、全体のマウスの脳7,14をクリアするには数週間かかることがあります。組織の急速なクリアはライフサイエンス研究やボリューム診断のための基本的なまたは臨床検査室の設定に、このような方法の適用のために不可欠です。現在のプロトコルは、圧力補助型送達免疫染色によって生体組織クリアランスとそれに続くタンパク質検出のための単純化された方法を提供します。これは、画像化法との組み合わせを介して提出された大規模な3次元データ処理システムの高解像度ボリュームイメージングに適しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="813">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:175px;">Lugen SCI&#160;</td>
			<td style="width:201px;">LGB-1175-4B</td>
			<td style="width:191px;">sample fixation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">75820</td>
			<td style="width:191px;">Hydrogel monomer solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">2,2&#8217;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride</td>
			<td style="width:175px;">Wako Pure Chemical Industries&#160;&#160;</td>
			<td style="width:201px;">VA-044</td>
			<td style="width:191px;">Hydrogel monomer solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Boric acid</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">76324</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">18220</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td style="width:175px;">Junsei chemical</td>
			<td style="width:201px;">1310-73-2</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:201px;">sc-2323A</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">T8787</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">S2002</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Collagen type &#8547;</td>
			<td style="width:175px;">Abcam</td>
			<td style="width:201px;">AB6586</td>
			<td>Antibody/immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tyrosine hydroxylase (TH)</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:201px;">AB152</td>
			<td>Antibody/immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:201px;">711-165-152</td>
			<td style="width:191px;">Secondary antibody/ immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies - Molecular Probes</td>
			<td>A21206</td>
			<td style="width:191px;">Secondary antibody/ immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Confocal dish</td>
			<td style="width:175px;">SPL lifesciences</td>
			<td style="width:201px;">101350</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:201px;">SP8</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sucrose</td>
			<td style="width:175px;">Junsei chemical</td>
			<td style="width:201px;">31365-0301</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Urea</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">23036</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">122262</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:247px;">ECT chamber</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10101</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">ECT chamber controller</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10201</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12101</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Peristatic pump</td>
			<td style="width:175px;">Baoding longer precision pump Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">YZ1515X</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Buffer reservoir</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10401</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Tissue container&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12001</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Container holder for 1 tissue container</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12002</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Mouse brain slice holder</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12004</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Whole rat brain holder</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12007</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Peristaltic pump tubing</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12104</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Tabletop-centrifuge</td>
			<td style="width:175px;">Hanil science industrial Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">MICRO 12</td>
			<td>c-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:175px;">Baoding longer precision pump Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">LSP02-1B</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Syringe (20 ml)</td>
			<td style="width:175px;">Korea vaccine Co., Ltd.</td>
			<td style="width:201px;">KV-S20</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">3-way stopcock</td>
			<td style="width:175px;">Hyupsung medical Co.,Ltd.</td>
			<td style="width:201px;">HS-T-01N</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

act-presto: biological tissue clearing and immunolabeling methods for volume imaging

細胞レベルでの臓器の詳細な組織または全身の同定および探査は、生物学における基本的な課題です。移行方法は、三次元画像を得るために時間と労力のかなりの量を必要とし、無傷の組織、免疫標識、およびプロセスの各段階における情報の損失を生成する撮像直列切片組織を切片を含みます。無傷の組織内の高分解能イメージングのための最近開発された手法では、分子の特徴付けは、タンパク質の標識に制限されています。しかし、臓器をクリアするための現在利用可能なプロトコルは、それが困難な実験室での組織のクリア技術を実装すること、かなり長い処理時間を必要とします。我々は最近、迅速かつ再現性の高いプロトコルは、ACT-PRESTO ransfer トン （A ctive C larity トン echnique- のp ressure rの高揚電子の fficientとsテーブルと呼ばれる確立しました数時間以内に組織クリアランスを可能にする入出力 rgansへの巨大分子）、の。また、ACT-PRESTOは、従来の方法で迅速な免疫標識を可能にし、圧力または対流の流れを適用することにより、高密度に形成され、厚さの試験片の深い層への抗体の浸透を加速させます。私たちは、電気泳動を用いて脂質を除去することによってクリアする方法を組織し、準備する方法を説明し、方法圧力補助送達によって免疫染色します。プロトコルの迅速性と一貫性は、3D組織学的研究とボリュームベースの診断のパフォーマンスを促進します。

ACT-組織のクリア 組織のクリアに影響を与える1つの重要な要因は、組織固定です。 PFA固定およびアクリルアミドの注入は、このプロトコルで別個のステップです。組織注入ヒドロゲルは、内因性高分子と架橋されているが、組織ヒドロゲル重合工程の後、フリーA4P0溶液は、重合されていません。したがって、ゲルが組織（ 図2A）の外側を形成するべきではありません。 CLARITYプロトコルに比べてタンパク質とアクリルアミドとの間に以下の架橋におけるACT手順の結果。したがって、組織ヒドロゲル試料は、より多孔質です。この機能は、脂質の高速抽出と高分子の拡散を可能にします。 1〜2ミリメートルの厚さのマウスの脳の切片を、十分に1内にクリアされた- 2時間（ 図2B）、および5 - ETCの6時間は、cのために十分でした全マウスの脳（ 図2C）のlearance。ヒドロゲル媒介組織のクリアがETC工程後の組織の拡大を誘導したが、組織は、屈折率が一致した溶液中での元のサイズに戻りました。 ACT手順において形成された組織ヒドロゲル試料は高度に多孔質であるため、低分子化合物および高分子を効率的に浸透する可能性があり、（ 図3）容易に拡散します。チロシンヒドロキシラーゼ（TH）およびコラーゲンIV型抗体で1 mmの脳切片を2時間インキュベートした後、二次抗体とその後の2時間のインキュベーションが500μmの深さでのドーパミン作動性ニューロンを標識するのに十分であった（ 図3） 。 PRESTO-組織免疫標識 高密度の器官は、一般に組織への抗体の浸透に影響するECM繊維の高濃度を有します。したがって、抗体はpenetインキュベーションの12時間後に、このような腎臓組織などの密な組織で唯一の20〜30ミクロンの深さに評価しました。この制限を克服するために、我々は深い組織への試薬の提供を可能にアクティブな巨大分子の浸透方法を設計、すなわちPRESTO（器官への巨大分子の圧力に関連する効率的かつ安定した転送）（ 図4）。抗体溶液、卓上遠心分離機（遠心PRESTO、C-PRESTO）深部組織に大幅に改善された抗体の配信（ 図5）と遠心力（600 XG）を適用してACT-処理さ腎組織の静的インキュベーションと比較すると。我々は緻密な組織へのc-PRESTOの手順を適用すると、3時間のインキュベーションは、300μmの深部構造に250-をラベルするのに十分でした。重大な組織の損傷なしで組織の歪みを改善するために、我々はまた、シリンジポンプ（シリンジPRESTO、S-PRESTO）で対流を提供する機械を設計しました。このプロセスは、同様に、抗体のPEを向上します受動拡散（ 図5）に比べnetration。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig1.jpg" /> S-PRESTO装置の図1.準備。 A.シリンジ（30mL）および三方活栓。 B.三方活栓に接続し、シリンジに接着。 C.試料及び抗体溶液を含むシリンジ、シリンジポンプ上に配置されたシリンジ。 D.シリンジポンプや作業条件設定。 E.ポンプは、試料に標識試薬を含む溶液を注入します。指定されたボリュームは、ポンピング方向の変化に達し、時間の指定期間後の溶液を撤回した場合。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54904/54904fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> マウスの脳の図2. ACT組織クリア。 A.重合後、自由A4P0ソリューションが重合されていません。組織注入されたヒドロゲルは、内因性高分子と架橋することによってゲル化されています。厚さ2mmの脳切片へのB. 1-は1のためにクリアされた- 2時間、およびソリューションを-matching屈折率（RI）の拡大とサイズの回復の程度を記録しました。 C.は、全マウスの脳の厚さは約0.8 cmで、かつ5 - ETCの6時間は、完全に透明な脳に十分でした。 ETCの3時間後に、非クリア組織のかなりの量が存在しました。 ETCの6時間では、しかし、脳全体のクリアが発生していました。 ETCバッファ内のACT後の組織の色は白または不透明です。 RI調整することで、組織が透明になります。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54904/54904fig2large.jpg" target="_blank">彼女をクリックしてください</a>eは、この図の拡大版を表示します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig3.jpg" /> ACT-クリアマウスの脳組織図3.免疫標識。コラーゲンIV型およびチロシンヒドロキシラーゼ（TH）に対する抗体で染色した中脳の一部に対する抗体で染色したマウス脳皮質を示すACT-処理1mmのマウス脳切片の写真。スケールバーは100μm。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54904/54904fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig4.jpg" /> 図4.さきがけ免疫標識方法。抗体は、拡散により緻密な組織に浸透することはできません。さきがけ免疫標識法が積極的に高分子を注入すると、中に試薬を提供するように設計されました緻密な組織。標準的な卓上型遠心分離機（遠心PRESTO、C-PRESTO）を使用して、遠心力の適用は著しく抗体の送達を容易にしました。シリンジポンプ（シリンジPRESTO、S-PRESTO）改善された抗体の浸透と対流をアプリング。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54904/54904fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig5.jpg" /> ACT-クリア緻密な組織の5さきがけ免疫標識図。 C-PRESTOの場合、組織は一次および二次抗体の浸透を促進するために、標準的な卓上型遠心機を用いて3時間600×gで遠心分離しました。 S-PRESTOために、シリンジポンプは、抗体を送達するために使用されました。例えば、腎臓および肝臓などのマウスの器官は、IV型コラーゲンで標識しました。従来の方法の3時間と比較してC-またはs-PRESTOは著しく、標識の深さを向上させます。コントロールサンプルは、わずか40の深さで標識されているが、さきがけサンプル（右）で350ミクロンまたはより深い - - 50ミクロン（左）、腎臓および肝臓では、Z軸の深さが300に達します。 3次元再構成画像は、共焦点顕微鏡を用いて得ました。スケールバーは100μm。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54904/54904fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO（器官への巨大分子のアクティブな明快技術-圧力関連の効率的かつ安定した転送）は、受動拡散または圧力補助送達によるクリア組織への、迅速、効率的な、しかし、安価な組織清算および迅速な抗体の浸透を可能にします。この方法を使用して、組織の広い範囲は、クリア複数の抗体によって免疫標識、および体積画像化することができます。

ACT-PRESTO：生体組織のクリアとボリュームイメージングのための免疫標識方法

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

act-presto-biological-tissue-clearing-immunolabeling-methods-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K ビュー.  Korea University College of Medicine.  ACT-PRESTO（器官への巨大分子のアクティブな明快技術-圧力関連の効率的かつ安定した転送）は、受動拡散または圧力補助送達によるクリア組織への、迅速、効率的な、しかし、安価な組織清算および迅速な抗体の浸透を可能にします。この方法を使用して、組織の広い範囲は、クリア複数の抗体によって免疫標識、および体積画像化することができます?...

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Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians. The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal pair and a longer maxillary pair. Barbel tissue contains cells of ectodermal, mesodermal and neural crest origin, including skin cells, glands, taste buds, melanocytes, circulatory vessels and sensory nerves. Unlike most adult tissue, the maxillary barbel is optically clear, allowing us to visualize the development and maintenance of these tissue types throughout the life cycle. 
This video shows early development of the maxillary barbel (beginning approximately one month post-fertilization) and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration in the adult appendage (&gt;3 months post-fertilization). Briefly, the left maxillary barbel of an anesthetized fish is elevated with sterile forceps just distal to the caudal edge of the maxilla. A fine, sterile spring scissors is positioned against the forceps to cut the barbel shaft at this level, establishing an anatomical landmark for the amputation plane. Regenerative growth can be measured with respect to this plane, and in comparison to the contralateral barbel. Barbel tissue regenerates rapidly, reaching maximal regrowth within 2 weeks of injury.
Techniques for analyzing the regenerated barbel include dissecting and embedding matched pairs of barbels (regenerate and control) in the wells of a standard DNA electrophoresis gel. Embedded specimens are conveniently photographed under a stereomicroscope for gross morphology and morphometry, and can be stored for weeks prior to downstream applications such as paraffin histology, cryosectioning, and/or whole mount immunohistochemistry. These methods establish the maxillary barbel as a novel in vivo tissue system for studying the regenerative capacity of multiple cell types within the genetic context of zebrafish.

The zebrafish maxillary barbel is an integumentary sense organ containing ectodermal, mesodermal and neural crest derivatives. Importantly, the adult barbel can regenerate after proximal amputation. This video introduces maxillary barbel development and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration, followed by collection, embedding and downstream imaging of barbel specimens.

ゼブラフィッシュ上顎バーベルの研究のための方法

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

生物学

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

生体系における酸素イメージング用燐光ナノプローブの合成とキャリブレーション

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging with high molecular specificity 1. The sensitivity of these techniques, however, is many orders of magnitude weaker than fluorescence, requiring milli-molar molecular concentrations 1,2. Here, we describe a technique that can enable the detection of weak or low concentrations of Raman-active molecules by amplifying their signal with that obtained from strong or abundant Raman scatterers. The interaction of short pulsed lasers in a biological sample generates a variety of coherent Raman scattering signals, each of which carry unique chemical information about the sample. Typically, only one of these signals, e.g. Coherent Anti-stokes Raman scattering (CARS), is used to generate an image while the others are discarded. However, when these other signals, including 3-color CARS and four-wave mixing (FWM), are collected and compared to the CARS signal, otherwise difficult to detect information can be extracted 3. For example, doubly-resonant CARS (DR-CARS) is the result of the constructive interference between two resonant signals 4. We demonstrate how tuning of the three lasers required to produce DR-CARS signals to the 2845 cm-1 CH stretch vibration in lipids and the 2120 cm-1 CD stretching vibration of a deuterated molecule (e.g. deuterated sugars, fatty acids, etc.) can be utilized to probe both Raman resonances simultaneously. Under these conditions, in addition to CARS signals from each resonance, a combined DR-CARS signal probing both is also generated. We demonstrate how detecting the difference between the DR-CARS signal and the amplifying signal from an abundant molecule's vibration can be used to enhance the sensitivity for the weaker signal. We further demonstrate that this approach even extends to applications where both signals are generated from different molecules, such that e.g. using the strong Raman signal of a solvent can enhance the weak Raman signal of a dilute solute.

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS

A combination of three single wavelength short-pulsed lasers is used to generate coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) and doubly-resonant CARS (DR-CARS). The difference between these signals provides enhanced sensitivity for otherwise difficult to detect coherent Raman signals, enabling imaging of weak Raman scatterers.

二重共鳴コヒーレント反ストークスラマン散乱（CARS）と生物学的構造の差イメージング

Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

創傷応答のためのスキン傷つけ処理のための方法およびアッセイ<em&gt; C。エレガンス</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of interest. When considering the analysis of complex biological systems, the segmentation of three-dimensional image data is a time consuming and labor intensive step. With the increased availability of many imaging modalities and with automated data collection schemes, this poses an increased challenge for the modern experimental biologist to move from data to knowledge. This publication describes the use of SuRVoS Workbench, a program designed to address these issues by providing methods to semi-automatically segment complex biological volumetric data. Three datasets of differing magnification and imaging modalities are presented here, each highlighting different strategies of segmenting with SuRVoS. Phase contrast X-ray tomography (microCT) of the fruiting body of a plant is used to demonstrate segmentation using model training, cryo electron tomography (cryoET) of human platelets is used to demonstrate segmentation using super- and megavoxels, and cryo soft X-ray tomography (cryoSXT) of a mammalian cell line is used to demonstrate the label splitting tools. Strategies and parameters for each datatype are also presented. By blending a selection of semi-automatic processes into a single interactive tool, SuRVoS provides several benefits. Overall time to segment volumetric data is reduced by a factor of five when compared to manual segmentation, a mainstay in many image processing fields. This is a significant savings when full manual segmentation can take weeks of effort. Additionally, subjectivity is addressed through the use of computationally identified boundaries, and splitting complex collections of objects by their calculated properties rather than on a case-by-case basis.

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS Super-region Volume Segmentation Workbench

Segmentation of three-dimensional data from many imaging techniques is a major bottleneck in analysis of complex biological systems. Here, we describe the use of SuRVoS Workbench to semi-automatically segment volumetric data at various length-scales using example datasets from cryo-electron tomography, cryo soft X-ray tomography, and phase contrast X-ray tomography techniques.

ボリューム分割と SuRVoS (超領域ボリューム分割) ワークベンチを用いた生物学的材料の分析

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

裏打ちクリア: 組織の脂肪組織の三次元イメージング法をクリア

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity is characterized by an increase in adipose tissue (AT) mass due to adipocyte hyperplasia and/or hypertrophia, leading to profound remodeling of its three-dimensional structure. Indeed, the maximal capacity of AT to expand during obesity is pivotal to the development of obesity-associated pathologies. This AT expansion is an important homeostatic mechanism to enable adaptation to an excess of energy intake and to avoid deleterious lipid spillover to other metabolic organs, such as muscle and liver. Therefore, understanding the structural remodeling that leads to the failure of AT expansion is a fundamental question with high clinical applicability. In this article, we describe a simple and fast clearing method that is routinely used in our laboratory to explore the morphology of mouse and human white adipose tissue by fluorescent imaging. This optimized AT clearing method is easily performed in any standard laboratory equipped with a chemical hood, a temperature-controlled orbital shaker and a fluorescent microscope. Moreover, the chemical compounds used are readily available. Importantly, this method allows one to resolve the 3D AT structure by staining various markers to specifically visualize the adipocytes, the neuronal and vascular networks, and the innate and adaptive immune cells distribution.

Here, we describe a simple, inexpensive and fast clearing method to resolve the 3D structure of both mouse and human white adipose tissue using a combination of markers to visualize vasculature, nuclei, immune cells, neurons, and lipid-droplet coat proteins by fluorescent imaging.

メチルサリチル酸除去と3Dイメージングによる脂肪組織構造の探索

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic phenomena, such as cytokinesis, mitotic spindle formation and assembly of the nucleus. Building upon early methods that imaged fixed extracts sampled at sparse time points, recent approaches image live extracts using time-lapse microscopy, revealing more dynamical features with enhanced temporal resolution. These methods usually require sophisticated surface treatments of the imaging vessel. Here we introduce an alternative method for live imaging of egg extracts that require no chemical surface treatment. It is simple to implement and utilizes mass-produced laboratory consumables for imaging. We describe a system that can be used for both wide-field and confocal microscopy. It is designed for imaging extracts in a 2-dimensional (2D) field, but can be easily extended to imaging in 3D. It is well-suited for studying spatial pattern formation within the cytoplasm. With representative data, we demonstrate the typical dynamic organization of microtubules, nuclei and mitochondria in interphase extracts prepared using this method. These image data can provide quantitative information on cytoplasmic dynamics and spatial organization.

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

We describe a method for the preparation and live imaging of undiluted cytoplasmic extracts from Xenopus laevis eggs.