This work was supported by an Alfred P. Sloan Research Fellowship (to C.-F.C.) and an NIH R01 grant (5R01GM098026-05 to C.-F.C.). We thank David Crowe for access to the advanced infrared imaging system.

注：蛍光標識したDNAプローブまたは標識されたDNAの他の形態を使用EMSAsは、タンパク質または細胞抽出物の調製、タンパク質-DNA結合反応、およびPAGEゲルを調製するために同じプロトコルを共有し（ 図1A）を実行します 。主な違いは、DNA標識手順、ポストランゲル処理工程、および検出方法です。 1.ジェルの準備<ol><li>ミニタンパク質ゲルシステム（8.3センチメートル幅X 7.3センチメートル縦x 0.75ミリメートルの厚さ）を使用して、0.5倍のTBE（45 mMトリス - ホウ酸、1mMのEDTA）および2.5％グリセロールを含む5％未変性ポリアクリルアミドゲルを準備します。 <ol><li> 、5×TBEの、3ミリリットル（0.45 Mトリス - ホウ酸、10mMのEDTA）、50％グリセロールの1.5 mLを4：ゲル用のゲル溶液の30ミリリットルを調製するために、30％アクリルアミド/ビスの5ミリリットル（1 37.5）を混ぜます10％アンモニウム過硫酸塩の300μL、TEMEDの15μL、そして徹底的にのddH 2 Oの20.2 mLです。 注：アクリルアミドは有害で毒性である、適切な個人保護具を使用して処理します。 </l私&gt; </ol></li><li>すぐにゲル溶液をキャストします。重合後、0.5×TBEで予め湿らせラップし、4℃で保管し、透明なプラスチックでゲルをラップします。 </li></ol>赤外蛍光色素で標識されたプローブの調製注：準備、保管、および実験中に離れて、できるだけ多くの光から赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを保管してください。 <ol><li>デザインやオーダーオリゴヌクレオチド。 <ol><li> 〜51マーのための長いオリゴヌクレオチドを設計します。 注：LIM-4 / SOX-2プローブの長いオリゴヌクレオチド配列はTATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCCです。長いオリゴヌクレオチドは、PAGEまたはHPLC精製を必要としません。 </li><li> 5 &#39;末端（5&#39;Dye）と37℃以上の溶融温度での赤外蛍光色素修飾を有する〜14量体のための補完的な短いオリゴヌクレオチドを設計します。 注：LIM-4 / SOX-の短いオリゴヌクレオチド配列2プローブは5&#39;Dye-GGGAGAAGATTTTGです。 5&#39;Dye標識した短いオリゴヌクレオチドの最小の合成スケールは100nmです。したがって、オリゴヌクレオチドはHPLC精製を必要とします。 </li></ol></li><li> 1×トリスEDTA緩衝液中で再懸濁したオリゴヌクレオチド（TE：10mMのトリス-HCl、pH8.0の、1mMのEDTA）、100μMの最終濃度まで。 </li><li>ショート（5&#39;Dye）とロングオリゴヌクレオチドをアニール。 <ol><li> ; 10mMトリス - 塩酸、pHを100mMのNaCl：（100μM）、ロングオリゴの1.2μL（100μM）、および塩化ナトリウム、トリス-EDTA緩衝液の28.2μL（STE 5&#39;Dye-ショートオリゴの0.6μLを混ぜます8.0; 1mMのEDTA）1.5 mLチューブインチ</li><li> 5分間沸騰水中でチューブを置きます。熱源の電源をオフにして、アニールしたオリゴは、暗闇の中でO / Nを冷却して水をしてみましょう。 </li></ol></li><li>二本鎖DNAプローブを作るためにクレノウDNAポリメラーゼによるアニール5&#39;Dye-ショート/ロングオリゴの5 &#39;オーバーハングを入力してください。 <ol><li>混合して反応を準備します5&#39;Dyeタグとアニールショート/ロングオリゴの30μL、8.5μLの10×クレノウ緩衝液、10mMのdNTPの1.7μL、1.7クレノウのμL（3 &#39; - &gt; 5&#39;エキソ - ）（5 U /μL）、および0.2mLのPCRチューブ内のddH 2 Oの43.1μL。 </li><li> PCR機で37℃で60分間インキュベートします。 </li><li>反応して熱を停止するために3.4μLの0.5 M EDTAを追加PCR装置で20分間75℃で不活性化します。 </li></ol></li><li> 0.1μMの最終濃度STEで塗りつぶされたプローブ（0.7μM）を希釈します。 </li><li>使用する直前まで、暗所で-20℃で保存オリゴ。オリゴは、この状態で年間まで保存することができます。 注：変異体の結合部位を有するDNAプローブを生成するには、長いオリゴヌクレオチドの変異体バージョンは、クレノウで5 &#39;オーバーハングのフィルインが続く5&#39;Dye標識短いオリゴヌクレオチドでアニールされます。一方の鎖を有するプローブは、赤外蛍光で標識されたことが示されています色素は、色素で標識された両方の鎖を有するプローブのわずか30％の強度を有します。信号強度を強化する必要がある場合、両方の鎖の長いオリゴの5 &#39;末端に赤外蛍光色素で標識し、赤外蛍光色素で標識されたプローブを作製するためにアニールされます。 </li></ol>ラベルなし/コールドプローブ（競技者）の調製注：相補的な配列（ロングとLongR）のロングオリゴヌクレオチドは、赤外蛍光色素で標識したプローブとの競合分析のための非標識プローブを作るためにアニールしました。 <ol><li> 1.5 mLチューブに100μMのロングの20μL、100μMLongRオリゴヌクレオチドの20μL、およびSTEの60μLを混ぜます。 </li><li> 、5分間沸騰水中でチューブを置き、熱源をオフにして、アニールしたオリゴは、一晩冷却して水をしてみましょう。 </li></ol> 4.結合反応と電気泳動<ol><li> 50μLを混合して5倍の結合緩衝液を1mLの準備1 MのTris-HCl、pH7.5での、60。 5 M NaClを10μL; 1 M KClを200μL、1 MのMgCl 2、0.5 M EDTA、pHが8.0の10μLの5μL; 1 M DTTの5μL; ddH 2 Oの25の10mg / mLのBSAのμL、および695μL 注：5×結合緩衝液を等分し、-20℃で保存することができます。考慮すべきもう一つのポイントは、異なる転写因子が結合緩衝液とは異なる修飾を有するということです。 </li><li>右結合反応を設定する前に、30、80 Vで過硫酸アンモニウムのすべての痕跡を除去するために+ 2.5％グリセロール0.5×TBEで5％未変性ポリアクリルアミドゲルを事前に実行していない - 60分、または現在はもはや時間的に変化するまで。 </li><li> 20μLの最終容量で結合反応を設定します。 <ol><li> 4 5×結合緩衝液のμL、80ミックス-精製されたタンパク質Aをngの200（ すなわち 、50％グリセロール中でSOX-2）、0.1μM色素共役プローブの1μL（最終濃度entration：5 nM）を、とのddH 2 O </li><li>オプション：コールドプローブ競合他社が必要な場合は、様々な濃度の冷プローブの（2倍、10倍、25倍、50倍、100倍、 など ） を追加します。 </li><li>オプション：タンパク質AとBとの間の相互作用（ すなわち 、SOX-2およびLIM-4）試験される場合、80の追加-精製タンパク質B ngの200（ すなわち 、50％グリセロール中で、LIM-4）。 </li><li>オプション：核抽出物調製物を用いて、プロテインAの特異的な結合された場合、タンパク質A（ すなわち、抗の6xHis、抗FLAG など ）に特異的な抗体を追加し、検証します。 </li><li> 15分間、暗所でのR / Tでインキュベートします。 </li></ol></li><li>ゲルに結合反応のすべてをロードし、所望の距離に10 V / cmのでゲルを実行します。 </li></ol> 5.イメージング NOTE：ゲルは、高度な赤外線撮像システムを用いてガラス板に直接スキャンしました。したがって、ゲルをさらに解決することができ、繰り返し走査（ 図1Cおよび<st栄&gt; 2）。主に、ウェスタンブロットのために、近赤外蛍光イメージングシステムはまた、ゲルをスキャンするために試験したが、唯一の高度な赤外線撮像システムは、良好な分解能を有するゲルを走査することができました。他のソフトウェアパッケージを使用してもよいが、説明した方法は、特定の赤外線イメージングソフトウェアに固有です。 <ol><li>スキャン前のddH 2 Oおよびドライウェルとスキャナの床を清掃してください。ゲルのガラスプレートを乾燥し、スキャナベッド上でゲルを含むプレートを配置拭いてください。 </li><li>赤外線イメージングソフトウェアを開き、「獲得」タブに移動します。薄いプレート（1ミリメートル）をスキャナベッド上に置かれた場合、チャンネルの設定を使用：700、輝度：オート、解像度：169μmで、品質：中、フォーカスオフセット：1.5ミリメートルを。厚い板（3ミリメートル）がスキャナベッド上に置かれた場合、チャンネルの設定を使用：700、輝度：オート、解像度：84μmで、品質：中、フォーカスオフセット：3.5ミリメートル。フォーカスオフセットに依存しますガラス板の厚さ。 </li><li>ゲルは、スキャナの占有領域を選択します。スキャンを開始するには[スタート]をクリックします。 </li><li>電気泳動を繰り返し、さらに必要に応じてスキャンします。 </li></ol>

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	<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylated+probes+in+the+electrophoretic+mobility+shift+assay+to+examine+specific+dsDNA,+ssDNA+or+RNA-protein+interactions.">Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions.</a> Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).</li><li>Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. 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The authors have nothing to disclose.

fEMSAs、タンパク質-DNA相互作用を研究するための効率的なツールであり、DNAの放射性標識に対する代替です。赤外線染料などの蛍光染料は、市販されており、放射性DNA標識と比較して、より安全で環境に優しい方法を提供します。赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを用いてEMSAsは、ポストランゲル処理工程を必要とするため、他のDNA標識技術に比べて、時間とコストを節約しないでください。放射性EMSAsを用いてバンドを検出するための時間は、プローブ1を試験したDNAの放射能濃度に応じて、30分から数日の範囲とすることができます。対照的に、FEMSAゲルの走査が著しくプロトコルの時間を短縮、平均25分を取ります。ゲルは、分析用のガラスプレートから除去する必要がないようfEMSAsはまた、放射性標識よりも有意な利点を提供します。最初の実行時間が十分でない場合、これはゲルを再スキャンすることができますタンパク質-DNA複合体を解決します。電気泳動を拡張するためのオプションは、放射性同位体またはビオチン/ストレプトアビジンを使用して利用できません。 DNAプローブの蛍光標識は、危険ではなく、容易に廃棄することができる一方で、最も重要なのは、放射性物質の取り扱いは、実験室の人員の安全リスクをもたらします。ストレプトアビジンの使用は、検出（約3時間）、12まで、より長い期間を必要とします。ここで紹介するプロトコルおよび結果はFEMSAは、生物医学研究のための効果的かつ便利なツールであることを示しています。我々は成功し、嗅覚ニューロン恒等変換5,10につながる特異的DNA結合活性に対するSOX-2 G73E変異の効果に機械的な洞察を提供するためにFEMSAを使用しています。 ゲルを分析するときにないか、または弱い信号を検出した場合に、DNAプローブの濃度を増加させることができます。我々の試験で使用されるDNAプローブ上の赤外蛍光色素で標識されています一本鎖。この方法は、我々がテストしたプローブに成功してきましたが、一本鎖の蛍光標識は、両方の鎖に標識されているプローブの30％の強度を有することが報告されています。強度が低すぎることが判明した場合、赤外蛍光色素でDNAプローブの両方の鎖を標識することをお勧めします。シフトしたバンドが観察されない場合、タンパク質-DNA複合体が不安定であってもよいです。グリセロールは、タンパク質-DNA相互作用を安定化させるために、このプロトコルで重要です。グリセロールはキャストゲル、結合反応、およびランニングバッファーに含まれています。実行中にゲルを通して試料の進行を追跡するとき考慮のもう一つのポイントは、染料の選択です。オレンジGは、ゲルのスキャンに干渉することができるようブロモフェノールブルーなどのローディング色素の他のタイプとして、この目的のために理想的です。ゲルをPrerunningすると過硫酸アンモニウムのロードサンプルの前にゲルから削除されていることを確認することも重要です。また、ポリのdI-DCの使用はバインディンに干渉することができますfEMSAsでDNAプローブと目的のタンパク質のグラム。関心と標的DNAの完全性のタンパク質の純度はまた、それらの相互作用に重要です。イメージングソフトウェアを使用している場合、正しいスキャン設定を確実にするためにも重要です。適切なフォーカスオフセット及び強度パラメータはゲルプレート及びDNAプローブの強度の厚さに応じて選択されます。 以前のプロトコルでは、蛍光EMSAs 13,14を実行するために記載されています。しかし、これらのプロトコルは、ジ-DCの使用を必要としている、および/またはポンプは、特定の温度を維持するために水を循環させるために使用されます。ここで説明するプロトコルは、より詳細な方法を提供し、任意のポンプの使用を必要としません。 このプロトコルの将来のアプリケーションは、リアルタイムで監視競合アッセイが含まれます。ゲルは異なる電気泳動時間POINで複数回走査することができるように蛍光標識したプローブは、この追加的な洞察をご提供しますTS。また、関心および競合プローブのDNAプローブは、2色の画像化を可能にする、異なる赤外蛍光色素で標識することができます。すべての技術と同様に、蛍光EMSAsを使用することには限界があります。比較的低い感度のために、伝統的なEMSAsと比較して、タンパク質のより高い濃度が必要とされています。別の制限は、赤外蛍光色素を検出するために高分解能で特定の撮像システムの必要条件です。初期費用は、スキャナを購入するために高いですが、赤外蛍光色素標識の長期使用は、コスト効果的です。これらの制限にもかかわらず、蛍光EMSAsは、重要な生物学的質問に対処するための重要な方法を提供します。

EMSAsは、目的のタンパク質とタンパク質1の潜在的な標的部位を含む標識DNAプローブの混合物を解決するために、ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を使用して、DNAとタンパク質間の相互作用を分析するために使用されます。タンパク質と結合したDNAプローブは、遊離DNAプローブに比べて遅く移動し、ポリアクリルアミドマトリックスを通るその移動にしたがって、遅角されます。 32 PによるDNAの放射性標識はEMSAsでの検出のための主要な方法でした。生化学研究における放射性標識の適用が有益であったが、同程度の感度で代替DNA標識の方法が原因で、放射能の取り扱いに関連した健康と安全リスクに採用されています。これらの代替方法は、ビオチン2またはジゴキシゲニン（DIG）、3（どちらも、その後の化学発光システムにより検出される）とDNAの結合、PAGEゲル4のSYBRグリーン染色を含みますまたはゲル5,6をスキャンすることによって、DNA蛍光色素コンジュゲートの直接検出。 放射性標識されたDNAプローブを使用してEMSAsの解決されたゲルは、放射性信号1,7を検出するために、オートラジオグラフィーのフィルムまたはホスホイメージャシステムを通じてポストラン処理を必要とします。ビオチン2またはDIG-共役3 DNAプローブを使用してEMSAsのゲルはまた、処理され、適当な膜に転写した後、化学発光6によって検出されなければなりません。ゲルのSYBRグリーン染色は、ポストランゲル染色および蛍光スキャナ4が必要です。ポストランゲル処理ステップは、これらのDNA標識技術を使用してEMSAsために必要とされるので、解像ゲルは一度だけ測定することができます。対照的に、フルオロフォアで標識されたDNAプローブを直接スキャナによるガラス板内部のゲル中で検出することができます。従って、DNA-タンパク質相互作用をモニターすることができると、実行中の異なる時点で複数回アッセイしますかなりの時間とコストを削減します。 EMSAsために使用されているDNA蛍光色素コンジュゲートのCy3 6,8、Cy5の6,8、フルオレセイン9、及び赤外蛍光色素4-6を含みます。 転写調節は、転写因子とその標的遺伝子のタンパク質-DNA相互作用を必要とします。これらの相互作用の調整は、動物の開発中に、共通の祖先から、多様な細胞型を生成します。公平なフォワード遺伝学的スクリーニングは、 シノラブディスエレガンス転写因子SOX-2の高度に保存されたHMG DNA結合ドメインにおいて、ミスセンス変異、G73Eを同定しました。 、分子形態学的および機能レベル5,10でAWC嗅覚ニューロンへのAWB嗅覚ニューロンの細胞恒等変換における突然変異の結果。 SOX-2示差コンテキスト依存パートナー転写因子と相互作用することによって、AWBとAWCニューロンの分化を調節し、各DNA標的部位5,10。 SOX-2端子AWB神経分化におけるLIM-4（LHX）と提携し、SOX-2端子AWCニューロンの分化におけるCEH-36（OTX / OTD）とのパートナーが。ルシフェラーゼレポーターアッセイは示しているが、そのSOX-2及び変異SOX-2 G73Eタンパク質はAWBとAWCニューロンに発現し、プロモーターを活性化する転写補助因子LIM-4とCEH-36との協力の相互作用を持っています。しかし、SOX-2及び変異SOX-2 G73Eは、プロモーターの差動活性化特性を示しました。 SOX-2、SOX-2 G73Eの差動DNA結合活性の分子的基礎を調査するために、fEMSAsは、これらのタンパク質およびそれらの潜在的な標的部位を用いて行きました。 まず、バイオインフォマティクスアプローチは、ルシフェラーゼアッセイに使用1kbのプロモーター領域内の生物学的に関連したDNA結合配列を同定するために採取しました。複数の潜在的SOX-2結合部位がプロモーター全体に存在していたので、私たちは集中しました推定上CEH-36またはLIM-4結合部位に隣接し、進化的に多様な線虫種間で保存予測SOX-2結合部位に。これらの配列は、欠失または変異し、及びその後AWBまたはAWCニューロンにおけるGFPレポーター導入遺伝子を発現するそれらの活性についてインビボで試験しました。このアプローチを通じて、我々は、具体的にはAWBとAWCニューロン、それぞれ5におけるGFPの発現に必要とされるLIM-4 / SOX-2電位とCEH-36 / SOX-2に隣接する標的部位を同定しました。私たちは、SOX-2およびSOX-2 LIM-4 / SOX-2同定し、CEH-36 / SOX-2に隣接する標的部位でFEMSAを使用してG73EのDNA結合の潜在的な違いを調べました。私たちのEMSA分析は、SOX-2 G73Eは同様の効率WT SOX-2がしたように（AWBにおける遺伝子発現のために必要）LIM-4 / SOX-2に隣接する標的部位を含むDNAプローブを結合しなかったことを示しました。しかし、SOX-2およびSOX-2 G73Eは含むDNAプローブの結合には差がありませんでしたCEH-36 / SOX-25,10（AWCにおける遺伝子発現のために必要）djacent標的部位。私たちのFEMSAは、AWBツーAWC細胞恒等変換の表現型に特異的なDNA結合活性に影響を与えることにSOX-2 G73E突然変異の性質に機械的な洞察を提供する分析します。ここで、私たちは一緒に取り組むためのケーススタディとしてLIM-4 / SOX-2に隣接する標的部位を含む赤外蛍光色素標識DNAプローブを用いて精製した6xHis-SOX-2またはの6xHis-SOX-2 G73Eを使用してFEMSAの最適化されたプロトコルを記述する重要な生物学的質問。

<table><tbody><tr><td>30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td>Acrylamide is harmful and toxic.</td></tr><tr><td>6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8)</td><td>ThermoFisher</td><td>MA1-21315</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag M2 antibody&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>5&#039;IRDye700-labeled DNA Oligos</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom DNA oligo</td><td>These are referred to as &quot;5&#039;Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos&quot; in the manuscript. The company will custom synthesize 5&#039; IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100&amp;nbsp;&amp;mu;M scale synthesis and HPLC purification.</td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3&#039;--&gt;5&#039; exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>LightShif Poly (dI-dC)</td><td>ThermoFisher</td><td>20148E</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&amp;nbsp;Vertical Electrophoresis Cell&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC&amp;nbsp;</td><td>This is referred to as a &#039;mini protein gel system&#039; in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size.</td></tr><tr><td>Odyssey CLx Infrared Imaging System</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Odyssey CLx Infrared Imagng System</td><td>This is referred to as an &#039;advanced infrared imaging system&#039; in the manuscript.</td></tr><tr><td>Odyssey Fc Imaging System&amp;nbsp;</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System</td><td>This is referred as a &#039;near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots&#039; in the manuscript.</td></tr><tr><td>Image Studio software (version 4.0)</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Image Studio software&amp;nbsp;</td><td>This is referred to as a &#039;particular imaging software&#039; in the manuscript.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3756-25G</td><td></td></tr><tr><td>6x Orange loading dye</td><td></td><td></td><td>0.25% Orange G; 30% Glycerol</td></tr><tr><td>0.5x TBE</td><td></td><td></td><td>45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x TE</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x STE</td><td></td><td></td><td>100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>5x Binding Buffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 &amp;#956;g/mL BSA</td></tr></tbody></table>

an optimized protocol for electrophoretic mobility shift assay using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides

電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）は、タンパク質とその標的DNA配列間の相互作用を特徴付けるための器械ツールです。放射能はEMSAsにおけるDNA標識の主な方法でした。しかしながら、蛍光色素及びスキャン方法における最近の進歩は、時間を節約し、コストを低減し、安全性を向上させる、容易な取り扱いの利点のための放射能の代替として、DNAの蛍光タグの使用を促してきました。我々は最近、正常に重要な生物学的質問に対処するために、蛍光EMSA（FEMSA）を使用しています。私たちのFEMSA分析は、嗅覚ニューロンの種類の多様化に高度に保存されたHMG転写因子SOX-2に、G73E、ミスセンス変異の効果に機械的な洞察を提供します。我々は、変異SOX-2 G73Eタンパク質は、それによって嗅覚ニューロンの恒等変換を引き起こし、特定のDNA結合活性を変化させることがわかりました。ここでは、最適化され、費用対効果のステップバイステップのプロトコルを提示しますFEMSAのための生物学的な例として、LIM-4 / SOX-2に隣接する標的部位および精製SOX-2タンパク質（WTおよび変異体SOX-2 G73Eタンパク質 ）を含む赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを使用。

オレンジGローディングダイ（6×100 mLの30％グリセロール0.12 gでオレンジG）は、電気泳動の進行を視覚化するためにロードする前に、結合反応に添加することができます。ブロモフェノールブルーを含む他のローディング色素は、スキャン中に検出されたため、画像解析（ 図1B）に干渉されます。 EMSAsのいくつかの例では、核抽出物調製物が使用される場合は特に、deoxyinosinic -デオキシシチジルポリ（ジ-DC）は、DNA 11へのタンパク質の非特異的結合を減少させるために結合反応に含まれます。しかし、ジ-DCを50μg/ mLを5&#39;Dye DNAプローブ（ 図1B）で精製した6xHis-SOX-2の結合を廃止しました。 赤外蛍光色素標識DNAプローブの結合特異性を示すために、我々は、WTまたは競合物質としての変異体コールドプローブ（使用しました<strong&gt;図1C）。この場合、LIM-4結合部位で変異LIM-4（M）/ SOX-2コールドプローブは、赤外蛍光色素で標識されたLIM-4と競合にWT LIM-4 / SOX-2コールドプローブほど効率的です6xHis-SOX-2 G73E（ 図1C、レーン3-6 VS。7-10）への結合について/ SOX-2プローブ。しかし、SOX-2結合部位に変異したLIM-4 / SOX-2（M）コールドプローブの競争効率がの6xHis-SOX-2 G73Eへの結合について、WT LIM-4 / SOX-2コールドプローブよりはるかに低いです（ 図1C、レーン13-16 対 17-20）。 タンパク質の結合特異性は、核抽出物の調製は、アッセイ1に使用される場合は特に、タンパク質またはタグに特異的な抗体を用いてタンパク質-DNA相互作用のスーパーシフトアッセイを行うことによって決定することができます。 SOX-2は、の6xHisおよびFLAGエピトープでタグ付けされました。 1μgの抗の6xHisまたは2.5μgの抗FLAG M2 antiboの追加<html>スーパーシフトSOX-2-DNAバンド（ 図2）が得られたダイ。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54863/54863fig1.jpg" /> 図1 FEMSAのFEMSA赤外蛍光色素標識オリゴヌクレオチドを用いた。（A）フロー・チャート。 （B）FEMSA上のブロモフェノールブルー色素、オレンジG、およびDI-DC（1μgの）の効果。 5&#39;Dye-LIM-4 / SOX-2プローブの5 nMで使用しました。 （C）FEMSAは、LIM-4 / SOX-2要素のSOX-2標的部位への6xHis-SOX-2 G73Eの結合特異性を示します。 5&#39;Dye-LIM-4 / SOX-2プローブの5 nMで使用しました。 LIM-4 / SOX-2（M）、変異型標的部位。ゲルは、電気泳動後の20〜40分でスキャンしました。電気泳動は、任意のコールドプローブなしレーンの強度によって正規化した蛍光バンド強度を定量化するために使用された後、スキャンされた画像は、40分で得られます。 AU、任意単位。ource.jove.com/files/ftp_upload/54863/54863fig1large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54863/54863fig2.jpg" /> FEMSAおよび抗体を用いて、SOX-2-DNA複合体の図2.スーパーシフト分析。SOX-2の6xHisおよびFLAGエピトープの両方でタグ付けされました。抗の6xHisまたは抗FLAG抗体の添加は、SOX-2-DNA複合体のスーパーシフトを引き起こしました。 5&#39;Dye-LIM-4 / SOX-2プローブを用いました。ゲル画像は、無関係のレーンを除外するために、レーン2と3の間にスプライスしました。ゲルは40、60でスキャンし、電気泳動後90分であった。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54863/54863fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

ここで重要な生物学的質問に取り組むためのケーススタディとして、赤外蛍光色素標識DNAプローブと一緒に精製されたSOX-2タンパク質を用いた蛍光電気泳動移動度シフトアッセイ（FEMSA）の最適化されたプロトコルを記述します。

赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを使用したゲルシフトアッセイのために最適化されたプロトコル

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

an-optimized-protocol-for-electrophoretic-mobility-shift-assay-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15.5K ビュー.  University of Illinois at Chicago. ここで重要な生物学的質問に取り組むためのケーススタディとして、赤外蛍光色素標識DNAプローブと一緒に精製されたSOX-2タンパク質を用いた蛍光電気泳動移動度シフトアッセイ（FEMSA）の最適化されたプロトコルを記述します。 

ビデオ: An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of RNA-protein interactions. These interactions have been traditionally analyzed with polyacrylamide gels generated between two glass plates and samples electrophoresed vertically. However, polyacrylamide gels cast in trays and electrophoresed horizontally offers several advantages. For example, horizontal gels used to analyze complexes between fluorescent RNA substrates and specific proteins can be imaged multiple times as electrophoresis progresses. This provides the unique opportunity to monitor RNA-protein complexes at several points during the experiment. In addition, horizontal gel electrophoresis makes it possible to analyze many samples in parallel. This can greatly facilitate time course experiments as well as analyzing multiple reactions simultaneously to compare different components and conditions. Here we provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis for analyzing RNA-Protein interactions.

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool for analyzing RNA-protein interactions. Traditionally most experiments have used vertical gels. However, horizontal gels provide several advantages, such as the opportunity to monitor complexes during electrophoresis. We provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis.

タンパク質-RNA複合体の検出を向上させるための水平ゲル電気泳動

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

生化学

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis can be characterized using an in vitro DNA synthesis assay followed by polyacrylamide gel electrophoresis. The goal of this assay is to quantify synthesis of both natural DNA and modified DNA (M-DNA). These approaches are particularly useful for resolving oligonucleotides with single nucleotide resolution, enabling observation of individual steps during enzymatic oligonucleotide synthesis. These methods have been applied to the evaluation of an array of biochemical and biophysical properties such as the measurement of steady-state rate constants of individual steps of DNA synthesis, the error rate of DNA synthesis, and DNA binding affinity. By using modified components including, but not limited to, modified nucleoside triphosphates (NTP), M-DNA, and/or mutant DNA polymerases, the relative utility of substrate-DNA polymerase pairs can be effectively evaluated. Here, we detail the assay itself, including the changes that must be made to accommodate nontraditional primer DNA labeling strategies such as near-infrared fluorescently labeled DNA. Additionally, we have detailed crucial technical steps for acrylamide gel pouring and running, which can often be technically challenging.

This protocol describes the characterization of DNA polymerase synthesis of modified DNA through observation of changes to near-infrared fluorescently labeled DNA using gel electrophoresis and gel imaging. Acrylamide gels are used for high resolution imaging of the separation of short nucleic acids, which migrate at different rates depending on size.

アクリルアミドゲル電気泳動法で可視化した近赤外蛍光標識 DNA を用いた DNA ポリメラーゼ活性測定法

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

エチジウム ブロマイドや代替染料ではなくチアゾール オレンジを用いた DNA 電気泳動

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

合成オリゴヌクレオチドを用いたDNA酵素のアッセイ

Using Modified Synthetic Oligonucleotides to Assay Nucleic Acid-Metabolizing Enzymes

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to characterize diverse properties of nucleic acid metabolizing enzymes that can be run in any standard molecular biology lab. The use of fluorescent labels has made these methods accessible to researchers with standard PAGE electrophoresis equipment and a fluorescent-enabled imager, without using radioactive materials or requiring a lab designed for the storage and preparation of radioactive materials, i.e., a Hot Lab. The optional addition of standard modifications such as phosphorylation can simplify assay setup, while the specific incorporation of modified nucleotides that mimic DNA damages or intermediates can be used to probe specific aspects of enzyme behavior. Here, the design and execution of assays to interrogate several aspects of DNA processing by enzymes using commercially available synthetic oligonucleotides are demonstrated. These include the ability of ligases to join or nucleases to degrade different DNA and RNA hybrid structures, differential cofactor usage by the DNA ligase, and evaluation of the DNA-binding capacity of enzymes. Factors to consider when designing synthetic nucleotide substrates are discussed, and a basic set of oligonucleotides that can be used for a range of nucleic acid ligase, polymerase, and nuclease enzyme assays are provided.

著者スポットライト:Characterizing Novel Enzymes from Extremophiles and Common Pathogens to Understand DNA Repair and Replication

Here, a protocol for assaying nucleic acid metabolizing enzymes is presented, using examples of ligase, nuclease, and polymerase enzymes. The assay utilizes fluorescently labeled and unlabeled oligonucleotides that can be combined to form duplexes mimicking RNA and/or DNA damages or pathway intermediates, allowing for the characterization of enzyme behavior.

修飾合成オリゴヌクレオチドを用いた核酸代謝酵素のアッセイ

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to ...

<meta charset="utf8"></head><body>OPTIR-FISHを使用した細胞同定および代謝分析のための包括的なプロトコール

Optical Photothermal Infrared-Fluorescence In Situ Hybridization (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we present a comprehensive protocol for simultaneous cell identification and metabolic analysis with the OPTIR-FISH platform by combining rRNA-tagged FISH probes and isotope-labeled substrates. Fluorescence imaging provides cell identification by the specific binding of rRNA-tagged FISH probes, while OPTIR imaging provides metabolic activities within single cells by isotope-induced red shift on OPTIR spectra. Using bacteria cultured with 13C-glucose as a test bed, the protocol outlines microbial culture with isotopic labeling, fluorescence in situ hybridization (FISH), sample preparation, optimization of the OPTIR-FISH imaging setup, and data acquisition. We also demonstrate how to perform image analysis and interpret spectral data at the single-cell level with high throughput. This protocol&#39;s standardized and detailed nature will greatly facilitate its adoption by researchers from diverse backgrounds and disciplines within the broad single-cell metabolism research community.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:複雑な環境におけるシングルセル代謝およびアイデンティティ解析のための統合OPTIR-FISH(英語)

Here, we present a protocol using optical photothermal infrared-fluorescence in situ hybridization (OPTIR-FISH), also known as mid-infrared photothermal-FISH (MIP-FISH), to identify individual cells and understand their metabolism. This methodology can be applied broadly for diverse applications, including mapping cellular metabolism with single-cell resolution.

光学的光熱赤外蛍光In Situハイブリダイゼーション(OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we ...

生物工学

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron regulatory proteins, IRP1 and IRP2. They bind to iron responsive elements (IREs) within the untranslated regions (UTRs) of several target mRNAs, thereby controlling the mRNAs translation or stability. IRE/IRP interactions have been widely studied by EMSA. Here, we describe the EMSA protocol for analyzing the IRE-binding activity of IRP1 and IRP2, which can be generalized to assess the activity of other RNA-binding proteins as well. A crude protein lysate containing an RNA-binding protein, or a purified preparation of this protein, is incubated with an excess of32 P-labeled RNA probe, allowing for complex formation. Heparin is added to preclude non-specific protein to probe binding. Subsequently, the mixture is analyzed by non-denaturing electrophoresis on a polyacrylamide gel. The free probe migrates fast, while the RNA/protein complex exhibits retarded mobility; hence, the procedure is also called &#8220;gel retardation&#8221; or &#8220;bandshift&#8221; assay. After completion of the electrophoresis, the gel is dried and RNA/protein complexes, as well as free probe, are detected by autoradiography. The overall goal of the protocol is to detect and quantify IRE/IRP and other RNA/protein interactions. Moreover, EMSA can also be used to determine specificity, binding affinity, and stoichiometry of the RNA/protein interaction under investigation.

Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

Here we present a protocol to analyze RNA/protein interactions. The electrophoretic mobility shift assay (EMSA) is based on the differential migration of RNA/protein complexes and free RNA during native gel electrophoresis. By using a radiolabeled RNA probe, RNA/protein complexes can be visualized by autoradiography.

IRE / IRP例：RNA  - タンパク質相互作用の研究のための電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...

赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを使用したゲルシフトアッセイのために最適化されたプロトコル

要約

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タンパク質-RNA複合体の検出を向上させるための水平ゲル電気泳動

アクリルアミドゲル電気泳動法で可視化した近赤外蛍光標識 DNA を用いた DNA ポリメラーゼ活性測定法

エチジウムブロマイドや代替染料ではなくチアゾールオレンジを用いた DNA 電気泳動

修飾合成オリゴヌクレオチドを用いた核酸代謝酵素のアッセイ

修飾合成オリゴヌクレオチドを用いた核酸代謝酵素のアッセイ

修飾合成オリゴヌクレオチドを用いた核酸代謝酵素のアッセイ

光学的光熱赤外蛍光In Situハイブリダイゼーション(OPTIR-FISH)

光学的光熱赤外蛍光In Situハイブリダイゼーション(OPTIR-FISH)

光学的光熱赤外蛍光In Situハイブリダイゼーション(OPTIR-FISH)

IRE / IRP例：RNA - タンパク質相互作用の研究のための電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）

赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを使用したゲルシフトアッセイのために最適化されたプロトコル

要約

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修飾合成オリゴヌクレオチドを用いた核酸代謝酵素のアッセイ

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修飾合成オリゴヌクレオチドを用いた核酸代謝酵素のアッセイ

光学的光熱赤外蛍光In Situハイブリダイゼーション(OPTIR-FISH)

光学的光熱赤外蛍光In Situハイブリダイゼーション(OPTIR-FISH)

光学的光熱赤外蛍光In Situハイブリダイゼーション(OPTIR-FISH)

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