This work was supported by the National Research Foundation (NRF-NRFF2011-01) and the National Medical Research Council (NMRC/CBRG/0005/2012).

1. Estrazione di sporopollenin exine capsule (SEC) da L. clavatum spore Nota: Il processo di estrazione SEC comporta una polvere infiammabile (L. clavatum), acidi corrosivi caldi, e solventi infiammabili, quindi un equipaggiamento di protezione individuale (occhiali, maschera viso, guanti, camice da laboratorio), la valutazione dei rischi approvato il loro utilizzo, e lo smaltimento dei prodotti chimici da personale di laboratorio autorizzato è essenziale. <ol><li> spore sgrassante <ol><li> Preparare un reflusso set-up in una cappa aspirante tramite un condensatore di vetro, sistema di circolazione dell&#39;acqua e bagnomaria (Figura 1). </li><li> Pesare 100 g L. spore clavatum senza creare polvere e lontano da fonti di ignizione. Nota: Le spore utilizzate qui sono state commercialmente ottenuto (vedi Materiali List). </li><li> spore Trasferire lentamente ad una 1 L politetrafluoroetilene (PTFE) pallone a fondo tondo con un agitatore magnetico. </li><li> Aggiungere 500 ml di acetone per le spore delpallone PTFE e scuotere delicatamente il pallone in modo da formare una sospensione omogenea. </li><li> Porre il pallone PTFE nel set bagnomaria a 50 ° C e connettersi al condensatore a riflusso. </li><li> Eseguire riflusso in acetone per 6 ore con agitazione a 200 rpm e poi si lascia raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Filtrare la sospensione con carta da filtro sotto vuoto e raccogliere le spore sgrassate in grandi (15 cm di diametro) piatti di vetro di Petri. </li><li> Essiccare le spore a temperatura ambiente (cappa) coprendo con un foglio di alluminio con fori per evaporazione del solvente. </li></ol></li><li> acidolisi <ol><li> Preparare 85% (v / v) di acido fosforico con acqua deionizzata (DI) e trasferire spore secco sgrassate in un matraccio PTFE 1 L. </li><li> Aggiungere 500 ml di acido fosforico (85% v / v) alle spore sgrassate. </li><li> Porre il pallone PTFE in un set bagno di acqua a 70 ° C e connettersi al condensatore a riflusso. </li><li> Eseguire dolce riflusso (70 ° C) in acido fosforico per 30 ore e quindi si lascia araffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Diluire la sospensione con acqua DI 500 ml caldo e raccogliere i SEC per filtrazione sotto vuoto usando carta da filtro. </li><li> Trasferire il SECs ad un bicchiere di vetro 3 L per eseguire una serie di lavaggi. </li></ol></li><li> SEC lavaggio <ol><li> Posizionare il bicchiere di vetro 3 L contenente SEC in una cappa aspirante. </li><li> Aggiungere (50 ° C) acqua deionizzata 800 ml caldo per le SEC con delicata agitazione per 10 minuti. </li><li> Filtrare la sospensione utilizzando carta da filtro e filtrazione sottovuoto set-up. </li><li> Raccogliere la SEC in un bicchiere di vetro pulito 3 L. </li><li> Ripetere i punti 1.3.1. a 1.3.4. cinque volte. </li><li> Aggiungere 600 ml a caldo (45 ° C) acetone per le SECs con blanda agitazione per 10 min. </li><li> Raccogliere le sec in filtrazione sotto vuoto e trasferire i secondi per un bicchiere di vetro pulito 3 L. </li><li> Ripetere i punti 1.3.6. e 1.3.7. utilizzando 600 ml a caldo (50 ° C) 2 M di acido cloridrico. </li><li> Ripetere i punti 1.3.6. e 1.3.7. utilizzando 600 ml Hot (50 ° C) 2 M di idrossido di sodio. </li><li> Ripetere i punti 1.3.1 e 1.3.4 otto volte. </li><li> Ripetere i punti 1.3.6. e 1.3.7. usando 600 ml a caldo (45 ° C) di acetone. </li><li> Ripetere i punti 1.3.6. e 1.3.7. utilizzando 600 ml a caldo (45 ° C) di etanolo. </li><li> Ripetere i punti 1.3.6. e 1.3.7. utilizzando 800 ml a caldo (50 ° C) acqua deionizzata. </li><li> Trasferire i SEC pulite a sei grandi piatti in vetro di Petri e secco in una cappa aspirante a temperatura ambiente per 24 ore per rimuovere tutti i contenuti di acqua. </li><li> Essiccare le SECs in stufa da vuoto a 60 ° C e 1 mbar vuoto per 10 ore o fino a peso costante. </li><li> Raccogliere la SEC secca e trasferimento in una bottiglia in polipropilene. </li><li> Conservare la SEC in un armadio asciutto. </li></ol></li></ol> 2. Caratterizzazione di SEC <ol><li> Eseguire elettronico a scansione analisi microscopica 41 con spore e SEC prodotte in diverse fasi. </li><li> Effettuare analisi elementare 41 con spore e SEC prodotte in diverse fasi. Dry tutti i campioni a 60 ° C per almeno 1 ora prima analisi elementare e calcolare il contenuto proteico con azoto per cento, con un fattore di moltiplicazione di 6,25. 11 ottenere risultati utilizzando misurazioni triplicato per ogni campione. </li><li> Condurre micromeritica analisi proprietà utilizzando un analizzatore di immagini di particelle dinamica. 41 </li><li> Scansione non trasformati, elaborati e SEC FITC-BSA-caricati usando la microscopia confocale a scansione laser. 41 </li></ol> 3. Biomacromolecule incapsulamento da vuoto Tecnica Caricamento <ol><li> Preparare 1,2 ml di 125 mg / ml soluzione albumina sierica bovina (BSA) usando acqua deionizzata e trasferire in una provetta di polipropilene da 50 ml. </li><li> Pesare 150 mg di SEC e trasferire alla soluzione BSA. </li><li> Agitare la provetta per 10 minuti per formare una soluzione omogenea. </li><li> Coprire il tubo con carta da filtro. </li><li> Trasferire il tubo in un pallone liofilizzatore e asciugare per 4 ore con vuoto a 1 mbar. </li><li> Eseguire i passaggi 3.1a 3,5. per tre lotti indipendenti. </li><li> Raccogliere il SECs BSA-caricati e rimuovere gli agglomerati utilizzando un mortaio e pestello. </li><li> Trasferire i SEC BSA-caricati ad un tubo da 50 ml e aggiungere acqua DI 2 ml per rimuovere il residuo di BSA. </li><li> Raccogliere le SEC per centrifugazione a 4.704 xg per 5 minuti e scartare il surnatante. </li><li> Ripetere il lavaggio con acqua deionizzata una volta. </li><li> Coprire il tubo contenente SEC BSA-caricati con carta da filtro. </li><li> Trasferire i secondi per un congelatore (-20 ° C) e congelare per 1 ora. </li><li> Congelare asciugare la SEC per 24 ore e conservare in un congelatore fino ulteriore caratterizzazione. </li><li> Preparare i SEC placebo senza BSA utilizzando la stessa procedura nei passaggi 3.1. a 3.13. </li><li> Preparare i FITC-BSA SEC caricati utilizzando la stessa procedura nei passaggi 3.1. a 3.13. </li></ol> 4. Determinazione del incapsulamento efficienza <ol><li> Pesare 5 mg di BSA SEC-caricati in 2 ml di tubi di polipropilene. </li><li> Aggiungere 1,4 ml phosphaTE soluzione salina tamponata a pH 7,4 (PBS) e vortex per 5 min. </li><li> Probe Sonicare la sospensione a 40% dell&#39;ampiezza per 3 cicli di 10 sec. </li><li> Filtrare la soluzione con un filtro da 0,45 micron Polietersulfone (PES). </li><li> Eseguire la stessa procedura descritta nella passi 4.1. a 4.4. utilizzando SEC placebo. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza a 280 nm con placebo, come uno spazio vuoto. </li><li> Quantificare la quantità di BSA incapsulato utilizzando una curva standard BSA (200 a 1.000 mg / ml) in PBS. 42 </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamentals of Fourier transform infrared spectroscopy. , 182 (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo lavoro, un&#39;analisi sistematica di estrazione SEC da L. spore clavatum viene presentato e questo rapporto mostra che è possibile produrre capsule di qualità superiore ottenendo anche una semplificazione significativa del preesistente protocollo comunemente utilizzato. 11 Contrariamente al protocollo esistente che richiede una temperatura elevata processo (180 ° C) e durata lungo processo (7 giorni), 11 all&#39;ottimizzazione trasformazione di estrazione corrente SEC è concentrata principalmente riducendo la temperatura e la durata della fase acidolisi. I trattamenti sgrassanti e alcali forniscono minima asportazione di materiale sporoplasmic da spore. Tuttavia, acidolisi da 5 ore a 120 ore rimossa la quantità massima di materiale sporoplasmic. I risultati hanno indicato che la durata totale trasformazione e temperature potrebbero essere drasticamente ridotti da tecniche convenzionali, 11 e che solo 30 ore a temperatura moderata (70° C) acido fosforico disponibile capsule qualità ottimale. Inoltre, oltre il 30 hr acidolisi, si è constatato che la SEC iniziò a fratturarsi ed è stato osservato un aumento significativo frammenti di particelle, suggerendo che l&#39;intera partita di SECs può esporrà una riduzione integrità strutturale complessiva. Inoltre, va notato che L. clavatum è considerato comprendere sporopollenin relativamente robusto, 2 e che le condizioni di lavorazione specifici coinvolti in questo protocollo, come ad esempio, la concentrazione di acido, la temperatura e / o la durata idrolisi, potrebbe essere necessario un aggiustamento per le altre specie di polline. E &#39;stato dimostrato che la produzione di SEC per acidolisi-acidi fosforici mediante (85% v / v) per 30 hr rendimenti SEC puliti e intatti. 41 I dati confermano che acidolisi è il passo cruciale nella produzione SEC. Infine, gli acidi unici SECs sono stati utilizzati per l&#39;incapsulamento di BSA, ha mostrato un alto grado di carico. Il carico wcome ottenuto con l&#39;applicazione di un vuoto, per cui la pressione interna della cavità SEC è alterato per disegnare forza la soluzione BSA nelle capsule vuote. Nanochannels (diametro 15 -. 20 nm), che sono stati precedentemente identificati nelle pareti exine di L. clavatum, 7 permettono la soluzione di entrare nella grande cavità interna. Dopo il caricamento, le capsule vengono lavate ed essiccate in un congelamento-essiccatore per produrre una polvere liberamente scorrevole. Dimensione uniformità e caratteristiche morfologiche sono fattori importanti per valutare la qualità di un materiale di incapsulamento successo. L&#39;uniformità dimensioni e morfologia osservata intatto di BSA-caricato SEC hanno confermato l&#39;uso potenziale di acidolisi solo elaborati secondi per le applicazioni di microincapsulazione. Questi risultati sono importanti per la produzione su larga scala industriale di SEC e per stimolare un maggior interesse per le potenziali applicazioni della SEC nella microincapsulazione di farmaci,proteine, peptidi, integratori alimentari, nutraceutici e cosmetici.

C&#39;è un notevole interesse in capsule a base di piante naturali ottenuti da spore di piante e pollini per l&#39;uso in applicazioni di microincapsulazione. 1-15 In natura, spore e polline forniscono protezione per i materiali genetici sensibili nei confronti di condizioni ambientali difficili. La struttura di base di spore vegetali e polline tipicamente comprende uno strato esterno shell (esina), uno strato guscio interno (intine), e il materiale citoplasmatico interna. Il exine comprende un biopolimero chimicamente robusta 1,9,10,13,16 denominato sporopollenin e intine è composto principalmente da materiali cellulosici. 16-18 capsule vuote possono essere isolati da vari processi 7,9 per rimuovere il materiale citoplasmatico , proteine, e lo strato intine. 2,12,16 Queste capsule exine sporopollenin (sec) forniscono una valida alternativa per incapsulanti sintetici a causa della loro distribuzione concentrata dimensioni e morfologia uniforme. 7,9,13,19,20 ilsviluppo di processi standardizzati per ottenere secondi da varie specie vegetali, come Lycopodium clavatum, si apre la possibilità di una vasta gamma di applicazioni di microincapsulazione nei campi della somministrazione dei farmaci, alimenti e cosmetici. 6,10-13,21 Per ottenere SECs, ricercatori prima trattati spore e polline con solventi organici e ricadere in soluzioni alcaline per rimuovere contenuti citoplasmatici. 22-25 Tuttavia, la struttura della capsula rimanente è stato determinato per contenere ancora il livello intine cellulosico. Per eliminare questo, i ricercatori hanno esplorato l&#39;uso di prolungato trattamento idrolisi acida con acido cloridrico, acido solforico caldo, o acido fosforico caldo per diversi giorni, 22-25 con acido fosforico diventando il metodo preferito di rimozione intine SEC. 2 Tuttavia, continua ricerca nel corso degli anni ha dimostrato che i vari spore e pollini hanno diversi gradi di resistenza al me elaborazione durathods comunemente usato. 26,27 Alcune spore e pollini sono completamente degradati e perdono tutto integrità strutturale in soluzioni alcaline forti, o diventano pesantemente danneggiato in forti soluzioni acide. 16 La variabilità in risposta SEC a condizioni di trattamento è dovuta a lievi variazioni nella chimica struttura e la morfologia exine del materiale sporopollenin exine tra le specie. 28 a causa della variabilità nella robustezza dei sporopollenin capsule exine (sec), è necessario ottimizzare le condizioni di elaborazione per ogni specie di spore e polline. Spore pianta dal specie L. clavatum sono diventati la fonte singola più studiati della SEC. Si propone che questo è soprattutto a causa della sua ampia disponibilità, a basso costo, monodispersity, e la robustezza chimica 9,29 Le spore possono essere facilmente raccolto e contiene contenuti sporoplasmic sotto forma di raggruppamenti di 1 -. 2 micron organelli cellulari e Biomolecules. 11 L. spore clavatum sono stati utilizzati come lubrificante polvere naturale, 30,31 base per cosmetici, 30 e in erboristeria 32-36 per un&#39;ampia gamma di applicazioni terapeutiche. I SEC ottenuti da L. clavatum hanno dimostrato di essere più resistente al trattamento di secondi da altre specie di spore e polline. 2 Dopo l&#39;elaborazione, i SEC risultanti hanno dimostrato di mantenere le loro strutture microridge intricate e un&#39;elevata uniformità morfologica, fornendo una grande cavità interna per l&#39;incapsulamento. 7 Gli studi indicano che L. SEC clavatum possono essere utilizzati per l&#39;incapsulamento dei farmaci, vaccini, 10,13 11 proteine, 7,14 cellule, 8 oli, 5-7,9 e integratori alimentari. 5,15 osservati efficienza di carico SEC sono relativamente alti in confronto ai tradizionali incapsulamento materiali. 7 Non ci sono anche una serie di vantaggi segnalatiSEC incapsulamento come la capacità di mascherare gusti, 6,10 e per fornire un certo grado di protezione naturale contro l&#39;ossidazione. 12 Negli studi esistenti, il metodo di estrazione più comunemente usato SEC per L. clavatum si basa su quattro fasi principali. Passo è riflusso del solvente in acetone per 12 ore a 50 ° C per sgrassare le spore. 11 Fase due è riflusso alcalina in idrossido di potassio 6% fino a 12 ore a 120 ° C per rimuovere citoplasmatica e materiali proteici. 11 Fase tre è riflusso acido in acido fosforico 85% fino a 7 giorni a 180 ° C per rimuovere il materiale intine cellulosiche. 11 Fase quattro è un processo di lavaggio completo con acqua, solventi, acidi e basi per rimuovere materiale non exine restante e residui chimici. Gli obiettivi principali di estrazione SEC in relazione alle applicazioni di incapsulamento sono per la produzione di capsule che sono vuoti di materiale citoplasmatica, gratis from proteine potenzialmente allergeniche, e morfologicamente intatto. 2,37 Tuttavia, dal punto di vista della produzione industriale, è anche importante considerare fattori economici e ambientali, quali l&#39;efficienza energetica, durata della produzione, la sicurezza, ei residui risultanti. Per quanto riguarda l&#39;efficienza energetica, sia ad alte temperature e tempi di lavorazione lunghi incidono sui costi di produzione e impatto ambientale. la durata della produzione e tempi di risposta sono fattori chiave che influenzano l&#39;elaborazione redditività. Di particolare interesse è che il trattamento acido fosforico alta temperatura aumenta i problemi di sicurezza ed è noto per causare incrostazioni corrosivo che porta a un aumento significativo nella manutenzione delle infrastrutture e ritardi nei tempi di consegna dei lotti. 38-40 Ove possibile, riducendo al minimo il numero di passaggi necessari può portare per ridurre significativamente i rifiuti prodotti. Tuttavia, comunemente utilizzati quattro fasi di L. Estrazione clavatum SEC ha semplicemente evolved da decenni di ricerca e ha avuto poca ottimizzazione del processo vero e proprio. Recentemente, Mundargi et al., 41 ha fatto un significativo contributo ai lavori in corso in questo campo, valutando in modo sistematico e ottimizzando una delle tecniche di estrazione SEC più comunemente riportati. Nella prima sezione di questo studio: spore sgrassamento è dimostrata utilizzando trasformazione acetone a 50 ° C per 6 ore; procedure sporoplasm e rimozione intine siano dimostrate utilizzando 85% trattamento acido fosforico a 70 ° C per 30 h; vasta lavaggio con acqua, solventi, acidi, e la base viene usata per dimostrare la rimozione del contenuto sporoplasmic residui; e SEC asciugatura è dimostrato utilizzando la convezione di essiccazione e il vuoto forno di essiccazione. Nella terza sezione, SEC vuoto carico è dimostrata utilizzando loading vuoto di una proteina modello, albumina di siero bovino (BSA), seguita da BSA-caricata-SEC lavaggio e liofilizzazione. Nella quarta sezione, la determinzione del rendimento incapsulamento BSA è dimostrata utilizzando centrifugazione, sonda sonicazione, e UV / Vis spettrometria.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Lycopodium clavatum&lt;/em&gt; spores (s-type)</td><td>Sigma</td><td>19108-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated BSA</td><td>Sigma</td><td>A9771-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoric acid (85% w/v)</td><td>Sigma</td><td>438081-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma</td><td>V800202&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma</td><td>S5881-1KG&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>V800022</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>AcME&amp;nbsp;</td><td>C000356</td><td></td></tr><tr><td>Deionized water</td><td>Millipore purified water&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene microspheres (50 &amp;plusmn; 1 &amp;micro;m)&amp;nbsp;</td><td>Thermoscientific (CA, USA)</td><td>4250A</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield&amp;nbsp;</td><td>Vector labs (CA, USA)</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 &amp;mu;m, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide</td><td>Ibidi GmbH (Munich, Germany)</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Commercial Lycopodium SECs (L-type)</td><td>Polysciences, Inc. (PA, USA)</td><td>16867-1</td><td></td></tr><tr><td>Heating plates</td><td>IKA, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scanning electron microscope</td><td>Jeol, Japan</td><td>&amp;nbsp;JFC-1600</td><td></td></tr><tr><td>Elemental analyzer&amp;nbsp;</td><td>Elementar, Germany</td><td>VarioEL III</td><td></td></tr><tr><td>FlowCam: The benchtop system</td><td>Fluid Imaging Technologies, USA</td><td>FlowCamVS</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope</td><td>Carl Zeiss, Germany</td><td>LSM710</td><td></td></tr><tr><td>Freeze dryer</td><td>Labconco, USA&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Spectrometer</td><td>Boeco, Germany</td><td>S220</td><td></td></tr></tbody></table>

extraction of plant-based capsules for microencapsulation applications

Microcapsule derivati ​​da spore o pollini vegetali forniscono una solida piattaforma per una vasta gamma di applicazioni di microincapsulazione. capsule sporopollenin exine (sec) si ottengono quando spore o polline sono trattati in modo da rimuovere il contenuto sporoplasmic interne. Le microcapsule risultanti cave presentano un elevato grado di uniformità micromeritica e conservano intricate caratteristiche microstrutturali relative alle particolari specie vegetali. Qui, dimostriamo un processo semplificato per la produzione di secondi da Lycopodium spore clavatum e per il carico di composti idrofili in questi sec. L&#39;attuale procedura di isolamento SEC è stato recentemente ottimizzato per ridurre in modo significativo i requisiti di elaborazione che vengono convenzionalmente utilizzati in isolamento SEC, e per garantire la produzione di microcapsule intatti. L. naturale spore clavatum sono sgrassati con acetone, trattata con acido fosforico, e ampiamente lavati per rimuovere sporoplasmicontenuti c. Dopo l&#39;acetone sgrassante, è stato dimostrato che una singola fase di lavorazione con acido fosforico 85% per rimuovere tutti i contenuti sporoplasmic. Limitando il tempo di elaborazione acido per 30 ore, è possibile isolare SEC pulite ed evitare SEC fratturazione, che ha dimostrato di verificarsi con tempo di lavorazione prolungato. lavaggio abbondante con acqua, acidi diluiti, diluire basi e solventi assicura che tutti i residui di materiale e chimiche sporoplasmic siano adeguatamente rimossi. La tecnica del vuoto di carico è utilizzata per caricare un modello proteine ​​(albumina sierica bovina) come composto idrofilico rappresentativo. Vacuum loading fornisce una tecnica semplice per caricare vari composti senza la necessità di solventi o sostanze chimiche aggressive indesiderabili che sono spesso richiesti in altri protocolli di microincapsulazione. Sulla base di questi protocolli di isolamento e di carico, SEC fornire un materiale promettente per l&#39;uso in una vasta gamma di applicazioni di microincapsulazione, ad esempio, terapie, alimenti, cosmetici, e prod cura personaledotti.

Processo di estrazione semplificata per sporopollenin exine Capsule La L. Estrazione clavatum SEC è stato raggiunto da tre fasi principali: (1) Sgrassante con acetone; (2) acidolisi con acido fosforico 85% (v / v); e (3) Ampia SEC lavaggio con solventi. Il flusso del processo di estrazione SEC aerodinamico è presentato in Figura 1 A -. I Brevemente, il processo comporta una fase di sgrassatura con acetone ricadere per 6 ore a 50 ° C e le spore sgrassate sono stati quindi essiccati durante la notte in una cappa aspirante per rimuovere residui acetone. Le spore sgrassate stati sottoposti a acidolisi con acido fosforico per 30 hr. Durante acidolisi la maggior parte dei materiali sporoplasmic vengono sciolti e poi rimosso durante la fase di filtrazione sotto vuoto. Al fine di rimuovere materiali sporoplasmic residui una vasta serie di fasi di lavaggio con solventi, acido, Viene eseguita base, e acqua. Le SECs stati inizialmente essiccati a temperatura ambiente per 24 ore e in seguito essiccati a 60 ° C e 1 mbar vuoto per 10 ore per rimuovere solventi e umidità residua. Come mostrato in figura 1, sono state eseguite tutte le fasi di estrazione SEC in una cappa aspirante con un avviso di pericolo. Durante l&#39;estrazione SEC, circa perdita di massa 70% si osserva a causa della rimozione di materiali sporoplasmic e nostri dati è coerente con i rapporti esistenti della produzione di SEC puliti e intatti. 7, 19,20,29 Il processo semplificato dal punto iniziale sgrassamento al prodotto finale si completa in circa 5 giorni e il processo può essere facilmente scalata fino a 1 kg laboratorio lotto bilancia con adeguati controlli di sicurezza. Passaggi di incapsulamento che utilizzano SEC sono presentati nella Figura 1 J - M, questi sono vantaggiosi a causa di essere semplici passaggi senza involving solventi organici aggressivi o che richiedono forze di taglio meccanici. 7 I nostri esperimenti di incapsulamento comporta 150 mg di SEC e un volume di soluzione di carico sufficiente per l&#39;assorbimento da parte delle sec. Il caricamento di queste SEC è limitata dalla solubilità del composto in solventi acquosi od organici selezionati, e il caricamento può essere ottenuta con qualsiasi dei tre metodi di caricamento: passiva, compressione e vuoto carico. Tuttavia, sottovuoto loading fornisce relativamente maggiore incapsulamento di composti. 7, 19,20 Caratterizzazioni fisico-chimiche della sporopollenin exine capsule Per determinare la pulizia di SEC prodotte utilizzando il processo razionalizzato illustrato nella figura 1, la superficie e trasversale morfologia, proprietà micromeritica e composizione elementare sono stati esaminati in diverse fasi del processo di estrazione SEC. Come mostrato inFigura 2, le immagini SEM indicano spore intatti con una microstruttura unica, e prima della trasformazione, organelli sporoplasmic micron scala sono stati osservati nell&#39;immagine trasversale. Con spore sgrassante e trattamento con alcali sono stati osservati cambiamenti morfologici e strutturali parte la rottura degli organelli sporoplasmic. La figura 3 mostra le immagini SEM di SEC dopo acidolisi con acido fosforico in vari momenti da 5 ore a 30 ore. Questi risultati sostegno che acidolisi per un massimo di 30 ore fornisce SEC intatti e puliti privi di materiali sporoplasmic. Al fine di confermare materiale proteico residuo, CHN analisi elementare 29 è stata eseguita e dati vengono presentati in Figura 4. Questi risultati forniscono una linea guida per la scelta della migliore condizione di trasformazione per ottenere SEC puliti e intatti. Nel caso di sgrassata e alcali trattata SECs, non proteinico sostanzialesi osserva asportazione di materiale. Tuttavia, con acidolisi con acido fosforico, la maggior parte dei materiali proteici viene rimosso in 30 ore e nessun ulteriore riduzione si osserva all&#39;aumentare del tempo di processo fino a 120 ore. I dati elementale è coerente con precedenti rapporti sul trattamento prolungato di SEC 7,11 e con SECs commerciali. Proprietà micromeritica sono stati analizzati mediante analisi di immagine dinamica delle particelle (DIPA) ed i risultati sono presentati nella Figura 5. Questi risultati supportano la distribuzione uniforme dimensioni SECs dopo acidolisi fino a 30 ore, con una dimensione di 31,0 ± 2,2 micron. Al contrario, SEC integrità strutturale diminuisce con acidolisi prolungata e comincia a causare notevoli frammentazione delle SECs oltre periodi di trattamento di 30 hr. La Figura 6 mostra i dati SEM e DIPA per SECs prodotte solo acidolisi proelaborazione con acido fosforico per 30 ore. Questi risultati confermano che dopo la fase di sgrassatura, acidolisi prodotta SEC puliti e intatti con una distribuzione di dimensione uniforme del 32,5 ± 2,7 micron. Acidolisi sola SECs hanno un contenuto proteico residua di soli 0,15 ± 0,0%, come determinato rispetto al contenuto% di azoto, 11 che è paragonabile a SEC prodotti da alcali e acidolisi trattamento come discusso sopra e relazioni precedenti. 7 Microincapsulazione utilizzando sporopollenin exine Capsule Per dimostrare l&#39;uso di L. SEC clavatum prodotti utilizzando il processo acidolisi-only, esperimenti di microincapsulazione sono stati effettuati utilizzando BSA come una proteina modello. Il caricamento nel SEC è stata ottenuta utilizzando una tecnica di vuoto del carico con 150 SECs mg e 1,2 ml di 125 mg / ml di BSA. Figura 7 mostra il CLSM imetà compresa tra i SEC prima e dopo l&#39;elaborazione acidolisi-only e con FITC-BSA incapsulamento. I dati indicano che la SEC non trattati mostra autofluorescenza a causa della presenza di costituenti sporoplasm all&#39;interno della cavità spore. Tuttavia, dopo l&#39;elaborazione acidolisi-solo, tutti i contenuti sporoplasmic vengono rimossi con un conseguente cavità interna vuota. Sorprendentemente, dopo l&#39;incapsulamento di FITC-BSA, fluorescenza verde si osserva all&#39;interno della SEC, confermando l&#39;incapsulamento del modello di proteine in sec. 19,20,41 Inoltre, per indagare i cambiamenti morfologici e le proprietà micromeritica di BSA-caricati SEC, SEM e l&#39;analisi DIPA sono state condotte ed i dati sono presentati in figura 8. Le immagini SEM confermano la presenza di microridges intatti e puliti dopo BSA carico. Inoltre, non sono stati osservati cambiamenti sostanziali di diametro, circolarità, e rapporto di aspetto dopo BSA carico in sec. Questi dati sono Consistent con le precedenti relazioni sul incapsulamento dei farmaci che utilizzano sec. 7,10 Per quantificare la quantità di incapsulato BSA, BSA è stato estratto da 5 mg di BSA-caricato SEC, ed i dati vengono presentati nella Tabella 1. I dati indicano 0,170 ± 0,01 g di BSA carico per grammo di SECs. Nel complesso, il SEM, DIPA, CLSM, e quantificazione di BSA mediante analisi spettrografica, confermano l&#39;incapsulamento successo di BSA in L. SEC clavatum e SEC stabilità morfologica. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig1.jpg" /> Figura 1. Processo semplificato di estrazione per L. clavatum sporopollenin exine Capsule (SEC). (A) le spore non trattati. (B) Spore sgrassante con un set-up riflusso a 50 ° C per 6 ore. (C) filtrazione di solventi e raccogliere<html> ione di spore sgrassate. (D) Essiccazione di spore sgrassate a temperatura ambiente. (E) Spore acidolisi nel pallone PTFE con 85% (v / v) di acido fosforico a 70 ° C per 30 h. filtrazione (F) Acido mediante filtrazione sotto vuoto set-up. lavaggio (G) SEC utilizzando una serie di acqua, acido, base, e solventi fasi di lavaggio. (H) SEC essiccazione utilizzando stufa da vuoto a 60 ° C e 1 mbar vuoto per 10 ore. (I) Intact, pulito , ed essiccato SEC come prodotto finale. (J) miscelazione della soluzione di SEC e BSA. (K) omogeneizzazione della soluzione SECs e BSA. (L) carico di vuoto di BSA in SECs. SEC (M) BSA-caricati. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54768/54768fig1large.jpg" target="_blank">cliccate qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 54768 / 54768fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Scanning Electron analisi microscopica di L. clavatum spore durante le diverse fasi di trattamento pre-acido. (A) spore non trattati mostrano organelli cellulari sporoplasmic e biomolecole. (B) Acetone spore trattate mostrando interrotti contenuto sporoplasmic. (C) e (D) alcali trattati spore che mostra la rimozione dei contenuti sporoplasmic e rugosa strato intine cellulosico interno. Adattato da 41 e utilizzati con il permesso di relazioni scientifiche. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54768/54768fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig3.jpg" /> Figura 3. Scanning Electron analisi microscopica di L. clavatum spore durante le diverse fasi di AcidoTrattamento da 5 a 30 ore (A - D). Rispettivamente, 5, acidato spore 10, 20, e 30 hr mostrano intatta microstruttura esterna e cavità interna pulita. Adattato da 41 e utilizzati con il permesso di relazioni scientifiche. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54768/54768fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig4.jpg" /> Figura 4. contenuto proteico delle spore e sporopollenin exine capsule (sec). Il contenuto proteico, dopo varie fasi del trattamento. Dati rappresentati è una media di misurazioni in triplicato con deviazione standard (n = 3). Adattato da 41 e utilizzati con il permesso di rapporti scientifici. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54768/54768fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande o</a>f questa figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig5.jpg" /> Figura 5. dinamica Imaging Analisi delle particelle (DIPA) di spore e sporopollenin exine capsule (sec) nelle varie fasi di trattamento Colonne (A - C). Sono, rispettivamente, il trattamento pre-acido, trattamento acido e SECs intatti. Parcelle sono grafici rappresentativi di diametro SEC, circolarità, aspect ratio, e il gradiente bordo. Adattato da 41 e utilizzati con il permesso di relazioni scientifiche. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54768/54768fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig6.jpg" /> Figura 6. microscopia elettronica a scansione (SEM) e Dynamic Imaging Analisi delle particelle (DIPA) del 30 hr AcidolySEC sis-solo sporopollenin exine Capsule (sec). (A) mostrano intatto microstruttura esterna e cavità interna pulita. (B) i grafici rappresentativi di diametro SEC, circolarità, e rapporto di aspetto. Adattato da 41 e utilizzati con il permesso di relazioni scientifiche. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54768/54768fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig7.jpg" /> Figura 7. confocale a scansione laser microscopia (CLSM) Analisi di sporopollenin exine capsule (SEC) prima e dopo il trattamento e BSA incapsulamento. La prima fila raffigura spore non trattati mostrano sporoplasmic organello cellulare e biomolecole autofluorescenza. La seconda riga raffigura 30 hr SECs acidolisi solo con una cavità interna vuota. La terza fila raffigura FITC-BSA caricatoin 30 hr SEC acidolisi-only. (Barre di scala sono 10 micron). Adattato da 41 e utilizzati con il permesso di relazioni scientifiche. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54768/54768fig7large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig8.jpg" /> Figura 8. microscopia elettronica a scansione (SEM) e Dynamic Imaging Analisi delle particelle (DIPA) Caratterizzazione di BSA-caricati sporopollenin exine capsule (SEC). Immagini (A) SEM di SEC BSA-caricati. (B) grafici rappresentativi di BSA-caricato diametro SEC, circolarità, aspect ratio, e il gradiente bordo. Adattato da 41 e utilizzati con il permesso di relazioni scientifiche. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54768/54768fig8large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <tablefo: together.within-page keep-= &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> Materiale </td><td> BSA carico per batch (125 mg / ml) </td><td> BSA in 5 secondi mg (mg) </td><td> Quantità di BSA caricato (g per g di secondi) </td></tr><tr><td> spore non trattati </td><td> 0,6 ml </td><td> 0.654 ± 0.05 </td><td> 0,131 ± 0,01 </td></tr><tr><td> SEC </td><td> 1,2 ml </td><td> 0,831 ± 0,05 </td><td> 0.170 ± 0.01 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. incapsulamento di albumina sierica bovina (BSA) in non trattate spore e SEC. Volume di soluzione BSA utilizzato per il carico per 150 mg di lotto &#39;spore non trattati&#39; o &#39;SEC&#39;. Dati rappresentati è una media dei lotti in triplicato con deviazione standard (n = 3). Adattato da 41 e utilizzati con il permesso di rapporti scientifici.

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Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications

Questo protocollo / manoscritto descrive un processo semplificato per la produzione di capsule exine sporopollenin (sec) da Lycopodium spore clavatum e per il carico di composti idrofili in questi SECs.

Capsule Estrazione di Plant-based per applicazioni di microincapsulazione

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.9K Views.  Nanyang Technological University.  Questo protocollo / manoscritto descrive un processo semplificato per la produzione di capsule exine sporopollenin (sec) da Lycopodium spore clavatum e per il carico di composti idrofili in questi SECs. 

Video: Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological materials. Such approaches have received considerable attention in research on the boundary between living and nonliving matter and have been used to construct artificial cells over the past two decades. In particular, Giant Vesicles (GVs) have often been used as artificial cell membranes. In this paper, we describe the preparation of GVs encapsulating highly packed microspheres as a model of cells containing highly condensed biomolecules. The GVs were prepared by means of a simple water-in-oil emulsion centrifugation method. Specifically, a homogenizer was used to emulsify an aqueous solution containing the materials to be encapsulated and an oil containing dissolved phospholipids, and the resulting emulsion was layered carefully on the surface of another aqueous solution. The layered system was then centrifuged to generate the GVs. This powerful method was used to encapsulate materials ranging from small molecules to microspheres.

Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.

Preparazione di giganti Vescicole Encapsulating microsfere mediante centrifugazione di una emulsione acqua-in-olio

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Ricerca

Biochimica

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Incapsulamento alginato di cellule staminali pluripotenti usando un ugello coassiale

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Biologia dello sviluppo

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement from a bulk fluid environment with applications in high throughput screening, cytometry, and mass spectrometry. We describe a method to not only encapsulate single cells, but to repeatedly capture a set number of cells (here we demonstrate one- and two-cell encapsulation) to study both isolation and the interactions between cells in groups of controlled sizes. By combining drop generation techniques with cell and particle ordering, we demonstrate controlled encapsulation of cell-sized particles for efficient, continuous encapsulation. Using an aqueous particle suspension and immiscible fluorocarbon oil, we generate aqueous drops in oil with a flow focusing nozzle. The aqueous flow rate is sufficiently high to create ordering of particles which reach the nozzle at integer multiple frequencies of the drop generation frequency, encapsulating a controlled number of cells in each drop. For representative results, 9.9 &mu;m polystyrene particles are used as cell surrogates. This study shows a single-particle encapsulation efficiency Pk=1 of 83.7% and a double-particle encapsulation efficiency Pk=2 of 79.5% as compared to their respective Poisson efficiencies of 39.3% and 33.3%, respectively. The effect of consistent cell and particle concentration is demonstrated to be of major importance for efficient encapsulation, and dripping to jetting transitions are also addressed. 
Introduction 
Continuous media aqueous cell suspensions share a common fluid environment which allows cells to interact in parallel and also homogenizes the effects of specific cells in measurements from the media. High-throughput encapsulation of cells into picoliter-scale drops confines the samples to protect drops from cross-contamination, enable a measure of cellular diversity within samples, prevent dilution of reagents and expressed biomarkers, and amplify signals from bioreactor products. Drops also provide the ability to re-merge drops into larger aqueous samples or with other drops for intercellular signaling studies.1,2 The reduction in dilution implies stronger detection signals for higher accuracy measurements as well as the ability to reduce potentially costly sample and reagent volumes.3 Encapsulation of cells in drops has been utilized to improve detection of protein expression,4 antibodies,5,6 enzymes,7 and metabolic activity8 for high throughput screening, and could be used to improve high throughput cytometry.9 Additional studies present applications in bio-electrospraying of cell containing drops for mass spectrometry10 and targeted surface cell coatings.11 Some applications, however, have been limited by the lack of ability to control the number of cells encapsulated in drops. Here we present a method of ordered encapsulation12 which increases the demonstrated encapsulation efficiencies for one and two cells and may be extrapolated for encapsulation of a larger number of cells.
To achieve monodisperse drop generation, microfluidic "flow focusing" enables the creation of controllable-size drops of one fluid (an aqueous cell mixture) within another (a continuous oil phase) by using a nozzle at which the streams converge.13 For a given nozzle geometry, the drop generation frequency f and drop size can be altered by adjusting oil and aqueous flow rates Qoil and Qaq. As the flow rates increase, the flows may transition from drop generation to unstable jetting of aqueous fluid from the nozzle.14 
When the aqueous solution contains suspended particles, particles become encapsulated and isolated from one another at the nozzle. For drop generation using a randomly distributed aqueous cell suspension, the average fraction of drops Dk containing k cells is dictated by Poisson statistics, where Dk = &lambda;k exp(-&lambda;)/(k!) and &lambda; is the average number of cells per drop. The fraction of cells which end up in the "correctly" encapsulated drops is calculated using Pk = (k x Dk)/&Sigma;(k' x Dk'). The subtle difference between the two metrics is that Dk relates to the utilization of aqueous fluid and the amount of drop sorting that must be completed following encapsulation, and Pk relates to the utilization of the cell sample. As an example, one could use a dilute cell suspension (low &lambda;) to encapsulate drops where most drops containing cells would contain just one cell. While the efficiency metric Pk would be high, the majority of drops would be empty (low Dk), thus requiring a sorting mechanism to remove empty drops, also reducing throughput.15
Combining drop generation with inertial ordering provides the ability to encapsulate drops with more predictable numbers of cells per drop and higher throughputs than random encapsulation. Inertial focusing was first discovered by Segre and Silberberg16 and refers to the tendency of finite-sized particles to migrate to lateral equilibrium positions in channel flow. Inertial ordering refers to the tendency of the particles and cells to passively organize into equally spaced, staggered, constant velocity trains. Both focusing and ordering require sufficiently high flow rates (high Reynolds number) and particle sizes (high Particle Reynolds number).17,18 Here, the Reynolds number Re =uDh/&nu; and particle Reynolds number Rep =Re(a/Dh)2, where u is a characteristic flow velocity, Dh [=2wh/(w+h)] is the hydraulic diameter, &nu; is the kinematic viscosity, a is the particle diameter, w is the channel width, and h is the channel height. Empirically, the length required to achieve fully ordered trains decreases as Re and Rep increase. Note that the high Re and Rep requirements (for this study on the order of 5 and 0.5, respectively) may conflict with the need to keep aqueous flow rates low to avoid jetting at the drop generation nozzle. Additionally, high flow rates lead to higher shear stresses on cells, which are not addressed in this protocol. The previous ordered encapsulation study demonstrated that over 90% of singly encapsulated HL60 cells under similar flow conditions to those in this study maintained cell membrane integrity.12 However, the effect of the magnitude and time scales of shear stresses will need to be carefully considered when extrapolating to different cell types and flow parameters. The overlapping of the cell ordering, drop generation, and cell viability aqueous flow rate constraints provides an ideal operational regime for controlled encapsulation of single and multiple cells.
Because very few studies address inter-particle train spacing,19,20 determining the spacing is most easily done empirically and will depend on channel geometry, flow rate, particle size, and particle concentration. Nonetheless, the equal lateral spacing between trains implies that cells arrive at predictable, consistent time intervals. When drop generation occurs at the same rate at which ordered cells arrive at the nozzle, the cells become encapsulated within the drop in a controlled manner. This technique has been utilized to encapsulate single cells with throughputs on the order of 15 kHz,12 a significant improvement over previous studies reporting encapsulation rates on the order of 60-160 Hz.4,15 In the controlled encapsulation work, over 80% of drops contained one and only one cell, a significant efficiency improvement over Poisson (random) statistics, which predicts less than 40% efficiency on average.12
In previous controlled encapsulation work,12 the average number of particles per drop &lambda; was tuned to provide single-cell encapsulation. We hypothesize that through tuning of flow rates, we can efficiently encapsulate any number of cells per drop when &lambda; is equal or close to the number of desired cells per drop. While single-cell encapsulation is valuable in determining individual cell responses from stimuli, multiple-cell encapsulation provides information relating to the interaction of controlled numbers and types of cells. Here we present a protocol, representative results using polystyrene microspheres, and discussion for controlled encapsulation of multiple cells using a passive inertial ordering channel and drop generation nozzle.

Combining monodisperse drop generation with inertial ordering of cells and particles, we describe a method to encapsulate a desired number of cells or particles in a single drop at kHz rates. We demonstrate efficiencies twice exceeding those of unordered encapsulation for single- and double-particle drops.

High Throughput singola cellula e cellula Multiple-Micro-incapsulamento

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Bioingegneria

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

Un approccio personalizzabile per la produzione e la purificazione esulta dei prodotti naturali Diterpenoid

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Bacterial Cellulose Spheres that Encapsulate Solid Materials

Bacterial cellulose (BC) spheres have been increasingly researched since the popularization of BC as a novel material. This protocol presents an affordable and simple method for BC sphere production. In addition to producing these spheres, an encapsulation method for solid particles has also been identified. To produce BC spheres, water, black tea, sugar, vinegar, and bacterial culture are combined in a baffled flask and the contents are agitated. After determining the proper culture conditions for BC sphere formation, their ability to encapsulate solid particles was tested using biochar, polymer beads, and mine waste. Spheres were characterized using ImageJ software and thermal gravimetric analysis (TGA). Results indicate that spheres with 7.5 mm diameters can be made in 7 days. Adding various particles increases the average size range of the BC capsules. The spheres encapsulated 10 - 20% of their dry mass. This method shows low-cost sphere production and encapsulation that is possible with easily obtainable materials. BC spheres may be used in the future as a contaminant removal aid, controlled release fertilizer coating, or soil amendment.

This protocol presents an easy, inexpensive method of forming bacterial cellulose (BC) spheres. This biomaterial can function as an encapsulation medium for solid materials, including biochar, polymer spheres, and mine waste.

Sfere di cellulosa batterica che incapsulano materiali solidi

Bacterial cellulose (BC) spheres have been increasingly researched since the popularization of BC as a novel material. This protocol presents an ...

Ingegneria

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet encapsulation has been studied extensively as a means to increase islet survival in allogeneic or xenogeneic transplants. Alginate encapsulation is commonly achieved by nozzle extrusion and external gelation. Using this method, cell-containing alginate droplets formed at the tip of nozzles fall into a solution containing divalent cations that cause ionotropic alginate gelation as they diffuse into the droplets. The requirement for droplet formation at the nozzle tip limits the volumetric throughput and alginate concentration that can be achieved. This video describes a scalable emulsification method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate with 70% to 90% cell survival. By this alternative method, alginate droplets containing cells and calcium carbonate are emulsified in mineral oil, followed by a decrease in pH leading to internal calcium release and ionotropic alginate gelation. The current method allows the production of alginate beads within 20 min of emulsification. The equipment required for the encapsulation step consists in simple stirred vessels available to most laboratories.

This video and manuscript describe an emulsion-based method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate beads which can be produced in large batches using a simple stirred vessel. The encapsulated cells can be cultured in vitro or transplanted for cellular therapy applications.

L&#39;incapsulamento delle cellule dei mammiferi nei branelli di Alginate usando un vaso semplice mescolato

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Incapsulamento termogenico preadipocytes al trapianto nel tessuto adiposo Depositi tessuti

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Medicina

Synthesis of Black Seed Oil-loaded-, Alginate-based, pH-sensitive Beads Using Electrospraying Technique

Black seed oil (BSO), derived from the seeds of the Nigella sativa plant, has garnered attention for its potential anti-cancer properties, particularly in the context of colon cancer. Its active compound, thymoquinone, may help inhibit cancer cell growth and induce apoptosis in colon cancer cells. Additionally, black seed oil's anti-inflammatory and antioxidant effects could contribute to a healthier gut environment, potentially reducing cancer risk. Therefore, this study synthesized pH-sensitive alginate beads to deliver BSO into the colon in a controlled-release manner without releasing the drug at pH 1.2 (stomach), thus providing a well-defined release pattern at pH 6.8. The use of electrospray technology improves process performance by making it easier to formulate small, homogeneous beads with a higher rate of swelling and diffusion in the gastrointestinal medium. 
The formulated beads were characterized by an ex-vivo mucoadhesive strength test, bead size, sphericity factor (SF), encapsulation efficiency (EE), scanning electron microscope (SEM), in vitro swelling behavior (SB), and in vitro drug release in acidic and buffer media. All these manufactured beads demonstrated modest sizes of 0.58 &plusmn; 0.01 mm and spherical shape of 0.03 &plusmn; 0.00 mm in this testing. The formulation showed promising floating and releasing properties in vitro. With a very low cumulative percentage of beads, the oil EE of 90.13% &plusmn; 0.93% was high, and the release study demonstrated more than 90% in pH 6.8 with good floating nature in the stomach. Additionally, the beads were evenly spaced throughout the intestine. The electrospraying approach used in this protocol can be reproducible, yielding consistent outcomes. Therefore, this protocol can be used for large-scale production for commercialization purposes.

A technique employing high electric voltage and a targeted, active ingredient-loaded emulsion to fabricate pH-responsive, uniform microbeads is presented.

Black seed oil (BSO), derived from the seeds of the Nigella sativa plant, has garnered attention for its potential anti-cancer properties, particularly in ...

Chimica

Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their biocompatibility, biodegradability, non-immunogenicity, non-toxicity, and ability to entrap both hydrophilic and hydrophobic compounds. The classical hydration of thin lipid films in an organic solvent is applied herein as a technique to encapsulate tarin, a plant lectin, in nanoliposomes. Nanoliposome size, stability, entrapment efficiency, and morphological characterization are described in detail. The nanoliposomes are prepared using 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt; DSPE-MPEG 2000), and cholesterylhemisuccinate (CHEMS) as the main constituents. Lipids are first dissolved in chloroform to obtain a thin lipid film that is subsequently rehydrated in ammonium sulfate solution containing the protein to be entrapped and incubated overnight. Then, sonication and extrusion techniques are applied to generate nanosized unilamellar vesicles. The size and polydispersity index of the nanovesicles are determined by dynamic light scattering, while nanovesicle morphology is assessed by scanning electron microscopy. Entrapment efficiency is determined by the ratio of the amount of unencapsulated protein to original amount of initially loaded protein. Homogeneous liposomes are obtained with an average size of 155 nm and polydispersity index value of 0.168. A high entrapment efficiency of 83% is achieved.

This study describes classical hydration using the thin lipid film method for nanoliposome preparation followed by nanoparticle characterization. A 47 kDa-hydrophilic and globular protein, tarin, is successfully encapsulated as a strategy to improve stability, avoid fast clearance, and promote controlled release. The method can be adapted to hydrophobic molecules encapsulation.

Preparazione e caratterizzazione dei nanoliposomi per l'entratura delle proteine globulari bioattive

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their ...

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and scalability. In this paper, we describe a strategy for the robust and reproducible formation of hPSC spheroids where a co-axial flow focusing device is utilized to entrap hPSCs inside core-shell microcapsules. The core solution contained single cell suspension of hPSCs and was made viscous by the incorporation of high molecular weight poly(ethylene glycol) (PEG) and density gradient media. The shell stream comprised of PEG-4 arm-maleimide or PEG-4-Mal and flowed alongside the core stream toward two consecutive oil junctions. Droplet formation occurred at the first oil junction with shell solution wrapping itself around the core. Chemical crosslinking of the shell occurred at the second oil junction by introducing a di-thiol crosslinker (1,4-dithiothreitol or DTT) to these droplets. The crosslinker reacts with maleimide functional groups via click chemistry, resulting in the formation of a hydrogel shell around the microcapsules. Our encapsulation technology produced 400 &#181;m diameter capsules at a rate of 10 capsules per second. The resultant capsules had a hydrogel shell and an aqueous core that allowed single cells to rapidly assemble into aggregates and form spheroids. The process of encapsulation did not adversely affect the viability of hPSCs, with &gt;95% viability observed 3 days post-encapsulation. For comparison, hPSCs encapsulated in solid gel microparticles (without an aqueous core) did not form spheroids and had &lt;50% viability 3 days after encapsulation. Spheroid formation of hPSCs inside core-shell microcapsules occurred within 48 h after encapsulation, with the spheroid diameter being a function of cell inoculation density. Overall, the microfluidic encapsulation technology described in this protocol was well-suited for hPSCs encapsulation and spheroid formation.

This article describes encapsulation of human pluripotent stem cells (hPSCs) using a co-axial flow focusing device. We demonstrate that this microfluidic encapsulation technology enables efficient formation of hPSC spheroids.

Capsule Estrazione di Plant-based per applicazioni di microincapsulazione

Riepilogo

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